Αφηρημένο

ανθρώπινης τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης (hTERT) είναι το βασικό ένζυμο που είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση και τη διατήρηση των τελομερών σε τα άκρα των χρωμοσωμάτων, και είναι απαραίτητο για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Αυτό έχει κάνει hTERT επίκεντρο της έρευνας της ογκολογίας και ένα ελκυστικό στόχο για την ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων. Σε αυτή τη μελέτη, σχεδιάσαμε ένα μικρό RNA παρεμβολής (siRNA) που στοχεύουν στην καταλυτική υπομονάδα hTERT και δοκιμάζονται τα αποτελέσματά του στην ανάπτυξη του τελομεράση θετικά ανθρώπινα κύτταρα κόλου SW480 καρκινώματος in vitro, καθώς επίσης και για την ογκογονικότητα αυτών των κυττάρων σε γυμνά ποντίκια . Παροδική και σταθερή επιμόλυνση του hTERT siRNA σε κύτταρα κόλου SW480 καρκίνος κατασταλεί έκφραση hTERT, μειωμένη δράση της τελομεράσης και ανέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη και πολλαπλασιασμό. Να χτυπήσει κάτω έκφρασης hTERT σε όγκους SW480 ξενομοσχεύτηκε σε γυμνά ποντίκια επιβράδυνε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου και προώθησε την απόπτωση των καρκινικών κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι hTERT εμπλέκεται στην καρκινογένεση του ανθρώπινου καρκινώματος του παχέος εντέρου, και τονίζουν τις θεραπευτικές δυνατότητες μιας προσέγγισης knock-down hTERT

Παράθεση:. Liu AQ, Ge LY, Lu XL, Luo XL, Cai YL , Ye XQ, et al. (2014) αποσιώπηση του γονιδίου hTERT από shRNA Αναστέλλει του καρκίνου παχέος εντέρου SW480 ανάπτυξη κυττάρων

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 9 (9): e107019. doi: 10.1371 /journal.pone.0107019

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 Οκτώβρη 2013? Αποδεκτές: 14 Απριλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 10 Σεπτεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών του Guangxi (επιχορήγηση 2010GXNSF013238, https://www.gxst.gov.cn/zwgk/kjxmgl/xmxdgg/600619_7.shtml) και τα προγράμματα για Changjiang μελετητές και Καινοτόμες ομάδες Έρευνας στο Πανεπιστήμιο (Νο IRT1119). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ορθοκολικού καρκινώματος είναι ο τρίτος συχνότερος καρκίνος παγκοσμίως και η τέταρτη πιο συχνή αιτία θανάτου [1] – [2]. Μόνο το 2008, περίπου 1.230.000 νέες περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου διαγνώστηκαν σε όλο τον κόσμο, και 608.000 άνθρωποι έχασαν τη ζωή τους από την ασθένεια [3]. Η τυπική θεραπεία για αυτόν τον καρκίνο είναι η χειρουργική, αλλά τα αποτελέσματα δεν είναι καθόλου ικανοποιητική, με έως και 50% των ασθενών που πάσχουν υποτροπής ή θανάτου εντός 5 ετών από τη χειρουργική επέμβαση [4].

Στόχευση της τελομεράσης σε καρκίνωμα του παχέος εντέρου μπορεί να παρέχει μια αποτελεσματική εναλλακτική λύση ή συμπληρωματικά προς τη χειρουργική θεραπεία. Η τελομεράση, ένα σύμπλοκο ριβονουκλεοπρωτεΐνης που περιέχει ένα εσωτερικό πρότυπο RNA (hTR) και μια καταλυτική πρωτεΐνη με δραστικότητα ανάστροφης μεταγραφάσης τελομερούς-ειδική (hTERT), εκτείνεται τελομερή στο τέλος των ευκαρυωτικών χρωμοσωμάτων, αποτρέποντας έτσι κυτταρική γήρανση και τον θάνατο. Η τελομεράση φαίνεται ότι παίζει βασικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου και τον πολλαπλασιασμό: έκφραση και δραστικότητα του ενζύμου είναι παθολογικά αυξημένη σε περισσότερες μορφές καρκίνου [5] – [6], και τα κάτω ρύθμιση της ένζυμο αναστέλλει την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό [7]. Ενώ hTR είναι ιδιοσυστατικά παρόν σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα, hTERT είναι το περιοριστικό του ρυθμού συστατικό του συμπλόκου τελομεράσης, και η έκφρασή του συσχετίζεται με τη δράση της τελομεράσης [8]. Σε κανονική σωματικούς ιστούς, η δραστικότητα hTERT καταστέλλεται, αλλά και οι δύο την έκφραση hTERT και τη δράση της τελομεράσης είναι αυξημένα στους περισσότερους ανθρώπινους όγκους [9] – [10]. Αρκετές μελέτες δείχνουν ότι η τελομεράση μπορεί να είναι το κλειδί για την απαθανάτιση κυττάρων ως αναγκαίο βήμα για την ογκογένεση [11] – [12]., Καθιστώντας hTERT ένα δυνητικά χρήσιμο κλινικό βιοδείκτη [13] και ο στόχος για την αντικαρκινική έρευνα [14]

σε καρκίνο του παχέος εντέρου, μέχρι και το 85% των κυττάρων περιέχουν δραστικές τελομεράσης, ενώ μόνο περίπου 5% της κανονικής του παχέος κύτταρα περιέχουν ενεργό ένζυμο. Ως εκ τούτου, με στόχο την έκφραση ή δραστικότητα τελομεράσης μπορεί να παρέχει μια νέα θεραπεία για καρκίνο του παχέος εντέρου. Δεδομένου ότι δεν εξαιρετικά επιλεκτικοί αναστολείς τελομεράσης είναι διαθέσιμα για τη θεραπεία του καρκίνου οποιαδήποτε, εστιάσαμε στην προσεγγίσεις γονιδιακής θεραπείας. Η γονιδιακή θεραπεία αναμένεται να παίξει σημαντικό ρόλο στην θεραπεία του καρκίνου επόμενης γενιάς σε συνδυασμό με συμβατικές θεραπείες όπως η χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία και [15]. Μία γονιδιακή θεραπεία είναι RNA παρεμβολής (RNAi), η οποία μπορεί να ρυθμίζουν προς τα κάτω ( «knock-down») την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων, επιτρέποντας οι λειτουργίες των γονιδίων που πρόκειται να αναλυθεί ή να μπλοκαριστεί για θεραπευτικούς σκοπούς [16] – [18].

στην παρούσα μελέτη, σχεδιάσαμε μία νέα hTERT μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) και εξέφρασε την αντίστοιχη μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) σε ανθρώπινα κύτταρα ορθοκολικού in vitro και σε γυμνούς ποντικούς. Βρήκαμε ότι η κατεδάφιση της έκφρασης hTERT ανέστειλε την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου του ανθρώπου, αυξάνοντας την πιθανότητα των προσεγγίσεων γονιδιακής θεραπείας που στοχεύουν hTERT.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινο παχύ έντερο κυτταρικές γραμμές καρκινώματος SW480, DLD-1, και ΗΤ29 (Academia Sinica Τράπεζας κυττάρων, Σαγκάη, Κίνα) αναπτύχθηκαν σε χαμηλής γλυκόζης τροποποιημένο μέσο του Dulbecco Eagle (SW480) ή μέσο RPMI-1640 (DLD-1 και ΗΤ29) (GibcoBRL, Μεγάλο Island, ΝΥ, USA) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό, 100 IU /mL πενικιλλίνη και 10 mg /mL στρεπτομυκίνη. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C.

Δήλωση και Ζώα Δεοντολογίας

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρή συμφωνία με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση του Εργαστηρίου τα ζώα των ΗΠΑ Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας, και το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα της Guangxi Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και την ταλαιπωρία που είχε ελαχιστοποιείται όσο το δυνατόν περισσότερο. Αθυμικά γυμνά ποντίκια (BALB /Οα ηυ /ηυ) ηλικίας 4-5 εβδομάδων (Guangxi Ινστιτούτο Ιατρικών Υλών, Nanning, Κίνα) στεγάστηκαν σε αποστειρωμένα κλουβιά υπό κουκούλες στρωτή ροή αέρα σε ένα συγκεκριμένο άνευ παθογόνου δωμάτιο με 12 ώρες: 12 ώρες φως-σκοτάδι χρονοδιάγραμμα. Τα ζώα τρέφονταν αυτόκλειστο τροφή και νερό κατά βούληση.

RT-PCR για να μετρηθεί η έκφραση του mRNA hTERT σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές

Ολικό RNA εξήχθη από SW480, DLD-1 και κύτταρα ΗΤ29 χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ ( Bio Basic Inc., Canada) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. σύνθεση cDNA πρώτου κλώνου εκτελέστηκε με 2 μg RNA από κάθε κυτταρική σειρά και ιού λευχαιμίας ποντικού Moloney RT (MMLV-RT? ΜΒΙ Fermentas, Amherst, ΝΥ, USA), στη συνέχεια ενισχύθηκε σε 50 μλ μίγματος αντίδρασης που περιέχει 50 mM του καθένα από τα τέσσερα dNTPs, 3 U Taq DNA πολυμεράσης (Promega), και 0.5 mM εκκινητών (Sangon Co., Σαγκάη, Κίνα). Οι εκκινητές 5′-GCTGCTCAGGTCTTTCTTTTATG-3 ‘και 5′-CGACGTAGTCCATGTTCACAA-3′ χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχυθεί ένα 252-bp περιοχή εντός του γονιδίου hTERT. Ως εσωτερικός έλεγχος, η έκφραση της φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης αφυδρογονάσης (GAPDH) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας τους εκκινητές 5’-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3 ‘και 5′-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3’ για την ενίσχυση ενός 450-bp περιοχής. Οι αντιδράσεις ενίσχυσης διεξήχθησαν για 30 κύκλους των 94 ° C για 30 s, 56 ° C για 45 s και 72 ° C για 45 s. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε γέλη αγαρόζης 2,0%, που χρωματίστηκε με χρώση νουκλεϊκού οξέος Ι (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), φωτογραφήθηκαν και αναλύθηκαν ημι-ποσοτικά χρησιμοποιώντας GeneTools Λογισμικό Ανάλυσης (Syngene, Cambridge, UK). Η κυτταρική γραμμή που δείχνει το υψηλότερο επίπεδο της hTERT mRNA επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη.

Σχεδιασμός siRNAs που στοχεύουν hTERT

Τρεις σειρές hTERT siRNA σχεδιάστηκαν όπως περιγράφεται [19]. Οι αλληλουχίες ήταν ως εξής, με τις θέσεις εκκίνησης νουκλεοτιδίων με βάση την έναρξη NCBI για hTERT (ένταξη NM_198253): hTERT-966, 5′-CGGUGUACGCCGAGACCAATT-3 ‘?

hTERT-2862, 5′-GAGCCAGUCUCACCUUCAATT-3 «? και hTERT-2985, 5′-CGGUGUGCACCAACAUCUATT-3 ‘. Παράλληλα, σχεδιάσαμε μία άσχετη αλληλουχία ως αρνητικός έλεγχος για την εξειδίκευση siRNA: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘. Και οι τέσσερις σειρές υποβλήθηκαν σε μια αναζήτηση BLAST έναντι του ανθρώπινου γονιδιώματος για να αποκλείσει την πιθανότητα σημαντική ομολογία με άλλα γονίδια. Οι αλληλουχίες συντέθηκαν χημικά (GenePharma Co., Σαγκάη, Κίνα) και παροδικά διαμολυσμένα σε καλλιέργειες SW480 που είχαν καλλιεργηθεί όλη την νύκτα σε 40-60% συρροή σε πλήρες μέσο χωρίς αντιβιοτικά. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine (GenePharma Co., Σαγκάη, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 48-h επιμόλυνση, αντίστροφη μεταγραφάση (RT) -PCR χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η έκφραση hTERT mRNA. Η hTERT-2985 αλληλουχία βρέθηκε να μειωθεί το επίπεδο του hTERT mRNA στο μεγαλύτερο βαθμό και επομένως επελέγη για περαιτέρω μελέτη.

Κατασκευή ενός hTERT-shRNA ευκαρυωτικού πλασμιδίου έκφρασης

Τα ολιγονουκλεοτίδια RNA 5′-CGGUGUGCACCAACAUCUATT-3 ‘(νοηματικό) και 5′-UAGAUGUUGGUGCACACCGTC-3’ (antisense) συντέθηκαν χημικά (GenePharma Co., Σαγκάη, Κίνα) και ανόπτηση για να σχηματίσουν ένα διπλό με μια συμμετρική προεξοχή δύο deoxythymidines στο 3 ‘ τέλος (hTERT-siRNA). Ένα siRNA δίπολο που περιέχει την άσχετη αλληλουχία 5’-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘(NC-siRNA) συντέθηκε επίσης ως αρνητικός έλεγχος για την εξειδίκευση siRNA. Για την κατασκευή ενός πλασμιδίου που εκφράζει NC- ή hTERT-siRNA για σταθερή επιμόλυνση, τα ανοπτημένα ολιγονουκλεοτίδια 5’-caccgTTCTCCGAACGTGTCACGTcaagagattACGTGACACGTTCGGAGAAtttttt-3 ‘και 5′-caccgCGGTGTGCACCAACATCTAttcaagagaTAGATGTTGGTGCACACCGttttttg-3’ (αλληλουχίες στόχους με κεφαλαία γράμματα) υποκλωνοποιήθηκαν στον PGPU6 /GFP /Neo φορέα (GenePharma). Αυτός ο φορέας εκφράζει κοράλλι πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (cGFP) υπό τον έλεγχο του υποκινητή CMV για να καταστεί δυνατή η παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας επιμόλυνσης. Πλασμίδια που εκφράζουν NC- και hTERT-siRNA είχαν οριστεί, αντίστοιχα, PGPU6 /GFP /Neo-NC-shRNA (στο εξής: NC-shRNA) και PGPU6 /GFP /Neo-hTERT-shRNA. (Στο εξής: hTERT-shRNA)

Παροδική διαμόλυνση κυττάρων SW480

οι καλλιέργειες των 2 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 90% συρροή και επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ NC-shRNA ή hTERT-shRNA χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Παράλληλα, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με την ίδια ποσότητα του Lipofectamine 2000 χωρίς πλασμίδιο shRNA ως έλεγχος. Οι καλλιέργειες συλλέχθηκαν εις τριπλούν μετά την επιμόλυνση για 24, 48, και 72 ώρες.

RT-PCR για να μετρηθεί η έκφραση του mRNA hTERT μετά την επιμόλυνση

Σε κάθε χρονικό σημείο αναφέρεται ανωτέρω, το συνολικό RNA εκχυλίστηκε από επιμολυσμένα SW480 κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ και υποβλήθηκε σε RT-PCR, όπως περιγράφεται παραπάνω.

η ανοσοκυτταροχημεία για να μετρηθεί η έκφραση της πρωτεΐνης hTERT

SW480 κύτταρα απλώθηκαν σε 2,5 cm καλυπτρίδες σε πυκνότητα 5 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 6 φρεατίων. Μετά την επιμόλυνση για 24, 48, ή 72 ώρες, καλυπτρίδες απομακρύνθηκαν και ανοσοχρώση με αντι-hTERT πολύκλωνο αντίσωμα κουνελιού (1:300, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) και το κιτ Maxvision (Maixin, Fuzhou, Κίνα). Σε κάθε καλυπτρίδα, πέντε προβολές επιλέχθηκαν τυχαία και κατέλαβε τη χρήση λογισμικού ανάλυσης εικόνας (Leica, Γερμανία). Σε κάθε άποψη, η κλίμακα του γκρι ένταση μετρήθηκε σε 10 τυχαία επιλεγμένα σημεία και κατά μέσο όρο. Η μέση κλίμακα του γκρι ένταση ήταν αντιστρόφως ανάλογη με το επίπεδο της πρωτεΐνης.

ποσοτικού προσδιορισμού TRAP της δράσης της τελομεράσης

δραστικότητα της τελομεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ ELISA τελομεράση PCR (Roche Diagnostics Scandinavia ΑΒ, Στοκχόλμη, Σουηδία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η δοκιμασία αυτή βασίζεται στο πρωτόκολλο τελομερή επαναλαμβανόμενη ενίσχυση [20]. Μετά SW480 κύτταρα είχαν επιμολυνθεί για 48 ώρες με Lipofectamine 2000 μόνο, NC-shRNA ή hTERT-shRNA, ή αριστερά μη επιμολυσμένα σε μέσο καλλιέργειας ως τυφλό έλεγχο, ολικές κυτταρικές πρωτείνες εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό CHAPS λύσης, και ένα κλάσμα 0,5-μg ήταν δοκιμάστηκαν. Η δοκιμασία συνίστατο σε αντίδραση επιμήκυνσης τελομεράσης-εκκινητή, που ακολουθείται από 26 κύκλους PCR. Τα προϊόντα PCR ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας μία αντίδραση ELISA που βασίζεται χρώμα [20].

δραστικότητα τελομεράσης εκφράστηκε ως προσαρμοσμένη απορρόφηση, που δίνεται από την απορρόφηση σε αυθαίρετες μονάδες στα 450 nm μείον την απορρόφηση σε μήκος κύματος αναφοράς 690 nm . Σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, η μέγιστη απορρόφηση προσαρμοσμένη για τον αρνητικό έλεγχο θα πρέπει να είναι 0,25, ενώ η προσαρμοσμένη απορρόφηση για την αντίδραση θετικού ελέγχου που παρέχονται με το κιτ πρέπει να είναι & gt? 1,5 μετά από 20 λεπτά της αντίδρασης. Τα δείγματα που ορίζονται ως τελομεράση θετικό εάν ρυθμίζεται απορρόφηση ήταν & gt?. 0.2

Η κυτταρομετρία ροής για τη μέτρηση της κυτταρικής ανάπτυξης και του πολλαπλασιασμού

SW480 κύτταρα επιμολυσμένα για 48 ώρες με Lipofectamine 2000 μόνο, NC-shRNA ή hTERT-shRNA, ή αριστερή μη-επιμολυσμένα σε μέσο καλλιέργειας ως τυφλός μάρτυρας, συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) και σταθεροποιήθηκαν επί μία νύκτα με 66% αιθανόλη. Τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν και πλύθηκαν με PBS, μετά επωάστηκαν με 50 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου και 2,5 μg /mL RNase σε PBS για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. περιεχόμενο DNA αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής σε ένα μήκος κύματος εκπομπής 488 nm χρησιμοποιώντας Multicycle λογισμικού (BD Biosciences, USA) [21]. Ο δείκτης πολλαπλασιασμού (ΡΙ) υπολογίστηκε σύμφωνα με τον τύπο: ΡΙ

= [S + (G2 /M)] /{(Ο0 /Ο1) + [S + (G2 /M)]} χ 100 %.

η κυτταρομετρία ροής για τη μέτρηση της απόπτωσης

η απόπτωση μετρήθηκε με διπλή χρώση κυττάρων για αννεξίνη V και DNA (ιωδιούχο προπίδιο) και την ανάλυσή τους με κυτταρομετρία ροής. κύτταρα SW480 επιμολυσμένα για 48 ώρες με Lipofectamine 2000 μόνο, NC-shRNA ή hTERT-shRNA καλλιεργήθηκαν παρουσία των ενδεικνυόμενων συγκεντρώσεων pristimerin, συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, και επωάζονται σε αννεξίνης V ρυθμιστικό δέσμευσης (BD Pharmingen) που περιέχει 0.3% FITC-συζευγμένο αννεξίνης V για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε δέσμευση αννεξίνης V Buffer. ιωδιούχο προπίδιο προστέθηκε ακριβώς πριν από την κυτταρομετρία ροής [21] – [22]. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση FACSDiva Λογισμικού (BD Biosciences).

δοκιμασία TUNEL για τη μέτρηση της απόπτωσης

Το αδιέξοδο Χρωματομετρική ΤΟΥΝΕΛ Συστήματος (Kaiji, Nanjing, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της απόπτωσης σε καλλιέργειες SW480 επιμολυσμένα με Lipofectamine 2000 μόνο, NC-shRNA ή hTERT-shRNA, καθώς επίσης και σε γυμνά ποντίκια ενέθηκαν με φυσιολογικό ορό, NC-shRNA ή πλασμίδια hTERT-shRNA (βλέπε παρακάτω). Για in vitro πειράματα, SW480 κύτταρα τοποθετήθηκαν πάνω σε καλυπτρίδες 2,5-cm και επιμολύνθηκαν για 48 ώρες, μετά την οποία αφαιρέθηκαν και σταθεροποιήθηκαν καλυπτρίδες για τη δοκιμασία TUNEL σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για in vivo πειράματα, φέτες ιστού του όγκου (πάχους 5 μm) παρασκευάστηκαν. Τα πλακίδια σταθεροποιήθηκαν σε 10% ΡΒδ-ρυθμισμένη φορμαλίνη (Kaiji, Nanjing, Κίνα) και διαπερατά με πρωτεϊνάση Κ (Kaiji). Στη συνέχεια, υπέστησαν επεξεργασία slides όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή.

Τα πλακίδια αναλύθηκαν για αποπτωτικά κύτταρα ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, ανασυνδυασμένη τρανσφεράσης τερματική δεοξυνουκλεοτιδυλ είχε χρησιμοποιηθεί για να προσθέσει βιοτινυλιωμένα νουκλεοτίδια στο κιτρικό DNA, χλωριούχο νάτριο και νατρίου προστέθηκαν για να σταματήσει η αντίδραση, και στη συνέχεια τα πλακίδια επωάστηκαν με υπεροξειδάση αρμορακίας-σημασμένη στρεπταβιδίνη. Τέλος, τα πλακίδια επωάστηκαν με ένα μίγμα υπεροξειδίου του υδρογόνου, διαμινοβενζιδίνη χρωμογόνο, και υπόστρωμα υπεροξειδάσης ώστε να χρώση των πυρήνων σκούρο καφέ. Χρωματισμένο slides στη συνέχεια αναλύθηκαν με μικροσκοπία φωτός χρησιμοποιώντας ένα σύστημα λήψης εικόνας (Leica, Germany). Τουλάχιστον 3 πεδία υψηλής μεγέθυνσης εξετάστηκαν σε κάθε διαφάνεια (& gt? 500 κύτταρα συνολικά)., Και ο αποπτωτικό δείκτη (ΑΙ) υπολογίστηκε ως το ποσοστό των κυττάρων που χρωματίζονται παρατηρείται TUNEL θετικών

μετάδοσης ηλεκτρονίου μικροσκοπία ( ΤΕΜ) για την αξιολόγηση αποπτωτική μορφολογία

κύτταρα SW480 επιμολύνθηκαν για 48 ώρες με Lipofectamine 2000 μόνο, NC-shRNA ή hTERT-shRNA και στη συνέχεια συλλέχθηκαν. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν, αμέσως καθορίζεται στο 3% (ν /ν) γλουταραλδεΰδη, σταθεροποιούνται στη συνέχεια εις 1% (ν /ν) τετροξείδιο του οσμίου και χρωματίζονται με 4.8% οξικό ουρανύλιο. Μετά από αφυδάτωση μέσω διαβαθμισμένης σειράς διαλυμάτων αλκοόλης, τα δείγματα ξεπλύθηκαν σε οξείδιο του προπυλενίου και εμποτισμένα με εποξική ρητίνη. Οι υπέρλεπτες τομές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο για να παρέχει αντίθεση για ΤΕΜ, η οποία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός JEM-1230 μικροσκόπιο (JEOL, Japan).

Μέτρηση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) για να αξιολογήσει την απόπτωση

ΜΜΡ μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ροδαμίνη 123 φθορίζουσα χρωστική ως δείκτης (CAS 83702? Sigma, Σαγκάη, Κίνα) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Αυτή η χρωστική έχει ένα μέγιστο διέγερσης στα 488 nm και ένα μέγιστο εκπομπής στα 526 nm. Στην προσέγγιση αυτή, ΜΜΡ θεωρείται ότι ποικίλουν αντίστροφα με ροδαμίνη 123 φθορισμού. κύτταρα SW480 επιμολύνθηκαν για 48 ώρες με Lipofectamine 2000 μόνο, NC-shRNA ή hTERT-shRNA, μετά πλύθηκαν δύο φορές με PBS για να απομακρυνθούν τα νεκρά κύτταρα και επωάστηκαν με ροδαμίνη 123 (0.1 μg /mL) στους 37 ° C για 30 λεπτά. Rhodamine 123 ένταση φθορισμού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Nikon-AE, Japan). Για κάθε πειραματική συνθήκη, η μέση ένταση φθορισμού προσδιορίστηκε για 500 κύτταρα.

hTERT νοκ-κάτω σε ένα γυμνό μοντέλο όγκου ποντικού

SW480 κύτταρα υποδόρια ένεση στο δεξί πλευρό των άτριχων ποντικών σε ένα δόση των 5 × 10

7 κύτταρα ανά ποντικό σε 200 μΙ ϋΜΕΜ αραιωμένου 1:02 σε PBS [24]. Όταν τα οζίδια όγκων είχε αυξηθεί έως 7 mm, οι ποντικοί διαιρέθηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες των 8 ζώων, με κάθε ομάδα που λαμβάνει ένα σύνολο 6 ενέσεων εντός του όγκου φυσιολογικού ορού, 20 μg NC-shRNA ή 20 μg hTERT-shRNA κάθε 2 ημέρες . Τα ζώα παρατηρήθηκαν επί 6 ημέρες μετά την τελευταία ένεση shRNA [25]. μήκος όγκου (L), πλάτος (W) και διάμετρο μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα? όγκος του όγκου (cm

3) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο W

2 × (L /2) [26]. Οι ποντικοί θανατώθηκαν και ουδέτερα δείγματα όγκων σταθεροποιημένο με φορμαλίνη βάφτηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη και εξετάσθηκαν με οπτικό μικροσκόπιο.

Τα επίπεδα του hTERT mRNA και πρωτεΐνης στις τρεις ομάδες γυμνών ποντικών προσδιορίστηκαν, αντίστοιχα, με RT- PCR και ανοσοϊστοχημεία όπως περιγράφεται παραπάνω. δραστικότητα τελομεράσης και την έκταση της απόπτωσης χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία TUNEL μετρήθηκαν επίσης όπως περιγράφεται ανωτέρω.

Στατιστική ανάλυση

Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας SPSS 16.0 (IBM, USA). Οι διαφορές μεταξύ των συνθηκών θεραπείας αξιολογήθηκαν για στατιστική σημασία χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA, ακολουθούμενη από την LSD ή μέθοδος δοκιμασία t του Dunnett. Το όριο για τη σημασία ορίστηκε ως

P

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

ενδογενούς έκφρασης hTERT σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου

Πρώτα προβλήθηκε η SW480 , DLD-1, και τις γραμμές ΗΤ29 να προσδιορίσει ποια είχαν έκφραση mRNA επαρκώς υψηλό για να διευκολύνει hTERT παρεμβολή RNA και ανάλυση των αποτελεσμάτων επί της κυτταρικής ανάπτυξης. RT-PCR έδειξε ότι τα επίπεδα hTERT mRNA ήταν ελάχιστα ανιχνεύσιμη στο DLD-1 κύτταρα και σημαντικά υψηλότερη στα κύτταρα SW480 από ό, τι στα κύτταρα ΗΤ29 (0,827 ± 0,037

vs

0,705 ± 0,051,

P & lt?.

0,05? Εικ. 1Α). Ως εκ τούτου, SW480 κύτταρα επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη.

(Α) έκφραση Ενδογενής hTERT mRNA σε SW480, DLD-1 και κυτταρικές ΗΤ29 γραμμές. Υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των SW480, ΗΤ29 και κύτταρα DLD-1 (

#

P

& lt? 0.01), καθώς και μεταξύ των SW480 και κύτταρα ΗΤ29 (*

P

& lt? 0,05). (Β) Η ισχύς των hTERT siRNAs στα κύτταρα SW480. Τα επίπεδα του mRNA hTERT ήταν σημαντικά χαμηλότερα στα κύτταρα επιμολυσμένα με hTERT siRNAs ό, τι σε κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο (NC) shRNA ή Lipofectamine μόνο (Lipo). *

P

& lt? 0,05,

#

P

& lt? 0,01, σε σύγκριση με τις ομάδες NC-shRNA και Lipo. Τα αποτελέσματα είναι μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Διαλογή για την πιο ισχυρή hTERT siRNA σε καλλιέργειες SW480

Τρεις hTERT-siRNAs (hTERT-966, hTERT-2862, hTERT- 2985) και ένα άσχετο siRNA ως αρνητικός έλεγχος (NC-siRNA) διαμολύνθηκαν παροδικά σε κύτταρα SW480 να προσδιορίσει την siRNA που πλέον ισχυρά κατέστειλαν επίπεδο hTERT mRNA, καθώς και για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα του hTERT προσέγγιση siRNA μας. Τα κύτταρα μάρτυρες επιμολύνθηκαν με αντιδραστήριο Lipofectamine μόνο ( «Lipo») ή με NC-siRNA έδειξε παρόμοια επίπεδα hTERT mRNA (0,823 ± 0,025 και 0,815 ± 0,043, αντίστοιχα?

P

& gt? 0,05). Η επιμόλυνση με οποιαδήποτε από τις τρεις hTERT-siRNAs οδήγησε σε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα hTERT mRNA από επιμόλυνση με NC-siRNA ή Lipo μόνο (Σχήμα 1Β).: HTERT-966, 0.395 ± 0.075? hTERT-2862, 0.650 ± 0.064? hTERT-2985, 0,270 ± 0,056 (όλα

P

& lt? 0,05). Από τις τρεις αλληλουχίες hTERT siRNA που δοκιμάστηκαν, hTERT-2985 αναγνωρίστηκε ως το πιο ισχυρό και επομένως χρησιμοποιούνται για την κατασκευή ενός ευκαρυωτικού πλασμιδίου έκφρασης hTERT-shRNA για περαιτέρω in vitro και in vivo μελέτες.

Η έκφραση του hTERT-shRNA σε SW480 κύτταρα ρυθμίζει προς τα κάτω mRNA και η πρωτεΐνη έκφρασης

επιμολυσμένα SW480 κύτταρα με hTERT-shRNA ή NC-shRNA για 24, 48 και 72 ώρες, στη συνέχεια μετράται η έκφραση των hTERT mRNA και πρωτεΐνης. Στις 48-h επιμόλυνσης, καλλιέργειες ελέγχου έδειξαν παρόμοια επίπεδα mRNA: μέσο καλλιέργειας μόνα τους (Blank), 0,530 ± 0,032? Lipofectamine μόνη της (Lipo), 0,483 ± 0,075? NC-shRNA, 0,447 ± 0,058. Τα επίπεδα του mRNA ήταν σημαντικά χαμηλότερα μετά από 48-ώρες επιμόλυνση με hTERT-shRNA (0.322 ± 0.030?

P

& lt? 0,05 ή

P

& lt? 0,01? Εικ. 2Α). Στην πραγματικότητα, η μείωση της hTERT mRNA είχε ήδη παρατηρηθεί μετά από 24-h διαμόλυνση. Ωστόσο, δεν διαφορές στην έκφραση ΙιΤΕΚΤ mRNA βρέθηκαν μεταξύ των ομάδων μετά από 72-h διαμόλυνση (Εικ. 2Α).

(Α) RT-PCR ανάλυση της έκφρασης hTERT mRNA σε καλλιέργειες SW480 μετά ψευδο-επιμόλυνση με καλλιέργεια μέσο μόνο (Blank), Lipofectamine μόνη της (Lipo), αρνητικό siRNA ελέγχου (NC-shRNA), ή hTERT-shRNA. Επίπεδα mRNA επίπεδα ήταν σημαντικά χαμηλότερα μετά από 48-ώρες επιμόλυνση με hTERT-shRNA ό, τι μετά επιμολύνσεις ελέγχου.

▴

P

& lt? 0,05,

#

P

& lt? 0,01, σε σύγκριση με το Κενό? *

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με το Lipo και NC-shRNA. (Β) Η ανοσοκυτταροχημεία έκφρασης πρωτεΐνης hTERT. (Α) Κενό κύτταρα, (β) Lipo κύτταρα, (γ) κύτταρα NC-shRNA, και (δ) τα κύτταρα hTERT-shRNA. Όλες οι απόψεις, × 400. Υψηλότερη κλίμακα του γκρι τιμή υποδεικνύει χαμηλότερο επίπεδο της πρωτεΐνης. Τα επίπεδα πρωτεΐνης ήταν σημαντικά χαμηλότερα μετά από 48-ώρες επιμόλυνση με hTERT-shRNA ό, τι μετά επιμολύνσεις ελέγχου.

#

P

& lt? 0,01, σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες? *

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με το Κενό. (Γ) hTERT ρύθμιση προς τα κάτω αναστέλλει τη δράση της τελομεράσης. Η δραστικότητα τελομεράσης [προσαρμοσμένη απορρόφηση (450 nm-630 nm)] ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε κύτταρα επιμολυσμένα με hTERT-shRNA ό, τι σε κύτταρα ελέγχου. *

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με την Lipo και τυφλές. Τα αποτελέσματα είναι μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν εξετάσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης hTERT. Ενώ οι τρεις επιμολύνσεις ελέγχου οδήγησε σε ισχυρή χρώση πυρηνική μεμβράνη κίτρινο με άφθονο καφέ σωματίδια στους πυρήνες, επιμόλυνση με hTERT-shRNA οδήγησε σε πολύ ασθενέστερη χρώση (Εικ. 2Β, α-δ). Η ποσοτικοποίηση των αποχρώσεις του γκρι εντάσεων, οι οποίες μεταβάλλονται αντιστρόφως με το επίπεδο της hTERT πρωτεΐνης, έδειξαν ότι το 48-h επιμόλυνση με hTERT-shRNA οδήγησε σε πολύ χαμηλότερα επίπεδα πρωτεΐνης (209.600 ± 17.101) από την επιμόλυνση με μέσο καλλιέργειας μόνο (146.500 ± 22.325), Lipofectamine μόνος (151.800 ± 24.478) ή NC-shRNA (167.350 ± 37.754) (

P

& lt? 0,01? Εικ. 2Β). Μετά από 72 ώρες επιμόλυνσης, αν και μια σημαντική διαφορά διατηρήθηκε μεταξύ hTERT-shRNA και το μάρτυρα (239,500 ± 9,546 έναντι 223.950 ± 10.259,

P

& lt? 0,05? Εικ. 2Β), δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ hTERT-shRNA και NC-shRNA. Τα αποτελέσματα αυτά πιθανόν αντανακλούν το γεγονός ότι φορέας έκφρασης μας προορίζεται για μελέτες βραχυπρόθεσμης έκφραση επειδή δεν ενσωματώνονται στο γονιδίωμα του ξενιστή. Ως εκ τούτου, εκτελέσαμε όλοι περαιτέρω σε πειράματα vitro έξω έως 48 ώρες.

hTERT κάτω ρύθμιση αναστέλλει τη δράση της τελομεράσης στα κύτταρα SW480

Παρόμοια επίπεδα δραστικότητας τελομεράσης παρατηρήθηκαν σε κύτταρα SW480 επιμολυσμένα για 48-h με μέσο καλλιέργειας μόνο (2.756 ± 0.089), Lipofectamine μόνο (2.693 ± 0.225) ή NC-shRNA (2.691 ± 0.119). Σε αντίθεση, 48-h επιμόλυνση με hTERT-shRNA οδήγησε σε σημαντικά χαμηλότερη δραστηριότητα της τελομεράσης (2.242 ± 0.284?

P & lt?

0,05? Σχ. 2C).

hTERT κάτω ρύθμιση μειώνει την ανάπτυξη και την τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SW480

Η αναλογία των κυττάρων σε φάση G0 /G1 ήταν σημαντικά υψηλότερη μετά από 48-ώρες επιμόλυνση με hTERT-shRNA (49,37 ± 1,63%) από ό, τι μετά από επιμόλυνση με μέσο καλλιέργειας μόνο (42,27 ± 2,76%) , Lipofectamine μόνο (42.43 ± 4.67%) ή NC-shRNA (37.07 ± 1.53%, P & lt? 0,05). Ταυτόχρονα, ο δείκτης πολλαπλασιασμού ήταν πολύ χαμηλότερη μετά από επιμόλυνση με hTERT-shRNA (50,6 ± 1,57%) από ό, τι μετά από επιμόλυνση με NC-shRNA (59,03 ± 5,86%, Ρ & lt? 0,05)? ο δείκτης ήταν παρόμοια και για τις τρεις ομάδες ελέγχου (Εικ. 3Α).

(Α) hTERT-shRNA μειώνει την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SW480. Η αναλογία των κυττάρων σε φάση /G1 Ο0 ήταν σημαντικά υψηλότερη και ο δείκτης πολλαπλασιασμού ήταν πολύ χαμηλότερη μετά από επιμόλυνση με hTERT-shRNA ό, τι μετά επιμολύνσεις ελέγχου. *

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τις άλλες τρεις ομάδες?

#

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με το NC-shRNA. (Β) hTERT-shRNA αυξάνει την απόπτωση των κυττάρων SW480. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με (α) hTERT-shRNA ή (β) NC-shRNA, χρωματίστηκαν με διαμινοβενζιδίνη (καφέ) και αντι-βάφτηκαν με αιματοξυλίνη (μπλε) για την επισήμανση των πυρήνων. Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. Μεγέθυνσης, × 400. Το αποπτωτικό δείκτη (ΑΙ) ήταν σημαντικά υψηλότερο σε κύτταρα επιμολυσμένα με hTERT-shRNA.

#

P

& lt? 0,01, σε σύγκριση με τις άλλες τρεις ομάδες. (Γ) ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης ανάλυση των κυττάρων SW480 επιμολυσμένα με (Α-Ο) hTERT-shRNA ή (δ) NC-shRNA. Αποπτωτική μορφολογία ήταν ορατή σε κύτταρα επιμολυσμένα με hTERT-shRNA. Μεγέθυνσης, × 3800. (D) Rhodamine 123 ανάλυση ένταση φθορισμού των κυττάρων SW480 επιμολυσμένα με (α) μέσο καλλιέργειας μόνο (Blank), (β) Lipofectamine μόνο (Lipo), (γ) NC-shRNA ή (δ) hTERT-shRNA. Βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης? υψηλότερη ένταση φθορισμού δείχνει χαμηλότερο δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης. Μεγέθυνσης, × 400. Κύτταρα μετεμβολιασμένα με hTERT-shRNA έδειξε σημαντικά υψηλότερες ροδαμίνη 123 φθορισμό από τα κύτταρα ελέγχου. *

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με το NC-shRNA ή Lipo?

#

P

& lt? 0,01, σε σύγκριση με το Κενό. Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

hTERT κάτω ρύθμιση αυξάνει την απόπτωση των κυττάρων SW480

Σε αντίθεση του ελέγχου-επιμολυσμένα κύτταρα, κύτταρα επιμολυσμένα με hTERT-shRNA ήταν συρρικνωμένο σε εμφάνιση? έδειξαν βαθύ καφέ χρώση στην κυτταρική μεμβράνη, κυτταρόπλασμα ή τον πυρήνα? και περιστασιακά περιείχαν αποπτωτικά σώματα (Σχ. 3Β, α-β). χρώση TUNEL έδειξε ότι η αναλογία των αποπτωτικών κυττάρων ήταν πολύ υψηλότερη μετά από επιμόλυνση με hTERT-shRNA [δείκτης απόπτωσης (ΑΙ) = 22,2 ± 4,25%] ό, τι μετά την επιμόλυνση με μέσο καλλιέργειας μόνο (1,98 ± 1,05%), Lipofectamine μόνο (2,2 ± 1,20 %) ή NC-shRNA (2,4 ± 1,25%? όλα

P

& lt? 0,01? Εικ. 3Β). ανάλυση ΤΕΜ αποκάλυψε επίσης ότι ένα μεγάλο ποσοστό των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με hTERT-shRNA είχε αποπτωτική μορφολογία, συμπεριλαμβανομένων μειωμένου όγκου, μείωση του αριθμού των προεξοχών και μικρολάχνες και η συσσώρευση χρωματίνης ανομοιόμορφη υπό την πυρηνική μεμβράνη (Σχ. 3C, α). Μερικοί πυρήνες των κυττάρων ήταν σχήμα ημισελήνου, κυκλικό ή ογκώδες, και πολλά κύτταρα που περιέχονται πολυάριθμα κενοτόπια (Σχ. 3C, β-γ). Σε αντίθεση, τα κύτταρα ελέγχου επιμολυσμένα έδειξε φυσιολογική εσωτερική δομή (Σχ. 3C, d).

Ως πρόσθετο μέτρο της απόπτωσης, χρησιμοποιήσαμε ροδαμίνη 123 ως δείκτης της ΜΜΡ (Σχ. 3D, a-d) ? σε αυτή τη δοκιμασία, υψηλότερη ένταση βαφής δείχνει χαμηλότερη ΜΜΡ, η οποία συνδέεται με την απόπτωση. Κύτταρα επιμολυσμένα με hTERT-shRNA έδειξε σημαντικά υψηλότερη ροδαμίνης 123 φθορισμού (719.998 ± 17.083) από ό, τι τα κύτταρα επιμολυσμένα με μέσο καλλιέργειας μόνο (545.833 ± 6.811,

P

& lt? 0.01), NC-shRNA (585.361 ± 51.781,

P

& lt? 0,05) ή Lipofectamine μόνο (632.169 ± 65.635,

P

& lt?.. 0,05) (Σχήμα 3D)

hTERT-shRNA αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vivo

η

Ένα μοντέλο όγκου ξενομοσχεύματος ιδρύθηκε με την έγχυση γυμνών ποντικών με κύτταρα SW480 και στη συνέχεια έγχυση των όγκοι που προκύπτουν με NC-shRNA ή hTERT-shRNA. Περιοδική μέτρηση του μεγέθους του όγκου έδειξε ότι σε 31 ημέρες, οι όγκοι που έλαβαν θεραπεία με hTERT-shRNA (0,248 ± 0,102 cm

3) ήταν σημαντικά μικρότερος από τους όγκους που έλαβαν θεραπεία με αλατούχο διάλυμα (0,543 ± 0,230 cm

3

P

& lt? 0,05) ή NC-shRNA (0,580 ± 0,293 εκατοστά

3

P

& lt? 0,01?. Σχ. 4Α)

(Α) hTERT-shRNA αναστέλλει όγκων κυτταρική ανάπτυξη. την ανάπτυξη του όγκου σε 31 ημέρες ήταν σημαντικά πιο αργή σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με hTERT-shRNA από ό, τι σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με φυσιολογικό ορό (*

P

& lt? 0,05) ή NC-shRNA (

#

P

& lt? 0,01). (Β) ιστοπαθολογική εξέταση του ιστού του όγκου SW480 μπολιάζονται γυμνούς ποντικούς και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με hTERT-shRNA. Όγκου ιστού βιοψία στις 31 ημέρες και χρώση με αιματοξυλίνη-Eosin. Το βέλος στο (α) δείχνει νέκρωση φύλλων? το βέλος στο (Β) δείχνει αναστροφή του πυρηνόπλασμα προς τον όγκο κυτταρόπλασμα, μαζί με μιτωτική παθολογία. Μεγέθυνσης, × 200. ανάλυση (C) RT-PCR για να μετρηθεί η έκφραση του mRNA hTERT σε ιστό όγκου αγωγή με φυσιολογικό ορό (λωρίδες 1-8), NC-shRNA (λωρίδες 9-16), ή hTERT-shRNA (διαδρομές 17-24). Μ, 100-bp σκάλα DNA. Η σχετική έκφραση της hTERT mRNA ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα ποντίκια hTERT-shRNA. *

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τον φυσιολογικό ορό και ομάδων NC-shRNA. (Δ) Η ανοσοκυτταροχημεία πρωτεΐνης hTERT (χρωματίζονται καφέ) στον ιστό του όγκου σε επεξεργασία με (α) φυσιολογικό ορό, (β) NC-shRNA, ή (γ) hTERT-shRNA. Μεγέθυνσης, × 200. Υψηλότερες διαβαθμίσεις του γκρι τιμές δείχνουν χαμηλότερα επίπεδα της πρωτεΐνης. Η σχετική έκφραση της hTERT πρωτεΐνης ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε ποντίκια hTERT-shRNA. # Ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με τον φυσιολογικό ορό και ομάδων NC-shRNA. (Ε) Επίδραση του hTERT-shRNA για δραστικότητα τελομεράσης in vivo. Η προσαρμοσμένη απορρόφηση (450 nm – 630 nm) ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με hTERT-shRNA ό, τι σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με αλατούχο διάλυμα (*

P

& lt? 0,05) ή NC-shRNA (

#

P

& lt? 0,01). (F) Επιπτώσεις της hTERT-shRNA στην απόπτωση. Οι όγκοι εγχύθηκαν τακτικά με (α) φυσιολογικό ορό, (β) NC-shRNA ή (γ) hTERT-shRNA, τότε βιοψία και χρωματίστηκαν με διαμινοβενζιδίνη (καφέ)? πυρήνες βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη (μπλε). Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Μεγέθυνσης, × 200. Το αποπτωτικό δείκτη (ΑΙ) ήταν σημαντικά υψηλότερο σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με hTERT-shRNA ό, τι σε όγκους που έλαβαν θεραπεία με αλατούχο διάλυμα ή NC-shRNA.

#

P

& lt?. 0.01, σε σύγκριση με τις δύο ομάδες ελέγχου

Η

hTERT-shRNA αναστέλλει την έκφραση hTERT και της δραστηριότητας της τελομεράσης

in vivo

Μετά από 31 ημέρες θεραπείας με αλατούχο, NC-shRNA, ή hTERT-shRNA, σχετική έκφραση hTERT mRNA ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα ποντίκια hTERT-shRNA (0.388 ± 0.093) από ό, τι στο αλατούχο (0.809 ± 0.335) ή