Αφηρημένο

Η p53 και τα μονοπάτια του NF-κΒ παίζουν σημαντικό ρόλο σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων ανάπτυξη, η απόπτωση, και ογκογένεση. Οι μεταλλάξεις που απενεργοποιούν το γονίδιο ρ53 και συστατική ενεργοποίηση μονοπατιού ΝΡ-κΒ είναι κοινές εμφανίσεις σε ανθρώπινους καρκίνους. Παρά το γεγονός ότι πολλά φάρμακα έχουν αναπτυχθεί που ενεργοποιούν επιλεκτικά p53 ή αναστέλλουν NF-κΒ, υπάρχουν λίγοι υποψήφιοι φάρμακο που μπορεί να κάνει και τα δύο. Ταυτόχρονη ενεργοποίηση των p53 και αναστολή του μονοπατιού NF-κΒ είναι, επομένως, αποτελεί πρωταρχικό στόχο για την ανάπτυξη νέων φαρμάκων για τον καρκίνο. Η μελέτη αυτή είναι η πρώτη αναφορά μιας προσέγγισης υψηλής απόδοσης με μάζα ενώσεις που στοχεύουν ταυτόχρονα και τις δύο οδούς. Χρησιμοποιώντας ένα ποσοτικό προσδιορισμό διαλογής που βασίζεται σε κύτταρα και μια βιβλιοθήκη των 200.000 συνθετικών ενώσεων, εντοπίσαμε 9 μικρά μόρια τα οποία αναστέλλουν ταυτόχρονα ΝΡ-κΒ και ενεργοποιούν ρ53. Μία από αυτές τις ενώσεις, Ν-2, αύξησε την έκφραση των γονιδίων στόχων ρ53, συμπεριλαμβανομένων των ρ21 και GADD45a. Επιπλέον, η Ν-2 ανέστειλε την μεταγραφική δραστικότητα του ΝΡ-κΒ, συνακολούθως καταστολή της ιντερλευκίνης-6 και ΜΟΡ-1 (MCP-1) έκφρασης. Όταν υποβλήθηκαν σε επεξεργασία κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ένα ευρύ φάσμα καρκίνων

in vitro

με Ν-2, παρατηρήσαμε αυξημένο κυτταρικό θάνατο. Ν-2 επίσης ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη αλλομοσχευμάτων σε μοντέλα ποντικών με μελάνωμα και καρκίνωμα πνεύμονα. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η Ν-2 μπορεί να δράσει ως δισθενούς αντικαρκινικό παράγοντα μέσω της ταυτόχρονης διαμόρφωσης του NF-κΒ και τις δραστηριότητες p53

Παράθεση:. Hwang SG, το Park J, Πάρκο JY, Πάρκο CH, Lee KH, Cho JW, et al. (2012) Anti-Cancer δραστικότητα μιας ένωσης Novel μικρό μόριο που ενεργοποιεί ταυτόχρονα p53 και αναστέλλει ΝΡ-κΒ σηματοδότηση. PLoS ONE 7 (9): e44259. doi: 10.1371 /journal.pone.0044259

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Απρίλη 2012? Αποδεκτές: 31 Ιούλη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 13 Σεπτεμβρίου 2012 |

Copyright: © Hwang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από SK Biopharmaceuticals Co., Ltd., και επιχορηγήσεις (2011K00277) από τον εγκέφαλο Ερευνητικό Κέντρο του 21ου αιώνα Frontier Προγράμματος Έρευνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. SGH, CHP, KHL, JYP και JWC είναι υπάλληλοι της SK Biopharmaceuticals Co., Ltd (Daejeon, Κορέα), ένας από τους χρηματοδότες της μελέτης αυτής. SK Biopharmaceuticals Co., Ltd., αναπτύσσει φάρμακα μικρών μορίων για ασθένειες, όπως διαταραχές του ΚΝΣ και διαφορετικές μορφές καρκίνου. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, επιπλέον προϊόντα στην ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Ο NF-κΒ και ρ53 μονοπατιών σηματοδότησης λειτουργία σε σχεδόν όλους τους τύπους κυττάρων και ενεργοποιούνται σε απόκριση σε πολυάριθμες βιολογικές ερεθίσματα. NF-κΒ είναι βασικός παίκτης σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες [1], [2]. Αν και αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως παράγοντας μεταγραφής που εμπλέκονται στην φλεγμονώδη απόκριση, πειραματικά στοιχεία υποδεικνύουν ότι το ΝΡ-κΒ ρυθμίζει επίσης την ανάπτυξη των κυττάρων, την επιβίωση, και την απόπτωση [3]. ΙκΒ πρωτείνες αναστείλει την λειτουργία του ΝΡ-κΒ με την παρεμπόδιση του ΝΡ-κΒ από σύνδεση DNA. Η ενεργοποίηση του NF-κΒ περιλαμβάνει φωσφορυλίωση συγκεκριμένων καταλοίπων σερίνης ΙκΒ με ΙκΒ κινάσες (IKKS) που οδηγεί σε πρωτεασώματος μεσολάβηση αποικοδόμηση του ΙκΒ. Κατά την αποικοδόμηση της ΙκΒ, το σύμπλοκο NF-κΒ είναι τότε ελεύθερος να εισέλθει στον πυρήνα όπου μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων που σχετίζονται με φλεγμονώδεις ή ανοσολογικές αποκρίσεις, οι αποκρίσεις επιβίωσης των κυττάρων, και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό [4]. Η ρ53 ογκοκατασταλτικό πρωτεΐνη είναι ένας παράγοντας πρόσδεσης μεταγραφή του DNA που παίζει σημαντικό ρόλο στη φύλαξη του κυττάρου σε απόκριση προς διάφορα σήματα στρες [5]. Η ενεργοποιημένη ρ53 επάγει έκφραση διαφόρων γονιδίων που σχετίζονται με την διακοπή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, γήρανση, τη μετάφραση και την επιδιόρθωση του DNA. Φωσφορυλίωση του p53 σε συγκεκριμένα υπολείμματα σερίνης περιλαμβάνει τη δική της δραστηριότητα. Για παράδειγμα, η φωσφορυλίωση του σερίνες 9 και 46 σχετίζεται με την επαγωγή της απόπτωσης και βλάβη του DNA [6], [7]. Φωσφορυλίωση σε σερίνες 15 και 20 οδηγεί σε μειωμένη αλληλεπίδραση με αρνητικό ρυθμιστή της, ποντικού διπλό λεπτό 2 (MDM2). MDM2 αναστέλλει τη συσσώρευση ρ53 με στόχευση αυτό για πρωτεασώματος με τη μεσολάβηση της υποβάθμισης [8], [9].

Συστατική ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ παρατηρείται συχνά σε ανθρώπινους καρκίνους διαφόρων προελεύσεων, συμπεριλαμβανομένων των πνευμόνων, μελάνωμα, καρκίνο του παχέος εντέρου και , και συνδέεται με την αγγειογένεση, την αντίσταση χημειοθεραπεία, και την επιβίωση των καρκινικών βλαστικών κυττάρων [10], [11], [12], [13]. Καρκινικών κυττάρων που σχετίζονται με ΝΡ-κΒ και ρυθμιζόμενα γονίδια της, όπως την κυτοκίνη IL-6, έχουν συνδεθεί με την ανάπτυξη της χημειοαντίσταση σε διάφορους τύπους καρκίνων [14], [15]. Για παράδειγμα, η IL-6 είναι αυξημένα στον ορό και ασκίτη των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών και αυξημένη παραγωγή IL-6 συγκεντρώσεις συσχετίζονται με κακή πρόγνωση και χημειοαντίσταση [16]. Τέτοια αντίσταση στη χημειοθεραπεία μπορεί να επηρεάσει σοβαρά την αποτελεσματικότητα των αντικαρκινικών παραγόντων. Η οδός ΝΡ-κΒ έχει αποκτήσει μεγαλύτερη προσοχή ως μια αναδυόμενη θεραπευτικός στόχος στα καρκινικά κύτταρα φέρουν μεταλλάξεις στην οικογένεια γονιδίων Ras, ένα από τα πιο συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο σε οικογένειες ανθρώπινων καρκίνων. Είναι γνωστό ότι περίπου 20 έως 30% των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου (περίπου το 85% όλων των καρκίνων του πνεύμονα) έχουν ογκογόνες μεταλλάξεις στο K-Ras [17]. Η αναστολή της ΝΡ-κΒ σηματοδότηση βλάπτει κυτταρικό μετασχηματισμό και ευαισθητοποιεί Ras-μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα να υποστούν απόπτωση [11], [18], [19], [20], [21]. Αυτή η αναστολή θα μπορούσε ως εκ τούτου να είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τη θεραπεία όγκων που έχουν Ras μεταλλάξεων και άλλων καρκίνων που εκφράζουν ιδιοσυστατικά ενεργό Ras.

Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο ρ53 είναι πιο συχνές σε όγκους από μεταλλάξεις στο γονίδιο της οικογένειας Ras. Στην πραγματικότητα, η ρ53 είναι άμεσα μεταλλαγμένο σε περίπου το 50% των ανθρώπινων όγκων [22]. Αποκατάσταση της λειτουργίας ρ53 μπορεί συνεπώς να παρέχει μία ελκυστική θεραπευτική στρατηγική για τη στόχευση καρκινικών κυττάρων και έτσι, μικρά μόρια όπως το MDM2 ανταγωνιστής νουτλίνη-3 [23], το μόριο ρ53-πρόσδεσης RITA [24], και το MDM2 κάτω-ρυθμιστής gambogic οξύ [ ,,,0],25], έχουν αναπτυχθεί. Ωστόσο, η αποκατάσταση της λειτουργίας ρ53 δεν αρκεί για την πλήρη απώλεια των κυττάρων του όγκου. Για παράδειγμα, ρ53 η υπερέκφραση δεν είχε καμία επίδραση στην ανάπτυξη του χαμηλού βαθμού αλλοιώσεις όπως αδενώματα και p53 δεν προκαλεί πλήρη απώλεια των κυττάρων του όγκου σε υψηλού βαθμού αλλοιώσεις όπως καρκινώματα [26], [27], [28].

Πολλές μελέτες έχουν ερευνήσει το ρόλο του ΝΡ-κΒ και ρ53 μονοπατιών υπό παθολογικές συνθήκες, ιδιαίτερα του καρκίνου του [4], [29]. Η ενεργοποίηση του μονοπατιού ΝΡ-κΒ και αδρανοποίηση της οδού ρ53 ανιχνεύονται σε διάφορους καρκίνους. Ωστόσο, είναι απίθανο ότι ένας παράγοντας που στοχεύει μόνο ένα από αυτά τα μονοπάτια μπορεί να είναι αποτελεσματική για τη θεραπεία διαφόρων τύπων καρκίνου, λόγω της πολυπλοκότητας της ογκογένεσης. Αρκετές χημειοθεραπευτικά p53-προκαλώντας έχουν αναφερθεί ότι επάγουν ρ53, καθώς και ΝΡ-κΒ σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων [30]. Παρά ρ53 απόπτωση, την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ είναι σε θέση να προωθήσει την αντίσταση στην απόπτωση. Συστατική ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ έχει αναφερθεί σε διάφορες ανθρώπινους καρκίνους και σχετίζεται επίσης με αντοχή φαρμάκου [11].

Αυτά τα ευρήματα ισχυρά υποδηλώνουν ότι οι ενώσεις με την ικανότητα να καταστέλλει τη λειτουργία μονοπατιού ΝΡ-κΒ, ενώ ενεργοποιεί επίσης την ρ53 μονοπάτι θα μπορούσε να κατέχουν την υψηλότερη αποτελεσματικότητα κατά του καρκίνου. Πράγματι, η εξαρτώμενη από κυκλίνη κινάση (ΟϋΚ) αναστολέα seliciclib (r-ροσκοβιτίνη) [31] και η κινακρίνη ελονοσίας φάρμακο (QC), ένα 9-αμινοακριδίνη (9AA) -παράγωγο [32], διαθέτουν αυτή τη διπλή δράση και είναι επί του παρόντος σε φάση II των κλινικών δοκιμών ως αντι-καρκινικοί παράγοντες. QC και seliciclib αναφέρονται ότι αναστέλλουν την ΝΡ-κΒ μέσω αναστολής της φωσφορυλίωσης Ser-536 του ρ65 υπομονάδας του NF-κΒ [31], [32]. φωσφορυλίωση Ser-536 της υπομονάδας ρ65 είναι απαραίτητη για την δραστικότητα ΝΡ-κΒ και αποφωσφορυλίωση αυτού του site μετατρέπει ΝΡ-κΒ σε ένα μη ενεργό μορφή. Εκτός από αυτή τη δραστηριότητα, QC είναι ικανή να ενεργοποιήσει την οδό ρ53 και επάγει το θάνατο καρκινικών κυττάρων μέσω Bcl-2 πρωτεΐνης που συνδέεται με το Χ (BAX) [33] και seliciclib Ενεργοποίηση ρ53 με αναστολή MDM2 μεσολάβηση ρ53 αποικοδόμησης [34]. Ως εκ τούτου, τα φάρμακα αυτά παρουσιάζουν μια πολλά υποσχόμενη δυνατότητα για την θεραπεία καρκίνων στα οποία και οι δύο από αυτές τις οδούς απορυθμισμένη και το Ras είναι ουσιαστικά δραστική.

Στην παρούσα μελέτη, αναγνωρίσαμε μικρομοριακών ενώσεων που ενεργοποιούνται ταυτόχρονα ρ53 και ανέστειλαν ΝΡ-κΒ χρησιμοποιώντας ένα προς τα εμπρός χημική γενετική προσέγγιση. Από τις ενώσεις αυτές, Ν-2 που προκαλείται από το θάνατο διαφόρων τύπων καρκινικών κυττάρων μέσω αναστολής του ΝΡ-κΒ και επαγωγή της ρ53. Ν-2 ανέστειλε επίσης την ανάπτυξη του όγκου στο μελάνωμα B16F10 και καρκίνωμα πνεύμονα LLC μοντέλα ποντικών αλλομοσχεύματος. Έτσι, Ν-2 μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα δυνητικό χημειοθεραπευτικό φάρμακο με την ικανότητα να στοχεύουν σε ένα ευρύ φάσμα των κακοηθών όγκων.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των μικρών μορίων που ενεργοποιούν ταυτόχρονα p53 και αναστέλλουν NF-κΒ

Η βιβλιοθήκη υποβλήθηκε σε διαλογή για να ταυτοποιηθούν ενώσεις που διαμορφώνουν ταυτόχρονα την ρ53 και μονοπάτια NF-κΒ. Για να εκτιμηθεί η ευαισθησία και την ευρωστία της δοκιμασίας που βασίζεται σε κύτταρα πριν από την εκτέλεση HTS, επιβεβαιώσαμε τα προφίλ δόσης-απόκρισης με τη μορφή HTS χρησιμοποιώντας τον θετικό παρθενολίδη ελέγχου που μπλοκάρει LPS επαγόμενη δραστικότητα ΝΡ-κΒ (Εικ. 1Α). Το IC

50 αξία για parthenolide ήταν 7,2 μΜ, η οποία είναι σε συμφωνία με προηγούμενη έκθεση [35], [36]. Η βελτιστοποίηση και η σμίκρυνση των HTS έγιναν για να επιτευχθεί μορφές πλάκα 384-καλά. Οι αξίες της Ζ ‘των πλακών καλλιέργειας κυττάρων ήσαν & gt?. 0.6

C6 κύτταρα που προέρχονται από γλοιώματος αρουραίου που φέρουν την άγριου τύπου ρ53 χρησιμοποιήθηκαν για τη διαλογή της βιβλιοθήκης. (Α) Η δόση-εξαρτώμενη απόκριση του γονιδίου ανταποκριτή ΝΡ-κΒ με αυξανόμενες συγκεντρώσεις παρθενολίδη. (Β) Διαλογή ενώσεων που αναστέλλουν το γονίδιο ανταποκριτή ΝΡ-κΒ μέσω της βιβλιοθήκης των 200.000 ενώσεων. Οι ενώσεις που ανέστειλαν 100 ng ml δραστηριότητα ανταποκριτή /επαγόμενη από LPS περισσότερο από το 80% επελέγησαν ως πρωταρχικό επιτυχίες (n = 797). (Γ) Η διαλογή των πρωτογενών ενώσεων χτύπημα για ενεργοποίηση του γονιδίου ρ53 ανταποκριτή. Ενώσεις που ενεργοποιείται το p53 ρεπόρτερ περισσότερο από 3-φορές επιλέχθηκαν ως οι τελικές χτυπήματα (n = 9). (Δ) Περίληψη HTS διαδικασιών. Ο συνολικός δείκτης χτύπημα ήταν περίπου 0,0045%.

Η

Ο πρώτος γύρος του HTS χρησιμοποιώντας το γονίδιο αναφοράς NF-κΒ εντοπίστηκαν 797 πρωτοβάθμια χτυπήματα, που ισοδυναμεί με αναλογία χτύπημα 0,4% (Εικ. 1Β). Ένα δεύτερο HTS στη συνέχεια διεξήχθη για να αξιολογηθεί η ικανότητα αυτών των 797 ενώσεων να ενεργοποιούν το γονίδιο ρ53 ανταποκριτή. Αυτή η οθόνη εντοπίστηκαν 9 ενώσεις που πληρούσαν τα κριτήρια της μελέτης (Εικ. 1Γ). Ο συνολικός δείκτης χτύπημα της διαδικασίας διαλογής ήταν 0,0045% (Εικ. 1D).

Η κατάταξη του δισθενούς μικρού μορίου ενώσεις

Οι τελικές 9 ενώσεις που προσδιορίζονται μετά από δύο γύρους HTS ομαδοποιήθηκαν με τη χημική τους δομή (Εικ. 2). Ομάδα Δ περιλαμβάνονται 9AA-παράγωγα, όπως 9AA και QC. Οι 9AA-παράγωγα 9AA-1 και 9AA-2 έχουν αναφερθεί ότι ενεργοποιούν ρ53 αλλά αναστολή της NF-κΒ δεν έχει αναφερθεί [33], [37]. Οι μισές από τις ενώσεις χτύπημα ήταν παράγωγα 9AA και αυτές οι ενώσεις έδειξαν καλή συσχέτιση μεταξύ της αναστολής ΝΡ-κΒ δυναμικού και ρ53 ενεργοποίησης (R

2 = 0,85, Συμπληρωματικό Σχ. S1A και Β).

Ενώσεις που επάγεται η p53 ρεπόρτερ περισσότερο από 3-φορές και ταυτόχρονα ανέστειλε τον ανταποκριτή ΝΡ-κΒ κατά περισσότερο από 80% συμπεριλήφθηκαν στις αναλύσεις (η = 9). Επιπλέον, 8 λιγότερο δραστικά παράγωγα παρόμοιας δομής συμπεριλήφθηκαν για δομή: δραστηριότητα αξιολόγησης σχέση. Οι τιμές στις παρενθέσεις αναφέρονται σε μέγιστη επαγωγή ρεπόρτερ ρ53 αποκρίνονται σε κύτταρα σε αγωγή για 8 ώρες με κάθε ένωση (0,4 έως 25 μΜ). Σχετική αναστολή ΝΡ-κΒ παρουσιάζεται ως το ποσοστό αναστολής του ανταποκριτή ΝΡ-κΒ σε παρουσία 10 μΜ της κάθε ένωσης. Οι 17 ενώσεις ομαδοποιούνται σύμφωνα με δομικής ομοιότητας (Ομάδες Α-Δ).

Η

Ο Όμιλος Μια ένωση piperlongumine (PIP) έχει αναφερθεί να σκοτώσουν επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα με βάση τον καρκίνο ειδικά χαρακτηριστικά και αυτής της ένωσης προηγουμένως διαλογή χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία ρεπόρτερ p53-απόκρισης στα κύτταρα οστεοσαρκώματος U2OS [38]. Είναι ενδιαφέρον, στην οθόνη μας, βρήκαμε ότι PIP ενεργοποιεί όχι μόνο p53 αλλά επίσης είναι ένας ισχυρός αναστολέας της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ (Εικ. 2).

Μεταξύ νέες ενώσεις χτύπημα, Ν-2 (5-Ehyl- 3-μεθυλο-6- (1-methly-1Η-pryidin-2-υλιδενομεθυλο) -phenanthridinium, C

23Η

23Ν

2, ΜΒ = 327,5) έδειξε την πλέον υποσχόμενη προφίλ. Ν-2 προκάλεσε το p53 ρεπόρτερ περισσότερο από 10 φορές και ισχυρώς αναστέλλει δραστικότητα του ΝΡ-κΒ σε σύγκριση με άλλες νέες επιτυχίες στις ομάδες Α έως D. Επομένως, επιλέξαμε αυτήν την ένωση για περαιτέρω αναλύσεις. QC, που είναι επί του παρόντος σε κλινικές δοκιμές για τη θεραπεία ορμονικά ανθεκτικών ταξάνης ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη, και 9AA επελέγησαν ως ενώσεις ελέγχου.

N-2 αναστέλλει ΝΡ-κΒ και τα γονίδια προς τα κάτω στόχος του IL-6 , MCP-1, και το νιτρικό οξείδιο

σε σύγκριση με 9AA και QC, Ν-2 έδειξαν αυξημένη αναστολή της ρεπόρτερ ΝΡ-κΒ σε κύτταρα C6 όταν προστίθεται ταυτόχρονα με 100 ng /ml LPS. Το IC

50 τιμές του 9AA, QC, και Ν-2 για το γονίδιο ανταποκριτή ΝΡ-κΒ ήταν 23,8 μΜ, 50,4 μΜ, και 5,9 μΜ, αντίστοιχα (Σχ. 3Α). LPS διεγείρει ΝΡ-κΒ διαμεσολαβούμενη παραγωγή νιτρικού οξειδίου, καθώς και την έκφραση των κυτοκινών και χημειοκινών, όπως IL-6 και MCP-1 [39]. Θεραπεία της ποντικού RAW 264.7 μακροφάγα κύτταρα με Ν-2 παραγωγή νιτρικού οξειδίου ισχυρά ανέστειλε επαγόμενη από LPS? το IC

50 αξίες της παραγωγής νιτρικού οξειδίου από 9AA, QC, και Ν-2 ήταν 7,8 μΜ, 33,7 μΜ, και 0,64 μΜ, αντίστοιχα (Σχ. 3Β). Αξιολογήσαμε επίσης την αναστολή της προκαλούμενης από LPS IL-6 και MCP-1 σε κύτταρα RAW 264.7. Ν-2 και ο θετικός έλεγχος παρθενολίδη ανέστειλε σημαντικά IL-6 και MCP-1 παραγωγή πρωτεΐνης (Σχ. 3C). Η αγωγή με Ν-2 (1 μΜ) ανέστειλε LPS επαγόμενη φωσφορυλίωση Ser-536 του ρ65 υπομονάδας του NF-κΒ, παρόμοια με 20 μΜ του 9AA (Σχ. 3D). Μαζί, Ν-2 ανέστειλε έντονα τον ανταποκριτή ΝΡ-κΒ και κατάντη κυτοκίνης της IL-6 (Σχ. 3Β και C), ένα ακίνητο που παρέχει μια λογική για χημειοθεραπεία θεραπεία του καρκίνου με τη χρήση Ν-2.

(Α ) Η εξάρτηση από τη δόση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης του γονιδίου αναφοράς ΝΡ-κΒ προσδιορίστηκε σε κύτταρα C6 με αυξανόμενες συγκεντρώσεις 9AA, QC, και Ν-2 (μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων). (Β) Η δοσο-εξαρτώμενη αναστολή του νιτρικού οξειδίου (ΝΟ) προσδιορίστηκε με αυξανόμενες συγκεντρώσεις 9AA, QC, και Ν-2 σε RAW 264.7 κύτταρα. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος ± SD τριών πειραμάτων. (Γ) Επίπεδα της IL-6 και MCP-1 σε RAW 264.7 κύτταρα μετά από θεραπεία με παρθενολίδη (Par) ή Ν-2 παρουσία του LPS. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD από τέσσερα δοκιμασίες. * P & lt? 0.01 με t-test του Student ζεύγη. (Δ) Ανάλυση της φωσφορυλίωσης Ser536 της ρ65 υπομονάδας του ΝΡ-κΒ σε RAW 264.7 κύτταρα μετά από θεραπεία για 1 ώρα με 20 μΜ της QC ή 1 μΜ Ν-2 παρουσία του LPS. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

N-2 ενεργοποιεί ρ53 σε καρκινικά κύτταρα διαφορετικής προέλευσης

N-2 αύξησε το συνολικό ενδογενή έκφραση της πρωτεΐνης ρ53 και την έκφραση του στόχου του γονίδιο p21 σε Α549 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα και B16F10 κύτταρα μελανώματος ποντικού με χρονο και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχ. 4Α και 4Β). Η ενεργοποίηση του ενδογενούς ρ53 και ρ21 έφθασε μέγιστα επίπεδα 8 ώρες μετά τη θεραπεία με Ν-2 σε κύτταρα Α549 και 16 ώρες σε Β16Ρ10 κύτταρα. Ν-2 επάγεται το γονίδιο ρ53 και ρ21 ανταποκριτή γονιδίου ενδογενούς στόχο σε κύτταρα HCT116 με υψηλότερη αποτελεσματικότητα από QC (Σχ. 4C και 4D). Η ενεργοποίηση της ρ53 αποκρίνεται ανταποκριτού από 1 μΜ Ν-2 έδειξε παρόμοια κινητική με 10 μΜ της QC ή 1 μΜ Dox (Σχ. 4Ε). Η μέγιστη επίδραση της Dox, Ν-2 και QC στην ενεργοποίηση της ρ53 ρεπόρτερ παρατηρήθηκε στα 12 έως 20 ώρες μετά τη θεραπεία, ενώ 3 μΜ ταξόλης εμφανίζονται δραστηριότητας ρ53 ρεπόρτερ κορυφή μετά από 40 ώρες (Σχ. 4Ε). 9AA, QC, και Ν-2 ενεργοποιείται το γονίδιο ανταποκριτή ρ53 σε ποικίλες κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων των C6, HCT116, Α549, και B16F10 (Σχ. 4F). Η μέγιστη δραστικότητα ρεπόρτερ p53-απόκρισης παρατηρήθηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα με κάθε ένωση με εύρος 0,4 έως 25 μΜ. (Σχ. 4F). Καμία αύξηση στην έκφραση του mRNA p53 βρέθηκε σε απόκριση σε θεραπεία Ν-2 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντ ‘αυτού, η επεξεργασία των κυττάρων Α549 με 1 μΜ Ν-2 για 12 ώρες επαγόμενη φωσφορυλίωση ρ53 σε Ser9, Ser20, Ser46 και (Σχ. 4G). Ωστόσο, Ν-2 δεν ήταν σε θέση να επάγει φωσφορυλίωση του Ser-392, που φωσφορυλιώθηκε μετά 9AA ή θεραπεία QC. Για να αξιολογηθεί κατά πόσον Ν-2 προκαλεί βλάβες στο DNA, εξετάσαμε τη φωσφορυλίωση της γ-H2AX σε Ser139. Ν-2 και Dox αυξημένα επίπεδα φωσφορυλιωμένου γ-Η2ΑΧ (Σχ. 4G και Συμπληρωματικό Σχ. S2). Εμείς δεν βρήκε καμία τέτοια δραστηριότητα από 9AA και QC, όπως έχει ήδη αναφερθεί [32]. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι το Ν-2 σταθεροποιεί p53 μέσω DNA βλάβη μεσολάβηση φωσφορυλίωση του ρ53.

(Α) Τα επίπεδα των ενδογενών πρωτεϊνών ρ53 και ρ21 αξιολογήθηκαν μετά την επεξεργασία των Α549 και κύτταρα Β16Ρ10 με 1 μΜ Ν-2. (Β) Δόση εξάρτηση από Ν-2 επί ενδογενείς πρωτεΐνες ρ53 και ρ21. (C) Δόση εξάρτηση από Ν-2 και QC για ενδογενείς πρωτεΐνες ρ53 και ρ21 σε κύτταρα HCT116. (Δ) Η ρ53 αποκρίνεται δραστηριότητα ανταποκριτή στα κύτταρα HCT116 αγωγή για 12 ώρες με 9AA, QC, δοξορουβικίνη (Dox) ή Ν-2 σε ένα εύρος συγκεντρώσεων (0,4 έως 25,0 μΜ). (Ε) κινητική ενεργοποίηση της δραστικότητας ανταποκριτή ρ53 αποκρίνονται σε κύτταρα HCT116 θεραπεία για 2-40 ώρες με 3 μΜ Ν-2, 3 μΜ της ταξόλης, 1 μΜ Dox ή 10 μΜ της QC. (F) Η δραστηριότητα ανταποκριτή ρ53 σε C6, HCT116, Α549 ή κύτταρα B16F10 αγωγή για 12 ώρες με 9AA, QC, ή Ν-2 σε ένα εύρος συγκεντρώσεων (0,4 έως 25 μΜ). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η σχετική επαγωγή πτυχής του γονιδίου ρ53 ρεπόρτερ στο πλέον αποτελεσματική συγκέντρωση της κάθε ένωσης. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι ο μέσος όρος τριών πειραμάτων? οι μπάρες δείχνουν την τυπική απόκλιση (D-F). (G) Φωσφορυλίωση της ρ53 σε διάφορα σερίνης και φωσφορυλιωμένη ιστόνη γ-Η2ΑΧ σε κύτταρα Α549 σε αγωγή για 12 ώρες με QC (10 μΜ), 9AA (5 μΜ), Dox (1 μΜ) ή Ν-2 (1 μΜ).

η

Ν-2 έχει αποτελέσματα αντι-όγκου

in vivo

η

Είμαστε δίπλα σε σύγκριση με την αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα των 9AA, QC, και Ν-2 σε διαφορετικές τύπους καρκινικών κυττάρων. Η LD

50 συγκέντρωσης για κάθε τύπο των κυττάρων προσδιορίστηκε μετά από θεραπεία για 48 ώρες με 9AA, QC, και Ν-2 σε διάφορους αγρίου τύπου και μεταλλαγμένα κύτταρα ρ53. Ν-2 έδειξε σχετικά μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα από ό, τι 9AA και QC σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν (Σχ. 5Α). Ιδιαίτερα, Ν-2 έδειξε την πιο ισχυρή αποτελεσματικότητα σε κύτταρα LLC (LD

50 = 80 ηΜ). Ως εκ τούτου, επιλέξαμε κύτταρα LLC για την περαιτέρω

in vivo

δοκιμές. Επιπλέον, εξετάσαμε

in vivo

επίδραση του Ν-2 σε κύτταρα B16F10 ποντικού μελανώματος (LD

50 = 600 nm), όπως το μελάνωμα και καρκίνο του πνεύμονα είναι δύο από τις πιο τύπων όγκων ανθεκτικών στα φάρμακα.

(Α) Σύγκριση του IC

50 συγκεντρώσεις 9AA, QC, και Ν-2 σε διάφορα άγριου τύπου και μεταλλαγμένα ρ53 κυτταρικές σειρές. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει το IC

50 ενός συγκεκριμένου τύπου κυττάρου, τα οποία ομαδοποιούνται ως εξής: (

i

) κύκλους, κυτταρικές σειρές άγριου-τύπου ρ53 (Α549, Η460, HCT116, C6, SH- SY5Y, και B16F19)? και (

ii

) τρίγωνα, ρ53 μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές (Η2009, SW480, Jurkat, U937, και LLC). (Β) Χρονική πορεία αλλαγών βάρους σώματος μετά από θεραπεία με Ν2. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SD. (Γ) Η δραστικότητα κατά του όγκου του Ν-2 και QC σε αλλομοσχεύματα B16F10. Ο όγκος του όγκου και ένας αντιπρόσωπος αποκόπηκαν μελάνωμα κατά την ημέρα 15 δείχνονται. (Δ) Η δραστικότητα κατά του όγκου του Ν-2 επί LLC αλλομοσχεύματα. Το μέγεθος του όγκου, την εμφάνιση των αλλομοσχευμάτων, και αποκόπηκαν οι όγκοι LLC την ημέρα 14 δείχνονται. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την SD (C-D). * Υποδηλώνει σημασία σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, ρ & lt? 0,05,

# p & lt? 0.01 με ANOVA. (Ε) Επίδραση του Ν-2 από αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη σε κύτταρα Α549. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει το μέσο ± SD τριών προσδιορισμών. * P & lt? 0,05,

# p & lt?. 0.01 από t-test σε συνδυασμό Φοιτητών

Η

αξιολογηθεί κατά πόσον Ν-2 είχε αποτελέσματα κατά των όγκων σε B16F10 ποντίκι (μελάνωμα) και τα μοντέλα αλλομοσχεύματος LLC. Ενεργοποιητές της ρ53 έχουν δείξει υπόσχεση στην αντιμετώπιση πρωτογενές μελάνωμα ραγοειδούς και τα μοντέλα ποντικού αλλομοσχεύματος οφθαλμικών B16F10 κυττάρων μελανώματος [40]. QC και Ν-2 ανέστειλε την ανάπτυξη αλλομοσχευμάτων όγκων που σχηματίζονται με ενδοπεριτοναϊκή ένεση κυττάρων Β16Ρ10 μελανώματος σε ποντίκια C57 /BL6. Ν-2 (1 mg /kg) παρουσίασε παρόμοια αποτελέσματα κατά του όγκου ως 30 mg /kg QC χωρίς σημαντική απώλεια βάρους (έως και 20% στα 3 mg /kg θεραπεία του Ν-2? Σχήματα 5Β και C).. Επιπροσθέτως, Ν-2 έδειξε ισχυρή αποτελεσματικότητα σε

in vivo

LLC μοντέλο αλλομοσχεύματος (Σχ. 5D). Τα αποτελέσματα της αλλομοσχεύματος LLC αντιστοιχούν με τους πιο ισχυρούς

in vitro

LD

50 τιμή του Ν-2 σε κύτταρα LLC. Το μέσο βάρος και ο όγκος των πρωτογενών όγκων σε ποντίκια Ν-2-αγωγή ήταν σημαντικά χαμηλότερα από ό, τι τα ποντίκια που υπέστησαν αγωγή με φορέα.

Αναστολή της ΝΡ-κΒ σηματοδότηση που επάγεται απόπτωση σε ρ53-ηυΙΙ κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα και ανέστειλαν ποντικού ανάπτυξη αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα [19], [41], [42]. Για να αξιολογηθεί η επίδραση της Ν-2 για τον καρκίνο του πνεύμονα του ανθρώπου, χρησιμοποιήσαμε δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας agar. ΝΡ-κΒ παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, μετάσταση, και τον σχηματισμό όγκων σε κύτταρα καρκινώματος του πνεύμονα, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων Α549 [43]. σχηματισμού αποικιών

in vitro

γενικά συσχετίζεται με κακοήθεια

in vivo

[44]. Ν-2 ισχυρώς ανέστειλε το σχηματισμό αποικίας σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο και η αποτελεσματικότητά της είναι πολύ υψηλότερη από ό, τι 9AA και QC σε προσδιορισμούς σχηματισμού αποικίας Α549 (Σχ. 5Ε).

N-2 επάγει γονίδια απόκριση στρες

Οραματιζόμαστε δίκτυο μοριακή αλληλεπίδραση αναλύοντας σχέση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων στόχων εμφανίζεται στην δοκιμασία μικροσυστοιχίας. Το συνολικό δίκτυο αποκαλύπτει αρκετά ενδιαφέροντα αλληλεπιδράσεις που μπορεί να συνδεθεί με ρ53 ή NF-κΒ. αγωγή Ν-2 μείωσε την έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο, την αντιγραφή του DNA, και την επισκευή αλλά αυξημένη έκφραση απόπτωση και κυτταρικών γονιδίων σχετίζονται με το άγχος (Σχ. 6Α και συμπληρωματικό πίνακα S1 και S2). Αυτά τα αποτελέσματα επαληθεύτηκαν χρησιμοποιώντας RT-PCR. αγωγή Ν-2 ευδιακρίτως επάγεται γονίδια σχετίζονται με το στρες, όπως DDIT3, DDIT4, SENS2 και GADD45 με ταυτόχρονη ρύθμιση προς τα κάτω της πολλαπλασιαστικής PCNA δείκτη, CDK1 (CDC2), και το γονίδιο στόχο CCND3 NF-κΒ (κυκλίνη D3? Εικ . 6Β).

(Α) Αλληλεπίδραση χάρτη της βαθμούς με. Συνολικά δίκτυο αποκαλύπτει πολλά ενδιαφέροντα αλληλεπιδράσεις που μπορεί να συνδεθεί με ρ53 ή NF-κΒ. Το χρώμα κόμβος αντιπροσωπεύει φορές αλλαγή (πράσινο, ρύθμιση προς τα κάτω? Κόκκινο, ρύθμιση προς τα πάνω). (Β) Ν-2-up ρυθμίζει τα επίπεδα του mRNA των γονιδίων απόκρισης στρες (DDIT3, DDIT4, SESN2, και GADD45a) και ρυθμίζει προς τα κάτω το επίπεδο του mRNA των γονιδίων που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό (PCNA και CCND3). Το επίπεδο της μεταγραφής των επιλεγμένων γονιδίων επιβεβαιώθηκε με RT-PCR. * P & lt? 0,01, ** p & lt?. 0.001

Η

Συζήτηση

Το παράγοντες μεταγραφής ρ53 και NF-κΒ είναι δύο κρίσιμες πρωτεΐνες που έχουν απελευθερωθεί σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους. Μια προσέγγιση πολλαπλών στόχος μπορεί να είναι το μέλλον της θεραπείας κατά του καρκίνου στην οποία η αντίσταση του φαρμάκου είναι ένα θέμα. Υπό το πρίσμα αυτό, νέα μόρια που ρυθμίζουν διπλή NF-κΒ και σηματοδότησης p53 μπορεί να είναι ιδιαίτερα σημαντικό να αξιολογηθεί η πιθανή θεραπευτική χρήση δισθενούς φαρμάκων σε ποικίλες καρκίνους [29].

οθόνη μας από 200.000 ενώσεις που προσδιορίζονται Ν- 2, ένα δισθενές μόριο με δυνατότητα να διαμορφωθούν αμφότερα τα ΝΡ-κΒ και σηματοδότηση ρ53. Σε σύγκριση με τις προηγουμένως αναφερθείσες bi-στοχευμένων φαρμάκων, 9AA και QC, Ν-2 έδειξε ισχυρότερη αποτελεσματικότητα σε ποικίλες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Η ισχυρή αποτελεσματικότητα του Ν-2 που παρουσιάζεται από το IC

50 τιμές για τον ΝΡ-κΒ-διαμεσολαβούμενη παραγωγή νιτρικού οξειδίου από 9AA, QC, και Ν-2 (7.8 μΜ, 33,7 μΜ, και 0,64 μΜ, αντίστοιχα) . Ν-2 επάγεται επίσης ρ53 και γονιδίων-στόχων της σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις από QC. ενεργοποιήσεως ρ53 έχει επίσης αναφερθεί ότι αναστέλλει την επαγόμενη από LPS ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ [45]. Είναι ενδιαφέρον ότι η IC

50 Ν-2 για τα καρκινικά κύτταρα ήταν ανεξάρτητη της γενετικής κατάστασης ρ53 υπό τις ίδιες συνθήκες (συμπληρωματικός Πίνακας S3 και το Σχ. S4). Curaxins, QC και προηγουμένως γνωστές PIP ενεργοποιητή ρ53 (Ομάδα Α) προκαλούν επίσης ανεξάρτητη της ρ53 αποπτωτικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων [46], [47]. Η αναστολή της ΝΡ-κΒ σηματοδότηση μόνο του μπορεί να είναι αποτελεσματική για τη θεραπεία των καρκίνων του πνεύμονα που έχουν Ras μεταλλάξεις [19], [41], [48]. 9AA και QC έδειξε επίσης καμία σημαντική διαφορά στην LD

50 τιμές μεταξύ άγριου τύπου και μεταλλαγμένα ρ53 καρκίνος κύτταρα (Εικ. 5Α και συμπληρωματικό πίνακα S3), υποδεικνύοντας ότι η ρ53-εξαρτώμενη απόπτωση δεν είναι ο μόνος μηχανισμός του Ν-2- μεσολάβηση θάνατο των κυττάρων του όγκου. Ιδιαίτερα, έχει ως αποτέλεσμα στο Σχ. S4 υποδηλώνει ότι ROS πιθανό ενεργεί ως μόρια σήματος για Ν-2-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο και η διαδικασία αυτή είναι ακόμη λειτουργικό ακόμη και εν απουσία του ρ53. Έτσι, η επαγωγή του ROS μπορεί να παρέχει ένα πιθανό μηχανισμό για Ν-2 κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε αμφότερες ρ53 άγριου τύπου και μεταλλαγμένου ρ53 καρκινικά κύτταρα.

Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι οι προηγουμένως γνωστούς ενεργοποιητές ρ53 PIP , 9AA-1, και 9AA-2 επίσης ανέστειλε επαγόμενη από LPS ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ (Εικ. 2). Η αντιφλεγμονώδης ιδιότητα της προηγουμένως εντοπιστεί δισθενή seliciclib φαρμάκου (ροσκοβιτίνη) θα μπορούσε να εξηγηθεί από την αναστολή της NF-κΒ [31]. Σε μελλοντικές μελέτες, θα είναι απαραίτητο να αξιολογηθεί η αντι-φλεγμονώδης δραστικότητα των ενώσεων αυτών χτύπημα με μεγαλύτερη λεπτομέρεια.

Η παγκόσμια γονιδιακής έκφρασης αποτελέσματα έδειξαν μια χαρακτηριστική επαγωγή γονιδίων σχετίζονται με το στρες, όπως ATF3, DDIT3 , DDIT4, SENS2, και GADD45 (Εικ. 6). Έχει αναφερθεί ότι διάφορες κυτταρικές καταπονήσεις, συμπεριλαμβανομένων ενδοπλασματικό δίκτυο, γονιδιοτοξική, και αντιδραστικά είδη οξυγόνου στρες, μπορεί να σταθεροποιήσει την πρωτεΐνη ρ53. Αποτελεσματική επαγωγέα του p53 RITA διεγείρεται επίσης τα γονίδια του στρες, όπως ATF3, DDIT3, DDIT4 και GADD45 όπως Ν-2 [49]. Το γονίδιο DDIT3 /CHOP είναι ένα συστατικό του ενδοπλασμικού δικτύου αντίδραση στο στρες, DDIT4 /REDD1 και SENS2 είναι αναστολείς της οδού επιβίωσης mTOR, και GADD45 είναι ένα κρίσιμο αισθητήρας στρες αποπτωτικού κυτταρικού θανάτου με χημειο-προληπτικά φάρμακα. Επιπλέον, ATF3, DDIT3, DDIT4, GADD45 και SESN2 είναι επίσης p53-ρυθμιζόμενων γονιδίων [50], [51], [52], [53]. Ιδιαίτερα, Ν-2 που προκαλείται από την έκφραση των αναστολέων mTOR DDIT4 και SESN2 και ανέστειλε φωσφορυλίωση των Ser536 της ρ65 υπομονάδας του ΝΡ-κΒ, η οποία φωσφορυλιώνεται από ΑΚΤ [54]. Ο μηχανισμός της Ν-2 δράση μπορεί να περιλαμβάνει την αναστολή της ΑΚΤ /mTOR και μονοπάτια ΑΚΤ /NF-κΒ. mTOR έχει αναδειχθεί ως ένα κρίσιμο κόμβο ανάπτυξης ελέγχου που δέχεται διεγερτικά σήματα από Ras και φωσφατιδυλινοσιτόλη-3-ΟΗ κινάση [55]. Τα αποτελέσματα της παγκόσμιας προφίλ γονιδιακής έκφρασης μας υποδηλώνουν ότι η επαγωγή της βλάβης του DNA, την παραγωγή ROS και αυξητική ρύθμιση των γονιδίων στρες που συνδέονται με Ν-2 είναι πιθανόν εμπλέκονται στην σταθεροποίηση ρ53, μαζί με αναστολή της ΑΚΤ /mTOR ή ΑΚΤ /NF -κB μονοπάτια επιβίωσης.

Η θεραπεία με το Ν-2 που προκαλείται φωσφορυλίωση ρ53 σε Ser9, Ser20 και Ser46 σε κύτταρα Α549. Φωσφορυλίωση αυτών των θέσεων σχετίζεται με την επαγωγή της απόπτωσης, βλάβης του DNA, και η σταθερότητα p53 [6], [7], [8]. Ειδικά, η φωσφορυλίωση του ρ53 σε Ser20 εμφανίζεται κυρίως σε απόκριση σε βλάβη του DNA και επαγωγή ROS [56]. Επιβεβαιώσαμε την βλάβη του DNA από Ν-2 μέσω της επαγωγής της φωσφορυλίωσης ιστόνης γ-Η2ΑΧ. Προσδιορίσαμε την επίδραση της Ν-2 στην παραγωγή ROS σε κύτταρα Α549 χρησιμοποιώντας 2 ‘, 7’-διχλωρο διοξεικό (DCF-DA). Κατεργασία της Ν-2 αυξημένα επίπεδα ROS σημαντικά σε κύτταρα Α549 αλλά 9AA δεν το έκανε. Θετικός έλεγχος οξική μυριστική φορβόλη προκάλεσε επίσης αύξηση των ROS, αλλά Ν-2- ενισχυμένη ROS ήταν πολύ μεγαλύτερη από ό, τι άλλες ενώσεις (Συμπληρωματικές Εικ. S3). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ισχυρή αποτελεσματικότητα του Ν-2 σε διάφορους τύπους καρκινικών κυττάρων οφείλεται στο συνδυασμό πολλών παραγόντων που στοχεύουν δύο βασικές οδούς στα κύτταρα του όγκου. Οι ομοιότητες και οι διαφορές μεταξύ των QC, 9AA, Dox, ΡΙΤΑ, Nurtlin-3, β-φαινυλαιθυλ-ισοθειοκυανικό (PEIC) και Ν-2 συνοψίστηκαν στο συμπληρωματικό σχήμα. S5.

Συνοπτικά, η νέα μικρό μόριο Ν-2 είναι ένα δισθενές αντικαρκινικός παράγοντας που έχει μια ισχυρότερη αποτελεσματικότητα σε σχέση με άλλες προηγουμένως ταυτοποιημένα μικρά μόρια. Ν-2 έχει τη δυνατότητα για τη θεραπεία ποικίλων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που ανθεκτικά σε τρέχουσες θεραπείες. Η μελέτη αυτή παρέχει επίσης μηχανιστικές γνώσεις σχετικά με το μοριακό μηχανισμό δράσης των άλλων γνωστών επαγωγέων ρ53 όπως PIP, 9AA-1, και 9AA-2 και τονίζει την πιθανή χρήση αυτών των ενώσεων ως αντι-φλεγμονώδεις παράγοντες.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας, επιμολύνσεις, και προσδιορισμούς λουσιφεράσης

HCT116, C6, B16F10, Α549, U937 και Lewis καρκίνωμα του πνεύμονα κυττάρων (LLC) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection και HCT116 null κύτταρα ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Dr. Bert Vogelstein [57]. Η460, Η2009, SW480, Jurkat και SH-SY5Y κύτταρα ελήφθησαν από κορεατική τράπεζα κυτταρική σειρά (Σεούλ, Κορέα). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640, συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS), 120 μg /ml πενικιλλίνη, και 200 ​​μg /ml στρεπτομυκίνη, και επωάστηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για σταθερή έκφραση του PNF-κΒ-Luc και pp53-Luc φορείς (Clontech, Palo Alto, CA, USA), την ίδια μέθοδο όπως παροδική επιμόλυνση χρησιμοποιήθηκε εκτός τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με pcDNA3.1 (+) σε μία μοριακή αναλογία 10:01. Σταθερό αποικίες επιλέχθηκαν με 1000 ng /mL του G418 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) και ανεξάρτητες αποικίες μεταφέρθηκαν σε πλάκα 24 φρεατίων. Για να εξεταστεί ΝΡ-κΒ διαμεσολαβούμενη ή p53-μεσολάβηση μεταγραφικό δραστηριότητες, παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα και θετικοί κλώνοι αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας ανταποκριτή λουσιφεράσης Promega σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Promega, West Virginia, USA). Θετικοί κλώνοι διατηρήθηκαν σε παρουσία 500 ng /mL G418. Λουσιφεράσης σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο (Victor 5, Perkin Elmer Wallac, Waltham, ΜΑ, USA).

Κυττάρου προσυμπτωματικό έλεγχο υψηλής απόδοσης (HTS) για την ταυτοποίηση μικρών μορίων τα οποία ενεργοποιούν ταυτόχρονα ρ53 και αναστέλλουν ΝΡ κΒ

για διαλογή μικρών μορίων που διαμορφώνουν ταυτόχρονα την ρ53 και οδούς ΝΡ-κΒ, δημιουργήσαμε μία κυτταρική σειρά αναφοράς C6 (που προέρχεται από γλοιώματος αρουραίου που φέρουν την άγριου τύπου ρ53) σταθερά επιμολυσμένα με ρ53 αποκρίνεται και NF-κΒ -responsive λουσιφεράσης γονίδια αναφοράς. Η ένωση βιβλιοθήκη αποτελείτο από 200000 χημικών που παρέχεται από το ChemBridge (San Diego, CA, USA), ChemDiv (San Diego, CA, USA), και Asinex (Μόσχα, Ρωσία) χημικές βιβλιοθήκες. Για τη διαλογή αυτές τις χημικές ουσίες, 1 × 10

4 ΝΡ-κΒ κύτταρα ανταποκριτού απλώθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας 384-φρεατίων πλαστικής πλάκας καλλιέργειας κυττάρων σε 40 μΐ DMEM μέσου που περιέχει 10% FBS. Μετά την επώαση όλη τη νύκτα, 0,1 μΙ των ενώσεων σε DMSO και 10 μΙ λιποπολυσακχαρίτες (LPS? Σε ϋΜΕΜ) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο σε μια τελική συγκέντρωση 10 μΜ ένωσης και 100 ng /ml LPS. Ίσες ποσότητες DMSO και παρθενολίδη χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί και θετικοί μάρτυρες αντίστοιχα.