Abstract

Η συστατική έκφραση του υψηλού κινδύνου HPV Ε6 και Ε7 ιικών ογκογονιδίων είναι η κύρια αιτία του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Για να διερευνηθεί πλήρως τη σύνθεση των HPV16 νωρίς μεταγραφές και γονιδιώματος σχολιασμό τους, του τραχήλου της μήτρας πλακώδη επιθηλιακά ιστών από 40 ασθενείς με λοίμωξη HPV 16 συλλέχθηκαν για ανάλυση των μεταγραφών ιού θηλώματος ογκογονιδίου (APOT). Παρατηρήσαμε διαφορετικά πρότυπα μεταγραφή των ογκογονιδίων HPV16 στην εξέλιξη των βλαβών του τραχήλου της μήτρας με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας και προσδιόρισε μια νέα μεταγραφή. εκδηλώσεις πολλαπλών ενσωμάτωση στους ιστούς του τραχηλικού καρκινώματος (CxCa) είναι σημαντικά πιο συχνά από εκείνες του χαμηλού βαθμού πλακώδους ενδοεπιθηλιακή αλλοιώσεις (LSIL) και υψηλού βαθμού πλακώδους ενδοεπιθηλιακή αλλοιώσεις (HSIL). Επιπλέον, τα περισσότερα κυτταρικά γονίδια εντός ή πλησίον αυτών των χώρων ολοκλήρωσης είναι σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια. Στο σύνολό τους, η μελέτη αυτή δείχνει ότι οι πολλαπλές ενσωματώσεις του HPV γονιδιώματος κατά την διάρκεια επίμονης ιικής μόλυνσης, η οποία μεταβάλλει τον τρόπο αυτό τα πρότυπα έκφρασης των ιικών ογκογονιδίων και σχετίζονται με την ενσωμάτωση κυτταρικά γονίδια, παίζουν κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη της τραχηλικών αλλοιώσεων σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Παράθεση: Lu Χ, Lin Q, Lin M, Duan P, Ye L, Chen J, et al. (2014) Πολλαπλές-ολοκληρώσεις του HPV16 γονιδίωμα και Altered μεταγραφή ιικών ογκογονιδίων και κυτταρικά γονίδια συνδέονται με την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. PLoS ONE 9 (7): e97588. doi: 10.1371 /journal.pone.0097588

Επιμέλεια: Xuefeng Liu, Πανεπιστήμιο Georgetown, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Οκτώβρη 2013? Αποδεκτές: 21 Απρ 2014? Δημοσιεύθηκε: 3 Ιουλίου, 2014

Copyright: © 2014 Lu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81001343, 81172463), το Υπουργείο Παιδείας της επαρχίας Zhejiang (Y200907403) και Wenzhou Επιστήμης και Τεχνολογίας του Προεδρείου (Y20090103, Y20100175 και H20100063). Αυτές οι χορηγοί υπό την προϋπόθεση ότι η χρηματοδότηση για τα πειράματα και τη συλλογή των δειγμάτων. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται θανάτου στις γυναίκες σε όλο τον κόσμο. Η επίμονη μόλυνση από ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων υψηλού κινδύνου (HR-HPV), όπως γονότυπος 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, και 59 είναι απαραίτητα για την εξέλιξη της τραχηλικών αλλοιώσεων [1], οι και πάνω από 50% των περιπτώσεων που προκαλούνται από HPV 16 [2]. Viral ογκοπρωτεΐνες, Ε6 και Ε7, HR-HPVs συμβάλλουν στην αυχενική καρκινογένεση αδρανοποιώντας δύο κύριες πρωτεΐνες καταστολέα κυτταρικών όγκων, p53 και pRb, αντίστοιχα [3] – [6]. Αυτές οι ιικές ογκοπρωτεΐνες σε μολυσμένα κύτταρα μπορεί επίσης να οδηγήσει σε χρωμόσωμα αστάθεια και συσσώρευση των γεγονότων μετάλλαξης [7].

Ένα ιικό πρώιμο υποκινητή ψέματα ανάντη του Ε6 ORF, όπως Ρ97 σε HPV16 [8], [9] , P99 σε HPV31 [10], [11] και Ρ105 σε HPV18 [12], [13], είναι υπεύθυνη για όλες σχεδόν τις έκφραση πρώιμου γονιδίου, συμπεριλαμβανομένων των Ε6 και Ε7. Upstream cis-στοιχεία στο LCR αλληλεπιδρούν με κυτταρικούς παράγοντες μεταγραφής και του ιικού διενεργοποιητή /καταστολέα Ε2 και ρυθμίζουν τη μεταγραφή του HPV Ε6 και Ε7 γονίδια [8], [14]. Επιπλέον, μεθυλίωση του DNA [15], εναλλακτικό μάτισμα RNA [9], [16], [17] και στις αρχές του πολυ (Α) σήμα πολυαδενυλίωσης [18], [19] επίσης να λάβουν μέρος στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης Ε6 και Ε7 [19].

Μέχρι σήμερα, μια πλήρης χάρτης μεταγραφή ογκογόνων HPV16 και HPV18 σε κύτταρα HPV-μολυσμένα και τους ιστούς σχεδία έχουν κατασκευαστεί [19], [20].

είναι καλά γνωστό ότι η ένταξη των HPV γονιδιωμάτων είναι ένα σημαντικό γεγονός στην τραχηλική καρκινογένεση [21], [22]. Εκτός από την ενσωμάτωση ιικού γονιδιώματος στην ενεργοποίηση κυτταρικά ογκογονίδια ή αδρανοποίηση κυτταρικών όγκων κατασταλτικός γονίδια [23] – [25], HPV ενσωμάτωση γονιδιώματος στο γονιδίωμα του ξενιστή μπορεί να αλλάξει τις συνήθειες μεταγραφή αμφότερων ιού και ξενιστή γονίδια [26]. Έχει αναφερθεί ότι η ενσωμάτωση των HPV γονιδιωμάτων μπορεί να διαταράξει το γονίδιο ιικής Ε2 σε κύτταρα και να απελευθερώσει την αναστολή της επί του ιικού πρώιμο προαγωγό που ελέγχει την έκφραση του Ε6 και Ε7 [27]. Επιπλέον, Ε6 και Ε7 μεταγραφημάτων cotranscribed με κυτταρικές αλληλουχίες μπορεί να είναι πιο σταθερό και επομένως να βελτιωθεί το επίπεδο έκφρασης τους [28] – [30].

μοτίβα μεταγραφή HPV16 στους ιστούς του καρκίνου του τραχήλου, έχουν αναφερθεί [ ,,,0],26], [31]. Υπήρχαν ένα επισωμικό HPV πρώιμο γονίδιο μεταγραφή (Ε7-E1

∧E4) και αρκετές ολοκληρωμένες μεταγραφές HPV (όπως Ε7-E1

∧cellular RNA, Ε7-E1

∧E4-κυτταρικό RNA, κ.λπ. ) σε HPV16-μολυσμένους ιστούς. Ωστόσο, η μεταγραφική επιλογή σε απόκριση προς μεταβολές του περιβάλλοντος είναι μια δυναμική διαδικασία για να επιτευχθεί η βέλτιστη έκφραση γονιδίου για την επιβίωση των κυττάρων και την καρκινογένεση [32]. Σε αυτή τη μελέτη, εφαρμόσαμε μια τροποποιημένη τεχνική ενισχύσεως του ιού θηλώματος ογκογονιδίου μεταγραφών (APOT) [26] για να διερευνήσει πλήρως τη δομή και τις αλληλουχίες του HPV16 Ε7 που σχετίζονται με μεταγραφές και γονιδιωματική σχολιασμό τους σε 8 LSIL (χαμηλού βαθμού πλακώδους ενδοεπιθηλιακή βλάβες), 24 HSIL (υψηλού βαθμού πλακώδους ενδοεπιθηλιακής βλάβες), και 8 CxCa HPV16-θετικά τραχήλου δείγματα βιοψίας.

Υλικά και Μέθοδοι

ασθενείς και δείγματα

Τα δείγματα ιστού του πρωτογενούς τραχήλου της μήτρας βλάβες που περιέχει δυσπλαστικών επιθήλιο κύτταρα /όγκου συλλέχθηκαν από το δεύτερο Ενταγμένο Νοσοκομείο Wenzhou Ιατρικό Πανεπιστήμιο (επαρχία Zhejiang, Κίνα) από τον Δεκέμβριο του 2010 έως τον Απρίλιο του 2012. η παρουσία του HR-HPV ανιχνεύτηκε από δοκιμασία HCII, και ο έλεγχος της HPV16 στο HR -HPV-θετικών δειγμάτων έγινε με κιτ ανίχνευσης HPV γονότυπους (KaiPu, Guangzhou, Κίνα) [33]. Όλοι τους δεν έλαβαν θεραπεία με ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία πριν από τη λειτουργία και κάθε ασθενής υποβλήθηκε σε κολποσκόπησης βιοψία. Τα συλλεχθέντα δείγματα βιοψίας ήταν διχοτομείται. Μία μερίδα υποβλήθηκε σε τυπική ιστοπαθολογική διάγνωση, ενώ το άλλο τμήμα φυλάχθηκε σε RNAlater (Ambion, Austin, Texas, USA) στους -80 ° C για μετέπειτα ανάλυση. Βάσει της ιστοπαθολογικής διάγνωσης, τα δείγματα χωρίστηκαν σε LSIL (CIN I, n = 8), HSIL (CIN II, η = 22? CIN III, n = 16) και καρκίνωμα τραχήλου (CxCa, n = 17). Πρόσθετες 8 του τραχήλου της μήτρας ιστών με φυσιολογική κυτταρολογία και HPV DNA αρνητικότητα ως μάρτυρες ελήφθησαν από τους ασθενείς που υποβλήθηκαν σε υστερεκτομή λόγω καλοήθεις γυναικολογικές παθήσεις. Η μελέτη έχει εγκριθεί από την Επιτροπή Ιατρικής Δεοντολογίας της δεύτερης Ενταγμένο Νοσοκομείο Wenzhou Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Όλες οι γυναίκες ενημερώθηκαν και έδωσαν την έγγραφη συγκατάθεσή τους για να συμμετάσχουν στη μελέτη.

RNA και DNA απομόνωση από κλινικά δείγματα

Το συνολικό RNA από δείγματα βιοψίας που περιγράφεται παραπάνω απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Καλιφόρνια ., USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για να αφαιρέσετε το υπολειπόμενο μόλυνση του DNA, το παρασκεύασμα RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RNase-free DNase Ι (Takara, Dalian, Κίνα) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το καθαρισμένο συνολικό RNA διαλύθηκε σε Rnase χωρίς νερό και αποθηκεύεται στους -80 ° C. Η συγκέντρωση και η καθαρότητα του συνολικού RNA ποσοτικοποιήθηκαν με φασματοφωτόμετρο υπεριώδους στα 260 nm και 280 nm και 1% ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. Μόνο RNA δείγματα με αναλογία A260 /A280 από 1.8-2.0 και υψηλή ακεραιότητα χρησιμοποιήθηκαν για την περαιτέρω πείραμα.

αντίστροφη μεταγραφή και PCR Ενίσχυση του Πρακτικά

δοκιμασία APOT παρουσιάζονταν είχε βασιστεί στην ένθετη οι αντιδράσεις PCR [26], η οποία θα μπορούσε να ενισχύσει μόνο τα άφθονα μεταγραφές και να αγνοήσει τις μεταγραφές με χαμηλότερα επίπεδα στα δείγματα. Έτσι τροποποιημένη δοκιμασία APOT χρησιμοποιήθηκε για να ενισχύσει τις ογκογονίδιο μεταγραφές HPV. Οι εκκινητές για τις αντιδράσεις αυτές σχεδιάστηκαν σύμφωνα με Klaes R, et al [26]. Ολικό RNA (1 μ§) μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας ένα ολίγο (dT)

17-εκκινητή συνδέεται με μία συνδετική αλληλουχία

RT

[34] σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή της αντίστροφης μεταγραφάσης Kit (ΤΟΥΟΒΟ, Ιαπωνία) . Για την επαλήθευση πρώτου κλώνου ποιότητα cDNA, PCR χρησιμοποιώντας αφυδρογονάση γλυκεραλδεΰδης-3-φωσφορικής (GAPDH) -ειδικές εκκινητές διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35]. Πρώτου κλώνου cDNA που περιλαμβάνει ιικό ογκογονίδιο αλληλουχίες στη συνέχεια ενισχύθηκαν με PCR χρησιμοποιώντας

p1

-HPV16E7 ειδικό εκκινητή (5′-CGGACAGAGCCCATTACAAT-3 ‘) και συνδετήρα

p0

(5′-GACTCGAGTCGACATCG-3 ») ως αντίστροφος εκκινητής? και η ενίσχυση PCR πραγματοποιήθηκε σε έναν όγκο αντίδρασης 50 μΙ. Διαφορετικό από προηγούμενες εκθέσεις, οι κύκλοι PCR αυξήθηκε στις 35, και όλα τα δείγματα εκτελέστηκε μόνο αντίδραση ενός γύρου PCR. Για να επαληθεύσετε την ιδιαιτερότητα αυτής της διαδικασίας, ο έλεγχος «μείον-RT» στην οποία ανάστροφης μεταγραφάσης παραλείφθηκε από τις αντιδράσεις που πραγματοποιήθηκε επίσης παράλληλα.

Ακολουθία Ανάλυση μεταγραφές

Τα προϊόντα ενίσχυσης APOT ήταν οπτικοποιήθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 2,5%. PCR προϊόντα που παρουσιάζουν ενδιαφέρον αποκόπηκαν από την πηκτή και εκχυλίστηκαν με χρήση κιτ DNA ανάκτηση γέλη αγαρόζης (TianGen, Beijing, Κίνα). Οι αντίστοιχες amplimeres κλωνοποιήθηκαν σε φορέα κλωνοποίησης (διαγονιδιακής, Beijing, Κίνα) και ανάλυση αλληλουχίας DNA εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας ένα ΑΒΙ 3730 XL Genetic Analyser (Applied Biosystems, USA) σύμφωνα με τυποποιημένα πρωτόκολλα. Αποτελέσματα ανάλυσης αλληλουχίας αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα BLASTN που παρέχεται από το National Center for Biotechnology Information, USA. Επιπλέον, οι θέσεις ενσωμάτωσης χρωμοσωμικές διαπιστώθηκαν χρησιμοποιώντας το National Center for Biotechnology Information (BLAST) και το Ευρωπαϊκό Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας (EBI). Επιπλέον, οι εύθραυστες τοποθεσίες και τα γονίδια των περιοχών ολοκλήρωσης ορίστηκαν χρησιμοποιώντας την εύθραυστη θεατή site map NCBI και το εργαλείο UCSC Blat.

Αποτελέσματα

Ιδιαιτερότητα της δοκιμασίας APOT για HPV16 ογκογονίδιο μεταγραφές

Η αρχή της δοκιμασίας APOT είναι ένα 3 ‘ταχεία ενίσχυση άκρων cDNA (RACE) PCR δοκιμασίας που επιτυγχάνει ενίσχυση και κλωνοποίηση της περιοχής μεταξύ ενός μόνο μικρή αλληλουχία σε ένα μόριο cDNA και άγνωστες 3′-άκρο του [34]. Σε γενικές γραμμές, οι ολοκληρωμένες μεταγραφές προέρχονται από Ε6 και Ε7 ογκογονίδια περιλαμβάνουν ιικές αλληλουχίες στα 5′- άκρα τους και οι αλληλουχίες γονιδιώματος του ξενιστή στο 3’-άκρα τους [26]. Το αναμενόμενο μέγεθος των προϊόντων που λαμβάνονται από ένα επίσωμα που προέρχεται μεταγραφής είναι 1050 bp [26] Amplimers που εμφανίζεται ένα μέγεθος διαφορετικό από 1050 bp μπορεί επομένως να προέρχεται από ένα ολοκληρωμένο γονιδίωμα HPV. Για να μαρτυρούν την ιδιαιτερότητα του τροποποιημένου ποσοτικού προσδιορισμού APOT, cDNA από HPV16-θετικού κυττάρου Caski περιέχει τα ολοκληρωμένα γονιδίωμα HPV16 και HPV-αρνητικών φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς, καθώς και οι έλεγχοι «μείον-RT», στην οποία η αντίστροφη μεταγραφάση παραλήφθηκε από τις αντιδράσεις ήταν μεταχειρισμένος. Τα ενισχυμένα προϊόντα των cDNA από HPV16-θετικού κυττάρου Caski ήταν παρόμοια με την προηγούμενη έκθεση [26], ενώ κανένα προϊόν RT ελήφθη από τα φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς χωρίς HPV DNA και τον έλεγχο «μείον-RT» (Εικόνα 1). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν την τροποποιημένη δοκιμασία APOT μπορεί να ανιχνεύσει ειδικά τις μεταγραφές που προέρχεται από το ολοκληρωμένο γονιδίωμα του HPV.

Τα ενισχυμένα προϊόντα από κύτταρα CaSki (Α), HPV16-θετικά CxCa (Β), HPV αρνητικό φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς (C) και τα «μείον-RT» ελέγχους του RNA που απομονώθηκε από HPV 16-θετικά δείγματα (D) με την δοκιμασία APOT διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 2.5%. Α:

Lane 1-3

ήταν τρεις διαφορετικές ανακαλλιέργειας κύτταρα CaSki (ως θετικοί μάρτυρες)? Β:

Lane 1-3

ήταν τρία διαφορετικά δείγματα CxCa? C:

Lane 1-3

ήταν τρεις διαφορετικές κανονική του τραχήλου της μήτρας ιστούς (ως αρνητικοί μάρτυρες)? D:

Lane 1-3

ήταν αντίστοιχη με δείγματα στο Β, αντίστοιχα? M:. 250-bp DNA σκάλες

Η

Χαρακτηριστικά του HPV16 ογκογονιδίου μεταγραφές στους ιστούς του τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας και

καρκίνωμα τραχήλου

Για να αναλυθούν οι ογκογονιδίου μεταγραφές HPV16, HPV16 40-θετικά τραχηλικού δείγματα (LSIL, η = 8? HSIL, η = 24? CxCa, n = 8) με καλή ποιότητα RNA επελέγησαν μεταξύ 63 συλλέγονται δείγματα σε αυτή τη μελέτη. Σύνολο 133 μεταγραφές που περιέχουν ιογενή θραύσματα βρέθηκαν. Μεταξύ αυτών των μεταγραφημάτων, 64 θραύσματα είχαν HPV16 Ε7-E1 * αλληλουχίες στα άκρα τους 5′- και συνδέεται άμεσα με πολυ Α σε 3 ‘άκρα τους (Σχήμα S1). Επιπλέον, υπήρχαν τέσσερις διαφορετικές διαταραχές της περιοχής Ε1 στο nt 880, 949, 1054 και 1234 (Εικόνα S2). Οι μεταγραφές που περιέχει ένα σήμα δότη Ε1-ματίσματος στο nt 880 [36] θα μπορούσε να ανήκει σε δυναμικό πρότυπο επισωματική, ενώ η μεταγραφή η οποία κολοβωμένη στο nt949 θα μπορούσε να είναι ένα αποτέλεσμα της εσωτερικής πλήρωσης με ολίγο dT [37]. Άλλες μεταγραφές που περικόπτονται σε nt 1054 και 1234 δεν περιείχε αλληλουχίες πολυ Α, ούτε οποιαδήποτε θέση πολυαδενυλίωσης ανήκουν σε ιογενή ή υποδοχής, έτσι ώστε αυτές οι μεταγραφές θεωρήθηκαν ως πιθανοί ολοκληρωμένη μοτίβα. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης μια άλλη μεταγραφή η οποία έχει ματιστεί Ε7 ORF στο nt 880 στην θέση δέκτη Ε4-ματίσματος στο nt 3358 και στη συνέχεια συγκολλημένα από το σήμα δότη Ε4-ματίσματος στο nt 3632 στην θέση δέκτη L1-ματίσματος στο 5639, και επίσης, τερματίζεται σε πολυ Α (Εικόνα S1). Σε αυτή την μεταγραφή, η Ε4 ORF δεν διαταράσσεται. Η έλλειψη ενός σήματος δότη ματίσματος στο nt 5815 σε αυτήν την μεταγραφή υποδηλώνει ότι το γονιδίωμα HPV16 διαταραχθεί σε nt 5815 θα μπορούσε επίσης να λάβουν μέρος στην ενσωμάτωση του γονιδιώματος του ιού.

Επιπλέον, υπήρχαν 64 ιογενής μεταγραφές που συνδέονται άμεσα να φιλοξενήσει γονιδίωμα αλληλουχίες και ήταν όλα ξεκίνησαν με την αρχή της προς τα εμπρός εκκινητή (Ρ1) στο nt 729. Αυτά τα HPV16 ογκογονίδιο ολοκληρωμένες μεταγραφές μπορούσε να διαιρεθεί τρεις διαφορετικούς τύπους (Εικόνα 2). Μεταξύ αυτών μεταγραφές, τύπου Α έχει HPV16 Ε7-E1

* αλληλουχίες στα 5 ‘άκρα τους και άμεσα συνδεδεμένη για να φιλοξενήσει τις αλληλουχίες του γονιδιώματος. Ωστόσο, υπήρχαν δύο διαφορετικές θέσεις ενσωμάτωσης των Ε1 περιοχή (στο nt880 και nt1107) σε αυτού του τύπου (Σχήμα S3). Η θέση σε nt880 περιείχε ένα σήμα δότη Ε1-ματίσματος, ενώ η περιοχή έχει περικοπεί σε nt1107 θα μπορούσε να είναι πιο πιθανό να γραμμικοποίηση του ιικού γονιδιώματος εγκύκλιο για την ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του ξενιστή. τύπος μεταγραφής Β έχει μια Ε2 ORF διαταράσσεται κατά nt2870 και η αλληλουχία τύπου Β συνθέτει από HPV16 Ε7-Ε1

∧E2

* στο 5′- άκρα του και την αλληλουχία του γονιδιώματος ξενιστή σε 3′-άκρα του. Στην μεταγραφή τύπου C, η Ε1

κωδικόνιο τερματισμού ∧E4 διαταράσσεται για την ενσωμάτωση του ιού και ένα ολόκληρο Ε1

∧E4 ORF χωρίς ένα κωδικόνιο στοπ συντήκεται σε πλαίσιο για να φιλοξενήσει αλληλουχία. Μεταξύ αυτών των τριών μοντέλων, μεταγραφές τύπου Α και Γ είχαν αναφερθεί από Wentzensen Ν, et al. [31]. Ωστόσο, μεταγραφή τύπου Β δεν είχαν προηγουμένως αναφερθεί σε προκαρκινικές αλλοιώσεις και καρκίνο του τραχήλου της μήτρας

Πληκτρολογήστε Α δείχνει Ε1 αλληλουχίες συγκολλημένα απευθείας στο κυτταρικό πλευρικής αλληλουχίας.? Τύπος Β δείχνει Ε1 ματισμένο να Ε2, με Ε2 συντήκονται με μία κυτταρική αλληλουχία? Τύπος Γ δείχνει Ε1 ματισμένο να Ε4, με Ε4 τρέχει σε έναν κυτταρικό ακολουθία.

▴, υπάρχουν δύο θέσεις ενσωμάτωσης σε Ε1 (τα δεδομένα δείχνονται στο Σχήμα S3). Τα κουτιά εντός κάθετοι αντιπροσωπεύουν έξι νουκλεοτιδίων μεταξύ Ε7 και E1gene.

Η

Επιπλέον, ογκογονίδια HPV16 έδειξαν σημαντικά διαφορετικά μοτίβα μεταγραφής στους ιστούς των LSIL, HSIL και CxCa (Σχήμα 3, 4 και Πίνακα 1). Μεταξύ αυτών των 3 μοντέλων της μεταγραφής ανιχνεύθηκε στους ασθενείς μας, η τύπου Α και τύπου Β ήταν υψηλότερο επιπολασμό από ό, τι τύπου C, που παρατηρήθηκαν σε όλες σχεδόν τις παθολογικές τύπους, ενώ ο τύπος C ανιχνεύθηκε μόνο στα δείγματα των CxCa, με συχνότητα ανίχνευσης 75% (Πίνακας 1 και Σχήμα 4). Όλα τα δείγματα ασθενών εμφανιστεί ο τύπος Α, αλλά όλα τα δείγματα που είχαν την CxCa τύπου Β και τύπου C (Σχήμα 4). Συνεπής με το τεκμήριο της δυναμικό ολοκλήρωσης του γονιδιώματος του ιού στα τελευταία στάδια της ανάπτυξης του καρκίνου [38], [39], η επικράτηση των μεταγραφών σύντηξης ήταν υψηλότερα σε HSIL και CxCa από LSIL.

HPV16-θετική κλινική δείγματα με LSIL, HSIL και CxCa υποβλήθηκαν σε δοκιμασία APOT και διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης 2.5%,

Lane 1-5

σημαίνει πέντε διαφορετικά δείγματα σε κάθε παθολογική τύπου. Μ:. 250-bp DNA Σκάλες

Η

Η

τόπους Ενσωμάτωση και τον χαρακτηρισμό των κυτταρικών πλευρικής αλληλουχίας

Για την αναγνώριση των μεμονωμένων χρωμοσωμικές θέσεις, όλα τα 64 σύντηξη μεταγραφές που περιέχουν ιικές και κυτταρικές σειρές αναλύθηκαν περαιτέρω με BLASTN συγκρίσεις για το σύνολο της βάσης δεδομένων του γονιδιώματος. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι όλα τα χρωμοσώματα, εκτός από CHR21 και το Χ, εντάχθηκαν με γονιδίωμα HPV16, επιβεβαιώνοντας τις προηγούμενες αναφορές ότι καμία προνομιακή τοποθεσία HPV ολοκλήρωσης παρατηρήθηκε στην επιλογή του ανθρώπινου χρωμοσώματος [40]. Κάποιοι τόποι, όπως 1p36.22, 1ρ36, 2p24, 2q33, 5q31.1, 5q31, 6p24, 8ρ23, 10q22.1, 13q22.1, 19q13 και 19p13.3, έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [31], [41] – [45] (Πίνακας 2). Μεταξύ αυτών των εκδηλώσεων ολοκλήρωσης, δεκατέσσερα από 40 δείγματα παρουσίασαν πολλαπλές θέσεις ενσωμάτωσης (Πίνακας 2). Αν και οι τοπικές αναδιατάξεις DNA θα μπορούσε να συμβεί συχνά και γρήγορα μετά την ενσωμάτωση [43], βρήκαμε ότι η κυτταρική πλευρικές αλληλουχίες σε 11 ιστούς χαρτογραφήθηκαν σε διαφορετικά χρωμοσώματα, αναφέροντας την παρουσία πολλαπλών ανεξάρτητων ενσωματώσεων σε αυτά τα δείγματα. Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα γεγονότα πολλαπλών ολοκλήρωσης ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ιστούς CxCa (75%) από ό, τι στην αυχενική ιστούς του LSIL (50%) και HSIL (53,8%). Διαλογή όλων των τόπων ολοκλήρωσης δείχνει ότι 35 από 63 χαρτογραφηθούν περιοχές ολοκλήρωσης βρίσκονται μέσα ή κοντά σε μια εύθραυστη θέση με απόσταση 26 bp έως 5 ΜΒΡ (Πίνακας 2). Μεταξύ των 22 χαρτογραφηθεί εύθραυστες περιοχές, FRA13A βρέθηκε σε 4 ανεξάρτητα δείγματα. Είκοσι δύο μεταγραφές δεν συνδέθηκαν με κάθε εύθραυστης θέσης.

Η

Τα κυτταρικά πλευρικές αλληλουχίες των ιικών-κυτταρικών μεταγραφές σύντηξης περαιτέρω εξετάστηκαν για γνωστά γονίδια. Οι περισσότερες από αυτές συντήκονται μετεγγραφής είχε ένα κυψελοειδές αλληλουχία από την κωδικεύουσα προσανατολισμό των γνωστών γονιδίων και τριάντα μεταγραφές είχε την κυτταρική σειρά από μια περιοχή ιντρόνιο, και 8 μεταγραφές συντήχθηκαν με μια αλληλουχία εξονίου αίσθηση των προβλεπόμενων γονιδίων (Πίνακας 2). Μεταξύ αυτών προβλέπεται γονίδια,

AMICA1

,

DAPK1

,

EBAG9

,

PIBF1

επλήγησαν δύο φορές,

MRPS31

τέσσερις φορές και

PRDX5

ακόμα και έξι φορές από την ιική ενσωμάτωση. Την ίδια στιγμή, τα πλησιέστερα γονίδια ξενιστή για κάθε θέση ολοκλήρωσης στην κατεύθυνση της μεταγραφής αναλύθηκαν επίσης (Πίνακας 2). Μεταξύ αυτών προβλέπεται γονίδια ενσωματώνονται ή να κλείσει την ιστοσελίδα ολοκλήρωσης, εντοπίσαμε αρκετά γονίδια που σχετίζονται με τον όγκο, συμπεριλαμβανομένων των

PRDX5

,

CD28

,

Rock2

,

RhOH

,

Timp3

και

DAPK1

, κ.λπ. Όπως φαίνεται στον πίνακα 1, οι μεταγραφές τύπου D και Ε ανιχνεύθηκαν μόνο σε CxCa και οι περισσότεροι από τους γενετικούς τόπους ολοκλήρωσης βρίσκονταν εντός ή πλησίον οι εύθραυστες περιοχές της FRA13C, FRA22B, FRA2I και FRA13A. Τα γονίδια που συνδέονται με τις μεταγραφές τύπου D και Ε ήσαν ογκογονίδια (

CD28

και

EBAG9

), ογκοκατασταλτικά γονίδια (

Timp3

), ή γονίδια που σχετίζονται με όγκο (

PIBF1

και

MRPS31

).

Συζήτηση

Ένταξη του HPV γονιδιώματος σε χρωμοσώματα ξενιστή αντιπροσωπεύει μια πρώιμη κλωνική εκδήλωση για να παρέχει ένα επιπλέον επιλεκτικό πλεονέκτημα για την επέκταση του νεοπλάσματος. Οι μεταγραφές του ιού έχουν ανιχνευθεί με την δοκιμασία APOT [26], [31], [42] – [45]. Αν και δοκιμασία APOT έχει κάποια πλεονεκτήματα σε μεταγραφές ανίχνευση από κάθε θέση ολοκλήρωσης χρωμόσωμα, υπάρχουν αρκετοί περιορισμοί. Πρώτον, είναι δύσκολο να ενισχυθεί πολύ μεγάλο μεταγραφές ολοκλήρωση προερχόμενο, το οποίο θα υποτιμούν τον αριθμό των όγκων με ενσωματωμένο DNA του HPV [45]. Δεύτερον, APOT είναι ένας τύπος ένθετη PCR, η οποία μπορεί να τείνει να ενισχύσει τις μεταγραφές με υψηλότερα επίπεδα και να αγνοήσει εκείνους με χαμηλότερα επίπεδα. Τρίτον, έχει αναφερθεί ότι η εσωτερική πολυ Α γόμωσης θα μπορούσε να αντικαταστήσει το ολίγο (dT) εκκινητή εντός ορισμένων ορίων, και παραγωγής ενός συνόλου αγκυροβολημένη ολιγο (dT) εναρκτήρες για σύνθεση cDNA. Αυτές οι αλληλουχίες που προκαλείται από την εσωτερική πλήρωση διέκοψε την παραγωγής της πλήρους μήκους cDNA και συγχέει την ανάλυση του εναλλακτικού ματίσματος [37]. Με τροποποιημένη δοκιμασία APOT μας να ανιχνεύσουμε το μοτίβο μεταγραφής του τραχήλου της μήτρας ιστών, κάναμε βρείτε πολλές ιογενείς μεταγραφές που συνδέονται με πολυ ακολουθίες γονιδίωμα του ξενιστή Α ή στην αυχενική πλακώδη επιθηλιακά ιστών HPV16 μολυσμένα. Παρατηρήσαμε ότι υπήρχαν πολλά ιικών μεταγραφημάτων έληξε άμεσα με πολυ Α σε 3′-άκρα τους. Εκτός από την αναφερόμενη περιοχή σήματος δότη Ε1-ματίσματος (nt 880), οι θέσεις αποκοπής σε nt1054, 1234 και 5815 δεν περιλαμβάνονται εσωτερικές αλληλουχίες πολυ Α ούτε οποιαδήποτε σήματα πολυαδενυλίωσης πρέπει να είναι εν δυνάμει νέων ολοκληρωμένων χώρων και την ανάγκη για περαιτέρω ανάλυση. Το ιικό-κυτταρικό μετάγραφο σύντηξης του τύπου Α και C έχει αναφερθεί προηγουμένως [26], [31], [41]. Στην μεταγραφή τύπου Γ, η διαταραχή ενσωμάτωση των κωδικόνιο τερματισμού Ε4 θα είχε ως αποτέλεσμα την Ε4 να χρησιμοποιήσει ένα κωδικόνιο τερματισμού ξενιστή. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε παρατηρήσει επίσης ότι ορισμένα δείγματα του τραχήλου του καρκίνου που περιέχονται και οι τρεις τύποι των μεταγραφών ήταν ιογενή-κυτταρικό μεταγραφές σύντηξης.

μοτίβα μεταγραφής HPV16 σε LSIL, HSIL και CxCa ήταν σημαντικά διαφορετικές. Βρήκαμε ότι η μεταγραφή Type C ανιχνεύθηκε μόνο στα δείγματα του CxCa και περισσότερες περιοχές τυχαία ενσωμάτωση υπήρχαν σε δείγματα ιστού μας. Παρόμοια με προηγούμενες εκθέσεις [31], [38] – [42], [46], [47], η μελέτη μας δείχνει ότι HPV ολοκλήρωση δεν έχει προνομιακή θέση στο ανθρώπινο γονιδίωμα. Εκτός από το χρωμόσωμα 21 και το Χ, άλλα χρωμοσώματα είναι όλα τα ευπαθή στην ολοκλήρωση HPV16. Περίπου το 55% εντάξεις που βρίσκονται μέσα ή κοντά σε μια εύθραυστη περιοχή. Διαφορετικό από τις προηγούμενες εκθέσεις [42], [45], παρατηρήσαμε ότι τα γεγονότα ολοκλήρωσης συμβαίνουν συχνά πολλές φορές σημαντικά περισσότερο στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας σε σχέση με LSIL και HSIL. Τα στοιχεία αυτά δεν παρέχουν μόνο βιολογική υποστήριξη στην επιδημιολογική παρατήρηση ότι επίμονη μόλυνση από συγκεκριμένους τύπους HR-HPV είναι η σημαντική αιτία τραχηλικού καρκινώματος [1], αλλά επίσης δείχνουν ότι μετέπειτα επιλογή για και συσσώρευση μεταλλάξεων στο ακόμη-να-με- προσδιορίζονται κλειδί κυτταρικά ρυθμιστικά γονίδια προωθεί περαιτέρω εξέλιξη σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Η ενσωμάτωση δεν αλλάζει μόνο το μοτίβο μεταγραφή που απαιτήθηκε για την απορρυθμισμένη έκφραση των ιικών ογκογονιδίων, αλλά επίσης επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου-ξενιστή με την ενσωμάτωση του γονιδιώματος του ιού. Η ενσωμάτωση μεταβάλλει την έκφραση γονιδίων ξενιστών σε θέσεις ενσωμάτωσης, ακόμη και αν αυτό συμβεί εντός των αλληλουχιών ιντρονίου [43], [45]. Στη μελέτη μας, εντοπίσαμε ένα ευρύ φάσμα που σχετίζεται με καρκίνο γονίδια στις θέσεις ολοκλήρωσης και πλευρικές περιοχές αλληλουχίας. Τα περισσότερα από τα γονίδια στις θέσεις ενσωμάτωσης συσχετίστηκαν με την ανάπτυξη όγκων, και δεκαεννέα γονίδια έντονα σχετίζονται με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Μερικά από αυτά δρουν ως καταστολείς των όγκων (όπως

miR-34a

,

MSH2

,

WWOX

και

Timp3

,

κ.ά.

) ή ογκογονίδια (όπως

Rock2

,

CD28

,

EBAG9

και

ANGPT1

,

et al

). Είναι ενδιαφέρον ότι, οι περισσότεροι από αυτούς δεν έχουν αναφερθεί σε προηγούμενα έγγραφα [31], [45].

MiR-34α

, μια σημαντική ογκοκατασταλτικό, ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνο του τραχήλου [48], [49]. Έχει αναφερθεί ότι ογκοπρωτεΐνη Ε6 του HPV 16 και HPV 18 μπορούν να αναστείλουν την έκφραση του όγκου-κατασταλτικό

miR-34a από

αποσταθεροποίηση της ρ53 και είχε ως αποτέλεσμα τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [50]. Η διακοπή του

miR-34a

γονίδιο θα μπορούσε να ερμηνεύσει περαιτέρω το φαινόμενο της μειωμένης έκφρασης του

miR-34a

στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

MSH2

είναι μια πρωτεΐνη επιδιόρθωσης του DNA, και που συνδέονται με την επιδιόρθωση του DNA μονοπάτι [51], [52]. Μειωμένη έκφραση του MSH2 θα μπορούσε να είναι ένας παράγοντας κινδύνου στην καρκίνο του τραχήλου πρώιμο στάδιο [53].

Rock2

, ένα σημαντικό μόριο σηματοδότησης, μπορεί να προωθήσει τραχήλου της μήτρας μετάσταση του καρκίνου με προς τα πάνω ρύθμιση και ενεργοποίηση της έκφρασης και τη λειτουργία της πρωτεΐνης μοεσίνη μέσω RhoA /Rock2 μονοπατιού [54]. Εκτός από τις σχετιζόμενες με καρκίνο γονίδια, τα γονίδια σε θέσεις ενσωμάτωσης και περιοχές που πλευρίζουν αλληλουχία θα μπορούσε να είναι επίσης ευεργετική για την ενσωμάτωση ιικού γονιδιώματος.

FANCM

το οποίο είναι ένα DNA μεταθετάσης και άκρως σχετίζονται με την αντιγραφή του DNA ρυθμίζει το σημείο ελέγχου της σηματοδότησης και της εξέλιξης της διχάλας του αναδιπλασιασμού [55], [56]. Άλλα γονίδια, όπως

COX6B1

σχετίζεται με κυτταρικής απόπτωσης [57] και

ESRRA

έχουν επίσης αναφερθεί σχετίζεται με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας [58]. Επιπλέον, μεταξύ 45 εκδηλώσεις ολοκλήρωσης, 13 γεγονότα οδήγησαν στην αντίθετης φοράς μεταγραφή των ακολουθιών κωδικοποίησης, όπως

PRDX5

,

EBAG9

και

CD28, κλπ

. Αυτές οι εντάξεις γενικά θεωρείται κανένα ενδιαφέρον. Ωστόσο, οι αλληλουχίες τους έννοια συνδέθηκαν με αποκατάσταση DNA ή ανάπτυξη του όγκου και θα μπορούσαν να επηρεάσουν τόσο ξενιστή και έκφραση ιικού γονιδίου κατά την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Η πιο ολοκλήρωση με αντιπληροφοριακή φορά ήταν το γονίδιο που κωδικοποιεί peroxiredoxin 5 (

PRDX5

), ένα προστατευτικό emzyme κατά του οξειδωτικού στρες [59], [60]. αλλαγμένη έκφραση του λόγω ολοκλήρωσης HPV16 μπορούσε να έχει σημαντικές ιολογικές συνέπεια, μαζί με την ενσωμάτωση σε γονίδια επιδιόρθωσης του DNA, όπως FANCM και MSH2. Προς τα πάνω ρύθμιση

EBAG9

έκφραση έχει παρατηρηθεί σε αρκετές κακοήθεις όγκους [61]. Η συνεργιστική παράγοντας διέγερσης του

CD28

οποία διατηρεί ανοσολογική ομοιόσταση παίζει ρόλο στην αύξηση της ευαισθησίας σε καρκίνο του τραχήλου [47].

Εν κατακλείδι, οι αλλαγές από τα σχέδια μεταγραφής του HPV 16 πρώιμων γονιδίων πάει μαζί με την πρόοδο από τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία να καρκινώματος τραχήλου και την ενσωμάτωση ιικού γονιδιώματος σε χρωμόσωμα του ξενιστή. Η αλλαγή ή η επιλογή των μοντέλων της μεταγραφής και η ένταξη στην έκφραση των γονιδίων του ξενιστή στις θέσεις ενσωμάτωσης και συνοδευτικά κυτταρικές περιοχές αλληλουχίας μπορεί όλοι να συμμετέχουν στην ογκογένεση των καρκίνων HPV16 που προκαλείται.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1 .

Τα είδη των ιικών αλληλουχιών που συνδέονται με πολυ Α σε 3′-άκρα τους. Ο τύπος της Τάξης Ι δείχνει ακολουθίες Ε1 έληξε άμεσα με πολυ Α? το είδος της κατηγορίας II δείχνει Ε1 συγκολλημένα σε Ε4 και στη συνέχεια να L1 και τελείωσε με αλληλουχίες πολυ Α.

▴, υπάρχουν πολλές τοποθεσίες περικοπή στο Ε1 (δεδομένα που παρουσιάζονται στο σχήμα S2)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0097588.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Διαφορετικές περιοχές αποκοπής στην περιοχή Ε1 στον τύπο της κατηγορίας Ι Υπάρχουν τέσσερις περικοπεί sites στο Ε1, 880, 949, 1054 και 1234, αντίστοιχα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0097588.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Αρκετές συγκολλημένα περιοχές χορηγών στο Ε1. Σε Τύπου Α υπάρχουν δύο θέσεις ολοκλήρωσης στην Ε1, 880, και 1107, αντίστοιχα. Τα στερεά κουτιά σημαίνει κυτταρικές σειρές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0097588.s003

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Zhi-Ming Zheng του ΝΙΗ και Kong -Nan Zhao για τα χρήσιμα σχόλια και τις αναθεωρήσεις.