Αφηρημένο

Η ενεργοποίηση του μονοπατιού PI3K σήματος /AKT είναι γνωστό κινητήρια δύναμη για την εξέλιξη σε ευνουχισμό-υποτροπιάζοντα καρκίνο του προστάτη (CR-CAP), το οποίο αποτελεί το μεγαλύτερο θανατηφόρο φαινότυπο της ΚΓΠ. Εδώ, έχουμε εντοπίσει χρησιμοποιώντας μια γονιδιωματική οθόνη shRNA τον /στόχου κατάντη ΑΚΤ-αδρανοποίηση PI3K, FOXO4, ως δυνητικός καταστολέας CaP μετάσταση. τα επίπεδα πρωτεΐνης FOXO4 αντιστρόφως συσχετίζεται με την επιθετική πιθανότητα ενός πάνελ ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών καπάκι, με μειωμένα επίπεδα mRNA που συσχετίζεται με αυξημένη συχνότητα εμφάνισης κλινικών μετάστασης. Knockdown (KD) των FOXO4 σε ανθρώπινα κύτταρα LNCaP προκαλεί αυξημένη εισβολή

in vitro

και λεμφαδένα (LN) μετάσταση

in vivo

χωρίς να επηρεάζει τους δείκτες του πολλαπλασιασμού ή της απόπτωσης. Αυξημένη Matrigel εισβολής βρέθηκε από KD της FOXO1 αλλά όχι FOXO3. Σύγκριση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων επηρεάζεται από FOXO4-KD σε LNCaP κύτταρα σε καλλιέργεια, σε πρωτογενείς όγκους και μεταστάσεις LN εντοπιστεί ένα πάνελ ρυθμίζεται προς τα πάνω γονίδια, συμπεριλαμβανομένων PIP, CAMK2N1, PLA2G16 και PGC, η οποία, αν χτυπηθεί κάτω από siRNA, θα μπορούσε να μειωθεί η αυξημένη ικανότητα εισβολής που συνδέονται με την ανεπάρκεια FOXO4. Παρά το γεγονός ότι μόνο μερικά από αυτά τα γονίδια κωδικοποιούν θέσεις πρόσδεσης υποκινητή FOXO, είναι όλα RUNX2 επαγόμενο, και σύνδεση με τον υποκινητή PIP RUNX2 αυξάνεται σε κύτταρα FOXO4-KD. Πράγματι, η αναγκαστική έκφραση FOXO4 ανέτρεψε την αύξηση της εισβολής των κυττάρων LNCaP /shFOXO4? η αναγκαστική έκφραση FOXO4 δεν μετέβαλε τα επίπεδα της πρωτεΐνης RUNX2, όμως μειωμένη σύνδεση RUNX2 στον υποκινητή PIP, με αποτέλεσμα PIP αρνητική ρύθμιση. Τέλος, υπήρξε ένας συσχετισμός μεταξύ FOXO4, αλλά όχι FOXO1 ή FOXO3, προς τα κάτω ρύθμιση και μειωμένη μετάσταση επιβίωση χωρίς σε ανθρώπους ασθενείς με καπάκι. Τα δεδομένα μας υποδεικνύουν έντονα ότι η αυξημένη PI3K /AKT μεσολάβηση μεταστατικό εισβολής στο Cap συνδέεται με την απώλεια FOXO4, και ότι οι μηχανισμοί για να προκαλέσει FOXO4 επανέκφραση μπορεί να καταστείλει CaP μεταστατικό επιθετικότητα

Παράθεση:. Su Β, Gao L, Baranowski C, Gillard Β, Wang J, Ransom R, et al. (2014) ένα γονιδίωμα-Wide Screen RNAi Προσδιορίζει FOXO4 ως μετάσταση-κατασταλτικά μέσα καταπολεμήσεως του PI3K /AKT σηματοδοτικό μονοπάτι στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 9 (7): e101411. doi: 10.1371 /journal.pone.0101411

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 14 Απρ 2014? Αποδεκτές: 5 Ιούν 2014? Δημοσιεύθηκε: 1 Ιουλίου 2014

Copyright: © 2014 Su et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και. δεδομένων των μικροσυστοιχιών έχει κατατεθεί στην Omnibus γονιδιακής έκφρασης υπό τον αριθμό ένταξης GSE58403

Χρηματοδότηση:. IHG υποστήριξε Υπουργείο Άμυνας, (www.army.mil) χορηγεί PC040256 και PC061246, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (www.cancer .gov) χορηγεί CA94108 (IHG), και το Εθνικό Αντικαρκινικό Κέντρο υποστήριξης Grant 2P30 CA016056. BS υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας Νο 81272380. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δήλωσε ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (ΚΑΠ) παραμένει η πιο διαγνωστεί μη-δερματικό καρκίνο και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στις ΗΠΑ άνδρες [1]. Τα αρχικά στάδια της CaP ρυθμίζεται από ανδρογόνα, έτσι, θεραπεία στέρησης ανδρογόνων υπήρξε ο στυλοβάτης της θεραπείας για τον καρκίνο του προστάτη προοδευτικής. Οι περισσότεροι ασθενείς αναπόφευκτα αποτύχει αυτή τη θεραπεία, προχωρούν σε ευνουχισμό-υποτροπιάζοντα καρκίνο του προστάτη (CR-CAP) συνήθως παρουσιάζουν ως οστών ή των λεμφαδένων μεταστάσεων των οποίων η ανάπτυξη εξαρτάται από την παρατεταμένη υποδοχέα ανδρογόνων (AR) σηματοδότησης [2]. Πράγματι, η στόχευση του CR-Cap με πιο συγκεκριμένο αντι-ανδρογόνα ή AR ανταγωνιστές προσέφερε σημαντική, αλλά παροδική, η κλινική αποτελεσματικότητα, και η αντίσταση εξακολουθεί να συνεπάγεται την εξάρτηση AR, αν και περιλαμβάνει μεταλλάξεις AR ή υπερέκφραση [3] – [5].

η ενεργοποίηση της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης-3-κινάση (PI3K) /μονοπατιού AKT είναι μια σημαντική συμβολή στην ΚΓΠ εξέλιξη [6], [7] ότι το 42% των πρωτογενών βλαβών ΚΓΠ και το 100% των μεταστατικών όγκων παρουσιάζουν μεταβολές (μεταλλάξεις /διαγραφές, αριθμό αντιγράφων παραλλαγές, διαφορική γονιδιακή έκφραση) σε ένα ή περισσότερα συστατικά [8]. Αυτό έχει οδηγήσει σε πολλαπλές κλινικές δοκιμές στόχευσης ΡΙ3Κ, ΑΚΤ ή TORC1 σε συνδυασμό με πρότυπα χημειοθεραπείες (ταξάνες, Platins) ή ανταγωνιστές του άξονα ανδρογόνων ή AR [6]. Πράγματι, η ειδικού προστατικού απώλεια του ανταγωνιστή ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, ΡΤΕΝ, σε μοντέλα διαγονιδιακό ποντίκι είναι επαρκής για να επάγει ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία [9], [10].

Τα μέλη της οικογένειας FOXO, FOXO1, FOXO3a και FOXO4 , οι πανταχού-εκφράζονται παράγοντες μεταγραφής που λειτουργούν ως πρωτεΐνες καταστολής όγκου μέσω της ικανότητάς τους να καταστέλλουν την έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν πολλαπλασιαστικής, την επιβίωση ή αντι-διαφοροποίηση λειτουργίες [11], [12]. έχουν ρόλους για τα μέλη FOXO στην καταστολή της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη έχουν περιγραφεί. Για παράδειγμα, απαλοιφή FOXO1 σε 13q14 σχετίζεται με ανδρογόνα και AR-ανεξάρτητο πολλαπλασιασμό [13]. ΑΚΤ, η δραστηριότητα των οποίων αυξήσεις στην εξέλιξη CaP [7], φωσφορυλιώνει άμεσα μέλη της οικογένειας FOXO, ανταγωνίζεται με τον τρόπο αυτό τη λειτουργία τους μέσω της προώθησης σύνδεσης με πρωτεΐνες 14-3-3 και την πρόληψη πυρηνική μετατόπιση τους [14], που οδηγεί σε ubiquitylation μεσολάβηση τους αποικοδόμησης πρωτεασώματος [ ,,,0],15]. Η απώλεια FOXO3a προάγει σχηματισμό καρκίνο στο μοντέλο ποντικού καρκίνου του προστάτη TRAMP [16], ενώ η προς τα πάνω ρύθμιση ή την ενεργοποίηση των πρωτεϊνών FOXO οδηγεί σε διακοπή αύξησης και απόπτωση [17] – [19]. Μια μελέτη από Zhang et al. [20] δείχνει ότι FOXO1 αναστέλλει την κινητικότητα CaP κυττάρων και εισβολής εμποδίζοντας RUNX2 από δέσμευση και τη μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων εξέλιξη, όπως

OP, IL8, VEGF

και

ΜΜΡ13

. Παρά το γεγονός ότι ορισμένες περιττές ρόλους για πρωτεΐνες FOXO συνάγεται από τη διαπίστωση ότι οι αυθόρμητες θυμικό λεμφώματα και συστηματική αιμαγγειώματα που προκαλείται μόνο από τη συνδυασμένη διαγραφή FOXO1, FOXO3 και FOXO4 [21], υπάρχουν αποδεικτικά στοιχεία από μελέτες χρωματίνη ανοσοκαθίζησης-αλληλουχίας (τσιπ επόμενα) για FOXO1 και FOXO3a των κοινών και μη επικαλυπτόμενα στόχους γονίδιο [22], [23]. Για την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη, τα κοινά ή διακριτούς ρόλους για πρωτεΐνες FOXO παραμένουν ασαφείς.

Για να ταυτοποιηθούν γονίδια που ανταγωνίζονται CaP μετάσταση, τα ανθρώπινα κύτταρα LNCaP, τα οποία εμφανίζουν αδύναμο διεισδυτικότητα, μολύνθηκαν με φακοϊό κωδικοποιημένα γονιδιωματική shRNA βιβλιοθήκη και στη συνέχεια επιλέγονται για εξαιρετικά μεταστατικών κυττάρων σε μία δοκιμασία θαλάμου Boyden Matrigel επικαλυμμένα. Τα δεδομένα μας υποδεικνύουν έντονα ότι FOXO4 καταστέλλει μεταστατικό εισβολής εμποδίζοντας RUNX2 από την ενεργοποίηση μια ομάδα των προ-μεταστατικό γονίδια, συμπεριλαμβανομένων

PIP, PGC, CAMK2N1

και

PLA2G16

. Το εύρημα ότι FOXO4 μειορρύθμιση συσχετίζεται με γρηγορότερη έναρξη μεταστατική νόσο σε ασθενείς CaP υποδηλώνει σαφώς ότι CaP μετάσταση θα μπορούσε να ανταγωνίζεται με την επανενεργοποίηση έκφραση FOXO4 ή με την αναστολή της λειτουργίας RUNX2.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και αντιδραστήρια χρησιμοποιήθηκαν

Τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα (Ab): πολυκλωνικά κουνελιού ειδικό για FOXO1, FOXO3, FOXO4, διασπασμένη κασπάση 3, GFP (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ)? μονοκλωνικών αντισωμάτων ποντικού (mAb) περιλαμβάνουν ΗΑ, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), Myc (Applied Βιολογικών Υλικών, Richmond, BC, Καναδάς), και Ki67 (Thermo Scientific /Pierce, Rockford, IL).

Κυτταροκαλλιέργεια

p> (2505 ATCC CRL) κύτταρα

2. κύτταρα DU145 (ATCC ΗΤΒ-81) και ΗΕΚ293Τ (ATCC CRL-3216) καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS. LNCaP μολύνθηκαν με κλάσματα του ΑΠΟΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ (OpenBiosystems) συγκεντρώθηκαν pGIPZ lentivirus βιβλιοθήκη που κωδικοποιεί την ανθρώπινη γονιδιωματική Τα siRNAs (13.650 γονίδια στοχεύουν σε 7 πισίνες του 9750 shRNA κλώνων /πισίνα) σε μια μόλυνση πολλαπλότητα-of-1 (RPCI shRNA πυρήνα, Irwin Gelman, Διευθυντής), και στη συνέχεια επιλέγονται για πουρομυκίνη (2: g /ml) αντίσταση. Πουρομυκίνη-ανθεκτικά κύτταρα μολυσμένα με άδειο pGIPZ μόνη χρησίμευσαν ως αρνητικός μάρτυρας.

siRNA επιμόλυνση

Συνθετικά ON-TARGETplus SMARTpool siRNA ειδικό για FOXO4, FOXO1 και FOXO3, siCONTROL nonsilence siRNA (NS-siRNA ), και DHarmaFECT-1 αντιδραστήριο επιμόλυνσης αγοράστηκαν από Dharmacon (Lafayette, CO). LNCaP κύτταρα απλώθηκαν σε ίσες πυκνότητες σε πλάκες των 6-φρεατίων (5 χ 10

4 ανά φρεάτιο) όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ NS-siRNA ή FOXO ειδικό siRNA για 24 ώρες χρησιμοποιώντας DharmaFECT1 ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

MTS της κυτταρικής ανάπτυξης δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων LNCaP σταθερώς μολυσμένα με pGIPZ -FOXO4 shRNA ή pGIPZ-NS-shRNA, ή παροδικά επιμολυσμένα με FOXO4- ή NS-siRNA αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία MTS (Promega, Madison, WI) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. δοκιμασία MTS μετρά την αποκατάσταση του 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο (MTS) προς φορμαζάνη από μεταβολικώς δραστικά κύτταρα.

Ανοσοστύπωμα (ΙΒ) ανάλυση

τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA (10 mM Tris, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 8% γλυκερόλη, 1% Triton Χ-100, 0,1 % SDS, 0,5% δεοξυχολικό νάτριο, 10 mM Na

3VO4, 1 mM NaF, Complete κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)). 40 μg ολικής πρωτεΐνης /δείγμα διαχωρίστηκε με SDS-PAGE, κηλιδώθηκαν πάνω σε μεμβράνες πολυβινυλιδενο φθορίδιο που αποκλείστηκαν για 30 λεπτά με 5% αλβουμίνη βόειου ορού (Sigma) σε 1 χ TBS /T (0.1% Tween-20 σε ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα ) και, στη συνέχεια, ανιχνεύθηκαν όπως υποδεικνύεται. Ψηφιακής απεικόνισης και του σήματος ποσοτικοποίηση διεξήχθησαν σε Chemi-Genius

2 Βιο-Imager (Syngene, Frederick, MD) χρησιμοποιώντας το λογισμικό GeneTools.

Η παροδική επιμόλυνση

pFOXO4-GFP ή pFOXO4- TM-GFP, με υποκαταστάσεις Αία στις τρεις ΑΚΤ θέσεις φωσφορυλίωσης (ευγενώς από Stefanie Dimmeler, Πανεπιστήμιο Φρανκφούρτη, Γερμανία) επιμολύνθηκαν παροδικά σε CWR22Rv1. Myc-wtFOXO4 πλασμίδιο (ευγενώς από Zhiping Liu, UT Southwestern Medical Center) συν-επιμολύνθηκαν παροδικά με pEGFP DNA (Clontech /Takara, Mountainview, CA) σε κύτταρα CWR22Rv1 χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τον κατασκευαστή συστάσεις, και στη συνέχεια επωάστηκαν για 40 ώρες. GFP θετικά κύτταρα βαθμολογήθηκαν για την εισβολή και

in situ

zymography. Για ανάλυση CHIP-qPCR, κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν παροδικά με ΗΑ-RUNX2 (ευγενώς από Jianmin Zhang, Roswell Park Cancer Institute), ΗΑ-RUNX2 συν Μγο-FOXO4, ή κενό φορέα.

δοκιμασίας εισβολή και την επιλογή εισβαλλόντων κλώνων

Τροποποιημένο δοκιμασίες θαλάμου Boyden διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24] ξεκινώντας με 5 × 10

μορφή 4 κύτταρα /5 φρεατίων. Οι τιμές για τη μετανάστευση ελήφθησαν μετρώντας τουλάχιστον 10 κύτταρα σε 6 πεδία ανά μεμβράνη (στόχος x20) και ο μέσος όρος για τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα κύτταρα με αυξημένη διεισδυτικότητα Matrigel απομονώθηκαν ακόλουθες τέσσερις γύρους των διαδοχικών προσδιορισμών εισβολής. Συγκεκριμένα, εισβάλλοντα κύτταρα (προσκολλάται στο κάτω μέρος της επικοινωνούντα μεμβρανών) απομακρύνθηκαν με θρυψινοποίηση, ομαδοποιήθηκαν με βάση τις μονάδες shRNA, τοποθετήθηκαν σε 6-φρεατίων, και μετά από την επέκταση, επανα-υποβλήθηκαν σε προσδιορισμούς εισβολής. Μετά από τρεις γύρους, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν αραιά σε δίσκους 10 εκ, και μετά από τον πολλαπλασιασμό και την απομόνωση αποικιών, γραμμωτών κωδικών ήταν Sanger προσδιορισμό αλληλουχίας (RPCI Genomics κοινόχρηστο πόρο πυρήνα, Irwin Gelman-Διευθυντής) από απομονωμένο DNA χρησιμοποιώντας πλευρικές ζεύγη εκκινητών PCR, F: 5 ‘ – ACGTCGAGGTGCCCGAAGGA-3 ‘και R: 5′-AAGCAGCGTATCCACATAGCGT-3′ ή χρησιμοποιώντας την άμεση εναρκτήρα αλληλούχησης 5’-GCATTAAAGCAGCGTATC-3 ‘. LNCaP [φορέα] ή LNCaP [shFOXO4] κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με 1: g το καθένα από pGIPZ λεντοϊού shRNA κλώνους (GFP που εκφράζουν) ειδικά για PIP (ένταξη # NM_002652.2? Κλώνοι V2LHS170040 και V2LHS170041), CAMK2N1 (προσχώρηση # NM_018584.5 , κλώνοι V2HS176164, V2HS176163, V2HS176165), PLA2G16 (προσχώρηση # NM_007069.3, clonesV2LHS_253144, V2HS199589), ΔΕΠΑ (προσχώρηση # NM_002630.3, κλώνος V2LHS169912) ή RUNX2 (προσχώρηση # NM_004348, κλώνοι V2LHS3151, V2LHS15062, V2LHS15065, V2LHS15066, V2LHS223856 , V2LHS 224628), ή άδειο pGIPZ φορέα ελέγχου (OpenBiosystems) αξιολογήθηκαν για επεμβατικές δυνατότητες.

In situ

zymography

Γυάλινες καλυπτρίδες επικαλύπτονται με 0,2 mg /ml Όρεγκον Πράσινο 488-συζευγμένο ζελατίνη, διασυνδεδεμένη σε 0.5% γλουταραλδεΰδη για 15 λεπτά στους 4 ° C, και επωάστηκαν με 5 mg /ml NaBH

4 για 3 λεπτά. Οι καλυπτρίδες στη συνέχεια απολυμάνθηκαν με 70% EtOH για 15 λεπτά και πλύθηκαν σε μέσα ελεύθερα ορού για 1 ώρα στους 37 ° C. Τα κύτταρα απλώθηκαν σε καλυπτρίδες, και επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες, σταθεροποιήθηκαν για 10 λεπτά με παγωμένο 60% ακετόνη /3,7% παραφορμαλδεϋδη σε PBS, αποκλείστηκαν με 3% άπαχο ξηρό γάλα σε PBS για 30 λεπτά σε RT. Myc-FOXO4 βάφτηκε με αντι-Μγο (1:500), και οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (Invitrogen? 1:500), που ακολουθείται από ΡΙΤΟ-συζευγμένο γίδινο αντι-ποντικού IgG (1:500? Chemicon, Temecula, CA ). Φθορίζουσες εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon TE2000-Ε ανεστραμμένο μικροσκόπιο εφοδιασμένο με Roper CoolSnap HQ CCD κάμερα. Εισβολής με μέτρηση της μέσης απώλειας περιοχή FITC-ζελατίνης σε διαφάνειες τριπλούν

ορθοτοπική μετάσταση μοντέλο

ορθοτοπική ενέσεις του προστάτη σε ραχιαία λοβούς των 10

6 κύτταρα σε 50:. L PBS σε αρσενικούς γυμνούς ποντικούς ενσωματωμένα σε λαγόνες τους με σφαιρίδια τεστοστερόνη διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Μετά από 10 εβδομάδες, τα ποντίκια θανατώθηκαν και ελέγχθηκαν για GFP φθορισμό (Lightools Research, Encinitas, CA) σε πρωτογενείς όγκους και σε περιφερικά όργανα. Όλα τα πειράματα σε ζώα έγιναν υπό την επίβλεψη της Επιτροπής Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Roswell Park Cancer Institute κάτω από εγκεκριμένο πρωτόκολλο 1177M. Αναισθησία εισπνεόμενα Αλοθάνη σε ισχύ. Η ευθανασία έγινε δια ασφυξίας με CO2 ακολουθούμενη από αυχενική εξάρθρωση.

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμισμένη φορμαλίνη για 24 ώρες πριν από την επεξεργασία. Σταθερή ιστοί εγκλείστηκαν σε παραφίνη και τομές των 5: m. Διαφάνειες ήταν de-parafinized σε ξυλόλιο και στη συνέχεια ενυδατώνεται σε διαβαθμισμένες αλκοόλες που ακολουθείται από αναπτυξιακής δυσπλασίας του ισχίου

2O. Τα πλακίδια επωάστηκαν σε 1χ ρΗ 6 ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού (Invitrogen Cat # 00-5000) για 20 λεπτά και στη συνέχεια σε 3% Η

2O

2 για 15 λεπτά. Τα πλακίδια αποκλείστηκαν με 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας για 30 λεπτά, ακολουθούμενο από αβιδίνη /βιοτίνη μπλοκ (Vector Labs Cat # SP-2001). Πρωτογενής Abs να Ki67 (1:500), GFP (1:50) ή κασπάσης 3 (1:200) αραιώθηκαν σε διάλυμα BSA 1% και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT), που ακολουθείται από επώαση με βιοτινυλιωμένη κατσίκας αντι Κουνέλι δευτερογενή Ab (Cell Signaling # 9661 Cat) για 15 λεπτά. Για την ενίσχυση του σήματος, το αντιδραστήριο ABC (Vector Labs Cat #PK 6100) εφαρμόστηκε για 30 λεπτά, που ακολουθείται από επώαση με υπόστρωμα DAB (Dako Cat # K3467) για 5 λεπτά και αντίθετη χρώση με τροποποιημένη Harris Αιματοξυλίνη (Richard-Allan Επιστημονική Cat # 72704) για 20 δευτερόλεπτα. Διαφάνειες πλύθηκαν εκτεταμένα σε PBS, σφραγίζονται με καλυπτρίδες και σαρώνονται σε Aperio ScanScope CS, χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageScope (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA).

array γονιδιακή έκφραση

Το συνολικό RNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή από έξι δείγματα: LNCaP [shFOXO4] κυτταρική γραμμή, LNCaP [pGIPZ ελέγχου] κυτταρική γραμμή, LNCaP [shFOXO4] πρωτοπαθούς όγκου, LNCaP [pGIPZ ελέγχου] πρωτοπαθούς όγκου, LNCaP [shFOXO4] λεμφαδένων μετάσταση και LNCaP [pGIPZ ελέγχου] λεμφαδένα μετάσταση. RNA δείγματα ποσοτικά χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο ND-1000 (Thermo Scientific /NanoDrop) και αξιολογήθηκαν για την υποβάθμιση χρησιμοποιώντας 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Δείγματα με RNA Ακεραιότητα Value (RIN) & gt? 7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση της σειράς γονιδιακής έκφρασης χρησιμοποιώντας τον ανθρώπινο ΗΤ-12 σε ολόκληρο το γονιδίωμα συστοιχία beadchip γονιδιακή έκφραση (V4) (Illumina, San Diego, CA). 500 ng ολικού RNA μετατράπηκε σε cDNA, που ακολουθείται από

in vitro μεταγραφή

να παράγει βιοτίνη σημασμένο cRNA χρησιμοποιώντας το Ambion Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion /Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 750 ng του επισημασμένου ανιχνευτές στη συνέχεια αναμιγνύεται με τα αντιδραστήρια υβριδισμού και υβριδοποιήθηκαν όλη τη νύχτα στους 58 ° C με τις BeadChips HT-12v4. Μετά το πλύσιμο και χρώση με Cy3-στρεπταβιδίνης, οι BeadChips απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Illumina iScan Reader για τη μέτρηση της έντασης φθορισμού σε κάθε ανιχνευτή. Η ένταση του σήματος αντιστοιχεί στην ποσότητα του αντίστοιχου mRNA στο αρχικό δείγμα. αρχεία δεδομένων BeadChip αναλύθηκαν με GenomeStudio (v2011.1? Illumina) μονάδα γονιδιακής έκφρασης (v1.9.0) να αναφέρει και τις δύο un-κανονικοποιημένη και ποσοστημόριο κανονικοποιούνται, φόντο διορθωμένη επίπεδα σήματος γονιδιακής έκφρασης. Τα επίπεδα σήμα γονιδιακής έκφρασης αναλύθηκαν στη συνέχεια χρησιμοποιώντας το Bioconductor πακέτα Lumi και Limma προγράμματα (https://www.bioconductor.org). Γονίδια με & gt?. Ταυτοποιήθηκαν 2 φορές αλλαγές έκφραση

Ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφάσης (qRT-PCR)

Ολικό RNA (1 μg /αντίδραση) απομονώθηκε με τη χρήση αντιδραστηρίου ΤπζοΙ υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή αντιδράσεις με τυχαίους εκκινητές εξαμερών χρησιμοποιώντας το υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription kit (Life Technologies /Applied Biosystems). qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα σύστημα ανίχνευσης 7900HT Sequence (Life Technologies /Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας FastStart καθολική SYBR Green κύριο κιτ (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αλληλουχίες των εκκινητών (Πίνακας S2) σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer -BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο οικοκυρική για τα qRT-PCR αντιδράσεις. Κάθε δοκιμή έγινε σε τριπλή αντιγραφή και η

-ΔΔCt μέθοδος 2 [26] χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της έκφρασης των γονιδίων.

συνανοσοκαθίζησης (Co-IP) των FOXO4 και RUNX2

κύτταρα ΗΕΚ293Τ συν-επιμολύνθηκαν με Μγο-FOXO4 συν HA-RUNX2, ΗΑ-RUNX2 μόνα ή κενό φορέα μόνο. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA και IP διεξήχθη χρησιμοποιώντας ΗΑ Ab, που ακολουθείται από ΙΒ με την υποδεικνυόμενη Ab, ή IP διεξήχθη χρησιμοποιώντας Myc Ab, που ακολουθείται από IB

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας). – qPCR

δοκιμασίες ChIP εκτελέστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως (9) με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, LNCaP και κυττάρων HEK93T αναπτύχθηκαν σε πιάτα 10-cm (80-90% συρροή) συνδέθηκαν σταυρωτά με την προσθήκη 10% φορμαλδεΰδης σε μέσα καλλιέργειας για 6-7 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, ακολουθούμενο από την προσθήκη γλυκίνης σε 125 mM. Χρωματίνης υποβλήθηκε σε υπερήχους για να αποδώσει 100-300 θραύσματα bp σε SDS ρυθμιστικού λύσης (0.1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό, ρΗ 8.1) που περιέχει 1 mM φαινυλομεθανοσουλφονυλο φθόριο και μείγμα αναστολέα πρωτεάσης. (Roche Applied Science) μετά από προ-καθαρισμό με πρωτεΐνη Α /G μαγνητικά σφαιρίδια (Millipore), χρωματίνη επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C με 5 μg του επομένου Ab όπως υποδεικνύεται: ΗΑ, RUNX2, ή κανονική IgG ποντικού. Ανοσοσυμπλέγματα κατεδαφίστηκαν με την πρωτεΐνη Α /μαγνητικά σφαιρίδια. Οι διασταυρώσεις τόσο για chip και εισόδου DNA αντιστράφηκαν στους 65 ° C για 5 ώρες και οι πρωτεΐνες υπέστησαν πέψη με πρωτεϊνάση Κ, και το DNA ανακτήθηκε με εκχύλιση φαινόλης /χλωροφορμίου και καταβύθιση αιθανόλης με 20 μg γλυκογόνου ως φορέα όπως περιγράφεται [27]. Καταβυθισμένες θραύσματα ποσοτικά με qPCR, και οι τιμές ποσοστού εισόδου διορθώθηκαν για αρνητική περιοχές ελέγχου, όπου ενδείκνυται. Εναρκτήρες για PCR ενίσχυση του PIP όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28].

Στατιστικές αναλύσεις

Στατιστική σημασίες μεταξύ ομάδων προσδιορίστηκαν με t-test δύο ουρών μαθητή, με γραμμές σφάλματος που δηλώνει S.E.M. Μια τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Ένα γονιδίωμα-ευρεία οθόνη shRNA να εντοπίσει γονίδια καταστολής υποψήφιος μετάσταση

Για να κατανοήσουμε τις γενετικές συνιστώσες. αναγκαίες για μετάσταση, χρησιμοποιήσαμε ένα υψηλής απόδοσης προσέγγιση διαλογής shRNA για την ταυτοποίηση γονιδίων ικανά να καταστέλλουν Matrigel διεισδυτικότητας, μια παράμετρο της μεταστατικής καταρράκτη [29]. LNCaP κύτταρα, τα οποία εμφανίζουν χαμηλή επιθετική πιθανότητα [30], μολύνθηκαν με ενότητες pGIPZ (GFP που εκφράζουν) φακοϊούς ενότητες κωδικοποίηση του ανθρώπινου γενωμικού Τα siRNAs σε ΜΟΙ = 0.7 (για να ελαχιστοποιηθεί κύτταρα μεταδιεγείρονται με πολλαπλούς Τα siRNAs), και μετά την επιλογή για πουρομυκίνη αντίσταση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε τριπλούν Matrigel Boyden δοκιμασίες εισβολή θάλαμο. Εισβάλλοντας κύτταρα (προσκολλημένο στο κάτω μέρος των transwells μεμβρανών) απομακρύνθηκαν με θρυψινοποίηση, συνενώθηκαν μεταξύ τριπλούν, επεκτάθηκαν σε καλλιέργεια και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε δύο ακόμη γύρους παρόμοιες δοκιμασίες εισβολής. LNCaP μολυνθεί με (LNCaP κύτταρα [διάνυσμα]) άδειο pGIPZ έτρεξαν παράλληλα να αξιολογεί κάθε επιλογή των αυθόρμητων αύξηση διεισδυτικότητα (Εικ. 1Α). Υποθέσαμε ότι τα κύτταρα με την αύξηση της ικανότητα εισβολής που προκύπτει από την απώλεια μίας λειτουργίας καταστολέα θα εμπλουτιστεί με διαδοχικούς γύρους δοκιμασίας. Μετά από τρεις κύκλους επιλογής, οι αποικίες απομονώθηκαν από δομοστοιχεία 2, 3, 6, και 7, τα οποία έδειξαν αύξηση ικανότητα εισβολής σε σχέση με το επίπεδο Γύρος 3 του LNCaP [διάνυσμα] ελέγχους (Σχ. 1Β). Η ανάλυση της αλληλουχίας (bar code και την ακολουθία shRNA) και BLAST βάση δεδομένων αναζήτησης (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) προσδιορίζονται πολλαπλές κλώνους κουτί forkhead Ο4 (

FOXO4

), κινεσίνης μέλος της οικογένειας 3Β (

KIF3B

), το μόριο μεταγωγής σήματος προσαρμογέα (τομέας SH3 και ΙΤΑΜ μοτίβο) 1 (

ΣΤΑΜ

), και ο Homo sapiens φορέα διαλυμένης ουσίας οικογένειας 17 (

SLC17A4

) (Πίνακας S1), που αντιπροσωπεύουν από κοινού & gt? 94% του συνόλου των κλώνων αλληλουχία. Δεδομένης της αυξανόμενης καταλάβετε για τους ρόλους για πρωτεΐνες FOXO ως αρνητικοί ρυθμιστές της εξέλιξης του καρκίνου [31], [32], και μια πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι πάνω ρύθμιση των ANXA8 από FOXO4 αναστέλλει το κύτταρο μεταναστευτικά και μεταστατικής χαρακτηριστικά των κυττάρων χολαγγειοκαρκίνωμα [33], εστιάσαμε τον πιθανό ρόλο των FOXO4 ως πιθανό καταστολέα μετάστασης.

Α. Σχηματική σύνοψη της οθόνης. Μια προσέγγιση διαλογής shRNA υψηλής απόδοσης χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση γονιδίων των οποίων επάγεται knockdown εισβολή όγκου, μία διεργασία απαραίτητη για τη μετάσταση. Εξαιρετικά επιλεγμένα επεμβατική παραλλαγές των LNCaP χρησιμοποιούσαν επικαλυμμένα με Matrigel δοκιμασίες εισβολής θάλαμο Boyden. B. Αυξημένη διεισδυτικότητα επάγεται από πισίνες του shRNA κλώνων πάνω από 3 γύρους επιλογής.

Άνω πάνελ

: αντιπροσωπευτικό εικόνες των μεταστατικών κυττάρων που εκφράζουν GFP από τον έλεγχο (φορέα pGIPZ) ή shRNA (κλάσμα # 2) μετά από τρεις γύρους επιλογής.

Κάτω πάνελ

:. Επεμβατική δυναμικό των συγκεντρωμένων κυττάρων σε κάθε μία από 7 ενότητες μόλυνση πάνω από τρεις γύρους επιλογής, σε σύγκριση με κύτταρα LNCaP [διάνυσμα]

Η

κάτω ρύθμιση των FOXO4 σε ανθρώπινο μεταστατικό κυτταρικές σειρές ΚΓΠ και μεταστατικούς ιστούς

Για να ελέγξετε αν η έκφραση του γονιδίου FOXO4 συσχετίζεται με τη διεισδυτικότητα των κυττάρων καπάκι, πρέπει πρώτα σύγκριση έκφραση της πρωτεΐνης FOXO4 σε ένα πάνελ κυτταρικών σειρών καπάκι με διαφορετικές επεμβατικές και μεταστατικό δυναμικό. Υπήρχε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ Matrigel διεισδυτικότητα και τα επίπεδα πρωτεΐνης FOXO4 (Εικ. 2Α), ειδικά όταν συγκρίνονται LNCaP σε δύο παραλλαγές μεταστατικών, Ln3 και C4-2. Μία έρευνα της βάσης δεδομένων Oncomine (https://www.oncomine.org) αποκάλυψε ότι FOXO4 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω στο μεταστατικό CaP σε σύγκριση με πρωτοπαθή καρκίνο του τόπου ή /και φυσιολογικά δείγματα από δύο μεμονωμένες μελέτες (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, η ανάλυση των μεταστατικών περιπτώσεων καπάκι από τη μελέτη των Taylor et al. [8] στο

cbio

ιστοσελίδα (https://www.cbioportal.org/public-portal/) έδειξε ότι τα άτομα με FOXO4 ρύθμιση προς τα κάτω συσχετίζονται με μια πιο γρήγορη εμφάνιση μεταστάσεων σε σύγκριση με εκείνους που δεν έχουν αλλοιωμένη FOXO4 έκφραση (Σχ. 2C). Δεν υπήρξε καμία ένδειξη συσχετίζοντας FOXO4 μειορρύθμιση στη μετάσταση του καρκίνου του μαστού, αν και υπήρξε μια μικρή προς τα κάτω ρύθμιση σε μετάσταση καρκίνου του παχέος εντέρου (Εικ. S1), γεγονός που υποδηλώνει ότι οποιαδήποτε υποθετική μετάσταση καταστολέας λειτουργία με FOXO4 θα είναι τύπου ιστού ειδικό. επίπεδα FOXO1 επίσης μειωτικά στο Cap μετάστασης (Εικ. S2A), ωστόσο, δεν θα μπορούσαμε να καθορίσει αν η απώλεια FOXO1 συσχετίζεται με αυξημένη μετάστασης σε ασθενείς ΚΓΠ (Εικ. S2B) λόγω της underpowering λόγω του χαμηλού αριθμού των ασθενών. Σε αντίθεση, τα επίπεδα έκφρασης FOXO3 δεν έδειξε συσχέτιση με καπάκι μετάσταση (Σχ S2C & amp?. D).

Α. ΙΒ ανάλυση της έκφρασης FOXO4 στην ανθρώπινη CaP κυτταρικές σειρές (

πάνω πίνακα

), ποσοτικά και σε σύγκριση με τη σχετική εισβολής Matrigel στο

κάτω πίνακα

. Οι μπάρες σφάλματος, SE από τρία ανεξάρτητα ΙΒ αναλύσεις ποσοτικοποιηθεί με πυκνομετρία (για τα επίπεδα FOXO4) ή προσδιορισμούς εισβολής Matrigel. Το σχετικό επίπεδο FOXO4 σε DU145 ορίστηκε σε τιμή = 1 (διακεκομμένη γραμμή). Β Oncomine μελετά τα επίπεδα έκφρασης RNA FOXO4 στην καλοήθη υπερπλασία του προστάτη, πρωτοβάθμια τόπου (1 °) κάλυμμα ή μεταστάσεις (Μετς) από LaTulippe et al. [45] και Yu et al. [46]. ανάλυση οικόπεδο Γ Kaplan-Meier (https://www.cbioportal.org/public-portal/) της εμφάνισης μετάστασης έναντι του χρόνου για εμφάνιση σε 37 CaP περιπτώσεις μετάστασης από Taylor et al. [8], στην οποία 12 περιπτώσεις (32%) εμφανίζονται FOXO4 μειορύθμιση και συσχετίστηκε με μια πιο ταχεία εμφάνιση μεταστάσεων σε σύγκριση με τις 25 περιπτώσεις που δεν παρουσίασαν αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης FOXO4.

Η

απώλεια FOXO4 σε LNCaP κύτταρα ΚΓΠ συμβάλλει σε άκρως μεταστατικού δυναμικού

για να καθοριστεί εάν τα κάτω ρύθμιση FOXO4 συνέβαλαν στην αύξηση της διεισδυτικής ικανότητας των κυττάρων LNCaP, κύτταρα LNCaP ήταν σταθερώς μεταγωγή με φακοϊό κλώνους FOXO4 shRNA, διαφορετικό από εκείνο που εντοπίστηκαν στην αρχική οθόνη, ή επιμολυσμένα με siFOXO4, και αυτά τα κύτταρα, έναντι φορέα ή ως κωδικοποιημένο (SCR) siRNA μάρτυρες, δοκιμάστηκαν για διεισδυτικότητα. Η knockdown του FOXO4 με SH- ή siFOXO4 οδήγησε σε 2.5- σε αυξήσεις 4 φορές σε LNCaP διεισδυτικότητα (Εικ. 3Α). Αντιστρόφως, τα κύτταρα CWR22Rv1 συνδιαμολύνθηκαν παροδικά με pEGFP συν είτε wt-FOXO4 ή ιδιοσυστατικά ενεργού μεταλλάγματος FOXO4 (TM, για «τριπλή μετάλλαξη», i.e.- απώλεια των τριών θέσεων φωσφορυλίωσης ΑΚΤ) οδήγησε σε μειωμένη διεισδυτικότητα (Σχ. 3Β). Απώλεια FOXO4 από shRNA ή siRNA δεν είχε καμία επίδραση στα ποσοστά LNCaP πολλαπλασιασμό σε 2D καλλιέργειες (Εικ. S3A) γεγονός που υποδηλώνει ότι τα αυξημένα επίπεδα εισβολή μετά FOXO4 δεν οφείλονταν σε αλλαγές στα ποσοστά πολλαπλασιασμού. Επιπλέον, αναλύσαμε το πώς FOXO4 ελέγχει την ικανότητα εισβολής των κυττάρων εμβολιάζονται σε CaP Oregon Green 488-σημασμένο ζελατίνης επικαλυμμένες καλυπτρίδες. FOXO4 knockdown σε LNCaP οδήγησε σε αυξημένη εντοπισμένη πέψη του Oregon Green 488-σημασμένο ζελατίνη εξωκυτταρικής μήτρας σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν μη-ειδική shRNA (Σχ. 3C) ενώ η υπερέκφραση του Myc-FOXO4 σε κύτταρα CWR22Rv1 μειωμένη εντοπισμένη πέψη (Σχ. 3D).

Α. LNCaP κύτταρα σταθερώς μεταγωγή με shRNA ή παροδικά επιμολυσμένα με siRNA κατά FOXO4 (vs. κωδικοποιημένο έλεγχος) ελέγχθηκαν για διεισδυτικότητα. FOXO4 νοκ ντάουν αξιολογήθηκε από την IB (

πάνω πίνακα

) και η επίδρασή της στην Matrigel εισβολής ήταν ποσοτικά (

κάτω πίνακα

). Οι ράβδοι σφάλματος, S.E. τριπλών πειραμάτων. *, P & lt? 0,01. Β έκτοπη έκφραση της WT ή μόνιμα ενεργό (TM) FOXO4 μειώνεται CWR22Rv1 εισβολής. Έκτοπη FOXO4 αξιολογήθηκε από την IB (

πάνω πίνακα

) και η επίδρασή της στην Matrigel εισβολής ήταν ποσοτικά (

κάτω πίνακα

). Οι ράβδοι σφάλματος, S.E. τριπλών πειραμάτων. *, P & lt? 0,01. C. Η τοπική εισβολής των LNCaP [φορέα] (

ανώτερη σειρά

) έναντι LNCaP [shFOXO4] (

κάτω σειρά

) εκτιμήθηκε για τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Oregon Green 488 σημασμένο ζελατίνη, με κύτταρα επισημαίνονται με DAPI. Δ Η ίδια ανάλυση όπως στο Γ εκτός από τη σύγκριση CWR22Rv1 που εκφράζουν σταθερά φορέα ή Myc-FOXO4. Ε πνεύμονα, του ήπατος, των νεφρών και του LN από μεμονωμένα ποντίκια που έχουν καρκίνο με LNCaP [φορέα] (έλεγχος) ή LNCaP [shFOXO4] απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το ορατό φως (

πάνω πάνελ

) ή φθορισμού φως (

κάτω πίνακα

). Βέλη, LN και των νεφρών μεταστάσεις. ΣΤ Μεταστατικό LN βλάβες από LNCaP [shFOXO4] όγκουε ποντίκι βάφονται για την H & amp? Ε ή GFP (από την IHC). Τρίγωνα, παραδείγματα των μεταστατικών κυττάρων GFP-θετικά.

Η

Δεδομένου ότι τα μέλη της οικογένειας FOXO μοιραστώ μερικές περιττές λειτουργίες [31], αναλύσαμε τα επίπεδα FOXO1 και FOXO3 στα κύτταρα ΚΓΠ και δοκιμάστηκε η ικανότητά τους να ελέγχουν εισβολής. Σε αντίθεση με FOXO4, τα επίπεδα FOXO1 και FOXO3 φάνηκε να αυξηθεί κατά τα πιο επεμβατική παραλλαγές των LNCaP και PC-3 κύτταρα (Σχ S4A & amp?. Β). Είναι ενδιαφέρον, το νοκ ντάουν της FOXO1, αλλά δεν FOXO3, στα κύτταρα LNCaP που προκαλείται υψηλότερη εισβολής (Εικ. S4C), αλλά η αναγκαστική έκφραση είτε FOXO1 ή FOXO3 απέτυχε να μειώσει την ικανότητα εισβολής των κυττάρων CWR22Rv1 (Εικ. S4D). Έτσι, ενώ FOXO1 μπορεί να εμπλέκεται με LNCaP εισβολής, FOXO4 είναι τόσο ασχολούνται με και επαρκή για τον έλεγχο της εισβολής.

Στη συνέχεια δοκιμάστηκε αν FOXO4 νοκ ντάουν θα μπορούσε να προωθήσει την αυθόρμητη μετάσταση

in vivo

. Αρσενικοί γυμνοί ποντικοί ενσωματωμένο με σφαιρίδια τεστοστερόνη χρονικής απελευθέρωσης εγχύθηκαν σε ραχιαία λοβούς τους με LNCaP [διάνυσμα] ή LNCaP [shFOXO4] κύτταρα, και μετά από δέκα εβδομάδες, τα ποντίκια θανατώθηκαν και αναλύθηκαν για GFP φθορισμό ως δείκτης pGIPZ. Αν και τα LNCaP [shFOXO4] όγκους πρωτοβάθμιας ιστοσελίδα ήταν ελαφρώς μικρότερη από ό, τι εκείνες που προκαλούνται από κύτταρα LNCaP [φορέα], η διαφορά αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Εικ. S3b). Σημαντικά, δεν υπήρξε διαφορά στην σχετική έκφραση GFP τους (Εικ S3C.), Ή πολλαπλασιασμό ή απόπτωση συντελεστές τους

in vivo

βασίζονται σε Κί67 ή διασπώνται χρώση κασπάσης-3 IHC (Σχήματα S3D & amp?. Ε, αντίστοιχα) . FOXO4 knockdown είχε ως αποτέλεσμα την αυξημένη συχνότητα εμφάνισης macrometastases GFP που εκφράζουν στην τοπική λεμφαδένες παροχέτευσης (LN), νεφρό (Εικ. S3E) και των πνευμόνων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Πίνακας 1). Συγκεκριμένα, το 82% (9/11) της ομάδας shFOXO4 είχε LN μεταστάσεις, σε σύγκριση με το 31% (5/16) για την ομάδα ελέγχου? 27% (3/11) και 9,1% (1/11) στην ομάδα shFOXO4 είχε νεφρό και πνεύμονα μεταστάσεις, αντίστοιχα, ενώ μεταστάσεις βρέθηκαν σε κανένα (0/16) της ομάδας ελέγχου. Επιπλέον, επιβεβαίωσε ότι οι αλλοιώσεις LN εκφρασμένη πρωτεΐνη GFP χρησιμοποιώντας GFP-ειδικά IHC (Εικ. 3F).

Η

Ανάλυση των γονιδίων προ-μετάσταση FOXO4-ρυθμιζόμενη

Δεδομένου ότι FOXO πρωτεΐνες λειτουργούν ως μεταγραφικοί καταστολείς, ερευνήσαμε αν η αυξημένη διεισδυτικότητα μετά την απώλεια FOXO4 μπορεί να οφείλεται στην αύξηση της γονιδιακής έκφρασης προ-μετάσταση. Έτσι, η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος-ευρεία διεξήχθη σε LNCaP [φορέα] έναντι LNCaP [shFOXO4] καλλιεργημένα κύτταρα, οι όγκοι πρωτογενούς τόπου και μεταστάσεις LN. Εξόντωση FOXO4 σε καθένα από αυτά τα σύνολα δείγματος επιβεβαιώθηκε με ΙΒ (Εικ. S5A). Η ανάλυση αυτή εντοπίστηκαν 535 γονίδια των οποίων η έκφραση αλλάζει ≥1.5 φορές (Εικ. S5B). Από αυτά, 54 μεταβολές ήταν κοινή σε όλες τις τρεις δείγματα σετ (Σχ. 4Α, Σχ. S5c), και από αυτούς, 19 γονίδια (15 ρυθμίζεται προς τα πάνω, 4 μειωτικά) σχετίστηκαν με FOXO4 knockdown (Εικ. 4Β). Για να εστιάσουμε την ανάλυσή μας, θα αναλύονται από το λογισμικό Ingenuity IPA το οποίο του 19 γονιδίου υπογραφή συμμετείχε στις διαδικασίες της μετάστασης που σχετίζονται, όπως η κυτταρική κινητικότητα, εισβολής, χημειοταξία ή την επιβίωση των κυττάρων. Οκτώ γονίδια ρυθμισμένα προς τα πάνω σε shFOXO4 που σχετίζεται με μεταστάσεις LN (

PIP, CAMK2N1, PLA2G16, ALDH1L1, VCX, VCX3A, APP

, και

PGC

) αναγνωρίστηκαν ως δυνητικά εμπλέκονται στην μετάσταση (Εικ . 4C,

πάνω

).