Αφηρημένο

Ουμπικουϊτίνη που μοιάζει με PHD και το δαχτυλίδι τομέων δακτύλου 1 (UHRF1), ως επιγενετική ρυθμιστή, παίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση και εξέλιξης του καρκίνου. KiSS1 λειτουργεί ως καταστολέας μετάσταση σε διάφορους καρκίνους, και επιγενετική αποσιώπηση KiSS1 αυξάνει το μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε κατά πόσον UHRF1 προάγει τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης εισβολή των κυττάρων αναστέλλοντας KiSS1. Τα επίπεδα έκφρασης του UHRF1 και KiSS1 εξετάστηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR δοκιμασία

in vitro

και

in vivo

. Ο ρόλος του στη ρύθμιση UHRF1 μετάσταση καρκίνου της ουροδόχου κύστης, αξιολογήθηκε σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρο. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα UHRF1 ρυθμίζεται αυξητικά στα περισσότερα κλινικά δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με συζευγμένες φυσιολογικούς ιστούς, και τα επίπεδα έκφρασης UHRF1 αυξήθηκαν σημαντικά σε πρωτογενείς όγκους που στη συνέχεια κάνει μετάσταση σε σύγκριση με μη-μεταστατικούς όγκους. Αναγκαστική έκφραση UHRF1 προάγει τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης εισβολή των κυττάρων, ενώ UHRF1 νοκ ντάουν μειώνει την κυτταρική διείσδυση. Η υπερέκφραση του UHRF1 αυξάνει την μεθυλίωση CpG νουκλεοτιδίων και μειώνει την έκφραση του KiSS1. επίπεδο έκφρασης UHRF1 και KiSS1 συσχετίζεται αρνητικά

in vivo

και

in vitro

. Νοκ ντάουν της KiSS1 προωθεί κύστης καρκινικών κυττάρων εισβολής. Είναι σημαντικό, ανάγκασε την έκφραση της KiSS1 καταργεί εν μέρει UHRF1 επαγόμενη κυτταρική εισβολή. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι απορυθμίζεται UHRF1 αυξάνει τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης εισβολή κυττάρων από επιγενετική αποσιώπηση των KiSS1

Παράθεση:. Zhang Υ, Huang Ζ, Zhu Z, Zheng Χ, Liu J, Han Ζ, et al. (2014) απορυθμίζεται UHRF1 Προωθεί τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης εισβολή κυττάρων από Επιγενετική κατασιγάσει του KiSS1. PLoS ONE 9 (10): e104252. doi: 10.1371 /journal.pone.0104252

Επιμέλεια: Hari Κ Κοαΐ, Louisiana State University Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Απρίλη του 2014? Δεκτές: 7 Ιούλ 2014? Δημοσιεύθηκε: 1η Οκτωβρίου 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης κατατάσσεται δεύτερη σε συχνότητα του ουροποιογεννητικού καρκίνου [1], και περίπου το 50% των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (MIBC) να αναπτύξουν απομακρυσμένες μεταστάσεις στους πνεύμονες και ήπαρ, με αποτέλεσμα την κακή ποσοστά επιβίωσης 5 ετών [2]. Επί του παρόντος, οι πρόοδοι στην κατάλληλη θεραπεία για την ενίσχυση της επιβίωσης περιορίζεται επειδή οι υποκείμενοι μηχανισμοί που προκαλούν μετάσταση καρκίνου δεν είναι καλά κατανοητοί. Ως εκ τούτου, είναι πολύ σημαντικό να αποκαλύψει το μοριακό μηχανισμό της μετάστασης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης για την ανάπτυξη αποτελεσματικής θεραπείας.

UHRF1, που ονομάζεται επίσης ICBP90 σε ανθρώπους και Np95 σε ποντικούς, είναι μια πολλών τομέων πρωτεΐνη, η οποία απαιτείται για επιγενετική ρύθμιση της γονίδιο έκφρασης και χρωματίνης τροποποίηση [3], [4]. UHRF1 αυξάνει την G1 /S μετάβαση ως ο στόχος του μεταγραφικού παράγοντα E2F [5], και οι αλλαγές στο επίπεδο έκφρασης UHRF1 ρυθμίζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και η κυτταρική μετανάστευση [6], [7]. UHRF1 ρυθμίζεται αυξητικά σε πολλαπλούς τύπους καρκίνων, και η υπερέκφραση του UHRF1 εμπλέκεται στην ογκογένεση και τον καρκίνο εξέλιξης [8], [9]. Πολλές εκθέσεις έδειξαν ότι UHRF1 μπορεί να αποτελέσει σημαντικό βιοδείκτη για τη διάγνωση και την πρόγνωση καρκίνων [5]. Unoki

κ.ά.

απέδειξαν ότι UHRF1 υπερέκφραση συνδέεται με το βαθμό και το στάδιο του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [10]. Η υπερέκφραση του UHRF1 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι επίσης συσχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο εξέλιξης του καρκίνου μετά από διουρηθρική εκτομή [10]. Wang

κ.ά.

έδειξε ότι UHRF1 υπερεκφράζεται σε ορθοκολικό κυτταρικές γραμμές καρκίνου (CRC) και κλινικών δειγμάτων [5]. Οι UHRF1 επίπεδα έκφρασης συσχετίζεται με μετάσταση του καρκίνου και των φτωχών στάσης Dukes. UHRF1 νοκ ντάουν επάγει κυτταρική απόπτωση και διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη φάση Ο0 /Ο1 και καταστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση.

UHRF1 είναι ένας πολύ σημαντικός ρυθμιστής της μεθυλίωσης του DNA, και παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA είναι ένα συχνό επιγενετικό συμβάν στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [6], [11]. UHRF1 αναγνωρίζει ημι-μεθυλιωμένο DNA που παράγεται κατά την αντιγραφή του DNA και στρατολογεί DNMT1 (DNA methyltransferase1) για να διασφαλιστεί πιστή διατήρηση των προτύπων DNA-μεθυλίωση σε θυγατρικά κύτταρα [6]. KiSS1 ταυτοποιείται ως καταστολή μεταστάσεων σε διάφορους καρκίνους, όπως ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης, κύτταρα καρκίνου του μαστού και μελάνωμα [12]. KiSS1 κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 145 αμινοξέων που υποβάλλονται σε επεξεργασία σε KiSSpeptins (ΠΚ), συμπεριλαμβανομένων των KP10, KP13, KP14 και KP54 [12], [13], [14]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι KiSS1 είναι επιγενετικώς σιγήσει υπερμεθυλίωση στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [15]. Cebrian

κ.ά.

απέδειξαν ότι KiSS1 υπερμεθυλίωση συχνά παρατηρείται και συσχετίζεται με χαμηλή έκφραση του γονιδίου, αποκαθίσταται με απομεθυλίωση αζακυτιδίνη σε καρκινικά κύτταρα κύστης [12]. Υπερμεθυλίωση KiSS1 επίσης συσχετίζεται με υψηλό βαθμό του όγκου και το στάδιο. Παρά αυτά τα ενδιαφέροντα ευρήματα, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το αν UHRF1 αυξάνει κύστης εισβολή των καρκινικών κυττάρων από επιγενετική αποσιώπηση των KiSS1.

Στη μελέτη, ελέγξαμε εάν UHRF1 /KiSS1 αντιπροσωπεύει μια νέα πορεία ρύθμιση της ουροδόχου κύστης εισβολή των καρκινικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι η έκφραση UHRF1 ρυθμίζεται αυξητικά σε πρωτογενείς όγκους που στη συνέχεια μεταστάσεις, και η υπερέκφραση του UHRF1 προωθεί κύστης εισβολή των καρκινικών κυττάρων από επιγενετική αποσιώπηση των KiSS1.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα και κυτταρικές σειρές

Ανθρώπινοι ιστοί ουροδόχου κύστης ελήφθησαν με τη γραπτή συγκατάθεση από το Πεκίνο Φιλίας Νοσοκομείο συνδεδεμένες με Capital Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Κεφαλαίου Ιατρικό Πανεπιστήμιο. 47 δείγματα (Πίνακας 1) παθολογικά και φυσιολογικά διαγιγνώσκεται δείγματα βιοψίας (≥3 εκατοστά μακριά από τους ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης) συλλέχθηκαν από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης, συμπεριλαμβανομένων 22 με μη διηθητικό [NMI, στάδιο ΡΤΑ-ρΤ1] και 25 με διηθητικό [ΜΙ, στάδιο ≥T2] .Ανθρωπινο κύστη καρκινικά κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 με 10% FBS (GIBCO, Carlsbad, CA).

πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR

Ολικό RNA από κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως και δείγματα εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Το RT (αντίστροφης μεταγραφής) αντίδραση διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα κιτ M-MLV ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen). Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα πρότυπο SYBR Green ΡΟΚ Master Mix (Life Technologies) πρωτόκολλο σχετικά με τις StepOne Real-Time PCR System (Applied Biosystems) σύμφωνα με τις οδηγίες του εκάστοτε κατασκευαστή. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για mRNA. Αντίστοιχες τιμές ΔCt (τόσο UHRF1 και KiSS1) ελήφθησαν από την κανονικοποίηση σε β-ακτίνη. Σχετική έκφραση υπολογίστηκε σε σχέση με το μάρτυρα. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως 2

-ΔΔCt. *

σ

& lt?. 0.05

Η υπερέκφραση και μικρά παρεμβαλλόμενα RNA

Για να υπερεκφράζουν UHRF1, πλασμίδιο pcDNA-UHRF1 κατασκευάστηκε με την εισαγωγή ενός

HindIII-EcoRI

θραύσμα που περιέχει το cDNA UHRF1 στις ίδιες θέσεις σε pcDNA3.1. Το γονίδιο UHRF1 ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας τον προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές: cccaagcttgggATGTGGATCCAGGTTCGGACCATGGACGGG και ggaattccTCACCGGCCATTGCCGTAGCCGGGGAAG. pcDNA-UHRF1 επιμολύνθηκε σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Για την αναστολή της ενδογενούς UHRF1 και έκφραση KiSS1, τα καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης επιμολύνθηκαν με 30 nm έδειξε υποδεικνύεται siRNA ή αρνητικό μάρτυρα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000. UHRF1-siRNAs (ακολουθία αναφοράς, SC-76805) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Η KiSS1-siRNAs (ακολουθία αναφοράς, SC-37443) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology.

Transwell δοκιμασία εισβολής

Η εισβολή των κυττάρων εξετάστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία εισβολή Transwell με ένθετα του μεγέθους πόρων 8-μm (Corning Costar) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Εν συντομία, ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης κύτταρα (RT4 ή Τ24) εναιωρήθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού και στη συνέχεια σπάρθηκε επί Matrigel επικαλυμμένα φίλτρα Transwell σε θαλάμους εισβολή Biocoat Matrigel. Το μέσο που περιέχει ορό χρησιμοποιήθηκε ως χημειο-προσελκυστικό στον κατώτερο θάλαμο. Τα καρκινικά κύτταρα της ουροδόχου κύστης υποβλήθηκαν σε θεραπεία με υποδεικνυόμενη αντιδραστήρια για 72 ώρες και στη συνέχεια τα κύτταρα που δεν εισβάλλουν μέσα από τους πόρους εξαλείφθηκαν με τη χρήση ενός μπατονέτα. Τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης βάφτηκαν με ιώδες κρυστάλλου. Οι αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν με μέτρηση των διαπερνούν τα κύτταρα κάτω από ένα μικροσκόπιο σε 200 × μεγέθυνση σε τυχαία πεδία σε κάθε φρεάτιο.

Ανάλυση μεθυλίωσης του

KiSS1

Η

Μια αναζήτηση για εμπλουτισμός των CpG σε KiSS1 έγινε και θειώδους εναύσματα αλληλουχίας σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το CpG νησί Searcher online εργαλείο (MethPrimer, https://www.urogene.org/methprimer/). Τα εμπρός εκκινητές είναι GATGGAAGGGGAATAGTTTTATTAGA, και τα αντίστροφα εναύσματα είναι TACAACTAAAACTCCTTCCACCTAC [12].

Γενωμικό DNA παρασκευάστηκε από καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα χρησιμοποιώντας την Mini κιτ αίμα QiAmp DNA, και στη συνέχεια το γενωμικό DNA τροποποιήθηκε όξινο θειώδες χρησιμοποιώντας DNA EZ Μεθυλίωση -Gold Kit από την έρευνα Zymo [17]. Τα προϊόντα PCR κλωνοποιήθηκαν σε PMD-18T (Takara) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 9 θετικοί κλώνοι αλληλουχήθηκαν. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με χρήση του λογισμικού αναλυτή BIQ [17].

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD (τυπική απόκλιση) από τουλάχιστον τρία ξεχωριστά πειράματα. Οι διαφορές μεταξύ των ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

test του Student. Η διαφορά κρίθηκε στατιστικά σημαντική σε

σ

& lt?. 0.05

Αποτελέσματα

επίπεδο UHRF1 υπερεκφράζεται σε μεταστατικούς ουροφόρων κύστη

καρκίνωμα

UHRF1 αποτελέσματα σε ανώμαλη DNA μεθυλίωση και της μετάστασης του καρκίνου, και η έκφραση UHRF1 συσχετίζεται με πτωχή πρόγνωση σε πολλές μορφές καρκίνου. Για να εκτιμηθεί εάν UHRF1 ρυθμίζει κύστη μετάστασης του καρκίνου, εξετάσαμε πρώτα έκφραση UHRF1 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως και καρκινικούς ιστούς. Σχήμα 1Α έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης των UHRF1 ρυθμίζεται αυξητικά σημαντικά στους περισσότερους ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς μάρτυρες. UHRF1 αξιοσημείωτα αυξημένη έκφραση σε 77% (36/47) των ιστών καρκίνου της ουροδόχου κύστης (Σχήμα 1Α). Όταν οι 47 ιστούς όγκων στρωματοποιήθηκαν με βάση την κλινική εξέλιξη, η έκφραση UHRF1 είναι σημαντικά αυξημένη σε πρωτογενείς όγκους που στη συνέχεια κάνει μετάσταση σε σύγκριση με μη-μεταστατικούς όγκους (Σχήμα 1Β). Στη συνέχεια προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασης του UHRF1 σε αμφότερες τις επεμβατικές κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως και καρκινικές κυτταρικές σειρές μη επεμβατική κύστης. Μεταξύ των τριών επεμβατική κυτταρικές σειρές (253J, Τ24 και KU7) τα επίπεδα UHRF1 είναι σχετικά υψηλότερες από εκείνες στις μη επεμβατικές αυτές (Εικόνα 1Γ). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι UHRF1 overexpressoin μπορεί να σχετίζεται με μετάσταση καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

(Α) Η ποσοτική ανάλυση του επιπέδου έκφρασης UHRF1 διεξήχθη σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης (n = 47) και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Ολικό RNA εκχυλίστηκε και υποβλήθηκε σε PCR πραγματικού χρόνου για να αναλυθεί η έκφραση του UHRF1 σε κάθε δείγμα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Το σχετικό επίπεδο UHRF1 ήταν υπολογίζονται 2

-ΔΔCt όπου ΔCt = Ct (UHRF1) – Ct (β-ακτίνη) και ΔΔCt = ΔCt (καρκινικός ιστός) – ΔΟΙ (παρακείμενο φυσιολογικό ιστό). δείγματα καρκίνου (Β) Η κύστη χωρίστηκαν σε δύο ομάδες με βάση την κλινική πρόοδο. Τα επίπεδα UHRF1 στην ομάδα μετάσταση (n = 25) ήταν υψηλότερες από αυτές στην ομάδα χωρίς μετάσταση (n = 22). *

σ

& lt? 0,05. (Γ) UHRF1 επίπεδο έκφρασης αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR σε τρία μη επεμβατική και τρία διηθητικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές της ουροδόχου κύστης. Κανονική urothelial κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. *

σ

& lt?. 0.05

Η

απορυθμίζεται UHRF1 αυξάνει τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυττάρων εισβολής

in vitro

Η

Για να διερευνήσουν το ρόλο της UHRF1 στη ρύθμιση κελί εισβολή, αναλύθηκαν οι κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως σε επεξεργασία με UHRF1-siRNA ή ροϋΝΑ-UHRF1. Δείξαμε πρώτα εάν RT4 και τα κύτταρα Τ24 μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως

in vitro

μοντέλο για τη διερεύνηση UHRF1 με προσδιορισμό της έκφρασής του σε RT4 ή κύτταρα Τ24 μετά υπερέκφραση ή knockdown του UHRF1. Σχήμα 2Α και C έδειξαν ότι η θεραπεία pcDNA-UHRF1 αυξάνει σημαντικά τα επίπεδα UHRF1 σε μη επεμβατικές κύτταρα RT4, ενώ θεραπεία UHRF1-siRNA μειώνει την έκφραση UHRF1 σε επεμβατικές κύτταρα Τ24. Επιπλέον, προς τα πάνω ρύθμιση του UHRF1 προάγει εισβολή κυττάρων RT4 (Σχήμα 2Β), ενώ siRNA μεσολάβηση αποσιώπηση UHRF1 αναστέλλει την εισβολή των κυττάρων Τ24 (Σχήμα 2D). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι UHRF1 ρυθμίζει θετικά κύστη καρκινικών κυττάρων εισβολής.

(Α) κύτταρα RT4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με pcDNA-UHRF1, και το σχετικό επίπεδο του UHRF1 δοκιμάστηκε με πραγματικό χρόνο PCR. *

σ

& lt? 0,05. (Β) UHRF1 υπερεκφράστηκε σε κύτταρα RT4, και δοκιμασία εισβολής διεξήχθη όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αντιπροσωπευτικά στοιχεία του κάθε πειράματος φαίνονται. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν δεδομένα από πέντε ανεξάρτητα πειράματα, που εκφράζεται ως μέση ± SD. *

σ

& lt? 0,05. (C) κύτταρα Τ24 υπέστησαν κατεργασία με UHRF1-siRNA, και το σχετικό επίπεδο του UHRF1 δοκιμάστηκε με πραγματικό χρόνο PCR. *

σ

& lt? 0,05. (D) δοκιμασία εισβολή πραγματοποιήθηκε μετά UHRF1 νοκ ντάουν. Τα αντιπροσωπευτικά στοιχεία του κάθε πειράματος φαίνονται. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν δεδομένα από πέντε ανεξάρτητα πειράματα, που εκφράζεται ως μέση ± SD. *

σ

& lt?. 0.05

Η

UHRF1 αυξάνει τη μεθυλίωση των CpG νουκλεοτίδια και μειώνει την έκφραση του KiSS1

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι KiSS1 συχνά υπερμεθυλίωση στην ουροδόχο κύστη καρκίνο και συσχετίζεται με την πρόοδο του καρκίνου [12]. Εδώ ερευνήσαμε αν UHRF1 ρυθμίζει τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης εισβολή κυττάρων από επιγενετική αποσιώπηση των KiSS1. Πρέπει πρώτα προσδιορίστηκαν αν UHRF1 ρυθμίζει την έκφραση KiSS1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α και Β, αναγκαστική έκφραση UHRF1 αναστέλλει την έκφραση KiSS1, ενώ knockdown του UHRF1 αυξάνει την έκφραση KiSS1. Στη συνέχεια προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασης UHRF1 και KiSS1 τόσο επεμβατική κυτταρικές σειρές καρκίνου της κύστεως και καρκινικές κυτταρικές σειρές μη επεμβατική κύστης. Σχήμα 3C έδειξε ότι τα επίπεδα UHRF1 είναι σχετικά υψηλότερη με ταυτόχρονη χαμηλά επίπεδα KiSS1 στην επεμβατική κυτταρικές σειρές. Μια σημαντική αρνητική συσχέτιση παρατηρείται επίσης μεταξύ των επιπέδων UHRF1 mRNA και τα επίπεδα KiSS1 mRNA

in vivo

(

r

2 = 0,0648,

σ

= 0.0063, Σχήμα 3D). Ερευνήσαμε περαιτέρω το εάν UHRF1 αναστέλλει την έκφραση KiSS1 με την αύξηση της μεθυλίωσης των CpG νουκλεοτιδίων του

KiSS1

. Αναλύσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης των CpG νησίδων σε KiSS1 με διθειώδες αλληλουχίας, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [12], [15]. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας μεθυλίωσης για την

KiSS1

γονίδιο σε 14 ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης και των παρακείμενων φυσιολογικούς ελέγχους συνοψίζονται στο Σχήμα 4Α. ανάλυση Bisulfite αλληλούχιση απεκάλυψε ότι

KiSS1

συχνότητα μεθυλίωσης είναι σημαντικά αυξημένη σε ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με παρακείμενες ελέγχους (Σχήμα 4Α). ανάλυση συσχέτισης έδειξε ότι το

KiSS1

επίπεδο μεθυλίωσης συσχετίζεται θετικά με την έκφραση UHRF1 τόσο καρκίνο της ουροδόχου κύστης και των φυσιολογικών ιστών ουροδόχου κύστης (Σχήμα 4Β, p = 0,0036, Ρ

2 = 0,2091). ανάλυση Bisulfite αλληλούχιση έδειξε περαιτέρω ότι UHRF1 υπερέκφραση αυξάνει την μεθυλίωση CpG νουκλεοτιδίων του

KiSS1

(Σχήμα 4C, D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι UHRF1 καταστέλλει την έκφραση KiSS1 από επιγενετική αποσιώπηση των KiSS1.

επίπεδο έκφρασης (Α και Β) KiSS1 αναλύθηκε σε κύτταρα RT4 υπερεκφράζεται με UHRF1 ή κύτταρα Τ24 αγωγή με UHRF1-siRNA. *

σ

& lt? 0,05. επίπεδα (C) UHRF1 και KiSS1 αναλύθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR σε τρία μη επεμβατική και τρεις επεμβατικές κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Κανονική urothelial κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. *

σ

& lt? 0,05. (D) αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων UHRF1 mRNA και τα επίπεδα KiSS1 σε 24 δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης (

r

2 = 0,0648,

σ

= 0.0063).

(Α) Η ανάλυση μεθυλίωσης του

KiSS1

γονιδίου σε 14 ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης και των παρακείμενων φυσιολογικών δειγμάτων. ανάλυση BSQ αποκάλυψε ότι

KiSS1

μεθυλίωση συχνότητα είναι σημαντικά αυξημένη με τα δείγματα του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. ** P & lt? 0,01. (Β) Μια θετική συσχέτιση παρατηρείται μεταξύ

KiSS1

μεθυλίωση και την έκφραση UHRF1 (R

2 = 0,2091, p = 0,0036). (Γ και Δ) κατάσταση CpG νησί μεθυλίωσης KiSS1 αναλύθηκε με όξινο θειώδες αλληλούχιση σε κύτταρα RT4. Εννέα μεμονωμένοι κλώνοι φαίνονται ανά κυτταρική γραμμή. CpG δινουκλεοτίδια εκπροσωπήθηκαν ως μαύρα τετράγωνα για μετουσιωμένο κυτοσίνες και ανοιχτές πλατείες για μη μεθυλιωμένες κυτοσίνες.

Η

UHRF1 αυξάνει τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης εισβολή των κυττάρων αναστέλλοντας KiSS1

UHRF1 μειώνει την έκφραση KiSS1 με την αύξηση της μεθυλίωσης του CpG νουκλεοτίδια του

KiSS

, και προς τα κάτω ρύθμιση των KiSS1 προωθεί κύστης καρκινικών κυττάρων εισβολής. Συνεπώς, πιθανολογείται ότι ο ρόλος του στη ρύθμιση UHRF1 κύτταρο εισβολή εν μέρει μεσολαβείται από KiSS1. Πρέπει πρώτα προσδιορίστηκαν κατά πόσον η αναστολή KiSS1 αυξάνει κύστης καρκινικών κυττάρων εισβολής. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α και Β, knockdown του KiSS1 προάγει εισβολή κυττάρων RT4. Πιο σημαντικό, KiSS1 υπερέκφραση αναστέλλει μερικώς UHRF1 επαγωγής εισβολή κυττάρων RT4 (Σχήμα 5C και D). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι UHRF1 προάγει καρκίνο της ουροδόχου κύστης εισβολή κυττάρου, τουλάχιστον εν μέρει, από επιγενετικές σίγηση του KiSS1.

(Α και Β) τα κύτταρα RT4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με KiSS1-siRNA και δοκιμασία εισβολής διεξήχθη μετά KiSS1 knockdown. Τα αντιπροσωπευτικά στοιχεία του κάθε πειράματος φαίνονται. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν δεδομένα από πέντε ανεξάρτητα πειράματα, που εκφράζεται ως μέση ± SD. *

σ

& lt? 0,05. (C και D) κύτταρα RT4 υπερεκφράστηκαν με την UHRF1 ή UHRF1 συν KiSS1, και δοκιμασία εισβολής διεξήχθη. *

ρ

& lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Στα θηλαστικά, η μεθυλίωση του DNA λαμβάνει χώρα στη θέση C5 της κυτοσίνης στο πλαίσιο των CpG δινουκλεοτιδίων, με αποτέλεσμα 5 -methylcytosine (5mC) [18]. Η τροποποίηση του γονιδιωματικού DNA με μεθυλίωση είναι ένα σημαντικό επιγενετική σήματος, και οι αλλαγές στο πρότυπο της μεθυλίωσης του DNA είναι ένα σταθερό εύρημα σε διάφορους τύπους όγκων [19]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η επιγενετική κληρονομιά της μεθυλίωσης του DNA απαιτεί UHRF1, η οποία προσλαμβάνει DNMT1 με πιρούνια αντιγραφή του DNA μέσα από μια μοναδική ημι-μεθυλιωμένο δραστηριότητα CpG-δεσμευτική [20]. Liu

et al

ανέφεραν ότι UHRF1 στρατολογεί DNMT1 για μεθυλίωση συντήρηση του DNA μέσω της σύνδεσης είτε ημι-μεθυλιωμένο CpG ή H3K9me2 /3, και ότι η παρουσία και των δύο δραστηριοτήτων δέσμευσης εξασφαλίζει υψηλή πιστότητα της μεθυλίωσης του DNA συντήρησης [20].

UHRF1 υπερέκφραση συνδέεται με τα στάδια του όγκου και προβλέπει κακή πρόγνωση σε διάφορους καρκίνους [21]. UHRF1 συντονίζει PPARG (πολλαπλασιαστή περοξυσώματος γ υποδοχέα) επιγενετική αποσιώπηση και μεσολαβεί καρκίνο του παχέος εντέρου εξέλιξη [22]. Νοκ ντάουν της UHRF1 προκαλεί PPARG επαναδραστηριοποίηση, που συνοδεύεται από θετικά σημάδια της ιστόνης και DNA απομεθυλίωση, επιβεβαιώνοντας το ρόλο της στην PPARG αποσιώπηση. Babbio

κ.ά.

έδειξε ότι UHRF1 συμβάλλει στην επιγενετικών γονιδιακή σίγηση σε εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη [23]. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης του UHRF1 αυξήθηκε σημαντικά στους περισσότερους ιστούς καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με παρακείμενες φυσιολογικούς μάρτυρες. Επιπλέον, η έκφραση UHRF1 είναι σημαντικά αυξημένη σε πρωτογενείς όγκους που στη συνέχεια κάνει μετάσταση σε σύγκριση με μη-μεταστατικούς όγκους. Βρήκαμε επίσης ότι τα επίπεδα UHRF1 είναι σχετικά υψηλότερες σε διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές από εκείνες στις μη επεμβατικές αυτές. Επιπλέον, ρυθμίζεται προς τα πάνω UHRF1 προωθεί μη επεμβατική εισβολή των κυττάρων RT4, ενώ νοκ ντάουν της UHRF1 αναστέλλει επεμβατική Τ24 κυτταρική εισβολή. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι πάνω ρύθμιση UHRF1 συμβάλλει στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρική εισβολή.

KiSS1 είναι μια μετάσταση όγκου γονίδιο καταστολής σε διάφορες μορφές καρκίνου. έκφραση KiSS1 είναι αισθητά μειωμένη σε επεμβατικές όγκους της ουροδόχου κύστης σε σύγκριση με τις αντίστοιχες κανονικές ουροδόχου κύστης τους [24]. Χαμηλότερο επίπεδο KiSS1 συσχετίζεται με τη συνολική επιβίωση σε όγκους της ουροδόχου κύστης [24]. KiSS1 σημαντικά μεθυλιωμένο. Αδρανοποίηση των KiSS1 από μεθυλίωση υποκινητής είναι ένα σπάνιο συμβάν σε αδενοκαρκίνωμα παγκρεατικού πόρου (PDAC) [25]. KiSS1 επίσης επιγενετικώς τροποποιηθεί καρκίνο του παχέος εντέρου, και KiSS1 μεθυλίωση σχετίζεται με το βαθμό του όγκου, προέβλεψε υποτροπής και συνολικής επιβίωσης [15]. Εδώ βρήκαμε ότι UHRF1 ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση KiSS1. επίπεδα UHRF1 είναι σχετικά υψηλότερα με ταυτόχρονη χαμηλά επίπεδα KiSS1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές επεμβατική κύστης. Μια σημαντική αρνητική συσχέτιση παρατηρείται επίσης μεταξύ των επιπέδων UHRF1 mRNA και τα επίπεδα KiSS1 mRNA

in vivo

. Ανάλυση όξινο θειώδες αλληλουχίας έδειξε ότι UHRF1 αναστέλλει την έκφραση KiSS1 από την αύξηση της μεθυλίωσης των CpG νουκλεοτιδίων του

KiSS1

. Πιο σημαντικό, KiSS1 υπερέκφραση αναστέλλει εν μέρει την εισβολή των κυττάρων RT4 στην UHRF1-κύτταρα που υπερεκφράζουν.

Συμπέρασμα

Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι απορυθμίζεται UHRF1 συμβάλλει στην ουροδόχο κύστη εισβολή των καρκινικών κυττάρων από επιγενετική αποσιώπηση των KiSS1.