Αφηρημένο

Ιστορικό

Ναι σχετιζόμενη πρωτεΐνη (YAP) είναι ένας μεταγραφικός συν-ενεργοποιητή και ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση. Ερευνήσαμε την κλινική και βιολογική σημασία της YAP στον καρκίνο του ενδομητρίου (EMCA).

Μέθοδοι

έκφραση YAP σε 150 πρωτογενείς ιστούς όγκων από ασθενείς με EMCA εκτιμήθηκε με ανοσοϊστοχημεία και η σύνδεσή της με κλινικοπαθολογοανατομικές δεδομένων αξιολογήθηκε. Οι βιολογικές λειτουργίες της YAP προσδιορίστηκαν σε κυτταρικές σειρές EMCA μέσω νοκ ντάουν /υπερέκφραση του YAP. Ο ρόλος της YAP στη ρύθμιση της ευαισθησίας ακτινοβολίας διερευνήθηκε επίσης σε κύτταρα EMCA.

Αποτελέσματα

Η αυξημένη πυρηνική YAP έκφραση ήταν σημαντικά σχετίζεται με υψηλότερο βαθμό, το στάδιο, λεμφο-αγγειακό χώρο εισβολή, μετεγχειρητική υποτροπή /μετάσταση και η συνολική επιβίωση των οιστρογόνων μεσολαβείται EMCA, που ονομάζεται τύπου 1 καρκίνου (p = 0.019, = 0.028, = 0,0008, = 0.046 και 0.015 =, αντίστοιχα). Στην πολυπαραγοντική ανάλυση, η έκφραση της πυρηνικής YAP επιβεβαιώθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για τη συνολική επιβίωση σε τύπου 1 EMCA. YAP knockdown με siRNA είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (ρ & lt? 0,05), εξαρτάται από την αγκύρωση αναπτύξεως (p = 0,015) και τη μετανάστευση /την εισβολή (ρ & lt? 0,05), και μια σημαντική αύξηση στον αριθμό των κυττάρων σε G0 /G1 φάση (p = 0,002). Αντιστρόφως, YAP υπερέκφραση προωθείται πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Κλωνογονική δοκιμασία επέδειξαν ενισχυμένη ραδιοευαισθησία κατά περίπου 36% σε YAP ανέστειλε κύτταρα.

Συμπεράσματα

Από YAP λειτουργεί ως μεταγραφικός συν-ενεργοποιητή, διαφορική εντοπισμός του στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων και την επακόλουθη επίδραση στις τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων θα μπορούσε να έχει σημαντικές συνέπειες σε σχέση με τον ρόλο της ως ογκογονίδιο σε EMCA. έκφραση της πυρηνικής YAP θα μπορούσε να είναι χρήσιμο ως προγνωστικός δείκτης ή θεραπευτικό στόχο και να προβλέψει την ευαισθησία ακτινοβολίας σε ασθενείς με EMCA

Παράθεση:. Tsujiura Μ, Mazack V, Sudol Μ, Kaspar HG, Nash J, Carey DJ, κ.ά. . (2014) Ναι-Associated Protein (YAP) Διαμορφώνει Ογκογόνες Χαρακτηριστικά και Ακτινοβολίας ευαισθησία σε καρκίνο του ενδομητρίου. PLoS ONE 9 (6): e100974. doi: 10.1371 /journal.pone.0100974

Επιμέλεια: Χονγκ Wanjin, Ινστιτούτο Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας, Biopolis, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Φεβ, 2014? Αποδεκτές: πρώτης Ιουνίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 27 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Tsujiura et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση έργο που επιτέλεσε σε αυτή την έκδοση ήταν από την Grant SRC-075 Clinic Research Fund, Geisinger Ιατρικό Κέντρο και το Ίδρυμα Ράις Καρκίνου. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του ενδομητρίου (EMCA) είναι η τέταρτη πιο κοινή μορφή καρκίνου και η πιο κοινή γυναικολογικό καρκίνο στις αμερικανικές γυναίκες, με περίπου 8200 θανάτους και 49.500 νέες περιπτώσεις στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2013 [1]. Ενώ οι γυναίκες με EMCA έχουν γενικά καλή πρόγνωση με 81,5% 5-ετή επιβίωση (2003-2009), η συχνότητα και το θάνατο του EMCA συνέχισαν να αυξάνονται κατά μέσο όρο 1,1% και 0,4% αντίστοιχα κάθε χρόνο κατά τη διάρκεια των τελευταίων 10 ετών [2 ]. Οι πρόσφατες αυξήσεις στη συχνότητα εμφάνισης του ενδομητρίου ποσοστά καρκίνου θεωρείται σε μεγάλο βαθμό αποδίδεται στην επιδημία της παχυσαρκίας [3]. Αν και οι βελτιώσεις σε διαγνωστικές τεχνικές και περιεγχειρητική διαχείριση είχαν ως αποτέλεσμα μία αύξηση στην πρώιμη ανίχνευση του EMCA και ευνοϊκή πρόγνωση, γυναίκες διαγιγνώσκονται με προχωρημένη ή υποτροπιάζουσα νόσο έχουν πολύ χειρότερα ποσοστά επιβίωσης και περιορισμένες επιλογές επικουρική θεραπεία. μελέτες γονιδιακής έκφρασης έχουν εντοπίσει ορισμένα γονίδια που εκφράζονται διαφορικά σε EMCA, όπως

PTEN

,

KRAS

,

CTNNB1

,

PIK3CA

και

FGFR2

[4], [5], [6], [7]. Στο κλινικό περιβάλλον, ωστόσο, μερικά μόρια έχουν αναλυθεί ως θεραπευτικοί ή /και διαγνωστικές βιοδείκτες. Ως εκ τούτου, η αναγνώριση των βιολογικών δεικτών και των μεταγενέστερων τους στόχους είναι απαραίτητη για την εξατομίκευση των θεραπειών και τη βελτίωση της έκβασης και της ποιότητας ζωής σε ασθενείς με EMCA.

EMCA έχει κατηγοριοποιηθεί σε δύο τύπους. Type 1 καρκίνος είναι υπεύθυνος για περίπου το 80% των EMCA και χαρακτηρίζεται ως οιστρογόνο εξαρτώμενος, υποδοχέα οιστρογόνου (ER) και υποδοχέα προγεστερόνης (PR) θετική με μορφολογία ενδομητριοειδές και γενικά μια ευνοϊκή πρόγνωση [8]. Αντιστρόφως, καρκίνος τύπου 2 είναι τα οιστρογόνα ανεξάρτητη, ER /PR αρνητική, πτωχά διαφοροποιημένο και συνδέονται με μια πολύ χειρότερη πρόγνωση [9]. Τυπική θεραπεία για τους δύο τύπους περιλαμβάνει χειρουργική αφαίρεση της μήτρας, του τραχήλου, των διμερών σαλπίγγων και των ωοθηκών. Οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι επιδεικνύουν υψηλού κινδύνου χαρακτηριστικά μπορεί επιπλέον να υποβληθούν σε λεμφαδενεκτομή. Πρώιμα στάδια EMCA με χαρακτηριστικά υψηλού κινδύνου, όπως η βαθιά μυομήτριο εισβολή, λεμφο-αγγειακό χώρο εισβολής (Lvsi) και υψηλού βαθμού συνδέεται με κίνδυνο 15-25% της υποτροπής [10]. Επικουρική ακτινοθεραπεία, η πιο κοινή μορφή θεραπείας για τους ασθενείς υψηλού κινδύνου πρώιμου σταδίου, έχει βρεθεί σε πολλαπλές μελέτες για να μειωθεί πυέλου και κολπικές υποτροπής 12-14% χωρίς θεραπεία στο 3-4% με τη θεραπεία, αλλά ακόμη χωρίς αντίστοιχη αύξηση στη συνολική επιβίωση [11], [12]. Με άλλα λόγια, η ακτινοθεραπεία εκθέτει έναν μεγάλο αριθμό γυναικών στην τοξικότητα χωρίς σαφή όφελος στη συνολική θνησιμότητα, ειδικά η πλειοψηφία των ασθενών που θα είναι απαλλαγμένες από τη νόσο σε απουσία επιπλέον θεραπεία. Η θεραπεία ακτινοβολίας χρησιμοποιείται επίσης για τη λάβει προηγούμενη θεραπεία ασθενών με τοπικά /περιφερειακά υποτροπής. Ωστόσο, παρά την ακτινοβολία, το 50% των ασθενών με τοπική υποτροπή τελικά θα πεθάνουν από τη νόσο τους [13], πράγμα που σημαίνει ότι οι ασθενείς αυτοί έχουν ακτινοβολία ανθεκτικά όγκους και μπορεί να έχουν επωφεληθεί από την εναλλακτική θεραπεία όπως χημειοθεραπεία. Προσδιορισμός δείκτες ευαισθησίας ακτινοβολίας /αντίσταση θα επιτρέψει την προσαρμοσμένη θεραπεία για την πιο αποτελεσματική θεραπευτική αγωγή και να μειώσει περιττή τοξικότητα που προκαλείται από ακτινοβολία.

Ναι σχετιζόμενη πρωτεΐνη (YAP) εντοπίστηκε για πρώτη φορά λόγω της ικανότητάς της να συνδέσουν με Yes και Src πρωτεϊνικής τυροσίνης κινάσες [14]. Η

YAP

γονίδιο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 11q22 του ανθρώπου, κωδικοποιεί μια μεταγραφική συν-ενεργοποιητή και είναι ένα από τα δύο κύρια κατάντη επενεργητές του Hippo κατασταλτικής του όγκου μονοπάτι [15]. Η αναστολή της οδού Hippo οδηγεί στην ενεργοποίηση YAP, πυρηνικό εντοπισμό και την αυξημένη δραστηριότητα των μεταγραφικών γονιδίων στόχων, όπως

CTGF

και

AREG

[16], [17]. Αντιστρόφως, η ενεργοποίηση της οδού Hippo οδηγεί σε φωσφορυλίωση YAP, κυτταροπλασμικό παγίδευση και αδρανοποίηση. Η σερίνη YAP 127 σε αλανίνη (S127A) μετάλλαξη είναι μία ουσιαστικά δραστική μορφή που παραμένει στον πυρήνα και είναι μεταγραφικά ενεργή. YAP ρυθμίζει την ισορροπία μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και απόπτωσης [18], [19], [20], και ενισχύεται σε έναν αριθμό ανθρώπινων κακοηθειών περιλαμβανομένων του μαστού, του οισοφάγου, ηπατοκυτταρικό, επενδύμωμα, κακόηθες μεσοθηλίωμα και μυελοβλάστωμα [21], [22] , [23], [24], [25], [26]. Επιπλέον, η έκφραση YAP συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε διάφορους καρκίνους, όπως του παχέος εντέρου, του οισοφάγου, του στομάχου, του ηπατοκυτταρικού, του πνεύμονα και των ωοθηκών [22], [27], [28], [29], [30], [31], [32],

υπάρχει επίσης στιχομυθία μεταξύ YAP και στεροειδείς ορμόνες. Dhananjayan et al. έδειξαν ότι YAP και η δέσμευση WW επικράτεια πρωτεΐνης-2 (WBP-2) είναι συν-ενεργοποιητές των ER και PR [33], τα οποία διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην κανονική έμμηνο κύκλο και στην αιτιολογία του τύπου 1 EMCA. Παρά το γεγονός ότι αρκετές αναφορές αποδειχθεί ογκογόνο λειτουργίες για YAP σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, βιολογικές και κλινικές ενδιαφέρον της στην EMCA παραμένει ασαφής. Επιπλέον, YAP υπερέκφραση προωθεί ραδιοαντοχή σε κύτταρα μυελοβλάστωμα μέσω της YAP /IGF2 /Akt μονοπάτι [34], υποδηλώνοντας YAP μπορεί να λειτουργήσει στη ρύθμιση ευαισθησίας ακτινοβολία /αντίσταση. Αυτές οι διαπιστώσεις μας προέτρεψε να διερευνηθεί περαιτέρω η YAP θα μπορούσε να διαδραματίσει κάποιο ρόλο στην ογκογένεση και την ανάπτυξη των EMCA και διαμόρφωσης της ευαισθησίας ακτινοβολίας.

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η πιθανή χρησιμότητα της YAP ως προγνωστικός και θεραπευτικός δείκτης σε EMCA και η βιολογική λειτουργία των YAP σε EMCA. Επιπλέον, αξιολογήσαμε YAP αποτέλεσμα όσον αφορά την ευαισθησία ακτινοβολίας. Κατά συνέπεια, τα δεδομένα μας αποδεικνύουν ότι η έκφραση της πυρηνικής YAP είναι ένας δείκτης για φτωχή πρόγνωση και μπορεί να έχει θεραπευτικές επιπτώσεις για τη θεραπεία ασθενών με EMCA.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα ιστού

Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας σε Geisinger Ιατρικό Κέντρο (Geisinger Ιατρικό Κέντρο IRB πρωτόκολλο # 2011 με 0163) και μια παραίτηση από τη συναίνεση ελήφθη από το IRB Κέντρο για την εκτέλεση της μελέτης. Ένα σύνολο 150 πρωτεύοντες ιστούς EMCA ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε υστερεκτομή σε Geisinger Medical Center μεταξύ 2008 και 2011, συμπεριλαμβανομένων 120 περιπτώσεις τύπου 1 EMCA και 30 περιπτώσεις τύπου 2 EMCA. Δημογραφικές και προγνωστικές πληροφορίες, συμπεριλαμβανομένης της ηλικίας, του δείκτη μάζας σώματος (ΔΜΣ), βαθμός, το στάδιο, Lvsi και η επιβίωση στοιχεία ελήφθησαν από όλα τα άτομα. Μακροσκοπική και μικροσκοπική ταξινομήσεις των όγκων έγιναν με βάση την Διεθνή Ομοσπονδία Γυναικολόγος και Μαιευτήρων (FIGO) σύστημα σταδιοποίησης [35], [36].

Η ανοσοϊστοχημεία

δείγματα ιστού παραφίνης ενσωματωμένο κόπηκαν σε ένα πάχους 5 microns και υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημική χρώση των YAP πρωτεΐνης με τη μέθοδο αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης. Το αντιγόνο ανάκτηση πραγματοποιήθηκε με θέρμανση των δειγμάτων σε κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0) για 5 λεπτά σε υψηλή ισχύ, από 10 λεπτά μέσης ισχύος, χρησιμοποιώντας ένα φούρνο μικροκυμάτων. Τα πλακίδια ψύχθηκαν και ξεπλύθηκαν σε απεσταγμένο νερό, και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας την ϋΑΚΟ Autostainer ως εξής: Τα πλακίδια επωάστηκαν σε 3% υπεροξείδιο του υδρογόνου 5 λεπτά, με επακόλουθη έκπλυση σε ρυθμιστικό TBST. Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν σε αντίσωμα YAP (1:200, NB110-58358) από Novus Biologicals (Littleton, CO) για 30 λεπτά με μια επακόλουθη πλύση TBST και επωάστηκαν σε διάλυμα κουνέλι Dako Envision + HRP (Dako, Carpinteria, CA) (αραιωμένο σύμφωνα τις οδηγίες του κατασκευαστή) για 30 λεπτά. Μετά από μια πλύση TBST, τα πλακίδια επωάστηκαν στη συνέχεια σε διάλυμα Dako DAB για 10 λεπτά και ξεπλένονται εκ νέου με ρυθμιστικό διάλυμα TBST. Τα πλακίδια στη συνέχεια αντιχρωματίστηκαν ως εξής: 20 δεύτερη επώαση σε Gills Αιματοξυλίνη λεκέ, που ακολουθείται από μια πλύση με νερό της βρύσης. Τα πλακίδια αφυδατώνονται και στη συνέχεια ξηραίνεται στον αέρα, και τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε μέσο στερέωσης. Ανοσοχρωματίστηκε πλακίδια αξιολογήθηκαν τόσο για την πυρηνική και κυτταροπλασματική χρώση αδενικό YAP από γυναικολογικές παθολόγο, (HK), σκοράροντας για την ένταση χρησιμοποιώντας ένα 5 σημείο (0-4) κλίμακα.

κυτταρικές σειρές EMCA

Τρεις τύπου 1 ανθρώπινες κυτταρικές σειρές EMCA, HEC-1-Α, HEC-1-Β και Ishikawa, χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. HEC-1-Α (ATCC HTB112) και HEC-1-Β (ATCC HTB113) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). κύτταρα Ishikawa παρασχέθηκαν από τον Δρ Jennifer Richer (Πανεπιστήμιο του Κολοράντο) [37], [38], [39]. HEC-1-Α καλλιεργήθηκε σε μέσο 5Α του McCoy (ATCC, Manassas, VA) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ), HEC-1-Β του Eagle ελάχιστο βασικό μέσο (ΕΜΕΜ) (ATCC, Manassas, VA) συμπληρωμένο με 10% (ν /ν) FBS και Ishikawa σε ελάχιστο βασικό μέσο (ΜΕΜ) (Life Technologies, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 1% μη απαραίτητα αμινοξέα ( ΝΕΑΑ), 6 ng /ml ινσουλίνη και 5% (ν /ν) FBS. Αντιβιοτικά (10 μονάδες /ml πενικιλλίνης και 10 μg /ml στρεπτομυκίνης) προστέθηκαν σε όλα τα μέσα καλλιέργειας. Όλες οι κυτταρικές σειρές επωάστηκαν στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% διοξείδιο του άνθρακα.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα Tris (10 mmol /l, ρΗ 7.4) που περιέχει 5 mmol /l EDTA, 300 mmol /l NaCl, 10% γλυκερόλη, 1% Triton Χ-100, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS και ενός αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) και υποβλήθηκε σε SDS-PAGE . Αντι-YAP αντίσωμα (NB110-58358) αγοράστηκε από Novus Biologicals (Littleton, CO)? αντι-φωσφο-YAP (Ser127) (# 4911) από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ)? αντι-NF2 (sc-331) από το Santa Cruz? αντι-LATS2 (ab70565) και αντι-GAPDH (ab9485) από Abcam (Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο). συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα κατάλληλα χρένο (Anti-Rabbit /ποντίκι, GE Healthcare, Little Chalfont, UK) χρησιμοποιήθηκαν. Οι ζώνες πρωτεΐνης έγιναν ορατές με ένα ενισχυμένο υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας LAS-3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan).

Ανοσοφθορισμός και απεικόνισης

πλύθηκαν καλλιεργημένα κύτταρα με PBS και μονιμοποιήθηκαν σε 4% (w /v) παραφορμαλδεϋδη. Μετά διαπερατότητας με 0,2% Triton Χ-100 σε PBS, τα κύτταρα είχαν μπλοκαριστεί σε 5% (w /v) ορό κατσίκας σε PBS και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα (YAP, 1:500) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, ακολουθούμενη από Alexa Fluor αντι-κουνελιού κατσίκας 488 (1:500) ως δευτερεύον αντίσωμα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αφού τοποθετηθεί με 4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) για πυρήνα χρώση, τα κύτταρα εξετάσθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus IX81, η Olympus, Tokyo, Japan).

σύντομης παρεμβολής RNA (siRNA ) θεραπεία

το siRNA που στοχεύει το

YAP

γονίδιο (SC-38637? Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) χρησιμοποιήθηκε για τα πειράματα απώλειας λειτουργίας. Ο έλεγχος siRNA (SC-37007? Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. Κάθε siRNA (37,5 ηΜ) διαμολύνθηκε σε κύτταρα EMCA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η knockdown ενός γονιδίου στόχου επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

δοκιμασία

Οι αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων σε διάφορα χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση των siRNAs αξιολογήθηκαν από μια χρωματομετρική υδατοδιαλυτό άλας τετραζολίου δοκιμασίας (καταμέτρηση κυττάρων kit-8? Dojindo, Kumamoto, Japan). όπως περιγράφεται αλλού [40]

μαλακό άγαρ

δοκιμασία

Για in vitro δοκιμή ανάπτυξης αποικίας ανεξάρτητη από προσκόλληση, 5000 κύτταρα επιμολυσμένα με siRNAs για 48 ώρες απλώθηκαν σε 1 ml 0.4% λειωμένο άγαρ σε ΕΜΕΜ με 10% (ν /ν) FBS σε πλάκες 6-φρεατίων επικαλύπτονται με 1,5 ml 0,9% λιωμένο άγαρ στο ίδιο μέσο. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% διοξείδιο του άνθρακα. Η επίστρωση πραγματοποιείται σε έξι επαναλήψεις και μια μικρή ποσότητα του ΕΜΕΜ πλήρους μέσου προστέθηκαν προσεκτικά κάθε λίγες ημέρες στην κορυφή του κάθε φρεάτιο για να εξασφαλιστεί θρεπτικές προμήθειες και για την πρόληψη της ξήρανσης. Μετά από επώαση για περίπου τέσσερις εβδομάδες, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με ένα διάλυμα που περιέχει 2% αιθανόλη και 0,03% κρυσταλλικό ιώδες και ο αριθμός των αποικιών εκτιμήθηκε από δύο ανεξάρτητους ερευνητές τυφλωθεί.

Εισβολή και Μετανάστευση Δοκιμασίες

Transwell μετανάστευση και δοκιμασίες εισβολής διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας 24 φρεατίων ένθετα κυτταρικής καλλιέργειας BIOCOAT (BD, Franklin Lakes, NJ). Η άνω επιφάνεια του φίλτρα διαμέτρου 6,4-mm με 8-μm πόρους πόρους προεπικαλύφθηκαν με (δοκιμασία εισβολής) ή χωρίς (δοκιμασία μετανάστευσης) επικάλυψης εξωκυττάριας μήτρας (Matrigel). 50000 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε μέσο χωρίς ορό σπάρθηκαν επί στον άνω θάλαμο του κάθε ενθέτου, με πλήρες μέσο προστίθεται στον κάτω θάλαμο. Μετά από 24 ώρες επώασης, μετανάστευσαν ή μεταστατικών κυττάρων στην κάτω επιφάνεια των φίλτρων μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με το διαφορικό Quik Stain Kit (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, ΡΑ), και οι αριθμοί των χρωματισμένων κυττάρων που είχαν μεταναστεύσει /εισβάλει στον πυθμένα του φίλτρου μετρήθηκαν άμεσα από δύο ανεξάρτητους ερευνητές τυφλό.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Για την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν 72 ή 96 ώρες μετά την επιμόλυνση των siRNAs, που ακολουθείται από επώαση σε χρώση ρυθμιστικό διάλυμα (0,1% Triton Χ-100, 0,2 mg /ml ΚΝάση Α, και 40 μg ιωδιούχο προπίδιο /ml σε PBS). Τα κύτταρα αναλύθηκαν ως προς την περιεκτικότητα DNA χρησιμοποιώντας Beckman Coulter, Cytomics FC 500 (Brea, CA).

κατασκευάσματα έκφρασης και σχηματισμού αποικίας δοκιμασία

πλασμίδια που εκφράζουν άγριου τύπου YAP (pEGFP-C3-κ.β. YAP) ελήφθησαν με κλωνοποίηση την πλήρη αλληλουχία κωδικοποίησης της YAP με 504 αμινοξέα [41] στον φορέα ρΕΟΡΡ-C3 (ένα δώρο από τον Gregory Matera και Channing Der του Πανεπιστημίου της Βόρειας Καρολίνας, Chapel Hill, NC). S127A μεταλλαγμένη μορφή της YAP (pEGFP-C3-S127A-YAP) παρήχθη μέσω PCR με μεσολάβηση τοπο-κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση του pEGFP-C3-WT-YAP. pEGFP-C3-WT-YAP, ρΕΟΡΡ-C3-S127A-YAP ή το κενό φορέα (pEGFP-C3-EV) ως ένας έλεγχος εισήχθη σε κύτταρα EMCA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη LTX και αντιδραστηρίου Plus (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η έκφραση της πρωτεΐνης YAP σε επιμολυσμένα κύτταρα επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western. Μετά από επώαση για περίπου τέσσερις εβδομάδες με κατάλληλες συγκεντρώσεις του G418, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με ένα διάλυμα που περιέχει 10% φορμαλδεΰδη και 1% κρυσταλλικό ιώδες. Το χρωματισμένο περιοχή υπολογίστηκε με πυκνομετρία χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. Συνθήκες

κλωνογονική δοκιμασία και ακτινοβόληση

έκθεση επιβίωση μετά ακτινοβολία ορίστηκε ως η ικανότητα των κυττάρων να διατηρήσουν κλωνογόνο ικανότητα τους. Εν συντομία, αύξηση του αριθμού των κυττάρων που επιμολύνθηκαν με το siRNA ελέγχου ή YAP ειδικό siRNA για 48 ώρες απλώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων. Τα κύτταρα ακτινοβολούνται με 0 έως 6 Gy χρησιμοποιώντας ένα γραμμικό επιταχυντή και επέστρεψαν στον επωαστή για αρκετές εβδομάδες έως ότου τα κύτταρα σε φρεάτια ελέγχου είχε σχηματιστεί επαρκώς μεγάλες αποικίες. Οι αποικίες που σχηματίζονται σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με ένα διάλυμα που περιέχει 10% φορμαλδεΰδη και 1% κρυσταλλικό ιώδες και αυτά με τουλάχιστον 50 κύτταρα μετρήθηκαν από δύο ανεξάρτητους ερευνητές τυφλό. Ο αριθμός των αποικιών που λαμβάνονται από τρεις επαναλήψεις ήταν κατά μέσο όρο για κάθε κατάσταση. Αυτές οι μέσες τιμές διορθώθηκαν σύμφωνα με επιμετάλλωση αποτελεσματικότητα των αντίστοιχων ελέγχων για τον υπολογισμό της κυτταρικής επιβίωσης για κάθε επίπεδο δόσης. Η γραμμική τετραγωνική εξίσωση προσαρμόστηκε σε σύνολα δεδομένων για να δημιουργηθούν καμπύλες επιβίωσης, και αυξητικό συντελεστή δόση υπολογίστηκε στο 10% κλάσμα επιβίωσης (DEF 0.1).

Στατιστική ανάλυση

Οι συσχετίσεις μεταξύ χρώση πυρηνικής /κυτταροπλασματικής επίπεδα και κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες αξιολογήθηκαν από t-test του Student, στην πλατεία τεστ Chi ή τεστ Fisher αναλόγως. Το Mann-Whitney

U-test

και t-test του Student χρησιμοποιήθηκαν για να συγκριθεί η διαφορά στην βιολογική συμπεριφορά μεταξύ επιμολυσμένα κύτταρα και κύτταρα ελέγχου. Για την ανάλυση της επιβίωσης, οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier κατασκευάστηκαν για τις ομάδες με βάση την μονοπαραγοντική προγνωστικούς παράγοντες και οι διαφορές μεταξύ των ομάδων ελέγχθηκαν με τη δοκιμασία log-rank. Για εκείνες οι μεταβλητές είναι στατιστικά σημαντικές στην μονοπαραγοντική ανάλυση, η αναλογικών κινδύνων κατά Cox μοντέλο με τη δοκιμή αναλογία πιθανότητας χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω αξιολόγηση της πολυπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης. P-value & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση JMP 10 (SAS Institute Inc., Cary, NC).

Αποτελέσματα

YAP έκφραση της πρωτεΐνης σε πρωτογενείς ιστούς EMCA

Για να προσδιορίσετε αν YAP εκφράζεται στην ανθρώπινη EMCA, έκφραση πρωτεΐνης YAP σε πρωτογενείς ιστούς EMCA εκτιμήθηκε με ανοσοϊστοχημεία. Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα καταδεικνύει έκφραση πυρηνικών και κυτταροπλασματικά YAP φαίνεται στο Σχήμα S1. Δεδομένου ότι η ενδοκυτταρική εντόπιση της YAP θεωρείται γενικά ως σημαντικοί για την ογκογόνο λειτουργία της [42], και οι δύο τα επίπεδα της πυρηνικής και κυτταροπλασματικής χρώσης αναλύθηκαν και βαθμολογήθηκαν για την ένταση χρησιμοποιώντας μια κλίμακα 5 σημείων (0 έως 4). Τα δημογραφικά στοιχεία και τα επίπεδα χρώσης YAP συγκρίνοντας τύπου 1 και 2 EMCA συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Τύπος 2 EMCA είχαν υψηλότερο στάδιο, υψηλότερη συχνότητα Lvsi και μετεγχειρητική μετάσταση /υποτροπή και υψηλότερη έκφραση της πυρηνικής YAP σε σύγκριση με τύπου 1 EMCA. Αξιολογήσαμε την επόμενη το συσχετισμό μεταξύ κλινικοπαθολογοανατομικών παραγόντων και χρώση YAP σε τύπου 1 και τύπου 2 EMCA, ξεχωριστά. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, υψηλότερη έκφραση πυρηνικών YAP συσχετίστηκε σημαντικά με υψηλότερο βαθμό, παθολογική στάδιο, Lvsi και μετεγχειρητική υποτροπή /μετάστασης σε τύπου 1 EMCA (p = 0.019, = 0.028, = 0,0008, = 0.046, αντίστοιχα). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των πυρηνικών YAP και αυτές τις μεταβλητές παρατηρήθηκε σε τύπου 2 EMCA (Πίνακας S1). Η κυτταροπλασματική έκφραση του YAP δεν συσχετίστηκε με κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες είτε σε καρκίνους τύπου 1 ή τύπου 2 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). εκτιμήσεις επιβίωσης Kaplan-Meier έδειξε ότι η αυξημένη πυρηνική ανοσοδραστικότητα της YAP ήταν σημαντικά σχετίζεται με χειρότερη συνολική επιβίωση στον τύπο 1 του καρκίνου. (P = 0,015, δοκιμασία log-rank, Εικόνα 1). Η μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε προχωρημένο στάδιο και η παρουσία του Lvsi επίσης συσχετίστηκε με κακή συνολική επιβίωση (p = 0,0005 και 0,003, δοκιμασία log-rank, αντίστοιχα, το σχήμα S2). Δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ της συνολικής επιβίωσης και κυτταροπλασματική χρώση YAP τύπου 1 EMCA ή YAP πυρηνικής /κυτταροπλασματικής λεκέ σε τύπου 2 EMCA (Σχήμα S3). Με την πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης αναλογικού κινδύνου Cox που θεωρείται στάδιο, Lvsi και το επίπεδο πυρηνικής YAP, μόνο επίπεδο πυρηνικής YAP (σκορ 2/3/4 έναντι σκοράρει 0/1) συσχετίστηκε ανεξάρτητα με τη συνολική επιβίωση (p & lt? 0.021). Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η πυρηνική YAP συνδέεται με την κακή προγνωστικά χαρακτηριστικά και μειωμένη συνολική επιβίωση σε τύπου 1 EMCA.

Η αυξημένη πυρηνική ανοσοδραστικότητα της YAP ήταν σημαντικά σχετίζεται με χειρότερη συνολική επιβίωση (P = 0,015, δοκιμασία log-rank).

Απλή αναζήτηση

πρωτεϊνική έκφραση YAP σε κυτταρικές σειρές EMCA

για να αποκτήσει περαιτέρω γνώση των βιολογικών ρόλων των YAP στο EMCA, επιλέξαμε να χρησιμοποιήσετε τρεις κυτταρικό τύπο 1 EMCA γραμμές? HEC-1-Α, HEC-1-Β και Ishikawa. Αξιολογήσαμε πρώτα επίπεδα πρωτεΐνης YAP και φωσφο-YAP (ανενεργό YAP) (Σχήμα 2Α). HEC-1-Β κατέδειξε τα υψηλότερα επίπεδα συνολικής YAP και πολύ χαμηλά επίπεδα των ανενεργών φωσφο-YAP με western αποτύπωση. Σε αντίθεση, HEC-1-Α εκφράζονται τα χαμηλότερα επίπεδα ολικής YAP και τα υψηλότερα επίπεδα των ανενεργών φωσφο-YAP. Ανοσοφθορισμός επιβεβαίωσε υψηλά επίπεδα πυρηνικής και κυτταροπλασματικής YAP σε HEC-1-Β κύτταρα και τα χαμηλά επίπεδα της πυρηνικής και κυτταροπλασματικής YAP σε κύτταρα HEC-1-Α, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της δυτικής κηλίδας (Σχήμα 2Β). Ως εκ τούτου, HEC-1-Β κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για ένα πείραμα απώλειας λειτουργίας, και αντίστροφα τα κύτταρα HEC-1-Α χρησιμοποιήθηκαν για ένα πείραμα κέρδος-of-λειτουργίας.

(Α) Εκφραση YAP και φωσφο-YAP (Ser127) σε τρεις κυτταρικές γραμμές EMCA με κηλίδωση Western. (Β) ανοσοφθορισμού κυτοχημικές χρώση των ενδογενών YAP χρησιμοποιώντας αντι-YAP αντίσωμα (YAP: πράσινο, ΟΑΡΙ: μπλε).

Η

YAP νοκ ντάουν στα κύτταρα EMCA

Για να επεκτείνει ανοσοϊστοχημική αποτελέσματα μας αποδεικνύουν ένας συσχετισμός μεταξύ της πυρηνικής YAP και φτωχών προγνωστικά χαρακτηριστικά σε ασθενείς EMCA, προσδιορίσαμε τις επιδράσεις της YAP knockdown επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού χρησιμοποιώντας YAP ειδικό siRNA (siYAP) και ελέγχου siRNA (siCont) σε κύτταρα EMCA HEC-1-Β. Η ενδογενής έκφραση της πρωτεΐνης YAP ήταν αποτελεσματικά ανέστειλε στις 72 και 96 ώρες μετά την παροδική επιμόλυνση του siRNA (Σχήμα 3Α). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μειώθηκε σημαντικά στα κύτταρα ανέστειλε YAP σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου κατά 26,2% (72 ώρες) και 42,9% (96 ώρες), αντίστοιχα (Σχήμα 3Α). Αυτό παρόμοιο αποτέλεσμα αναστολής αύξησης στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας μια εναλλακτική αλληλουχία YAP siRNA (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

(Α) ανέστειλε πρωτεΐνη έκφραση YAP από YAP ειδικό siRNA (siYAP) επιβεβαιώθηκε με στύπωση Western και τα δύο 72 και 96 ώρες μετά την επιμόλυνση (αριστερά). Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μεταξύ 24-96 ώρες μετά την επιμόλυνση siYAP ή ελέγχου siRNA (siCont) αξιολογήθηκε σε HEC-1-Β κύτταρα χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία άλατος τετραζολίου υδατοδιαλυτή (καταμέτρηση κυττάρων kit-8) (δεξιά). 26,2% και 42,9% αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού επιβεβαιώθηκαν με knockdown έκφρασης YAP στις 72 και 96 ώρες, αντίστοιχα. (* P & lt? 0,05 (η u-Mann-Whitney test)). Τα αποτελέσματα φαίνονται στον μέσο ± τυπικές αποκλίσεις (ράβδοι) σε πειράματα τετραπλούν. Παρόμοιες τάσεις ελήφθησαν σε δύο άλλα ανεξάρτητα πειράματα. (Β) Ο αριθμός των αποικιών σε μαλακό άγαρ συγκρίθηκε μεταξύ της YAP ανέστειλε κύτταρα και τα κύτταρα ελέγχου για την αξιολόγηση ανεξάρτητη από προσκόλληση κυτταρική ανάπτυξη σε HEC-1-Β κύτταρα. Αντιπροσωπευτική εικόνα των σχημάτισαν αποικίες σε μαλακό άγαρ (αριστερά). Ποσοτική ανάλυση του αριθμού των αποικιών που σχηματίζονται (δεξιά), που δείχνει μια σημαντική μείωση στην siYAP επιμολυσμένα κύτταρα. (* P & lt? 0,05 (η u-Mann-Whitney test)). Στήλες και τα μπαρ αντιπροσωπεύουν μέσο και την τυπική απόκλιση σε πειράματα έξι επαναλήψεις. Παρόμοιες τάσεις ελήφθησαν σε άλλο ανεξάρτητο πείραμα. (Γ) Transwell μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίας. Αντιπροσωπευτική εικόνα της μετανάστευσαν /εισέβαλαν HEC-1-Β κύτταρα (αριστερά). Ποσοτική ανάλυση σε αριθμό μετανάστευσαν /εισέβαλαν κύτταρα (δεξιά), η οποία έδειξε μία σημαντική μείωση στην siYAP επιμολυσμένα κύτταρα. (* P & lt? 0,05 (η u-Mann-Whitney test)). Στήλες και τα μπαρ αντιπροσωπεύουν μέσο και την τυπική απόκλιση σε πειράματα τετραπλούν. Παρόμοιες τάσεις ελήφθησαν σε άλλο ανεξάρτητο πείραμα. (Δ) Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα του πληθυσμού σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα EMCA HEC-1-Β 72 και 96 ώρες μετά την επιμόλυνση με siCont /siYAP (αριστερά). Ποσοτική ανάλυση του πληθυσμού σε κάθε φάση (δεξιά). siYAP επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν σημαντική συσσώρευση κυττάρων σε Ο0 /Ο1 φάση και σημαντικές μειώσεις στην S και G2 /φάσεων M στις 72 και 96 ώρες (* Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0.001, t- test του Student). Στήλες και τα μπαρ αντιπροσωπεύουν μέσο και την τυπική απόκλιση σε πειράματα εις τριπλούν. Παρόμοιες τάσεις ελήφθησαν σε ένα άλλο ανεξάρτητο πείραμα.

Η

προσδιορίζεται επίσης το ρόλο των YAP σε ανάπτυξη ανεξάρτητη από προσκόλληση κυττάρου, μετανάστευση και την ικανότητα εισβολής, συνήθως θεωρείται χαρακτηριστικά των κακοήθων μετασχηματισμένα κύτταρα. Σε προσδιορισμούς μαλακού άγαρ σχηματισμού αποικίας, knockdown του YAP σε HEC-1-Β κύτταρα μείωσε την ικανότητα σχηματισμού αποικίας σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (ρ = 0.015, Εικόνα 3Β). Στο κελί μετανάστευση /προσδιορισμούς εισβολής, μια σημαντική μείωση στον αριθμό των κυττάρων που μετανάστευσαν /εισέβαλαν μέσω μη επιστρωμένο /Matrigel επικαλυμμένες μεμβράνες παρατηρήθηκε σε siYAP επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με επιμολυσμένα κύτταρα siCont (ρ & lt? 0,05, Εικόνα 3C). Αυτά τα πειράματα δείχνουν ότι η έκφραση YAP σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη και τη μετανάστευση /δυναμικό εισβολή σε αυτή την κυτταρική γραμμή EMCA.

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα EMCA

Για να καθοριστεί εάν η αναστολή της ανάπτυξης που προκαλείται από YAP knockdown προκαλούνται μεταβολές στον κυτταρικό κύκλο, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα EMCA HEC-1-Β επιμολύνθηκαν με YAP-ειδικά και ελέγχου siRNAs. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα των προσδιορισμών πολλαπλασιασμού των κυττάρων, siYAP κατεργασία HEC-1-Β κύτταρα παρουσίασαν μια σημαντική συσσώρευση κυττάρων σε Ο0 /G1 φάση και σημαντικές μειώσεις στην S και G2 /M φάσεις στις 72 και 96 ώρες, σε σύγκριση με siCont επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 3D). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι YAP knockdown παράγει G0-G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε αυτή την κυτταρική γραμμή EMCA.

YAP υπερέκφραση σε κύτταρα EMCA

Με βάση τα αποτελέσματα μας από τη λειτουργία απώλειας προσδιορισμούς, υποθέσαμε ότι η υπερέκφραση της YAP σε κύτταρα EMCA με χαμηλά ενδογενή επίπεδα YAP θα αυξήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Διερευνήθηκε η ικανότητα των αποικιών που σχηματίζουν μετά από παροδική επιμόλυνση των YAP εκφράζουν κατασκευάσματα στα κύτταρα HEC-1-Α, που επέδειξε σχετικά χαμηλά επίπεδα YAP και υψηλά επίπεδα φωσφο-YAP (Σχήμα 2). Η υπερέκφραση του άγριου-τύπου GFP-tagged YAP και GFP-tagged ουσιαστικά δραστική S127A μεταλλαγμένη YAP σε κύτταρα HEC-1-Α επαληθεύτηκε με κηλίδωση Western (Σχήμα 4Α). Κύτταρα που υπερεκφράζουν WT-YAP ή S127A-YAP παράγονται σημαντικά περισσότερες αποικίες σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με τον κενό φορέα ελέγχου (EV). Ενώ S127A-YAP επιμολυσμένα κύτταρα παρήγαγαν τα πιο αποικίες, μία σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε σε σύγκριση με WT-YAP επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν περαιτέρω ένα ρόλο για YAP στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των EMCA.

(Α) Η ενδογενής έκφραση YAP (περίπου 65 kDa) και εξωγενή έκφραση YAP ετικέτα με την πρωτεΐνη GFP (περίπου 92 kDa συνολικά) στο HEC -1-A κύτταρα επιμολυσμένα με άγριου τύπου YAP (WT-YAP) και S127A μεταλλαγμένη YAP (S127A-YAP). (Β) αντιπροσωπευτική εικόνα της δοκιμασίας σχηματισμού αποικίας (αριστερά). Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με κενό φορέα (EV) /WT-YAP /S127A-YAP και επιλέγονται με κατάλληλες συγκεντρώσεις του G418 για τέσσερις εβδομάδες. Τα ανθεκτικά σε φάρμακο αποικίες που σχηματίζονται από τα YAP-επιμολυσμένα κύτταρα ήταν σημαντικά πολυάριθμες σε σύγκριση με τον έλεγχο (η Mann-Whitney U-test). Στήλες και τα μπαρ αντιπροσωπεύουν μέσο και την τυπική απόκλιση σε πειράματα τετραπλούν. Παρόμοιες τάσεις ελήφθησαν σε άλλο ανεξάρτητο πείραμα.

Η

Ο ρόλος της YAP στη ρύθμιση της ευαισθησίας ακτινοβολίας

Λόγω της σημασίας της ακτινοθεραπείας στη θεραπεία EMCA και δημοσιεύθηκε πρόσφατα δεδομένα τα οποία εμπλέκουν YAP στη διαμόρφωση της ακτινοβολίας ευαισθησία των κυττάρων μυελοβλάστωμα, έχουμε την επόμενη προσδιορίζεται η επίδραση της YAP στην ευαισθησία ακτινοβολία σε κύτταρα EMCA χρησιμοποιώντας δοκιμασία κλωνογονική επιβίωση. Knockdown έκφρασης YAP με siRNA μειωμένη κλωνογόνο επιβίωση σε HEC-1-Β κύτταρα, με αποτέλεσμα την αύξηση της ευαισθησίας στην ακτινοβολία με DEF 0,1 1,36 (Σχήμα 5). Συγκεκριμένα, το 90% θανάτωση των κυττάρων από την έκθεση σε ακτινοβολία σε siYAP επιμολυσμένα κύτταρα που απαιτούνται 3,48 Gy, ενώ το ίδιο επίπεδο θανάτωσης κυττάρων σε siCont επιμολυσμένα κύτταρα που απαιτούνται 4,72 Gy. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα μας δείχνουν μια αυξημένη ευαισθησία σε ακτινοβολία με την απώλεια της έκφρασης σε κύτταρα YAP EMCA HEC-1-Β.

Knockdown έκφρασης YAP με siRNA μειωμένη κλωνογόνο επιβίωση σε HEC-1-Β κύτταρα, με αποτέλεσμα ένα την αύξηση της ευαισθησίας στην ακτινοβολία με έναν παράγοντα ενίσχυσης της δόσης σε% επιβίωση 10 (DEF 0,1) 1,36. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον μέσο ± τυπικές αποκλίσεις (ράβδοι) σε πειράματα εις τριπλούν. Παρόμοιες τάσεις που αποκτήθηκαν σε άλλα τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Συζήτηση

Τα στοιχεία μας τον εντοπισμό των ογκογόνων λειτουργίες της YAP σε EMCA. Το μονοπάτι Hippo, ειδικά η άμεση ρυθμιστή προς τα ανάντη, LATS1 /2, ρυθμίζει αρνητικά την δραστηριότητα YAP με φωσφορυλίωση των S127 site της. Η φωσφορυλιωμένη-YAP είναι χωρισμένη στο κυτταρόπλασμα και στοχευμένες για ουβικιτίνη πρωτεόλυση διαμεσολαβείται [43], [44]. Ως εκ τούτου, η υποκυτταρική εντόπιση του YAP έχει θεωρηθεί κρίσιμη για τον καθορισμό βιολογικές λειτουργίες της σε διάφορους καρκίνους [42]. έκφραση Πυρηνική YAP ως προγνωστικός παράγοντας έχει αποδειχθεί σε άλλους τύπους καρκίνου, όπως του οισοφάγου, γαστρικό και ωοθηκών [22], [28], [31], [32]. ανοσοϊστοχημικές μελέτες μας έδειξαν ότι τα υψηλότερα επίπεδα των πυρηνικών YAP σχετίστηκαν με την κακή προγνωστικούς παράγοντες, όπως προχωρημένο στάδιο, ποιότητας, Lvsi, μετεγχειρητική υποτροπή /μετάστασης και η συνολική επιβίωση.