Αφηρημένο

Η αντίσταση στη θεραπεία με σισπλατίνη βάση είναι μια σημαντική αιτία της αποτυχίας της θεραπείας στον καρκίνο του ανθρώπου ωοθηκών. Η καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών αντίστασης σισπλατίνη θα προσφέρουν νέες ιδέες για νέες θεραπευτικές στρατηγικές για αυτήν την θανάσιμη ασθένεια. Akt και p53 είναι καθοριστικοί παράγοντες της ευαισθησίας σισπλατίνη. Rictor είναι ένα συστατικό του συμπλόκου πρωτεϊνικής κινάσης mTOR 2, η οποία είναι απαραίτητη για την φωσφορυλίωση Akt (Ser473) και πλήρη ενεργοποίηση. Ωστόσο, ο ακριβής ρόλος του rictor και η σχέση μεταξύ rictor και ρ53 σε σισπλατίνη αντίσταση παραμένει ελάχιστα κατανοητή. Εδώ, με τη χρήση ευαίσθητων ρ53 άγριου τύπου (Ον2008 και τα A2780S), ανθεκτικό ρ53 άγριου τύπου (C13 * και OVCAR433), και ρ53 σε κίνδυνο (A2780cp, OCC1, και SKOV-3) ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, έχουμε αποδείξει ότι (i) rictor είναι ένας καθοριστικός παράγοντας της αντίστασης σισπλατίνη σε νόσο ευαίσθητη ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών? (Ii) σισπλατίνη ρυθμίζει προς τα κάτω το περιεχόμενο rictor από κασπάσης 3-διάσπαση και την υποβάθμιση του πρωτεασώματος? (Iii) rictor μειορύθμιση ευαισθητοποιεί χημειο-ανθεκτικά κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών σε σισπλατίνη απόπτωση σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο? (Iv) rictor καταστέλλει σισπλατίνη απόπτωση και προσδίδει αντίσταση με ενεργοποίηση και σταθεροποίηση των Akt. Τα ευρήματα αυτά επεκτείνουν τις τρέχουσες γνώσεις σχετικά με τη μοριακή και κυτταρική βάση της σισπλατίνης αντίσταση και παρέχει μια βάση λογική για rictor ως πιθανό θεραπευτικό στόχο για την χημειοθεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Im-Αράμ Α, Farrand L, Bae SM, τραγούδι G, τραγούδι YS, Han JY, et al. (2013) Η mTORC2 Συστατικό Rictor Συμβάλλει στη σισπλατίνη Αντίσταση σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 8 (9): e75455. doi: 10.1371 /journal.pone.0075455

Επεξεργαστής: Ο Carl G. Μάκη, του Πανεπιστημίου Rush Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 24, 2013? Αποδεκτές: 15 Αυγούστου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 Σεπτέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Im-Αράμ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το πρόγραμμα World Class Πανεπιστήμιο (WCU) μέσω του Υπουργείου Παιδείας, Επιστήμης και Τεχνολογίας και χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας (R31-10056) και από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (M0P-126144). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια στις γυναίκες σε όλο τον κόσμο [1]. Παρά τις προόδους στην κατανόηση της βιολογίας των όγκων, η συνολική θνησιμότητα από καρκίνο των ωοθηκών (OVCA) παραμένει υψηλή. Επί του παρόντος, η χημειοθεραπεία σε συνδυασμό με χειρουργική debulking είναι η προτιμώμενη θεραπευτική επιλογή και παράγωγα σισπλατίνης (CDDP: cis-διαμινοδιχλωρολευκόχρυσος) είναι πρώτης γραμμής χημειοθεραπευτικών θεραπευτικά. CDDP προκαλεί το θάνατο κυτταροτοξικών κυττάρων μέσω του σχηματισμού ενώσεων προσθήκης DNA-πλατίνα, με αποτέλεσμα την βλάβη του DNA και στην ενεργοποίηση των αποπτωτικών μονοπατιών [2].

Η αποτελεσματική θεραπεία των OVCA συχνά παρεμποδίζεται από καθυστερημένη διάγνωση και την εμφάνιση της αντοχής σε χημειοθεραπεία μετά από διαδοχικούς γύρους της θεραπείας. Αντοχή σε χημειοθεραπευτικά περιλαμβάνει πολύπλοκους μηχανισμούς που μπορεί να προκύψει από απορυθμισμένη σηματοδότηση, αυξημένη επιδιόρθωση του DNA, τροποποιημένος μεταβολισμός των καρκινικών κυττάρων [3,4], μεταφορά του φαρμάκου και του μεταβολισμού [5], και η απορύθμιση των παραγόντων επιβίωσης, συμπεριλαμβανομένου του FLIP, ΧΙΑΡ και Akt [6 -9]. Αυτά τα μοριακά και κυτταρικά γεγονότα μεταβάλλει τη συνολική απόκριση του κυττάρου σε γονοτοξικούς παράγοντες, όπως CDDP και επιρροή το κύτταρο προς αποφάσεις προ-επιβίωσης.

Ο στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά (mTOR) οδού έχει αναδειχθεί ως κρίσιμο ρυθμιστή του κυψελοειδούς μεταβολισμό, την ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση. εκτροπή του, η οποία είναι παρούσα σε ποσοστό έως 50% [10] του OVCA ασθενών, έχει δειχθεί ότι προσδίδουν αντίσταση σε θεραπεία CDDP που βασίζεται και σχετίζεται με δυσμενή πρόγνωση [11-14]. Η οδός mTOR περιλαμβάνει δύο συγκροτήματα σηματοδότησης: mTORC1 και mTORC2. mTORC1 είναι ευαίσθητη σε ραπαμυκίνη και τους ελέγχους της πρωτεΐνης σύνθεση και τον κυτταρικό μεταβολισμό, ενώ mTORC2 είναι απαραίτητη για τη βιωσιμότητα του κυττάρου [15]. mTORC2 είναι επίσης γνωστή για το ρόλο της στην φωσφορυλίωση της Akt στην Ser473 επιτρέποντας την πλήρη ενεργοποίηση και του πρωτεασώματος υποβάθμιση [16-18]. Akt ενεργοποίηση ή /και υπερ-έκφρασης είναι ένας καθοριστικός παράγοντας της ευαισθησίας CDDP σε ανθρώπινο OVCA. Akt αποτελέσματα ενεργοποίηση στο σταθεροποίηση ενός αριθμού αναστολέων κασπάσης [19,20] αναστέλλει τη συσσώρευση των μιτοχονδρίων ρ53 και απελευθέρωση πρωτεϊνών θανάτου [21,22], και εξασθενεί φωσφορυλίωση ρ53 και πυρηνικών λειτουργία [8]. Σε αντίθεση, η αναστολή Akt αυξάνει τη φωσφορυλίωση ρ53 (Ser

15) και την ευαισθησία CDDP [8,23].

Η ραπαμυκίνη-ευαίσθητο σύντροφος του mTOR (Rictor) είναι ένα βασικό συστατικό του συμπλέγματος mTORC2, και απαιτείται για την πλήρη λειτουργία του [24]. Υπερ-έκφραση του rictor αυξάνει τη δράση mTORC2 και προάγει την κυτταρική ανάπτυξη και την κινητικότητα [25]. Αντιστρόφως, rictor ρύθμιση προς τα κάτω καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και το σχηματισμό όγκων σε ορισμένους καρκίνους [26-28]. Rictor αλληλεπιδρά επίσης με την ιντεγκρίνη-συνδεδεμένη κινάση (ILK) να προωθήσει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων μέσω φωσφορυλίωσης Akt Ser473, και με ΡΚΟζ για καρκινικών κυττάρων εισβολή και τη μετάσταση [29,30]. Rictor απαιτείται για την ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη που προκαλείται από την απώλεια του ΡΤΕΝ [31]. Στόχευση rictor επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1 και μειώνει την έκφραση D1 κυκλίνης στο στήθος, του παχέος εντέρου και του προστάτη καρκινικών κυττάρων [27,32]. Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση mTORC2 διευκολύνει χημειοθεραπευτικού φαρμάκου-προκαλούμενη απόπτωση σε κύτταρα καρκίνου του μαστού [33]. Ωστόσο, ο ρόλος του rictor στην ανθεκτικότητα CDDP σε OVCA παραμένει άγνωστος.

ρ53 είναι μια πρωτεΐνη καταστολέας όγκου που επηρεάζει καθοδικούς τελεστές απόπτωσης μέσω τόσο της μεταγραφής εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από τους μηχανισμούς [8,21]. Είναι συνήθως ενεργοποιείται με CDDP μέσω φωσφορυλίωσης σε Ser15 και Ser20, οι οποίες είναι απαραίτητες για προ-αποπτωτικά ιδιοτήτων του, και την καταστολή του μυϊκού διπλό λεπτά 2 (MDM2) και ουβικιτινίωση και πρωτεασώματος αποικοδόμηση της [34-36]. Έχουμε αποδείξει προσφάτως ότι η απώλεια της λειτουργίας ρ53 με αδρανοποίηση ή μετάλλαξη επηρεάζει αρνητικά την απόπτωση και τηςχημειοευαισθησίας [7,37]. Τα κύτταρα που στερούνται τη λειτουργική πρωτεΐνη ρ53 αποτυγχάνουν να αναστείλουν mTORC1 σε απόκριση σε βλάβη του DNA [38]. Ωστόσο, ο συντονισμός και η επικοινωνία μεταξύ της κατάστασης p53 και rictor στη ρύθμιση της χημειοαντίσταση είναι ελάχιστα κατανοητή.

Στην παρούσα μελέτη, υποθέτουμε ότι rictor παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση χημειοευαισθησία των OVCA κυττάρων και ότι κατάντη της ρύθμιση ευαισθητοποιεί χημειοθεραπεία OVCA κυττάρων σε αγωγή CDDP, διευκολύνοντας Akt-εξαρτώμενη αποδόμηση πρωτεοσωμική, με ένα τρόπο που εξαρτάται από την κατάσταση της ρ53. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης εγείρουν την πιθανότητα ότι rictor μπορεί να είναι ένας θεραπευτικός στόχος για OVCA, αν και η αποτελεσματικότητα μιας τέτοιας εφαρμογής είναι πιθανό να εξαρτάται από την κατάσταση του p53.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

RPMI 1640 και ϋΜΕΜ /Ρ12 μέσα καλλιέργειας, ορό εμβρύου μόσχου (FBS), μη απαραίτητα αμινοξέα, πενικιλλίνη, στρεπτομυκίνη και αμφοτερικίνη Β ήταν από την Life Technologies (Carlsbad, CA, USA). CDDP, διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), Hoechst 33248, απρωτινίνη, ορθοβαναδικό νάτριο (Na

3νο

4), φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF) ήταν από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Κουνέλι πολύκλωνα αντισώματα: αντι-φωσφο-Ser

473-Akt, αντι-φωσφο-Ser

450-Akt, αντι-Akt, αντι-φωσφο-Ser

15-ρ53, αντι-PARP και κουνέλι μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-rictor αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, CA, USA). ποντικού μονοκλωνικό αντι-ρ53 και αντι-ΟΑΡϋΗ αντισώματα ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) και Abcam (Cambridge, ΜΑ, USA), αντίστοιχα. Goat αντι-ποντικού και δευτερογενή αντισώματα αντι-κουνελιού ήταν από την Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA). Rictor και p53 siRNA αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, CA, USA). Ελέγχου siRNA ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Lipofectamine 2000, RNase Α, Ν, Ν, Ν ‘, Ν’-τετραμεθυλ-αιθανο-1,2-διαμίνη (TEMED), ΤΚΙζοΙ και βαφή ROX ήταν από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). RNeasy Mini Kit ήταν από την Qiagen (Valencia, CA, USA). Αδενοϊός κατασκευάσματα που περιέχουν τα wt-p53 και eGFP μεταγραφές ήταν από την Vector Biolabs (Philadelphia, ΡΑ, USA). Epoxomycin και λακτακυστίνη ήταν από EMD Χημικών (Gibbstown, NJ, USA). Ζ-DEVD-FMK και Ζ-VAD-FMK ήταν από Tocris Bioscience (Ellisville, ΜΟ, USA). Rictor και GAPDH RNA αστάρι ήταν από Bioneer (Daejeon, Κορέα) και ανθρώπινη ανασυνδυασμένη δραστική κασπάση 3 ήταν από BioVision (Mountain View, CA, USA). ΣΩΛΗΝΕΣ, DL-διθειοθρεϊτόλη (DDT), αιθυλενοδιαμινο-τετραοξικό οξύ (EDTA) και 3 [(3-χολαμιδο-προπυλ) dimethyallonio] -1-προπανοσουλφονικό ένυδρο (Chaps) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (Saint Louis, ΜΟ, USA) .

κυτταρικές σειρές και Πολιτισμού

ευαίσθητα CDDP (OV2008 και τα A2780S) και ανθεκτικά (C13 *, OVCAR-433, A2780cp, OCC-1, και SKOV3) ανθρώπινες κυτταρικές σειρές OVCA ήταν γενναιόδωρα παρέχεται από τους Δρ. Rakesh Goel και Barbara Vanderhyden (Ottawa Νοσοκομείο Κέντρο Καρκίνου, Ottawa, ON, Καναδάς). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 και DMEM /F-12 όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [20,21,36]. Η OV2008 κυτταρική γραμμή και ανθεκτικό ομόλογό του C13 * προήλθαν από ενδομητριοειδές αδενοκαρκίνωμα των ωοθηκών με πλακώδη διαφοροποίηση. OCC-1, τα A2780S και A2780cp κύτταρα προέρχονταν από αδιαφοροποίητα καρκινώματα ωοθηκών. κύτταρα SKOV3 ήταν σαφής προέλευση καρκίνωμα [39] και OVCAR433 κύτταρα ήταν ορώδους cystadenocarcinomas των ωοθηκών [23]. Μετά τις υποδεικνυόμενες θεραπευτικές αγωγές, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση.

εκχύλιση πρωτεϊνών και ανάλυση κηλιδώσεως Western

Οι διαδικασίες για την εκχύλιση των πρωτεϊνών και ανάλυση Western blotting πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [40]. Οι μεμβράνες επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα με αντι-rictor (1: 100), φωσφο-Ser

473-Ακί (1: 1000), φωσφο-Ser

450-Ακί (1: 1000), ρ53 ( 1: 5000), φωσφο-Ser

15-p53 (1: 1000) και PARP (1: 2000) αντισώματα και 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου για αντι-GAPDH (1: 10.000) και HRP-συζευγμένο κουνέλι ή ποντίκι δευτερογενή αντισώματα (1: 5.000 με 1: 10.000). GAPDH επελέγη ως έλεγχος φόρτωσης αφού κυτταρικό περιεχόμενο του στα OVCA κύτταρα εξετάζονται στις τρέχουσες μελέτες δεν επηρεάζεται από κατεργασία CDDP. πυκνότητες Band αναλύθηκαν για την ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας ένα ChemiDOC

TM XRS + (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)

Αξιολόγηση της απόπτωσης

Η απόπτωση αξιολογήθηκε με βάση την κυτταρική μορφολογία, χρησιμοποιώντας το πυρηνική χρώση Hoechst 33258. Η διαδικασία εκτελείται όπως περιγράφεται προηγουμένως [20,36]. Ένα ελάχιστο 400 κύτταρα ανά ομάδα θεραπείας μετρήθηκαν και ο μετρητής δεν γνώριζε για την αποφυγή πειραματικών προκατάληψη

siRNA διαμόλυνση

OVCA κύτταρα επιμολύνθηκαν με rictor siRNA (0-100 ηΜ? 48 h). , ρ53 siRNA (100 ηΜ? 48 ώρες), ή να ελέγξουν siRNA (0-100 ηΜ? 48 ώρες) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία στη συνέχεια με CDDP (0-10 μΜ? 24 h), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20], και συλλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση .

αδενοϊική μόλυνση

A2780cp και SKOV3 κύτταρα μολύνθηκαν με wt αδενοϊικό-p53 (ΜΟΙ = 10? 24 h? GFP ως έλεγχος) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9,20]

.

In vitro κασπάσης-3 δραστικότητα

Η δοκιμασία δραστηριότητα in vitro κασπάσης-3 πραγματοποιήθηκε με κυτταρολύματα των Ον2008 σύνολό της, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23].

Στατιστική ανάλυση

αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική ανάλυση έγινε με paired t-test, και μονόδρομη ή αμφίδρομη ΑΝΟνΑ όπως αρμόζει, χρησιμοποιώντας SigmaPlot® 12 (Systat Software Suite, IL, USA). Οι διαφορές μεταξύ των πολλαπλών πειραματικές ομάδες προσδιορίζεται με τη δοκιμή post-hoc Bonferroni. Η στατιστική σημαντικότητα συναχθεί σε P 24 ώρες κατά τη διάρκεια της θεραπείας με CDDP (0-10 μΜ)] με αναστολείς πρωτεασώματος epoxomycin (10 ηΜ) και λακτακυστίνη (4 μΜ). Ενώ CDDP μόνο του σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται ανέπαφο rictor και απόπτωση, όπως ήταν αναμενόμενο, η παρουσία των αναστολέων μπλοκαριστεί εντελώς επάγεται από την CDDP rictor κάτω ρύθμιση και σημαντικά, αλλά όχι πλήρως εξασθενημένου απόπτωση, όπως αποδεικνύεται από διάσπαση PARP και πυρηνική μορφολογία (Ρ & lt? 0.001? Σχήμα 3: α.)

Α. Ον2008 κύτταρα προκατεργάστηκαν (30 λεπτά) με τους αναστολείς του πρωτεασώματος [epoxomycin (10 ηΜ) και lacytasystin (4 μΜ)] και υποβλήθηκε σε πρόκληση CDDP (0-10 μΜ? 24 h). περιεχόμενο Rictor και την απόπτωση αναλύθηκαν με κηλίδωση Western και την αξιολόγηση της πυρηνικής μορφολογίας. Τόσο epoxomicin και λακτακυστίνη μπλοκάρει αποτελεσματικά CDDP που προκαλείται υποβάθμιση rictor (P & lt? 0.001), αλλά μόνο μερικώς εξασθενημένα απόπτωση. κύτταρα Β Ον2008 καλλιεργήθηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες όπως στο Α, αλλά προεπεξεργασία με αναστολέα πρωτεασώματος και /ή Ζ-DEVD (50 μΜ). Δεν παρατηρήθηκε συνεργική δράση μεταξύ των δύο αναστολέων. C. Η επώαση των Ον2008 λύματος ολόκληρων κυττάρων (30 min, 30 ° C) με ανασυνδυασμένη δραστική κασπάση-3 (5-20 μg /ml) είχε ως αποτέλεσμα διάσπαση Rictor όπως αποδεικνύεται από μειωμένη ανέπαφο περιεχόμενο rictor (200 kDa) και αυξήθηκαν κατά την σχάση μορφές (130 kDa και 160 kDa). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001 (έναντι των αντίστοιχων ελέγχων). Hoechst χρώση 33258 χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της απόπτωσης, όπως αναφέρεται σε πειραματικές διαδικασίες.

Η

Στη συνέχεια διερευνηθεί περαιτέρω εάν η μεταποίηση rictor από κασπάσης-3 δραστηριότητα και η υποβάθμιση του πρωτεασώματος συμβαίνει σε ξεχωριστές πορείες. Ον2008 κύτταρα καλλιεργήθηκαν [προεπεξεργασίας 30 λεπτά? 24 ώρες κατά τη διάρκεια της θεραπείας με CDDP (0-10 μΜ)] με αναστολείς πρωτεασώματος και /ή ειδικός αναστολέας κασπάσης-3. Τα ίδια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν είτε αναστολέα ήταν παρούσα. Ωστόσο, δεν απαιτείται επιπλέον επίδραση παρατηρήθηκε όταν οι δύο αναστολείς χρησιμοποιήθηκαν μαζί [Σχήμα 3: Β]

Επιπλέον, για να παρέχουν επιπλέον αποδείξεις ότι η επεξεργασία rictor επάγεται από την αγωγή CDDP είναι λύματα κασπάσης-3 εξαρτώμενη, ολόκληρων κυττάρων από. Ον2008 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για να εκτελέσει μια

in vitro

δοκιμασία δραστικότητας κασπάσης-3. Η

in vitro

δεδομένα ήταν σε συμφωνία με εκείνη που λαμβάνεται από το πείραμα κυτταρική γραμμή [Εικόνα 3: C]. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι CDDP ρυθμίζει προς τα κάτω ακέραια rictor στο επίπεδο της πρωτεΐνης μέσω της κασπάσης-3 διάσπαση και την υποβάθμιση του πρωτεασώματος.

Rictor νοκ ντάουν ευαισθητοποιεί χημειο-ανθεκτικά OVCA σε CDDP-επαγόμενη απόπτωση

για να διαπιστωθεί ο ρόλος των rictor σε OVCA χημειοαντίσταση, έκφραση rictor σε wt-p53 χημειοθεραπεία OVCA κυτταρική γραμμή (C13 *) σίγησε με siRNA (0, 50 και 100 ηΜ? 48 ώρες) πριν από την αγωγή με CDDP (10 μΜ? 24 h), και η απόπτωση αξιολογήθηκε. Ακέραια rictor και διασπασμένης μορφές της ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται από siRNA σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Μια σημαντική μείωση σε ανέπαφα rictor και διασπάται rictor παρατηρήθηκαν στα 50 ηΜ (ρ & lt? 0,05) και σε μια κατά προσέγγιση 30% μείωση στα 100 ηΜ, ανεξάρτητα από την παρουσία του CDDP. Αυτά τα ευρήματα όχι μόνον επιβεβαίωσε ότι η 160kDa και 130 kDa ζώνες ανοσοαντιδραστικά πράγματι διασπάται προϊόντα rictor, αλλά έδειξαν επίσης ότι rictor knockdown επαγόμενη απόπτωση (ρ & lt? 0,05), καθώς και αυξημένη CDDP επαγόμενη απόπτωση σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (ρ & lt? 0,001) [Σχήμα 4]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι rictor είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της αντίστασης CDDP σε OVCA

C13 * κύτταρα επιμολύνθηκαν με rictor siRNA. (0-100 ηΜ? 48 ώρες) και καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς CDDP (10 μΜ? 24 h ). Rictor knockdown ενισχύεται σημαντικά CDDP επαγόμενη απόπτωση σε C13 * κύτταρα σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,05, *** p & lt? 0.001 (έναντι αντίστοιχων CTL siRNA). Hoechst χρώση 33258 χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της απόπτωσης, όπως αναφέρεται σε πειραματικές διαδικασίες.

Η

απόκριση αποπτωτικά να CDDP εξής rictor κάτω ρύθμιση εξαρτάται από την κατάσταση της ρ53

Το ογκοκατασταλτικό ρ53 είναι ένας σημαντικός μεσολαβητής της CDDP απόπτωση [9,22]. Δεδομένου ότι περίπου το 50% των ασθενών που φέρουν OVCA

ΤΡ53

γονιδιακή μετάλλαξη (-εις) [41], είναι ενδιαφέρον να προσδιοριστεί εάν CDDP επαγόμενη απόπτωση σε χημειοθεραπεία κύτταρα μετά rictor knockdown εξαρτάται από την παρουσία ενός λειτουργικού ρ53 . Για να διερευνήσουν αυτή την πιθανότητα, η έκφραση rictor σε χημειοθεραπεία OVCA κυτταρικές σειρές με διαφορετικό καθεστώς p53 (wt-p53, C13 * και OVCAR433? P53-μεταλλαγμένο, OCC1 και A2780cp? P53-null, SKOV3) σίγησαν με rictor siRNA (100 nM siRNA, 48 ώρες) πριν από την αγωγή με CDDP (0-10 μΜ, 24 ώρες). Rictor knock-down ευαισθητοποιημένα σημαντικά στη χημειοθεραπεία WT κύτταρα-p53 (C13 * και OVCAR433, Σχήμα 5: Μια? Ρ & lt? 0.001) αλλά όχι p53-ανεπαρκή κύτταρα (OCC1, Σχήμα 6: Μια? A2780cp και SKOV3, Σχήμα 5: Β) προς CDDP απόπτωση, υποδηλώνοντας ότι ενδέχεται να χρειαστούν μία λειτουργική ρ53 για CDDP επαγόμενη απόπτωση στα χημειοθεραπεία OVCA κυττάρων με rictor knockdown. Για να διερευνηθεί περαιτέρω αυτή η υπόθεση, CDDP-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές OVCA που φιλοξενούν μια μετάλλαξη ρ53 (A2780cp) και μια γραμμή ρ53-ηυΙΙ (SKOV-3) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA rictor (0-100 ηΜ? 48 ώρες), που ακολουθείται από ανασύσταση κ.β. -ρ53 μέσω αδενοϊική μόλυνση (0-10 ΜΟΙ? 24 h) και αγωγή CDDP (0-10 μΜ CDDP? 24 h). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5: Β, ενώ rictor knockdown μόνο δεν αυξάνει σημαντικά την ευαισθησία CDDP σε απουσία του wt-p53, WT-ρ53 ανασύσταση ενισχύεται σημαντικά τις επιδράσεις της rictor-knockdown επί επάγεται από την CDDP περιεκτικότητα Ser15 φωσφο-ρ53 και την απόπτωση σε δύο κυτταρικές σειρές p53-ανεπαρκή (P & lt? 0.001).

κυτταρικές σειρές χημειοθεραπεία OVCA με διαφορετικό καθεστώς p53 (wt-p53, C13 * και OVCAR433? p53-μεταλλαγμένο, OCC1 και A2780cp? p53-null, SKOV3) επιμολύνθηκαν με rictor siRNA (100 ηΜ siRNA, 48 ώρες) με ή χωρίς αδενοϊική μόλυνση wt-p53 (0-10 ΜΟΙ? 24 h? ρ53-ελλειπή κύτταρα) και αγωγή CDDP (0-10 μΜ CDDP? 24 h). Rictor, ρ-ρ53 Ser15, ρ53, αξιολογήθηκαν PARP και το περιεχόμενο GAPDH, καθώς επίσης και την απόπτωση. Rictor knock-down σημαντικά ευαισθητοποιημένα χημειοθεραπεία WT κύτταρα-p53 (Α, C13 * και OVCAR433? Ρ & lt? 0.001) αλλά όχι p53-difficient κύτταρα (A, OCC1? Β, A2780cp και SKOV3) προς CDDP (10 μΜ) προκληθείσα απόπτωση. Ανασύσταση σε A2780cp και SKOV-3 του wt-p53 ενίσχυσε σημαντικά CDDP-επαγόμενη απόπτωση (Ρ & lt? 0.001). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001 (έναντι αντίστοιχων CTL siRNA), # # # p & lt? 0,05 (vs ελέγχει αδενοϊό λοίμωξη). Hoechst χρώση 33258 χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της απόπτωσης, όπως αναφέρεται σε πειραματικές διαδικασίες.

Η

κύτταρα στη χημειοθεραπεία OVCA (C13 *) επιμολύνθηκαν με rictor siRNA (100 ηΜ siRNA, 48 h) και προκατεργάστηκαν με epoxomycin (0 -12,5 ηΜ) 30 λεπτά πριν από την αγωγή CDDP (0-10 μΜ CDDP? 24 h). Rictor, αξιολογήθηκαν Akt, φωσφο Akt (Thr450 και Ser473), και το περιεχόμενο GAPDH, καθώς επίσης και την απόπτωση. Rictor knock-down σημαντικά βελτιωμένη CDDP-επαγόμενη απόπτωση σε χημειοθεραπεία OVCA κύτταρα (P & lt? 0.01 και η P & lt? 0.001, αντίστοιχα) και η επίδραση αυτή διασώθηκε από epoxomycin (P & lt? 0,05 και p & lt? 0.001, αντίστοιχα) Σύνολο-Akt μειώθηκε σημαντικά κατά τη διάρκεια της rictor φίμωση με τη θεραπεία CDDP (P & lt? 0,05) και μια μαζική αύξηση στην αναλογία μεταξύ φωσφο-Akt (Ser473) και συνολικό-Akt παρατηρήθηκε επίσης, η οποία μειώθηκε σημαντικά όταν epoxomycin προστέθηκε (Ρ & lt? 0.001 και P & lt? 0,05, αντίστοιχα) τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001 (έναντι αντίστοιχων CTL siRNA), # # p & lt? 0,01, # # # p & lt? 0,05 (vs χωρίς epoxomycin). Hoechst χρώση 33258 χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της απόπτωσης, όπως αναφέρεται σε πειραματικές διαδικασίες.

Η

Rictor κάτω ρύθμιση ευαισθητοποιεί χημειοθεραπεία κύτταρα σε CDDP-επαγόμενη απόπτωση με τη διευκόλυνση της Akt υποβάθμιση του πρωτεασώματος

Rictor είναι γνωστή να απαιτείται για να φωσφορυλιώσει mTORC2 Akt σε Ser473. Για να εξετάσει εάν και πώς Akt είναι σχετικό με αυτό το φαινόμενο, χημειοθεραπεία OVCA κύτταρα (C13 *) έκφραση rictor σίγησε με siRNA (100 nM? 48 ώρες) πριν από την προ-θεραπεία με epoxomycin (12,5 nM? 30 λεπτά) και τη θεραπεία με το CDDP (10 μΜ? 24 ώρες), και η απόπτωση αξιολογήθηκε. Rictor knockdown μόνος αυξημένη περιεκτικότητα σε φωσφο-Ακί (Ser473), αλλά μείωσε τα επίπεδα της φωσφο-Ακί Ser450 [Εικόνα 6], μια θέση φωσφορυλίωσης που είναι γνωστό ότι ρυθμίζεται Akt σταθερότητα [18]. Η αύξηση της φωσφορυλίωσης της Akt στην Ser473 παρακάτω rictor αποσιώπηση χωρίς τον αναστολέα του πρωτεασώματος συνοδεύτηκε από Akt κάτω ρύθμιση (P & lt? 0,05 στην ομάδα θεραπείας) και διασώθηκε από αναστολέα του πρωτεασώματος (p & lt? 0,05). επαγωγή απόπτωση ανεξάρτητα από την παρουσία του CDDP, δύο απαντήσεις εξασθενημένο από την παρουσία του epoxomycin αναστολέα πρωτεασώματος (Σχήμα 6? Ρ & lt? 0,05 και Ρ & lt? 0.001 στον έλεγχο και ομάδες αγωγής CDDP αντίστοιχα). Επιπλέον, η αναλογία μεταξύ φωσφο-Akt στο Ser473 και ολική Akt επίσης σημαντικά αυξημένη σε rictor knockdown με CDDP-θεραπεία και μειώθηκε σημαντικά όταν epoxomicin προστέθηκε (Ρ & lt? 0.001 και ρ & lt? 0,05? Με και χωρίς epoxomycin, αντίστοιχα). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι rictor παίζει ένα ρόλο στη σταθεροποίηση Akt και την αντίσταση CDDP σε ανθρώπινο OVCA και νοκ ντάουν της προωθεί Akt υποβάθμιση του πρωτεασώματος και ενισχύει την ευαισθησία CDDP.

Συζήτηση

χημειοαντίσταση είναι ένα σημαντικό θεραπευτικό εμπόδιο στην ωοθηκών καρκίνο και κυτταρικός μηχανισμός του είναι πολύπλοκη και ελάχιστα κατανοητή. Αν και το μονοπάτι σηματοδότησης mTOR είναι γνωστό ότι προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση, αν rictor εμπλέκεται στον έλεγχο της χημειοευαισθησίας είναι άγνωστη. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε το ρόλο της στην ανθεκτικότητα rictor CDDP χρησιμοποιώντας CDDP-ευαίσθητων και ανθεκτικών κυτταρικών γραμμών OVCA με διαφορετικό καθεστώς ρ53. Έχουμε αποδείξει για πρώτη φορά ότι rictor είναι ένας καθοριστικός παράγοντας της αντίστασης CDDP σε OVCA. CDDP ρυθμίζει προς τα κάτω το περιεχόμενο rictor σε νόσο ευαίσθητη κύτταρα με κασπάση-3 και πρωτεασώματος εξαρτώμενη από υποβάθμιση, αλλά καμία παρόμοια επίδραση παρατηρήθηκε σε ανθεκτικά κύτταρα. Επιπλέον, έχουμε δείξει ότι καταστέλλει rictor CDDP επαγόμενη απόπτωση και προσδίδει αντίσταση με ενεργοποίηση και σταθεροποίηση των Akt. Σίγαση rictor ευαισθητοποιεί χημειοθεραπεία OVCA κυττάρων σε CDDP απόπτωση σε κύτταρα που φιλοξενούν άγριου τύπου ρ53, αλλά όχι σε κύτταρα p53-παραβιαστεί εκτός ανασυσταθεί με ένα λειτουργικό ρ53. Στο σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι rictor κάτω ρύθμιση ευαισθητοποιεί χημειοθεραπεία OVCA κύτταρα για τη θεραπεία CDDP με τη διευκόλυνση της Akt-εξαρτώμενη αποδόμηση του πρωτεασώματος, κατά τρόπο που εξαρτάται από την κατάσταση του p53.

τρέχουσα έρευνα μας δείχνει ότι rictor είναι κάτω -regulated σε πρωτεΐνη, αλλά δεν επίπεδο mRNA (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και η διαδικασία αυτή συνδέεται με CDDP-επαγόμενη απόπτωση σε ευαίσθητες OVCA κύτταρα και ότι rictor παίζει ένα ρόλο στον καθορισμό της κυτταρικής τύχης. Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζεται περαιτέρω με τα αποτελέσματα με τη χρήση διαφόρων στη χημειοθεραπεία OVCA κυτταρικές γραμμές με διαφορετικό καθεστώς ρ53, από το ότι η αποτυχία της CDDP να μειορυθμίζουν περιεχόμενο rictor επιτρέπει στα κύτταρα να επιβιώσουν θεραπεία CDDP. Ο ρόλος των rictor στην κυτταρική επιβίωση έχει προηγουμένως επιδειχθεί, και μία μελέτη έχει αντιμετωπιστεί την αντίληψη ότι rictor και πρωτεϊνών στο μονοπάτι mTOR είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω μέσω του πρωτεασώματος-ουβικιτίνης πορείας στα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα μετά χημειοθεραπευτική πρόκληση, η πιθανή συμμετοχή του rictor επεξεργασία στον έλεγχο της χημειοευαισθησία δεν απευθυνόταν [26]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι CDDP προκαλεί rictor κάτω ρύθμιση, μέσω του πρωτεασώματος είναι σε συμφωνία με αυτό το εύρημα. Επιπλέον, το παρόν μελέτες μας έχουν επεκτείνει τις παραπάνω διαπιστώσεις, αποδεικνύοντας ότι κασπάσης-3 απαιτείται για την CDDP επαγόμενη από την επεξεργασία rictor στη νόσο ευαίσθητη ανθρώπινη OVCA κύτταρα. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι rictor προσδίδει αντίσταση CDDP σε ανθρώπινο OVCA και επάγεται από την CDDP rictor κάτω ρύθμιση εξαρτάται τόσο κασπάσης-3 δραστικότητα και η υποβάθμιση του πρωτεασώματος σε νόσο ευαίσθητη, αλλά όχι σε χημειοθεραπεία OVCA κυτταρικές σειρές.

Tumor καταστολέα

ΤΡ53

είναι επίσης ένα από τα πιο συχνά μεταλλαγμένα γονίδια στο ανθρώπινο OVCA, και θα μπορούσε να είναι τόσο υψηλή όσο το 50% σε ασθενείς OVCA [41]. Απώλεια ή μετάλλαξη του p53 μπορεί να έχει τεράστια επίδραση στην επιθετικότητα του όγκου, την πρόγνωση και την επιτυχή Εφαρμογή του θεραπείας [42]. Επειδή ο μηχανισμός CDDP αντοχής είναι πολυπαραγοντική και η κατάσταση ρ53 είναι μία από τις μεγαλύτερες ανησυχίες στην ανθρώπινη OVCA, ερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ rictor και ογκοκατασταλτικό ρ53, στην πτυχή της χημειοαντίσταση. Η έρευνά μας, ως εκ τούτου, περαιτέρω αναφέρεται στο ρόλο των rictor στην αντίσταση CDDP και δείχνει ότι rictor knockdown προάγει όχι μόνο την απόπτωση, αλλά επίσης ενισχύει CDDP απόπτωση σε ανθρώπινα κύτταρα OVCA. Αυτό το αποτέλεσμα συσχετίζεται με μια πρόσφατη μελέτη που δείχνει ότι η στόχευση του rictor αποτρέπει τη μετανάστευση των κυττάρων και προάγει την απόπτωση στον καρκίνο του μαστού [23]. Τα αποτελέσματα από την τρέχουσα μελέτη μας δείχνουν επίσης ότι η ευαισθητοποίηση χημειοθεραπεία OVCA κύτταρα με αποσιώπηση rictor φαίνεται να εξαρτάται από την κατάσταση του p53. Αυτή η έννοια υποστηρίζεται περαιτέρω από την παρατήρηση ότι ένας συνδυασμός rictor knockdown και ανασύσταση του wt-p53 αυξάνει απόπτωση σε κύτταρα p53-διακυβεύεται όταν επάγεται από την αγωγή CDDP, ένα αποτέλεσμα που δεν συμβαίνω τελικά χωρίς wt-p53. Η τελευταία απόκριση είναι ταυτόχρονη με την αύξηση της ενεργοποίησης p53 μέσω φωσφορυλίωσης στο υπόλειμμα Ser15, η οποία αλλάζει τη δομή της πρωτεΐνης ρ53 και αναστέλλει την αλληλεπίδραση p53-MDM2, σταθεροποιώντας έτσι p53 [35]. Αυτό θα μπορούσε να είναι ο λόγος για τη σταθεροποίηση της ρ53 παρατηρήθηκε σε A2780cp και SKOV-3 με την παρουσία φωσφο-ρ53 (Ser15). Στο σύνολό τους, αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι rictor knockdown προκαλεί απόπτωση και ενισχύει CDDP-επαγόμενη απόπτωση σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο.

Το μονοπάτι σηματοδότησης Akt είναι ένας καθοριστικός παράγοντας της χημειοαντίσταση και η ενεργοποίηση του προωθεί ένα χημειοθεραπεία φαινότυπο, ανιχνεύονται συχνά σε τόσο υψηλό όπως 87% των περιπτώσεων σε ανθρώπινο OVCA [10].