Abstract

DLC2 (διαγράφονται σε καρκίνο του ήπατος 2), ένα Rho ΟΤΡάσης ενεργοποίησης πρωτεΐνης, είχε προηγουμένως δειχθεί ότι υποεκφράζεται σε ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα και έχει λειτουργίες ογκοκατασταλτικών σε μοντέλα καλλιέργειας κυττάρων. Δημιουργήσαμε DLC2-ανεπαρκή ποντίκια για να ερευνήσει το ρόλο καταστολέα όγκων του DLC2 σε ηπατοκαρκινογένεσης και τη λειτουργία του DLC2 in vivo. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι, σε αντίθεση με ομόλογο DLC1, η οποία είναι απαραίτητη για την εμβρυϊκή ανάπτυξη, DLC2 ήταν απαραίτητη για την εμβρυϊκή ανάπτυξη και DLC2-ανεπαρκή ποντίκια θα μπορούσε να επιβιώσει μέχρι την ενηλικίωσή τους. Επίσης, δεν τήρησε μια υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης του σχηματισμού ήπατος όγκου ή diethylnitrosamine (DEN) επαγόμενη ηπατοκαρκινογένεσης σε DLC2-ανεπαρκή ποντίκια. Ωστόσο, παρατηρήθηκε ότι DLC2-ανεπαρκή ποντίκια ήταν μικρότερες και είχαν λιγότερο λιπώδη ιστό από τους ποντικούς άγριου τύπου. Αυτοί οι φαινότυποι δεν ήταν λόγω της μείωσης του μεγέθους των κυττάρων ή ελάττωμα στο λιπογένεσης, όπως παρατηρείται στο 190Β RhoGAP ανεπάρκεια μοντέλο ποντικού. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η ανεπάρκεια σε DLC2 και μόνο δεν ενισχύει ηπατοκαρκινογένεσης

Παράθεση:. Yau ΝΑ, Leung THY, Lam S, Cheung ΤΗΣ, Tung EKK, Khong PL, et al. (2009) Διαγράφεται ήπατος Καρκίνος 2 (DLC2) Ήταν Ανταλλακτικά για την Ανάπτυξη και η έλλειψή του δεν επιβαρύνει ηπατοκαρκινογένεσης. PLoS ONE 4 (8): e6566. doi: 10.1371 /journal.pone.0006566

Επιμέλεια: Alfred Lewin, Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7η Απριλίου, 2009? Αποδεκτές: 10 Ιουλίου, 2009? Δημοσιεύθηκε: 10 του Αυγούστου του 2009

Copyright: © 2009 Yau et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Χονγκ Κονγκ Κονδυλίων Έρευνας του Συμβουλίου Γενικών Ταμείου Έρευνας (HKU 7436 /04M) και RGC Συνεργατική Ταμείου Έρευνας (HKU 1 /06C). I.O.L. Ng είναι Loke Yew Καθηγητής Παθολογίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι ένας πρωταρχικός κακοήθεια και είναι ένα από τα πιο κοινά καρκίνους στην Ασία και στην Αφρική. Η μόλυνση με ηπατίτιδα Β ή C λοίμωξη από τον ιό και την έκθεση σε αφλατοξίνη Β1 έχουν καλά τεκμηριωθεί ως τις κύριες αιτίες. Ωστόσο, οι υποκείμενες μοριακοί μηχανισμοί που οδηγούν στην ανάπτυξη και εξέλιξη του HCC παραμένουν ασαφή.

Η αδρανοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα των καρκινικών κυττάρων. Σε μια αναζήτηση για καταστολείς των όγκων που εμπλέκονται στην ηπατοκαρκινογένεσης, εντοπίσαμε ένα νέο γονίδιο

DLC2

(διαγράφονται σε καρκίνο του ήπατος 2) σχετικά με χρωμοσωμική περιοχή 13q12.3, που συχνά χάνεται στα ΕΑΣ [1]. Παρόμοια με ομόλογο DLC1 της, DLC2 υποεκφράζεται σε ανθρώπινα HCCs και έχει λειτουργίες ογκοκατασταλτικών σε καλλιεργημένα κύτταρα [1], [2].

DLC1 και DLC2 είναι Rho ΟΤΡάσης ενεργοποίησης πρωτεΐνες (διάκενα). Έχουν τρεις λειτουργικούς τομείς, μια καταλυτική περιοχή RhoGAP [1], [3], ένα στείρο α μοτίβο (SAM) περιοχή αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης [4], [5] και ένα αστέρι που σχετίζονται με λιπίδια μεταφορά δέσμευσης λιπιδίων (START) τομέα [6], [7]. Τα οικογενειακά GTPases Rho έχει 18 μέλη, μεταξύ των οποίων τα τρία καλά μελετηθεί εκπροσώπους, Rac1, RhoA και Cdc42. Αυτές οι μικρές GTPases ρυθμίζουν διάφορα μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης [8], [9]. Έχει προταθεί ότι οι πρωτεΐνες Rho παίζουν σημαντικό ρόλο στην ογκογόνο μετασχηματισμό που διαμεσολαβείται από Ras και άλλων ογκοπρωτεϊνών ρυθμίζοντας ακτίνης οργάνωση του κυτταροσκελετού, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την κυτταρική επιβίωση [10], [11]. Επίσης, διεγείρουν κυττάρου όγκου εισβολή και τη μετάσταση [9]. Rho ΟΤΡάσης ενεργοποίησης πρωτεΐνες (διάκενα) αδρανοποιούν τους με μετατροπή της δραστικής ΟΤΡ-δεσμευμένη κατάσταση στην ανενεργή GDP-δεσμευμένο ένα μέσω της ενεργοποίησης του εγγενούς δραστικότητας ΟΤΡάσης των πρωτεϊνών Rho. Διαφορές έχουν ως εκ τούτου προταθεί ως καταστολείς όγκων που εξουδετερώνουν την ογκογόνο δυναμικό των πρωτεϊνών Rho.

Υπήρξαν αρκετές γραμμές in vitro στοιχεία για να υποστηριχθεί η ογκοκατασταλτικό ρόλος αυτών των δύο πρωτεϊνών Rho GAP, DLC1 και DLC2 [ ,,,0],1], [2], [3], [5], [12], [13], [14], [15], [16]. Τα ζωικά μοντέλα τα οποία θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για να διερευνήσει τις λειτουργίες ογκοκατασταλτικό αυτών των δύο πρωτεϊνών είναι ακόμη περιορισμένη. Durkin et al. [17] δημιούργησε ένα DLC1 ανεπάρκεια μοντέλο ποντικού για τη μελέτη των βιολογικών λειτουργιών του DLC1. Ωστόσο, η ανεπάρκεια DLC1 οδηγεί σε εμβρυϊκή θνησιμότητα από midgestation. Sordella et al [18] έδειξε ότι τα έμβρυα δεν έχουν p190B RhoGAP ήταν περίπου 30% μικρότερη σε μέγεθος και προσκόμισε αποδεικτικά στοιχεία που να δείχνουν ότι αυτή η μείωση του μεγέθους του εμβρύου οφειλόταν σε μείωση του μεγέθους των κυττάρων. Απέδειξαν επίσης ότι ποντικού εμβρυϊκά ινοβλάστες που προέρχονται από τα έμβρυα αυτά ήταν ελαττωματικά στην αδιπογένεσης σε σύγκριση με τον αντίστοιχο άγριου τύπου [19].

Σε αυτή τη μελέτη, δημιουργήσαμε DLC2-ανεπαρκή ποντίκια για να διερευνήσει τις βιολογικές λειτουργίες του DLC2 και ο ρόλος του στην ηπατοκαρκινογένεσης in vivo. Σε αντίθεση με το μοντέλο νοκ-άουτ DLC1, DLC2 ήταν περιττό για την εμβρυϊκή ανάπτυξη και DLC2-ανεπαρκή ποντίκια θα μπορούσε να επιβιώσει μέχρι την ενηλικίωσή τους. DLC2-ανεπαρκή ποντίκια δεν παρουσίασαν υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης ηπατοκαρκινογένεσης ή diethylnitrosamine (DEN) επαγόμενη ηπατοκαρκινογένεσης. Ωστόσο, DLC2-ανεπαρκή ποντίκια ήταν σημαντικά μικρότερες και είχαν λιγότερο λιπώδη ιστό από τους ποντικούς άγριου τύπου. Ανάλυση της λιπογένεσης των DLC2 ανεπάρκεια και άγριου τύπου εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού δεν δείχνουν σημαντική διαφορά μεταξύ τους. Επίσης, δεν παρατηρήσαμε κάποια σημαντική διαφορά στο μέγεθος των κυττάρων μεταξύ φάσης G1 DLC2 ανεπάρκεια και άγριου τύπου απαθανάτισε ινοβλάστες με κυτταρομετρία ροής.

Υλικά και Μέθοδοι

Δημιουργία DLC2-ανεπαρκή ποντίκια

Ένας κλώνος PAC που περιέχει το ποντίκι

Dlc-2

γονιδιωματική περιοχή λήφθηκε από το Sanger Centre (Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο). Για την κατασκευή του ποντικιού

Dlc-2

γονίδιο φορέα στόχευσης, μια 2,8 kb

Eco RI

/

Bam ΗΙ θραύσμα

, το οποίο είναι 3 ‘προς το εξόνιο 5, κλωνοποιήθηκε σε η

Eco

RI /

Bam ιστοσελίδα ΗΙ του pPNT (Σχήμα 1α). Ένα ζεύγος εκκινητών (προς τα εμπρός, 5′-ttactcgagttgctgatgcacaggtcttc? Αντίστροφη, 5′-ttactcgagttctcgtgttaggaatgggg) χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση ενός γονιδιωματική περιοχή, 2.7 kb σε μέγεθος και 5 ‘προς το εξόνιο 5 (Σχήμα 1α). Το θραύσμα στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε εντός pPNT [20]. Ο φορέας στόχευσης ευθυγραμμίστηκε με

Δεν

Ι και ηλεκτροδιατρήθηκε μέσα στο AB2.2 εμβρυϊκών βλαστικών (ES) κυτταρικής γραμμής (129s7 /SvEBrd-Hprt b-m2), και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ES μέσο κυτταρικής καλλιέργειας συμπληρωμένο με G418 και fialuridine. Ανθεκτικοί κλώνοι αναλύθηκαν με κηλίδωση Southern (βλέπε παρακάτω) για τον εντοπισμό

DLC2

-targeted κλώνων.

(α) Σχηματικό διάγραμμα για να δείξει στρατηγική στόχευση γονιδίου. Μαύρο κουτιά, εξώνια του γονιδίου DLC2 ποντικού (οι αριθμοί εξόνιο γραμμένο στην κορυφή)? γκρίζα κουτιά, αλληλουχία DNA του γονιδίου αντίστασης νεομυκίνης του μορφώματος στοχεύσεως? λευκό κουτί, αλληλουχία DNA του γονιδίου κινάσης θυμιδίνης του μορφώματος στοχεύσεως. sites πέψη ενζύμου περιορισμού: Β, BamHI? Bg, BglII? E, EcoRI? Ν, Ναοί? μόνο διαγνωστικές θέσεις περιορισμού φαίνονται για λόγους απλότητας. (Β) Ανάλυση Southern blot. πέψη BglII ανιχνεύθηκε με 5 ‘ανιχνευτή όπως υποδεικνύεται? μεγέθη των διαγνωστικών ζωνών: άγριου τύπου αλληλόμορφο, 4.7 kb? στοχευόμενο αλληλόμορφο, 5,7 kb. πέψη ΝοοΙ ανιχνεύθηκε με ανιχνευτή 3 ‘όπως αναφέρεται? μεγέθη των διαγνωστικών ζωνών: άγριου τύπου αλληλόμορφο, 9.1 kb? στοχευόμενο αλληλόμορφο, 5,7 kb. (Γ) προσδιορισμό γονοτύπου PCR? μεγέθη των ζωνών: άγριου τύπου αλληλόμορφο, 414 bp? στοχευμένη αλληλόμορφο, 339 bp. (Δ) RT-PCR για την ανίχνευση της έκφρασης DLC2 στην καρδιά, το ήπαρ και στους σκελετικούς μύες.

Η

Όλες οι έρευνες που αφορούν το έργο των ζώων εγκρίθηκε από την επιτροπή για την χρήση ζωντανών ζώων στη διδασκαλία και την έρευνα (CULATA) του Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ. Κύτταρα από αυτούς τους κλώνους ενέθηκαν σε ποντικούς C57BL /6N βλαστοκύστες. Χίμαιρες ζευγάρωσαν με ποντίκια C57BL /6N, και τους απογόνους που περιέχουν

εντοπίστηκαν DLC2

-targeted αλληλόμορφο. Τα ποντίκια με μικτό γενετικό υπόβαθρο ανάστροφα-διασταυρώθηκαν με C57BL /6N για τουλάχιστον πέντε γενεές.

ανάλυση στυπώματος Southern, PCR γονότυπου και RT-PCR

Για την ανάλυση στυπώματος Southern, δύο ανιχνευτές, 5 ‘και 3’ των εξωτερικών, χρησιμοποιήθηκαν (Σχήμα 1α).

πέψη ΒαΙ II

ανιχνεύθηκε με ανιχνευτή το 5 ‘και τα μεγέθη των διαγνωστικών ζώνες ήταν 4.7 kb για το αλληλόμορφο άγριου τύπου και 5,7 kb για το στοχευόμενο αλληλόμορφο.

Nc

oi πέψη ανιχνεύτηκε με ανιχνευτή 3 ‘, και τα μεγέθη των διαγνωστικών ζώνες ήταν 9.1 kb για το αλληλόμορφο άγριου τύπου και 5,7 kb για το στοχευόμενο αλληλόμορφο.

Δύο ζευγάρια εκκινητών ήταν που χρησιμοποιούνται για προσδιορισμό του γονότυπου PCR. Για την ανίχνευση του αλληλίου άγριου τύπου, προς τα εμπρός (5′-AATGGAAGCACCATGTAGCC) και αντίστροφο εκκινητή 5′-AATGGAAGCACCATGTAGCC) χρησιμοποιήθηκαν, με αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος 414 bp PCR. Για την ανίχνευση της στοχευμένη αλληλόμορφο, προς τα εμπρός (5′-CTGGGAAGACAGGGAACAAA) και αντίστροφη εκκινητές (5′-GGGGGAACTTCCTGACTAGG) χρησιμοποιήθηκαν, με αναμενόμενο μέγεθος του όντος προϊόντος PCR, 339 bp.

Για ημι-ποσοτική RT- PCR ανάλυση, παρασκευάστηκε ολικό RNA από ιστούς ποντικού χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). Πρώτου κλώνου cDNA συνετέθη από 1 μα ολικού RNA με τη χρήση τυχαίων εξαμερών με Kit GeneAmp RNA PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA). Δύο μΐ του cDNA χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης του

DLC1, DLC2

και

DLC3

χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: Για ποντίκι

DLC1

γονίδιο, προς τα εμπρός εκκινητή (5 «- CCCATTCAGTCAGTCCACCTTGA) και να αντιστραφεί εκκινητή (5′-GAGTCTCCCTCGTCGGAAAAC) χρησιμοποιήθηκαν? Για το ποντίκι

χρησιμοποιήθηκαν DLC2

γονίδιο, προς τα εμπρός εκκινητή (5′-GATGAGAAACACAGCCAGCA) και αντίστροφο εκκινητή (5′-GTTGGGTATCTGGACGCACT)? Για

DLC3

, χρησιμοποιήθηκαν τα εμπρός εκκινητή (5′-TCCACAGGCAGCCATGCCAG) και να αντιστραφεί εκκινητή (5′-TCTTGCTCAAGATCCTGGGCC). κατάσταση PCR ήταν ως εξής: μετουσίωση στους 95 ° C για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από 25 κύκλους (

DLC1

και

DLC2

) ή 27 κύκλους (

DLC3

) μετουσίωσης επί 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα με επέκταση στους 72 ° C για 30 δευτερόλεπτα και μια τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε 1.2% πηκτή αγαρόζης.

πείραμα κλουβί Μεταβολικό

Τα ποντίκια στεγάστηκαν μεμονωμένα σε κλωβούς μεταβολισμού σε 12:12 ωρών κύκλο σκούρο φως και ταΐστηκαν

διαφήμιση κατά βούληση

. Κατανάλωση νερού και τροφής, και τα ούρα και τα κόπρανα εξόδου μετρήθηκαν για 2 ημέρες.

Diethylnitrosamine (DEN) θεραπεία των ποντικιών

Το πρωτόκολλο ηπατοκαρκινογένεσης ήταν ως εξής. Το 15-ημερών αρσενικών

DLC2

ομόζυγους ποντικούς νοκ άουτ και ποντικών άγριου τύπου ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με 25 mg /kg DEN σε στείρο PBS. Στις 35 εβδομάδες της ηλικίας, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και τα συκώτια τους συλλέχθηκαν και εξετάστηκαν. Τα ήπατα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν σε 4% φορμαλδεΰδη σε PBS, ενσωματωμένο σε παραφίνη και κόπηκαν σε 4-μm τομές για ιστολογική εξέταση.

Παρασκευή εμβρυονικών ινοβλαστών ποντικού (ΠΜΑ), και δημιουργία κυτταρικών γραμμών

οι έγκυες ποντίκια θυσιάστηκαν σε 13,5 ημέρες μετά τη συνουσία (DPC). Τα έμβρυα αποκόπηκαν από τη μήτρα, και το επιπλέον-εμβρυονικές μεμβράνες και εντόσθια απομακρύνθηκαν. Τα έμβρυα κόβονται σε μικρά κομμάτια, και διαποτίζεται για 30 λεπτά σε 4 ml 0,25% θρυψίνη-ΕϋΤΑ σε θερμοκρασία δωματίου. Η επεξεργασία με θρυψίνη αδρανοποιήθηκε με α-τροποποιημένο μέσο Eagle (αΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS, 50 U πενικιλλίνης ανά ml, και 50 μg στρεπτομυκίνης ανά ml. Τα κύτταρα αιωρήθηκαν με σιφώνιο και πέρασε μέσα από ένα σουρωτήρι. Πρότυπες διαδικασίες χρησιμοποιήθηκαν για τον καθορισμό αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές ινοβλαστών [21]. Εν συντομία, τα κύτταρα περνιούνται κάθε 3 ημέρες σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ορό μόσχου και αντιβιοτικά σε πυκνότητα 10

6 κύτταρα ανά cm τρυβλίο 10. Media άλλαξαν για την επόμενη ημέρα. Σταθερό απαθανάτισε κυτταρικές σειρές καθιερώθηκαν μετά από 30 έως 50 περάσματα.

Μέτρηση του μεγέθους των κυττάρων

Τα σχετικά μεγέθη των

DLC2

+ /+

και

DLC2

– /-

κύτταρα προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής. Εν συντομία, τα κύτταρα BrdU-σημασμένο χρησιμοποιώντας FITC Kit Flow BrdU (BD Pharmingen ™, NJ, USA). G1 πληθυσμός των κυττάρων περιφραγμένο και η προς τα εμπρός σκέδαση φωτός (FSC) 5000 G1-κυττάρων προσδιορίστηκε. FSC χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των σχετικών μεγεθών των κυττάρων.

Διέγερση διαφοροποίησης των λιποκυττάρων

Για την επαγωγή της διαφοροποιήσεως των λιποκυττάρων, MEF κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν μέσα σε δύο περάσματα. Η επαγωγή της διαφοροποιήσεως των λιποκυττάρων διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και πολλαπλασιάστηκε προς συρροή. Δύο ημέρες αργότερα, το μέσο αντικαταστάθηκε με πρότυπο διαφοροποίησης μέσο επαγωγής (α-ΜΕΜ που περιέχει 0,5 mM ισοβουτυλμεθυλξανθίνη, 1 μΜ δεξαμεθαζόνη, 5 μα ινσουλίνης ανά ml, 10% FBS, 50 U πενικιλλίνης ανά ml, και 50 μg στρεπτομυκίνης ανά ml, και το μέσο ανανεώνεται κάθε δεύτερη ημέρα. Τα κύτταρα επάγονται για 8 ημέρες πριν την ανάλυση.

Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη, ξεπλύθηκαν δύο φορές με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS), και χρωματίστηκαν με διάλυμα ελαίου-Red Ο χρώση (0,5% Oil-Red Ο σε ισοπροπυλική αλκοόλη διάλυμα αποσταγμένου νερού [60:40]) για 30 λεπτά στους 37 ° C και στη συνέχεια πλένεται με αποσταγμένο νερό τρεις φορές. αδιπογένεσης σε Oil-Red-Ο- χρωματισμένο MEF ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση της απορρόφησης του φωτός στα 510 nm μετά από εκχύλιση με ισοπροπυλική αλκοόλη.

Rhotekin δοκιμασία δέσμευσης

τα κύτταρα λύθηκαν σε 500 μΙ ρυθμιστικού λύσης που περιέχει 50 mM Tris (ρΗ 7,4 ), 10 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 0.1% SDS, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 10 μg /ml απροτινίνης, 10 μg /ml λευπεπτίνη και 1 mM PMSF. Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση στα 12.000 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C, και 500 μg από κάθε προϊόν λύσης επωάζεται με 45 μg της GST-RBD (πρωτεΐνη σύντηξης GST που περιέχει RhoA-πεδίο σύνδεσης του Rhotekin) συνδέεται προς γλουταθειόνη-Sepharose σφαιρίδια (Amersham Pharmacia) για 1 ώρα. Μετά τη δέσμευση, τα δείγματα πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για τρεις φορές. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες κλασματοποιήθηκαν σε 12% SDS /PAGE και ανοσοστυπώθηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα για RhoA (Santa Cruz Biotechnology). Συνολικά κυτταρικό λύμα αναλύθηκε επίσης με αντι-RhoA αντίσωμα ως έλεγχος φόρτωσης. Το επίπεδο της δραστικής RhoA προσδιορίστηκε μετά από κανονικοποίηση με το συνολικό RhoA που υπάρχει στα κυτταρικά λύματα.

ανοσοφθορισμού χρώση

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε καλυπτρίδες και ξεπλύθηκαν σε PBS, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100 σε PBS για 5 λεπτά και αποκλείστηκαν με 5% αλβουμίνη βόειου ορού σε PBS. Μετά την πλύση με PBS, τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα παξιλλίνη (Sigma), που ακολουθείται από FITC-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα σε θερμοκρασία δωματίου. F-actins βάφτηκαν με τετραμεθυλροδαμίνη Β ισοθειοκυανική-επισημασμένο φαλλοειδίνη (Sigma) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. Τα κύτταρα τοποθετούνται με διάλυμα αντιξεθωριάσματος Vectashield (Vector Laboratories).

Αποτελέσματα

Δημιουργία DLC2-ανεπαρκή ποντίκια

Για να μελετήσουμε τη λειτουργία του DLC2

in vivo

και ο ρόλος των DLC2 στο ηπατοκαρκινογένεσης, δημιουργήσαμε ποντίκια DLC2-deficent. Η διάσπαση του γονιδίου DLC2 ποντικού επιτεύχθηκε με ομόλογο ανασυνδυασμό σε κύτταρα εμβρυϊκών βλαστικών (ES). Στην ανασυνδυασμού, εξόνιο 5, το μεγαλύτερο εξόνιο του

DLC2

γονίδιο, αντικαταστάθηκε από το γονίδιο αντοχής στη νεομυκίνη του φορέα στόχευσης (Σχήμα 1α). Δύο στοχευμένες ES κλώνοι χρησιμοποιούνται για τον καθορισμό των DLC2-ανεπαρκή ποντίκια (Σχήμα 1β και 1γ).

DLC2

– /-.

Ποντίκια δεν εκφράζουν το

DLC2

mRNA όπως ανιχνεύεται με RT-PCR σε επιλεγμένους ιστούς, την καρδιά, το ήπαρ και σκελετικό μυ (Σχήμα 1δ)

DLC2-ανεπαρκή ποντίκια ήταν ανατομικά φυσιολογική, αλλά μικρότερο και είχε λιγότερο λιπώδη λίπος

σε αντίθεση με το

DLC1

– /-

ποντίκια, τα οποία έχασαν τη ζωή τους σε εμβρυακό στάδιο,

DLC2

– /-

ποντίκια θα μπορούσε να επιβιώσει μέχρι την ενηλικίωσή τους. Αυτό υποδηλώνει ότι DLC2 δεν είναι απαραίτητη για την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Ανατομική ανάλυση έδειξε ότι

DLC2

– /- ποντίκια

ήταν φυσιολογικά (30 εβδομάδων), όμως

DLC2

– /-

ποντίκια ήταν μικρότερα σε μέγεθος και ελαφρύτερο σε βάρους (ρ = 0,01) (Σχήμα 2α) και είχαν λιγότερο λιπώδη ιστό από ποντικούς άγριου τύπου (ρ = 0,02) (Σχήμα 2β & amp? 2c). Θέλαμε να αποκλείσει την πιθανότητα ότι

DLC2

– /-

ποντίκια θα μπορούσε να τρώτε λιγότερο φαγητό από ό, τι

DLC2

+ /+

ποντίκια και αυτό θα μπορούσε να συμβάλει στην μικρότερου μεγέθους του σώματός τους. Ως εκ τούτου, πραγματοποιήθηκε μεταβολικό πείραμα κλουβί για να διερευνήσει κατά πόσον υπήρχαν διαφορές στην κατανάλωση τροφής και νερού. Ωστόσο, δεν θα μπορούσαμε να εντοπίζονται τυχόν σημαντικές διαφορές στην πρόσληψη τροφής και νερού μεταξύ

DLC2

– /-

ποντίκια και

DLC2

+ /+

ποντίκια (Σχήμα 3)

(α) το βάρος του σώματος. (Β) Βάρος των μαξιλαριών επιδιδυμικού λίπους. Στο (α) και (β), οι μέσες τιμές ± τυπικά σφάλματα και ρ-τιμές που φαίνονται. Ρ-τιμές υπολογίστηκαν με το t τεστ unpaired Student. (Γ) Αντιπροσωπευτικά δείγματα των μαξιλαριών του λίπους επιδιδυμίδας.

Η

(α) την πρόσληψη τροφής, (β) την πρόσληψη νερού, (γ) περιττώματα εξόδου και (δ) την παραγωγή ούρων μέσα σε 24 ώρες. Οι μέσες τιμές ± τυπικά σφάλματα και ρ-τιμές που φαίνονται. Ρ-τιμές υπολογίστηκαν με t-test unpaired Student.

Η

Η εξάντληση των DLC2 δεν επηρέασε το μέγεθος των κυττάρων και τη λιπογένεση στο ΠΜΑ

Οι p190B RhoGAP ανεπάρκεια έμβρυα ποντικού ήταν μικρότερο από το άγριο έμβρυα τύπο και ινοβλάστες που προέρχονται από τις p190B RhoGAP ανεπάρκεια έμβρυα ήταν μικρότερες από εκείνες που προέρχονται από έμβρυα άγριου τύπου [18]. Επίσης, οι ινοβλάστες που προέρχονται από τα p190B RhoGAP ανεπάρκεια έμβρυα ήταν ελαττωματικά στην αδιπογένεσης [19]. Κατά συνέπεια, εξετάσαμε αν ινοβλάστες που προέρχονται από το

DLC2

– /-.

Έμβρυα ποντικού ήταν μικρότερα σε μέγεθος και ελαττωματικά σε αδιπογένεσης

Όπως αποδείχθηκε με κυτταρομετρία ροής, το μέγεθος των κυττάρων που προέρχονται από το

DLC2

– /-

έμβρυα ποντικού δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από εκείνη του

DLC2 έμβρυα

+ /+

ποντίκι (Εικόνα 4α και 4β). Από Sordella et al. [18] έδειξε ότι η οδός ΑΚΤ ήταν προς τα κάτω στόχος του RhoA, και αυτό τελικά οδήγησε στην μείωση του μεγέθους των κυττάρων των ινοβλαστών που προέρχονται από τα p190B RhoGAP ανεπάρκεια έμβρυα, εξετάσαμε την οδό ΑΚΤ σε κύτταρα που προέρχονται από το

DLC2

– /-

και

DLC2

+ /+

ποντίκι έμβρυα. Εμείς δεν εντόπισε καμία διαφορά μεταξύ τους σε αυτό το μονοπάτι (Σχήμα 4γ). Έχουμε στο παρελθόν έδειξαν ότι DLC2 ήταν RhoGAP? υπερέκφραση του DLC2 ρυθμισμένα προς τα κάτω δραστικότητα Rho σε κυτταρικές σειρές ηπατώματος και είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή του σχηματισμού ακτίνης ινιδίων του στρες [2]. Ωστόσο, πάνω ρύθμιση της δραστικότητας Rho στο

DLC2

– /-

κύτταρα δεν παρατηρήθηκε (Σχήμα 4δ) και υπήρξε κάποια ελαφρά αλλά όχι σημαντική διαφορά στον σχηματισμό ινών στρες ακτίνης ή εστιακές συμφύσεις μεταξύ

DLC2

– /-

και

DLC2

+ /+

κύτταρα (Σχήμα 4Ε). Αυτά δείχνουν ότι μπορεί να υπάρχουν και άλλα λειτουργικά παρόμοια πρωτεΐνες οι οποίες θα μπορούσαν να αντισταθμίσουν την λειτουργία του DLC2

(α) Σύγκριση των μεγεθών DLC2 + /+ (n = 6) και DLC2 -. /- (N = 6) των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Πρόσω διάχυτο φως (FSC) του G1 φάσης-κυττάρων όπως προσδιορίζεται με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των σχετικών μεγεθών των κυττάρων. Οι μέσες τιμές ± τυπικά σφάλματα και ρ-τιμές που φαίνονται. Ρ-τιμές υπολογίστηκαν με το t τεστ unpaired Student. (Β) Αντιπροσωπευτικά δείγματα των αποτελεσμάτων κυτταρομετρίας ροής. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western των ινσουλινοθεραπεία DLC2 + /+ και DLC2 – /- κύτταρα. (Δ) δραστηριότητα RhoA της DLC2 + /+ και DLC2 – /- κύτταρα όπως ανιχνεύεται με δοκιμασία σύνδεσης Rhotekin. (Ε) Η ακτίνη του κυτταροσκελετού και εστιακές συμφύσεις στην DLC2 + /+ και DLC2 – /-. MEF κύτταρα ανιχνεύθηκαν με χρώση ανοσοφθορισμού της ακτίνης ίνες στρες (κόκκινο) και παξιλλίνη (πράσινο), αντίστοιχα

Η

Στη συνέχεια, εξέτασε τη λιπογένεση σε ινοβλάστες που προέρχονται από τις

DLC2

– τα έμβρυα

και

DLC2

+ /+

ποντίκι – /. Όταν

DLC2

– /-

και

DLC2

+ /+

κύτταρα που προκαλείται από το πρότυπο μέσο επαγωγής διαφοροποίησης των λιποκυττάρων, τόσο

DLC2

– /

-. και

DLC2

+ /+

κύτταρα ήταν αρμόδια να διαφοροποιηθούν σε λιποκύτταρα και δεν διέφερε σημαντικά στην παραγωγή λιπιδίων ποσοτικά (Σχήμα 5)

(α) Επαγωγή του αδιπογένεσης διεξήχθη επί DLC2 – /- (η = 6) και DLC2 + /+ (n = 6) ΠΜΑ. Μετά την επαγωγή, MEFs βάφτηκαν με λάδι-Red Ο, και ο λεκές στη συνέχεια εκχυλίστηκε και η απορρόφηση στα 510 nm μετρήθηκε. Οι μέσες τιμές ± τυπικά σφάλματα και ρ-τιμές που φαίνονται. Ρ-τιμές υπολογίστηκαν με το t τεστ unpaired Student. (Β) Αντιπροσωπευτικά δείγματα πετρελαίου-Red O-βάφονται ΠΜΑ.

Η

Η εξάντληση των DLC2 δεν προδιαθέτουν στο σχηματισμό των όγκων του ήπατος, ούτε να επιδεινώσει DEN που προκαλείται ηπατοκαρκινογένεσης

Εμείς δεν το έκανε παρατηρούν κάθε σχηματισμός όγκου στο συκώτι του ενήλικου

DLC2

– /- ποντίκια

μέχρι την ηλικία των 18 μηνών. Για την αντιμετώπιση του ρόλου της DLC2 στα χημικά που προκαλείται ηπατοκαρκινογένεσης, θα αντιμετωπίζονται με τον 15-ημερών αρσενικό

DLC2

– /-

και

DLC2

+ /+

ποντίκια με DEN . Όταν οι ποντικοί έφθασαν 35 εβδομάδων ηλικία, αποκόπηκαν και τα συκώτια τους εξετάσθηκαν για σχηματισμό όγκου. Παρατηρήσαμε ότι οι όγκοι του ήπατος που αναπτύχθηκε σε όλους τους ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με DEN. Επιπλέον, οι αριθμοί των όγκων που σχηματίζονται και οι μέγιστες διάμετροι του όγκου ήταν παρόμοια τόσο στην

DLC2

– /-

και

DLC2

+ /+

ποντικών (ρ = 0,79 και 0.51, αντίστοιχα) (Σχήμα 6). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ανεπάρκεια DLC2 δεν επιδεινώνει χημικών ηπατοκαρκινογένεσης.

(α) Αριθμός των όγκων που σχηματίζονται στο ήπαρ μετά τη θεραπεία DEN. (Β) Το μέγεθος του όγκου όπως αντιπροσωπεύεται από τη μέγιστη διάμετρο (σε χιλιοστά). Στο (α) και (β), οι μέσες τιμές ± τυπικά σφάλματα και ρ-τιμές που φαίνονται. Ρ-τιμές υπολογίστηκαν με το t τεστ unpaired Student. (Γ) Αντιπροσωπευτικά δείγματα ήπατος αντιμετωπίζονται με DEN. Λευκά βέλη δείχνουν τους όγκους. (Δ) Εκπρόσωπος H & amp?. Ε τομές των δειγμάτων ήπατος αντιμετωπίζονται με DEN

Η

DLC1

και

DLC3

έκφραση mRNA σε DLC2-εξαντλημένο ιστούς

Ημι-ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε σε επιλεγμένους ιστούς περιλαμβάνονται και τα συκώτια, σκελετικούς μύες και τις καρδιές του

DLC2

– /-

και

DLC2

+ /+

ποντίκια σε 3 μηνών για να παρατηρήσει οποιαδήποτε αποζημίωση δοσολογία γονιδίων από άλλα μέλη DLC σε μας

DLC2

– /-

ποντίκια. Τα δεδομένα μας δεν έδειξαν σημαντική αύξηση είτε DLC1 ή DLC3 σε αυτούς τους ιστούς του

DLC2

– /- ποντίκια

(Συμπληρωματική Εικόνα S1). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν ανεξάρτητα τρεις φορές.

Συζήτηση

Έχει αναφερθεί ότι DLC1 ανεπάρκεια έμβρυα είχαν ανωμαλίες του νευρικού σωλήνα και πέθανε νωρίς για να midgestation [17]. Όπως προτείνεται από Durkin et al. [17], αυτό θα μπορούσε επίσης να οφείλεται στην πρωτογενή δυσλειτουργία άλλων οργάνων, όπως η ανάπτυξη της καρδιάς. Η ομάδα μας έδειξε πρόσφατα ότι DLC1 ρυθμίζεται αρνητικά τη Rho /ROCK [22]. Επίσης, ένα σχετικά υψηλό επίπεδο έκφρασης ROCK παρατηρήθηκε προηγουμένως στις αναπτυσσόμενες καρδιές των εμβρύων, 7,0-9,0 DPC [23] και 09.05 με 11.05 DPC [24]. Αυτό υποδηλώνει ότι η ανεπάρκεια DLC1 μπορεί να διαταράξει την ομαλή λειτουργία των πρωτεϊνών ROCK στο εμβρυϊκό καρδιά και να οδηγήσει σε εμβρυϊκά θνησιμότητα. Παρ ‘όλα αυτά, οι παρατηρούμενες φαινότυποι δείχνουν ότι DLC1 έχει έναν κρίσιμο ρόλο κατά τη διάρκεια της πρώιμης ανάπτυξης του ποντικού.

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η ανεπάρκεια DLC2 δεν προκαλεί καμία παρατηρήσιμη αναπτυξιακές ανωμαλίες, και DLC2-ανεπαρκή ποντίκια θα μπορούσε να επιβιώσει μέχρι την ενηλικίωσή τους. Αυτό υποδηλώνει ότι οι λειτουργίες της DLC2 στην εμβρυϊκή ανάπτυξη μπορεί να αντισταθμιστεί από ομόλογο του, DLC1, αλλά όχι το αντίστροφο. Είναι κοινό ότι παράλογων γονιδίων αντισταθμίσει τις λειτουργίες των μελών της ομάδας. Για παράδειγμα, τα μέλη του ποντικιού Ηοχ παράλογων ομάδα 3, Ηοχβ3, Hoxb3 και Hoxd3, αλληλεπιδρούν συνεργικά για τη ρύθμιση της εμβρυϊκής ανάπτυξης με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο [25], [26]. Παρά το γεγονός ότι η ανεπάρκεια DLC2 δεν οδήγησε σε εμβρυϊκή θνησιμότητα, DLC2-ανεπαρκή ποντίκια ήταν μικρότερες και είχαν λιγότερο λιπώδη ιστό. Δεδομένου ότι αποδείχθηκε ότι οι ινοβλάστες που προέρχονται από 190Β RhoGAP ανεπάρκεια έμβρυα ήταν μικρότερες [18] και ήταν λιγότερο αποτελεσματικό στην αδιπογένεσης [19], εξετάσαμε τις DLC2-ανεπαρκή ποντίκια κατά μήκος αυτών των γραμμών. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές ως προς το μέγεθος των κυττάρων και λιπογένεσης μεταξύ ινοβλάστες που προέρχονται από

DLC2

– /-

και

DLC2

+ /+

ποντίκια. Επίσης, το πείραμα μεταβολικό κλουβί δεν ανιχνεύσει κάποια σημαντική διαφορά μεταξύ

DLC2

– /-

και

DLC2

+ /+

ποντίκια. Σε αυτό το πλαίσιο, δεν θα μπορούσαμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι το πείραμα μεταβολικό κλουβί μπορεί να μην είναι αρκετά ευαίσθητες για να ανιχνεύσουν την μικρή διαφορά στην ποσότητα της πρόσληψης τροφής που μπορεί να προκαλέσει την παρατηρούμενη φαινότυπο του σωματικού βάρους. Επίσης δεν μπορούσε να αποκλείσει το γεγονός ότι

DLC2

– /-

ποντίκια θα μπορούσε να είναι πιο δραστήρια και καταναλώνονται περισσότερες θερμίδες από ό, τι

DLC2

+ /+

ποντίκια

αποδείχθηκε ότι DLC2 εντοπισμένη στα μιτοχόνδρια και ενδέχεται να παίζουν ρόλο στην μεταφορά λιπιδίων [7]. Επιπλέον, έχει προταθεί ότι ο τομέας START περιέχει πρωτεΐνη, αστέρι, είναι ένα βασικό συστατικό στην παραγωγή στεροειδών ορμονών στο μετατόπιση του χοληστερόλης από την εξωτερική μεμβράνη στην εσωτερική μεμβράνη του μιτοχόνδρια στερεοειδογόνο κυττάρου [27]. Δεδομένου DLC2 είναι ένα πεδίο START περιέχει πρωτεΐνη και είναι σε θέση να εντοπίσουν στα μιτοχόνδρια, θα είναι ενδιαφέρον να μελετηθεί η φυσιολογική λειτουργία του DLC2 σε σχέση με τον μεταβολισμό των λιπιδίων, καθώς και βιοσύνθεση στεροειδών ορμονών.

DLC2 ήταν φαίνεται να υποεκφράζεται σε HCC [1], [2], [28] και διαθέτουν λειτουργίες καταστολής όγκου συμπεριλαμβανομένης της καταστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, Ras προκαλούμενη σχηματισμό αποικίας και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη [1], [2]. Ένας από τους πρωταρχικούς στόχους μας για τη δημιουργία του DLC2-ανεπαρκή ποντίκια ήταν η διερεύνηση του καταστολέα όγκου ρόλος του DLC2 in vivo. Βρήκαμε ότι η ανεπάρκεια DLC2 δεν προδιαθέτουν στο σχηματισμό HCC ούτε επιδεινώσει DEN-επαγόμενη ηπατοκαρκινογένεσης. Και πάλι, η λειτουργία καταστολής όγκου της λειτουργίας DLC2 μπορεί να αντισταθμιστεί από DLC1. Από DLC1-ανεπαρκή ποντίκια πεθαίνει σε εμβρυϊκό στάδιο, θα ήταν ενδιαφέρον να δούμε αν ηπατοκυττάρων-ειδική ανεπάρκεια DLC1 μπορεί να προδιαθέτουν όπως ποντίκια για την ανάπτυξη HCC και να περιγραφεί λεπτομερώς ο ρόλος της ανεπάρκειας DLC2 στην ανάπτυξη HCC σε αυτά τα ποντίκια. Απεδείχθη ότι η απώλεια της ρ53 θα επιταχύνει ηπατοκαρκινογένεσης σε διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν c-myc [29]. Θα ήταν κατατοπιστική να διασχίσει DLC2-ανεπαρκή ποντίκια με άλλα ποντίκια knockout ογκοκατασταλτικών γονιδίων, όπως ρ53 ή /και διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν ογκογονίδια όπως c-myc και ΤΟΡ-άλφα [30]. Εναλλακτικά, το νέο σύστημα από Zender et al. θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για να μελετήσει το ογκοκατασταλτικό ρόλο της DLC2 σε ηπατοκαρκινογένεσης [31]. Στο σύστημα αυτό, το ρ53 ανεπάρκεια ήπατος προγονικά κύτταρα θα μπορούσαν να μολυνθούν με ένα συνδυασμό οικοτροπική ρετροϊοί που φέρουν c-myc, RAS, ΑΚΤ και DLC2. Αυτό θα μας επιτρέψει να διερευνηθεί περαιτέρω η DLC2 έχει όγκο λειτουργία καταστολέα in vivo.

DLC2 ανήκει σε μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών DLC. Είναι κωδικοποιεί έναν τομέα RhoGAP με υψηλή ομολογία αλληλουχίας με τα μέλη της οικογένειας DLC, DLC1 και DLC3. Σε προηγούμενες μελέτες μας, αποδείξαμε ότι DLC2 ή DLC1 ήταν σε θέση να αναστέλλουν την δραστικότητα RhoA που είχε ως αποτέλεσμα τα κάτω ρύθμιση του σχηματισμού ακτίνης ινιδίων του στρες. Επιπλέον, η μελέτη από Kawai et al έδειξαν ότι DLC3 θα μπορούσε επίσης να αναστέλλουν τη δράση RhoA κατά τομέα του RhoGAP. Η έκτοπη έκφραση του DLC3 σε κύτταρα HeLa μειώθηκε ο αριθμός των ινών ακτίνης στρες [32]. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι λειτουργικές ρόλοι των DLC1, DLC2 και DLC3 σε κυτταρικές σειρές και κατάντη επενεργητές τους είναι αρκετά παρόμοια. Στο μοντέλο ποντικού, η εξάντληση DLC1 ήταν εμβρυϊκή θανατηφόρο ενώ DLC2 ποντίκια knockout μας θα μπορούσε να επιβιώσει μέχρι την ενηλικίωσή τους. Αυτό υποδηλώνει ότι οι λειτουργίες της DLC2 στην εμβρυϊκή ανάπτυξη μπορεί να αντισταθμιστεί από DLC1 ή DLC3. Ωστόσο, από ημι-ποσοτικό αποτέλεσμα RT-PCR μας, δεν υπήρχε σημαντική αύξηση του είτε DLC1 ή DLC3 στα ήπατα, οι καρδιές και των σκελετικών μυών των ποντικών DLC2 νοκ-άουτ. Το αποτέλεσμα αυτό σημαίνει ότι το φυσιολογικό επίπεδο των DLC1 ή έκφραση DLC3 μπορεί να είναι επαρκής για την αποζημίωση των λειτουργιών DLC2. Θα είναι ενδιαφέρον να δημιουργήσει ποντίκια knockout DLC3 να μελετήσει τη σημασία του σε εμβρυϊκή ανάπτυξη και εξετάζει εάν η λειτουργία του μπορεί να αντισταθμιστεί από άλλα μέλη DLC. Επιπλέον, τα δεδομένα knockout ποντίκια υποδεικνύουν ότι τα μέλη DLC θα μπορούσαν να παίξουν διαφορετικούς φυσιολογικούς ρόλους στην ανάπτυξη. Εκτός από την κοινή καθοδικός τελεστής (RhoA), ενδέχεται να υπάρχουν άλλα διαφορετικά μοριακούς στόχους που ρυθμίζονται ειδικά από ένα συγκεκριμένο μέλος του DLC.

Εκτός από τη μελέτη του ογκοκατασταλτικό ρόλο της DLC2 στο HCC, οι DLC2-ανεπαρκή ποντίκια μπορεί να να είναι χρήσιμα για τη μελέτη άλλων τύπων καρκίνου, καθώς επίσης παρατηρήθηκε μειορρύθμιση του DLC2 στον πνεύμονα, των ωοθηκών, νεφρικό, του μαστού, της μήτρας, του στομάχου, του παχέος εντέρου και του ορθού [33].

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

επίπεδο έκφρασης των DLC1 και DLC3 στο DLC2 – /- και + /+ ποντίκια DLC2. Ημι-ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε σε ήπατα, σκελετικούς μύες και την καρδιά του DLC2 – /- και DLC2 + /+ ποντίκια ηλικίας 3 μηνών δεν έδειξε σημαντική διαφορά στα επίπεδα έκφρασης του mRNA της DLC1 και DLC3. β-ακτίνης γονίδιο που χρησιμοποιείται για την εξομάλυνση

doi:. 10.1371 /journal.pone.0006566.s001

(0,39 MB ΔΕΘ)