Αφηρημένο

Ο καρκίνος των ωοθηκών παρουσιάζει θεραπευτικές προκλήσεις λόγω της συνήθως αργά την ανίχνευση της, επιθετική μετάσταση, και θεραπευτικές αντίσταση. Ο παράγοντας μεταγραφής Krüppel-σαν παράγοντας 4 (KLF4) έχει ενοχοποιηθεί σε καρκίνους του ανθρώπου ως καταστολέας όγκου ή ογκογονιδίου, αν και ο ρόλος της εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την κυτταρική έννοια. Ο ρόλος των KLF4 στον καρκίνο των ωοθηκών δεν έχει διευκρινιστεί σε μηχανιστικές λεπτομέρειες. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο της KLF4 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών με μεταγωγή των κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών SKOV3 και OVCAR3 με δοξυκυκλίνη επαγώγιμο KLF4 φορέα λεντοϊού. Η υπερέκφραση του KLF4 μειωμένη κυτταρικό πολλαπλασιασμό, μετανάστευση, και διείσδυση. Το επιθηλιακό κυτταρικό δείκτη του γονιδίου Ε-καντερίνη ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω, ενώ τα γονίδια σήμανσης μεσεγχυματικών κυττάρων vimentin, twist1and snail2 (γυμνοσάλιαγκας) ρυθμίστηκαν προς τα κάτω και στις δύο KLF4-κύτταρα που εκφράζουν SKOV3 και OVCAR3. KLF4 ανέστειλε τον αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού β (ΤΟΡβ) επαγόμενη επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση (ΕΜΤ) σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι KLF4 λειτουργεί ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών με αναστολή ΤΟΡβ-επαγόμενη EMT

Παράθεση:. Chen Ζ, Wang Υ, Liu W, Zhao G, Lee S, Balogh Α , et al. (2014) Η δοξυκυκλίνη επαγώγιμοι Kruppel-όπως Παράγοντας 4 φορέα λεντοϊού Μεσολαβεί μεσεγχυματικά στα επιθηλιακά Μετάβαση στο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 9 (8): e105331. doi: 10.1371 /journal.pone.0105331

Επιμέλεια: Chunming Liu, το Πανεπιστήμιο του Κεντάκι, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18 Μάρτη 2014? Αποδεκτές: 20 Ιούλ 2014? Δημοσιεύθηκε: 19, Αύγ του 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (HL095957, HD061420 να JY, και CA092160 σε GT) και τη χρηματοδότηση εκκίνησης UTHSC, Δυτική κλινική Cancer Center (JY) και η κινεζική κυβέρνηση (2010CB530204 να CL, 112102310110 να YG, 2011DFA33290 να WG). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Junming Yue είναι μια Συντακτική μέλος του Διοικητικού Συμβουλίου PLoS ONE. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE Editorial πολιτικές και κριτήρια. Όλοι οι συγγραφείς δεν έχουν ανταγωνιστικά ενδιαφέρον να κηρύξει.

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των ωοθηκών έχει υψηλό ποσοστό θνησιμότητας, φέρεται να προκαλεί 15.000 θανάτους ετησίως στις ΗΠΑ [1]. Παρά το γεγονός ότι έχουν σημαντικές βελτιώσεις έχουν γίνει στην ανίχνευση των ωοθηκών κατά την τελευταία δεκαετία, οι περισσότερες από 20.000 νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο [1], [2]. Οι θεραπευτικές επιλογές για τον καρκίνο των ωοθηκών περιορισμένες λόγω της αντοχής τους στην χημειοθεραπείας και της θεραπείας με ακτινοβολία που οδηγεί σε συχνές υποτροπές [3], [4].

KLF4 έχει δειχθεί να ρυθμίζει πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση των κυττάρων, ο ρόλος του έχει ερευνηθεί εκτενώς σε αρκετούς ανθρώπινους καρκίνους χρησιμοποιώντας gain- και απώλειας λειτουργίας προσεγγίσεων. Στην παχέος εντέρου και του καρκίνου του προστάτη, KLF4 δρα ως ένα ογκογονίδιο [5], [6]. Σε αντίθεση, διαδραματίζει ογκοκατασταλτικό ρόλο στην νευροβλάστωμα, καρκίνο του πνεύμονα, γαστρικό καρκίνο, λέμφωμα, καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, καρκίνο του παγκρέατος πόρου, και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]. Στον καρκίνο του μαστού, KLF4 μπορεί να λειτουργήσει τόσο ως ένα ογκογονίδιο [14], [15] και ένα ογκοκατασταλτικό [16], [17], [18]. Ο ρόλος της KLF4 στον καρκίνο των ωοθηκών δεν έχει επαρκώς και μηχανιστικά αντιμετωπιστούν. Μια προηγούμενη μελέτη δείχνει ότι το επίπεδο έκφρασης της KLF4 ήταν σημαντικά μειωμένη σε καρκίνο των ωοθηκών σε σύγκριση με φυσιολογικό επιθήλιο των ωοθηκών, προτείνοντας ότι KLF4 μπορούσαν ενδεχομένως να λειτουργήσει ως καταστολέας όγκων σε καρκίνο των ωοθηκών [19].

KLF4 παίζει έναν μοναδικό ρόλο σε επαναπρογραμματισμό βλαστοκυττάρων διευκολύνοντας την μεσεγχυματικών να επιθηλιακά μετάβαση (ΚΟΑ) [20]. Η κυτταρική διακόπτη φαινοτυπική από επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβαση των κυττάρων (EMT) είναι μια θεμελιώδης διαδικασία στη μετάσταση του όγκου, που είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό των ωοθηκών καρκινώματα. Η ΚΟΑ ή EMT οδηγεί στις αλλαγές των επιθηλιακών και την έκφραση του γονιδίου δείκτη μεσεγχυματικών που περιλαμβάνουν snail1 Burlingame, CA). Εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού.

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας)

ChIP εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ ChIP-IT Express Ενζυμική (Active Motif, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τον κατασκευαστή οδηγίες. Εν συντομία, KLF4 εκφράζουν και κύτταρα ελέγχου SKOV3 ήταν διασυνδεδεμένη με 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επεξεργασία με υπερήχους για τη διάτμηση χρωμοσωμικό DNA. Η ανοσοκατακρήμνιση εκτελέστηκε με σύνδεση 10 μg κουνελιού αντι-KLF4 αντίσωμα ή IgG (Santa Cruz Inc., Dallas, Texas) τα προϊόντα λύσης και επωάστηκε στους 4 ° C με περιστροφή όλη τη νύκτα. σύμπλοκα χρωματίνης εκλούστηκαν από μαγνητικά σφαιρίδια με αντίστροφης-σταυρωτής σύνδεσης. Χρωματίνης DNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA) και εκλούεται σε 40 μΐ ύδατος. DNA (4 μΐ) χρησιμοποιήθηκε για ποσοτική αντίδραση PCR για την ανίχνευση της παρουσίας του προαγωγέα Ε-καδερίνης. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση του υποκινητή του Ε-καδερίνης ήταν 5′-TAG AGG GTC ACC GCG TCT ΑΤ-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5’-TCA CAG GTG CTT TGC AGT TC-3 (αντίστροφη) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16].

Western blot

ωοθηκών και του καρκίνου του μαστού τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Thermo Scientific? Rockford, IL) που περιείχε 1% Halt Proteinase κοκτέιλ αναστολέα (Thermo Scientific? Rockford, IL). Μία ίση ποσότητα πρωτεΐνης (40 μg /λωρίδα) φορτώθηκε σε 10% πηκτώματα SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα για 1 ώρα και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα εναντίον KLF4 (Cell Signaling), GAPDH (Sigma? St. Louis, ΜΟ), βιμεντίνη, E-cadherin, ή snail2 (Cell Signaling).

η στατιστική ανάλυση

Σημαντικές διαφορές προσδιορίζονται από δύο ή τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD με τη χρήση του Student

t-test

.

σ

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Η υπερέκφραση του KLF4 στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών χρησιμοποιώντας Tet-on σύστημα

Για τον προσδιορισμό του ρόλου του KLF4 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, κατασκευάσαμε έναν επαγώγιμο φορέα λεντοϊού, στο οποίο το γονίδιο KLF4 οδηγήθηκε από tetracycline- (Tet) ή ενός Dox αποκρίνεται προαγωγό (TRE-σφιχτό). Η αντίστροφη μεταγραφή ενεργοποιητής rtTA-Μ3 κινείται από έναν ιδιοσυστατικό υποκινητή ανθρώπινης πανταχού C κλωνοποιείται σε ένα ξεχωριστό φορέα λεντοϊού (Σχήμα S1A). έκφραση KLF4 μπορεί να ενεργοποιηθεί με rtTA-M3 παρουσία Dox με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Ένα EGFP-επαγώγιμο φορέα λεντοϊού δομήθηκε και υπηρέτησε ως έλεγχος. Για να εξεταστεί η επαγόμενη έκφραση του KLF4 και EGFP στις καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών SKOV3 και OVCAR3, Dox προστέθηκε σε μία τελική συγκέντρωση 1 μg /ml, και η έκφραση του KLF4 και EGFP σε διαφορετικά χρονικά σημεία ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. Έκφραση της EGFP και KLF4 αυξάνεται σταδιακά κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 24 h (Σχήμα S1B). έκφραση της EGFP σε SKOV3 και OVCAR3 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών έγινε ορατή χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού 48 ώρες μετά την προσθήκη Dox (Σχ. S2A, Β). θεραπεία Dox προκάλεσε αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία των κυττάρων SKOV3. Ένα στρογγυλεμένο επιθηλιακών κυττάρων που μοιάζουν με μορφολογία παρατηρήθηκε σε KLF4-μεταδιηγερμένα κύτταρα SKOV3 σε σύγκριση με πεπλατυσμένο πολυπολικός επιθηλιακών κυττάρων που μοιάζουν με το σχήμα των κυττάρων ελέγχου EGFP ή KLF4 στις 48 και 72 ώρες (Εικ. S1c και το Σχ. S2C). Ωστόσο, η μορφολογία σε KLF4-μεταδιηγερμένα κύτταρα OVCAR3 δεν μεταβλήθηκε μετά από θεραπεία Dox σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

KLF4 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών

Για να ερευνηθεί ο ρόλος του KLF4 στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, η δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη σε KLF4-μεταδιηγερμένα κύτταρα SKOV3 και ελέγχου. Μετά την κατεργασία Dox, ο πολλαπλασιασμός σε KLF4-κύτταρα που υπερεκφράζουν ήταν σημαντικά ανέστειλε σύγκριση με EGFP ή KLF4 (μη-Dox) κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 1Α). Πραγματοποιήσαμε επίσης αναλύσεις σχηματισμού αποικιών σε SKOV3 και OVCAR3 κύτταρα μετάγονται με KLF4 και EGFP φορείς ελέγχου. Ο αριθμός των αποικιών σε κύτταρα KLF4 υπερεκφράζουν ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με κύτταρα EGFP και KLF4 ελέγχου (Σχήμα 1Β, C). Επιπλέον, προσδιορισμούς μαλακού άγαρ σχηματισμού αποικίας διεξήχθησαν επίσης για να προσδιοριστεί αν KLF4 επηρεάζει ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων. Ομοίως, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι KLF4 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στα ημιστερεό μέσο καλλιέργειας σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 1 D).

A. Κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων SKOV3 σε μεταγωγή είτε με EGFP ή KLF4 εξετάστηκε με ανάλυση ΜΤΤ σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά τη θεραπεία Dox. Η υπερέκφραση του KLF4 σημαντικά μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σύγκριση με εκείνη στο Dox-κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου (*

ρ

& lt? 0,05). Β 200 SKOV3 κύτταρα μεταδιεγείρονται με λεντοϊού KLF4 ή ελέγχου EGFP φορείς σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 14 d. αποικίες κυττάρων μετρήθηκαν μετά από χρώση κρυσταλλικού ιώδους. Ο αριθμός των αποικιών σε κύτταρα KLF4 υπερεκφράζουν μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με εκείνη στο Dox-κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου (***

ρ

& lt? 0.001). C. Ο αριθμός των αποικιών σε KLF4-κύτταρα που υπερεκφράζουν OVCAR3 ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με εκείνη σε Dox-κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου (**

ρ

& lt? 0,01). δοκιμασία σχηματισμού αποικίας Δ μαλακό άγαρ διεξήχθη εις τριπλούν χρησιμοποιώντας κύτταρα SKOV3. Οι αποικίες φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν μετά από 3 εβδομάδες. Ο αριθμός των αποικιών σε κύτταρα KLF4 υπερεκφράζουν μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με εκείνη στο Dox-κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου (***

ρ

& lt? 0.001).

Η

KLF4 μειώνει την κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή

Ένα κρίσιμο ιδιοκτησία του διηθητικού καρκίνου κυττάρων αυξάνεται κινητικότητάς τους. Για να διερευνηθεί αν KLF4 επηρεάζει την κυτταρική μετανάστευση στην κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών SKOV3, δοκιμασία επούλωση της πληγής πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας KLF4-μετατραπέντα κύτταρα SKOV3 και ελέγχου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, ο ρυθμός μετανάστευσης των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά σε κύτταρα που υπερεκφράζουν KLF4-σε σύγκριση με τα ποσοστά σε EGFP- και KLF4-μετατραπέντα κύτταρα ελέγχου. Κυττάρων χημειοταξία εξετάστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία μετανάστευσης transwell. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β και C, μετανάστευσαν κύτταρα ήταν σημαντικά μειωμένη σε KLF4 υπερεκφράζουν SKOV3 και τα κύτταρα OVCAR3 συγκριτικά με κύτταρα EGFP και KLF4 ελέγχους. Για να εξεταστεί εάν KLF4 επηρεάζει την κυτταρική διείσδυση, μία δοκιμασία κύτταρο εισβολή πραγματοποιήθηκε σε KLF4-μετατραπέντα κύτταρα SKOV3 και OVCAR3 χρησιμοποιώντας Matrigel-επικαλυμμένες πλάκες transwell. Η υπερέκφραση του KLF4 σημαντικά μειωμένη κυτταρική εισβολή σε σύγκριση με εκείνη των ελέγχων στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Α, Β).

A. δοκιμασία επούλωσης πληγών διεξήχθη για να εξεταστεί η ρυθμό μετανάστευσης των κυττάρων που μεταδιεγείρονται με SKOV3 KLF4 και EGFP φορείς λεντοϊού. Οι φωτογραφίες ελήφθησαν σε 0 και 24 ώρες μετά την αρχική μηδέν. ποσοστά μετανάστευσης ήταν ποσοτικά μετρώντας τρεις διαφορετικές περιοχές της πληγής. Τρία ξεχωριστά πειράματα διεξήχθησαν. ρυθμός μετανάστευση ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα KLF4 υπερεκφράζουν σε σύγκριση με εκείνη σε Dox αγωγή μάρτυρες (**

ρ

& lt? 0,01). Β, C. δοκιμασία μετανάστευσης Transwell διεξήχθη σε κύτταρα SKOV3 και OVCAR3. Η υπερέκφραση του KLF4 μείωσε σημαντικά την κυτταρική μετανάστευση σε SKOV3 (Β) και κύτταρα OVCAR3 (C) σε σύγκριση με εκείνη της Dox αγωγή ελέγχους (***

ρ

& lt? 0.001).

Η

Α, Β κυτταρική ανάλυση εισβολή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Matrigel πλάκες επικαλυμμένες transwell για SKOV3 (Α) και τα κύτταρα OVCAR3 (Β). Ο ρυθμός εισβολή ήταν σημαντικά μειωμένη σε KLF4 υπερεκφράζουν κυττάρων σε σύγκριση με εκείνη στο Dox-κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου και από τις δύο SKOV3 και τα κύτταρα OVCAR3 (**

ρ

& lt? 0,01). Τα δεδομένα συλλέχθηκαν από τρία ξεχωριστά πειράματα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Student

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ.

Η

KLF4 προωθεί ΚΟΑ στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

Για να διερευνηθεί αν KLF4 ρυθμίζει EMT στην ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, τα επιθηλιακά Ε-καδερίνης και δείκτη μεσεγχυματικών γονιδίων γονίδιο δείκτη κυτταρικής snail2 και βιμεντίνης εξετάστηκαν σε KLF4-μεταδιηγερμένα κύτταρα SKOV3 και OVCAR3 χρησιμοποιώντας στύπωμα Western. Η επιθηλιακή δείκτης Ε-καδερίνης ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω, ενώ η δείκτες μεσεγχυματικών βιμεντίνη και snail2 ήταν σημαντικά μειωμένες σε KLF4 υπερεκφράζουν κυττάρων σε σύγκριση με EGFP και KLF4 ελέγχους (Εικόνα 4Α, Β). Πραγματοποιήσαμε επίσης ανοσοχρώση για KLF4 υπερεκφράζουν και τον έλεγχο των κυττάρων για να εξετάσει δείκτες ΚΟΑ. Τόσο η χρώση E-cadherin και βιμεντίνης ήταν εμφανής σε κυτταρικές μεμβράνες, ενώ snail2 βάφονται οι πυρήνες των κυττάρων. Παρόμοια με τα στυπώματα Western, έδειξε ότι η ανοσοχρώση έκφραση Ε-καδερίνης ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω, ενώ βιμεντίνη και snail2 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω (Σχήμα 4C, D, και Ε). Εξετάσαμε επίσης την έκφραση του twist1 χρησιμοποιώντας πραγματικό χρόνο RT-PCR σε KLF4 μεταχθέντα κύτταρα SKOV3 και διαπίστωσε ότι twist1 ήταν σημαντικά προς τα κάτω σε KLF4 κύτταρα που εκφράζουν SKOV3 συγκρίσει με τον έλεγχο (Εικ. S4). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι KLF4 προωθεί ΚΟΑ στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Για να εξετασθεί περαιτέρω κατά πόσον Ε-καδερίνης αναρρύθμιση προκλήθηκε από μεταγραφική ενεργοποίηση, εκτελέσαμε χρωματίνη ανοσοκαθίζηση σε KLF4 εκφράζουν και κύτταρα ελέγχου SKOV3, και η περιοχή υποκινητή του Ε-καδερίνης ενισχύθηκε από εμπλουτισμένου χρωματική DNA με PCR πραγματικού χρόνου όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],16]. έκφραση KLF4 σε κύτταρα SKOV3 οδήγησε σε περίπου 15-φορές εμπλουτισμό του Ε-καδερίνης σε σύγκριση με τους μάρτυρες (Εικόνα 4F), υποδεικνύοντας ότι KLF4 δεσμεύεται στον προαγωγό του Ε-καδερίνης και ενεργοποιεί την έκφραση Ε-καδερίνης σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Α. B. στυπώματα Western διεξήχθησαν σε KLF4- και ΕΟΡΡ- μεταχθέντα SKOV3 (Α) και OVCAR3 κύτταρα (Β) με ή χωρίς επαγωγή Dox. έκφραση Ε-καδερίνης ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω (***

σ

& lt? 0.001), ενώ vimentin (**

σ

& lt? 0,01) και snail2 (***

p

& lt? 0.001) ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε KLF4- κύτταρα που υπερεκφράζουν SKOV3 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Α). E-cadherin (**

σ

& lt? 0,01) ρυθμίζεται αυξητικά, ενώ vimentin (*

σ

& lt? 0,05) και snail2 (***

σ

& lt? 0,001) ρυθμίστηκαν προς τα κάτω σε KLF4 υπερεκφράζουν OVCAR3 κυττάρων σε σύγκριση με Dox-κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Β). Ε-καδερίνη (C) και βιμεντίνης (D) ανοσοχρωματίστηκαν σε κυτταρικές μεμβράνες σε KLF4 εκφράζουν και ελέγχουν κύτταρα SKOV3. Ε Snail2 βάφτηκε στο κελί πυρήνες σε KLF4 εκφράζουν και να ελέγχουν τα κύτταρα SKOV3. ΣΤ KLF4 σύνδεση με τον υποκινητή του Ε-καδερίνης σε κύτταρα SKOV3 εξετάστηκε με χρωματίνη ανοσοκαθίζηση χρησιμοποιώντας KLF4 αντισώματος και εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας Ε-καδερίνης-ειδικούς εκκινητές. Τα επίπεδα του DNA ChIP εμπλουτισμένο ομαλοποιήθηκαν σε DNA εισόδου, που ακολουθείται από την αφαίρεση της μη-ειδική σύνδεση προσδιορίστηκε με IgG ελέγχου (***

ρ

& lt? 0.001)

Η

KLF4. αναστέλλει ΤΟΡβ-επαγόμενη EMT σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

Για να εξεταστεί ο μηχανισμός αν KLF4 ρυθμίζει ΤΟΡβ επαγόμενη EMT σε καρκινικά κύτταρα ωοθηκών, SKOV3 και OVCAR3 κύτταρα υπέστησαν κατεργασία με διαφορετικές δόσεις του ΤΟΡβ. Η έκφραση των πρωτεϊνών δεικτών ΕΜΤ Ε-καδερίνης, βιμεντίνη και snail2 εξετάστηκε χρησιμοποιώντας Western blot. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι TGFβ προωθούνται ΕΜΤ στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών με προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης και προς τα πάνω ρύθμιση snail2 και βιμεντίνης (Σχήμα 5Α, Β). Επιπλέον, όταν αντιμετωπίζονται KLF4 εκφράζουν και κύτταρα ελέγχου SKOV3 και OVCAR3 με αυξανόμενες δόσεις του ΤΟΡβ, η έκφραση KLF4 ανέστειλε σημαντικά ΤΟΡβ-επαγόμενη EMT στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 6Α, Β).

ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών SKOV3 (Α) και OVCAR3 (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές δόσεις του ΤΟΡβ για 48 ώρες. γονίδια δείκτες ΕΜΤ-συνδέονται, συμπεριλαμβανομένης της Ε-καδερίνης, snail2, και βιμεντίνη εξετάσθηκαν χρησιμοποιώντας Western blot. Έννοιες είχαν προσδιοριστεί με σύγκριση TGFβ επεξεργασία για να μη θεραπεία (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001).

Η

Ο καρκίνος των ωοθηκών SKOV3 κυτταρικές γραμμές (Α) και OVCAR3 (Β) μετάγονται με λεντοϊού KLF4 υπερέκφραση και τον έλεγχο των φορέων υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΟΡβ για 48 ώρες και η πρωτεΐνη εκφράσεις του ΕΜΤ-συνδέονται γονιδίων δεικτών Ε-καδερίνης, snail2 και βιμεντίνη εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας Western blot. Σημαντικές διαφορές σε σύγκριση μεταξύ KLF4 εκφράζοντας και την ομάδα ελέγχου (** p & lt? 0,05, *** p & lt? 0.001)

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε ο ρόλος της. KLF4 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών χρησιμοποιώντας φορέα λεντοϊού μεσολάβηση επαγώγιμη έκφραση. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι KLF4 ήταν κατιούσα ρύθμιση σε καρκίνους των ωοθηκών σύγκριση με τους μάρτυρες και ότι KLF4 δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά αυξήθηκε η αναλογία Bcl-2 /Bax και ανέστειλε την απόπτωση [19]. Αντίθετα, διαπιστώσαμε ότι KLF4 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SKOV3 σε σχηματισμό αποικίας και προσδιορισμούς ΜΤΤ (Εικ. 1Α, Β και C). Η διαφορά μπορεί να προκαλείται από τη χαμηλή αποτελεσματικότητα μορφομετατροπής στη μελέτη αυτή σε σύγκριση με πολύ αποδοτικό επαγώγιμο βραδέος μεταγωγή μας. Βρήκαμε επίσης ότι KLF4 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα OVCAR3 (Εικ. 1 C). Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι KLF4 αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή, ως εκ τούτου λειτουργεί ως καταστολέας όγκων σε αμφότερες κύτταρα SKOV3 και OVCAR3.

KLF4 μπορεί να έχει διττή επίδραση είτε ως ενός ογκογονιδίου ή ενός ογκοκατασταλτικού στο μητρικό καρκινικά κύτταρα [14], [16], [18], [30]. Για τη σύγκριση των ενεργειών των KLF4 στον καρκίνο του μαστού MCF7 με ότι στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, εκτελέσαμε παρόμοια πειράματα χρησιμοποιώντας το ίδιο φακοϊική Tet-on επαγώγιμου φορέα μεταγωγή σε κύτταρα MCF7. Βρήκαμε ότι KLF4 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων MCF7 (Σχ. S3A). Το εύρημά μας είναι παρόμοια με τα αποτελέσματα που φαίνονται στα κύτταρα ΜΟΡ10Α με Yori et al. [16]. Yu et al., Ωστόσο, έδειξε ότι KLF4 λειτουργεί ως ογκογονίδιο σε κύτταρα MCF7 [14], η οποία είναι αντίθετη προς το εύρημα μας.

Η μορφολογία σε KLF4 κύτταρα που εκφράζουν SKOV3 με την παρουσία Dox μεταβλήθηκε σαφώς από κύτταρα ελέγχου χωρίς Dox σε διαφορετικά χρονικά σημεία (Σχήμα S2C)? Ωστόσο, δεν παρατηρήσαμε εμφανή μορφολογική μεταβολή στα κύτταρα OVCAR3 μετά την επαγωγή της έκφρασης KLF4. Ένας από τους λόγους που προκαλούν αυτό το φαινόμενο είναι ότι KLF4 επάγεται επίσης κυτταρικής απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών βασίζονται σε μη δημοσιευμένα δεδομένα μας. Οι μορφολογικές διαφορές μπορεί να προκαλούνται από τις διαφορετικές αποκρίσεις σε KLF4 απόπτωση που επάγεται στις δύο κυτταρικές σειρές. Σε αμφότερες κύτταρα SKOV3 και OVCAR3 η επιθηλιακή κυτταρικό δείκτη γονίδιο Ε-καδερίνης ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω, και τα μεσεγχυματικά γονίδια δείκτες βιμεντίνη και snail2 ρυθμίστηκαν προς τα κάτω μετά την επαγωγή του KLF4 υπερέκφραση (Εικ. 4Α, Β). Συνολικά, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι KLF4 προωθούνται κυρίως ΚΟΑ στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Η έκφραση των γονιδίων δείκτη που σχετίζεται ΕΜΤ σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών είναι παρόμοια με αυτά που παρατηρήθηκαν σε MCF7 κύτταρα καρκίνου του μαστού, αν και η ενδογενής έκφραση του βιμεντίνης σε MCF7 δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε KLF4 υπερεκφράζουν ή κύτταρα ελέγχου. Αυτό μπορεί να προκληθεί από χαμηλά ενδογενή επίπεδα έκφρασης βιμεντίνης σε κύτταρα MCF7. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν την υπόθεση ότι KLF4 αποτελεί βασικό ρυθμιστή προώθηση της ΚΟΑ και την αναστολή της EMT στην ωοθηκών και του μαστού καρκινικά κύτταρα.

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι KLF4 συνδέεται με τις περιοχές των υποκινητών της Ε-καδερίνης και snail2, έτσι μπορεί να ενεργοποιήσει το έκφραση της Ε-καδερίνης ή καταστέλλουν την έκφραση των snail2 σε ινοβλάστες και αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές [18], [24], [27], [31]. Η έκφραση του επιθηλιακού κυττάρου δείκτη Ε-καδερίνης απαιτείται για τον επαναπρογραμματισμό βλαστοκυττάρων. KLF4 διευκολύνει τη διαδικασία ΚΟΑ με την ενεργοποίηση της έκφρασης Ε-καδερίνης [31]. Σε καρκινικά κύτταρα ωοθηκών, παρατηρήσαμε μια KLF4 εξαρτώμενη αυξητική ρύθμιση της Ε-καδερίνης και προς τα κάτω ρύθμιση βιμεντίνη και snail2. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι KLF4 συνδέεται μεταγραφικά με τους υποστηρικτές της E-cadherin, οδηγώντας έτσι στην ενεργοποίηση της έκφρασης Ε-καδερίνης σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

Η EMT ή ΚΟΑ είναι στενά ρυθμίζεται από πολλαπλά μονοπάτια σηματοδότησης. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι πολλαπλές οδούς σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου WNT, Notch, NFkB, και ΤΟΡβ, εμπλέκονται σε ΕΜΤ ή ΜΕΤ μετάβαση σε καρκίνους [32], [33], [34], [35]. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν επίσης ότι TGFβ προωθεί EMT στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών [36], [37]. Ωστόσο, δεν υπάρχουν σχετικές μελέτες στην περιγραφή του μηχανισμού πώς εμπλέκεται KLF4 σε ΕΜΤ και αλληλεπιδρά με τις εν λόγω οδούς σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. τρέχουσες μελέτες μας δείχνουν ότι KLF4 αναστέλλει ΤΟΡβ-επαγόμενη EMT τόσο SKOV3 και τα κύτταρα OVCAR3 (Εικ. 6Α, Β), υποδηλώνοντας ότι KLF4 εξασθενεί την προκαλούμενη EMT ΤΟΡβ σε καρκίνους των ωοθηκών. Ως εκ τούτου, συνεργιστικά υπερέκφραση KLF4 και η αναστολή της ΤΟΡβ οδού θα παρέχει μια νέα προσέγγιση στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών φαρμάκων για τη θεραπεία των καρκίνων των ωοθηκών.

Εν συντομία, αυτή είναι η πρώτη αναφορά που δείχνει ότι λειτουργεί ως KLF4 ενός όγκου καταστολέα αναστέλλοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών μέσω ελαφρυντικών ΤΟΡβ-επαγόμενη EMT.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

επαγωγή της έκφρασης KLF4 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών χρησιμοποιώντας λεντοϊού Tet-on φορέα. Α λεντοϊών Tet-on σύστημα φορέα. Αντίστροφη τρανσενεργοποιητή (rtTA-Μ3) προήλθε από ανθρώπινη ubiquitin C (UBC προαγωγός) και EGFP ή KLF4 οδηγήθηκε από τον επαγόμενο υποκινητή Dox TRE-σφιχτό. Για την επαγωγή της έκφρασης της EGFP ή KLF4, Dox απαιτείται για την ενεργοποίηση του υποκινητή Tet ακόλουθη δεσμευτική rtTA στο Tet-αποκριτικού στοιχείου στην περιοχή υποκινητή. Β EGFP και KLF4 εκφράσεις προκλήθηκαν με Dox σε SKOV3 κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών και ανιχνεύθηκαν με στύπωση Western. κύτταρα Γ SKOV3 υπερεκφράζουν KLF4 οθόνη στρογγυλοποιείται επιθηλιακών κυττάρων, όπως μορφολογία

doi:. 10.1371 /journal.pone.0105331.s001

(PDF)

Εικόνα S2.

Dox επαγόμενη EGFP έκφραση σε κύτταρα SKOV3 και OVCAR3. EGFP εκφράσεις σε SKOV3 (Α) και τα κύτταρα OVCAR3 (Β) σε μεταγωγή με EGFP φορέα λεντοϊού έγιναν ορατά κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού με ή χωρίς επαγωγή Dox. μορφολογίες κυττάρου εξετάστηκαν κάτω από οπτικό μικροσκόπιο. Γ μορφολογίες κυττάρων απεικονίστηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία κάτω από οπτικό μικροσκόπιο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0105331.s002

(PDF)

Εικόνα S3.

KLF4 προωθεί MET σε κύτταρα MCF7 καρκίνου του μαστού. σχηματισμός Α αποικίας διεξήχθη σε κύτταρα MCF7 μεταγωγή με EGFP και KLF4 φορείς υπερέκφραση βραδέος. Ο αριθμός των αποικιών σε κύτταρα KLF4 υπερεκφράζουν μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με εκείνη στο Dox αγωγή ελέγχους (***

ρ

& lt? 0.001). ανάλυση κηλίδος Β Western των KLF4 (**

σ

& lt? 0.01), E-cadherin (**

σ

& lt? 0.01), και snail2 (*

p

& lt? 0,05) σε κύτταρα MCF7 που υπερεκφράζουν KLF4 και EGFP με ή χωρίς θεραπεία Dox

doi:. 10.1371 /journal.pone.0105331.s003

(PDF)

Εικόνα S4.

KLF4 ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση twist1 στα κύτταρα του καρκίνου των ωοθηκών SKOV3. Twist1 έκφραση σε KLF4 εκφράζουν SKOV3 και ελέγχου κύτταρα ανιχνεύτηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR μετά από επαγωγή KLF4 επί 24 ώρες με χρήση 1 μg /ml δοξυκυκλίνης (*

ρ

& lt? 0,05)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0105331.s004

(PDF)

Κείμενο S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0105331.s005

(DOCX)