Αφηρημένο

Εδώ παρουσιάζεται μια απλή και αποτελεσματική μιμητικής μεμβράνης μικρορροϊκή συσκευή με αντίσωμα συζευγμένο υποστηρίζεται λιπιδική διπλοστοιβάδα (SLB ) «έξυπνη επένδυση» για να συλλάβει βιώσιμα κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (ΚΜΑ) και κυκλοφορούν microemboli όγκου (CTM) άμεσα από το ολικό αίμα όλων των ασθενών σταδίου κλινική καρκίνο. Το μη-ομοιοπολικά δεσμευμένο SLB ήταν σε θέση να προωθήσει τη δυναμική ομαδοποίηση των λιπιδίων δεμένοι αντισωμάτων σε αντιγόνα CTC και ελαχιστοποιείται μη ειδική συγκράτηση των κυττάρων του αίματος μέσω μη-ρύπανση φύση της. Μία ήπια ροή περαιτέρω ξεπλυθούν μακριά χαλαρά δεσμευμένα κύτταρα του αίματος για να επιτευχθεί υψηλή καθαρότητα του ΚΜΑ, και ένα ρεύμα αφρού αέρα εγχύεται αποσυντίθενται τα συγκροτήματα SLB να απελευθερώσει άθικτα και βιώσιμος CTCs από το τσιπ. Ανθρώπινου αίματος εμπλουτίστηκε δοκιμής της γραμμής καρκινικών κυττάρων έδειξε το ~ 95% της συνολικής απόδοσης για την ανάκτηση τόσο CTCs και CTMs. Live /νεκρός δοκιμασία έδειξε ότι τουλάχιστον το 86% των ανακτημένων κυττάρων διατήρηση της βιωσιμότητας. Με τη χρήση 2 mL περιφερικού αίματος, οι μετρήσεις ΚΜΑ και CTMs 63 υγιείς δότες και του παχέος καρκίνος ήταν συσχετίζεται θετικά με την εξέλιξη του καρκίνου. Εν ολίγοις, μια απλή και αποτελεσματική στρατηγική χρησιμοποιώντας βιομιμητική αρχή αναπτύχθηκε για την ανάκτηση βιώσιμων ΚΜΑ για απαρίθμηση, μοριακή ανάλυση, καθώς και

ex vivo

καλλιέργεια σε διάστημα εβδομάδων. Λόγω της υψηλής ευαισθησίας και εξειδίκευσης, είναι η πρώτη φορά για να δείξει την υψηλή ποσοστά ανίχνευσης και την ποσότητα των CTCs σε ασθενείς με καρκίνο μη μεταστατικό. Το έργο αυτό προσφέρει τις τιμές σε τόσο πρώιμη ανίχνευση του καρκίνου και την πρόγνωση της CTC και παρέχει μια ακριβή μη επεμβατική στρατηγική για την καθημερινή κλινική έρευνα ΚΜΑ

Παράθεση:. Chen JY, Tsai WS, Shao HJ, Wu JC, Lai JM, Lu SH, et al. (2016) ευαίσθητη και ειδική Βιομιμητική επικαλυμμένα με λιπίδια Microfluidics απομόνωσης Βιώσιμα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα και microemboli για ανίχνευση του καρκίνου. PLoS ONE 11 (3): e0149633. doi: 10.1371 /journal.pone.0149633

Επιμέλεια: Jeffrey Chalmers, το Ohio State University, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 29, Σεπτεμβρίου, 2015? Αποδεκτές: δεύτερης, Φεβρουαρίου 2016? Δημοσιεύθηκε: 3 Μάρτη του 2016

Copyright: © 2016 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο (τώρα Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας, Ταϊβάν) σύμβασης: NSC101-2113-M-001-021 -MY2, NSC102-2321-B-001-060, MOST-103-2321-B-001-042, και τη σύνοδο κορυφής του Προγράμματος από την Academia Sinica, της Ταϊβάν με 104-0210-01-09-02. Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από το Υπουργείο Ταϊβάν Υγείας και Πρόνοιας (Πρόνοιας Επιβάρυνση των προϊόντων καπνού), No.CMRPG3C1141. Ι.Μ. Lai υποστηρίχθηκε από Academia Sinica μεταδιδακτορικής έρευνας 2013-14. Ι.Υ. Chen υποστηρίχθηκε από τους περισσότερους-103-2811-B-001-132. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων και την ερμηνεία, την απόφαση της δημοσίευσης ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει κανένα ανταγωνιστικών συμφερόντων

Εισαγωγή

η μετάσταση είναι η κύρια αιτία της υποτροπής και θνησιμότητας σε ασθενείς με συμπαγείς όγκους, σε όλο τον κόσμο. Πιστεύεται ότι μόλις δημιουργηθεί το αρχικό όγκο, πρόσθετες μεταλλάξεις και οι αλληλεπιδράσεις μικροπεριβάλλον των καρκινικών κυττάρων θα προωθήσει τη διάδοση για μετάσταση καρκίνου. Η επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) έχει ενοχοποιηθεί ως υπεύθυνο για την αποβολή των κυττάρων του όγκου από προσκολλημένα επιθηλιακά κύτταρα σε προκλινικά μοντέλα [1]. Ενδαγγείωση επιθηλιακής προέλευσης πρωτογενή καρκινικά κύτταρα θα επιτρέψει τα καρκινικά κύτταρα κυκλοφορούν στο αίμα ως κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα (ΚΜΑ), μέσω της εξέλιξης της μετανάστευσης /εισβολής. Η διάδοση ΚΜΑ μπορεί έτσι να ταξιδέψουν κάποια απόσταση και να αποικίσουν σε δευτερεύουσες θέσεις για το μεταστατικό δημιουργία όγκων. Αλλά ο μηχανισμός της μετάστασης του καρκίνου εξακολουθεί να είναι ασαφής και την αντίληψη της διάδοσης του καρκίνου ως ΚΜΑ παραμένει μια πρόκληση. ΚΜΑ είναι υπεκφυγές για την ανίχνευση, λόγω της εξαιρετικά σπάνια πληθυσμού στην κυκλοφορία των ασθενών με καρκίνο. Θα μπορούσε να είναι τόσο λίγα όσο μόνο 1 ~ 1000s CTCs έξω από δισεκατομμύρια κύτταρα του αίματος σε ασθενείς με καρκίνο συμπτωματική. Παρά τις σπάνιες πληθυσμού της, η ποσότητα του CTCs στο αίμα έχει δείξει να συσχετίζεται με την κακή πρόγνωση των ασθενών μεταστατικό καρκίνο [2], και τα αποτελέσματα της χημειοθεραπείας σε μαστό, προστάτη και ασθενείς με καρκίνο με μελάνωμα [1,3,4]. Αυτές οι μελέτες έδειξαν ότι η παρακολούθηση του αριθμού των CTC μπορεί να είναι χρήσιμη για την έγκαιρη διάγνωση και την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας κατά τη διάρκεια θεραπείας.

Πρόσφατα, οι αναδυόμενες στοιχεία έδειξαν ότι η παρουσία των κυκλοφορούντων microemboli όγκου (CTM) είναι έντονα συνδέει με μακρινή μετάσταση. Σε σύγκριση με την παρουσία του μόνου ΚΜΑ, η παρουσία των CTMs συσχετίζεται καλά με την κακή πρόγνωση σε μεταστατικό μαστού, του προστάτη, και μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [5,6]. Έχει προταθεί ότι συσσωματώματα κυττάρων, όπως CTMs, παρέχουν ένα πλεονέκτημα προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου κατά διατμητική τάση στην κυκλοφορία του αίματος και ενεργοποιεί την σήμανση για αντι-απόπτωση και προστασία από anoikis [5]. Απόδειξη της συλλογικής κίνησης σε πρωτογενή καρκινικά κύτταρα μέσω ενός β1-ιντεγκρίνης-εξαρτώμενο τρόπο παρέχει μια ευκαιρία του ρίχνοντας CTMs εντός του ρεύματος του αίματος [7]. Η εγκατάλειψη της αλληλεπίδρασης κυττάρου-κυττάρου πλακοσφαιρίνης μεσολάβηση οδηγεί σε μια μείωση του CTMs στην κυκλοφορία του αίματος και συσχετίζεται με καλύτερη πρόγνωση [6]. Παρά το σημαντικό ρόλο της ΚΜΑ, το ρόλο των CTMs και τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ ΚΜΑ και το μικροπεριβάλλον κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου είναι ακόμα ασαφής. Απαρίθμηση και ο χαρακτηρισμός των καθορισμένων /καθαρίζεται ΚΜΑ από ασθενείς με καρκίνο θα αποκαλύψει το χαρακτήρα της ΚΜΑ /CTMs στην εξέλιξη του καρκίνου. Καθιέρωση ενός συστήματος καταγραφής ΚΜΑ που επιτρέπει την υψηλή ευαισθησία, ειδικότητα, και βιωσιμότητας για τις δύο ΚΜΑ και CTMs θα προσφέρει μεγάλο όφελος για τη διάγνωση και τη θεραπεία των ασθενών με κλινική καρκίνο.

Διάφορες τεχνολογίες έχουν αποκαλυφθεί ΚΜΑ εμπλουτισμό και την ταυτοποίηση με βάση διαφορετικές αρχές, συμπεριλαμβανομένων των ανοσο-μαγνητικά απομόνωση [8-14], κύτταρο-size φιλτραρίσματος με βάση [15,16], μικρορροϊκές συσκευές αντισώματος-ενεργοποιημένα [17-21], οπτικών ινών τεχνολογία σάρωσης array [22], dielectrophoresis, παθητική κυττάρων διαλογής [23], η αρνητική επιλογή [24,25], ensemble-απόφαση δείγμα κατάταξης [26], νανο-τραχεία επιφάνεια πρόσφυσης [27], θερμο-ευαίσθητη επικάλυψη πολυμερούς [28], ή συνδυασμούς των παραπάνω [29,30] . Ορισμένες από αυτές τις τεχνολογίες έδειξε καλύτερη ευαισθησία από ό, τι άλλοι, συμπεριλαμβανομένου ανέκδοτες μελέτες σε μη-μεταστατικές ασθένειες [31]. Ωστόσο, σχεδόν κανένα αποδείχθηκε κλινική χρησιμότητα στην ρουτίνα ανίχνευσης ΚΜΑ για όλα τα στάδια των καρκίνων, καθώς αυτό απαιτεί μια ιδιαίτερα ευαίσθητη και ειδική πλατφόρμα για την απομόνωση και διατήρηση ΚΜΑ που λαμβάνονται από ασθενή για περαιτέρω διερεύνηση.

Από όλες τις συγγένεια οι -με βάση τις μεθόδους, μικρορροϊκές συσκευές εμφανίζονται ως πολλά υποσχόμενη εργαλεία για να απομονώσουν αποτελεσματικά σπάνια κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των ΚΜΑ και βλαστικών κυττάρων [18,32-34]. Η κύρια πρόκληση για αυτή την πολλά υποσχόμενη πλατφόρμα είναι να απελευθερώσει και να ανακτήσει τα απομονωμένα κύτταρα-στόχους με βιολογική δράση [35]. Με τη χρήση ενζυμική πέψη, η απελευθέρωση των συλληφθέντων κυττάρων μπορεί να διαταράξει την κυτταρική μεμβράνη, να υποβαθμίσει επιφανειακούς δείκτες, και να μεταβάλλει τόσο φαινοτυπικές και λειτουργικές πληροφορίες του ΚΜΑ, περιορίζοντας έτσι τις μεταγενέστερες αναλύσεις των κυττάρων [34,36]. Επιπλέον, αν και η ροή που προκαλείται από κύτταρο απόσπαση δείχνει καλή απόδοση ανάκτησης από 60% έως 90% [37-39], η 50 έως 200 dynes /cm

2 υψηλή διατμητική τάση είναι απαραίτητη για την απόσπαση των κυττάρων με το σπάσιμο του αντισώματος- ομόλογα αντιγόνο κυτταρικής επιφάνειας [40]. Μια τέτοια ισχυρή δύναμη είναι γνωστό ότι μεταβάλλουν την γονιδιακή έκφραση και ενδεχομένως να οδηγήσει σε φαινοτυπικά αλλαγές και κυτταρικό θάνατο [32,41,42]. Bubble επαγόμενη αποκόλληση του συγγένειας-απορροφήθηκε αιμοσφαίρια, τα οποία μόχλευση που εξασκείται ο αέρος-υγρού διεπιφανειακή τάση από την προσκολλημένη κυτταρική να ξεριζώσει από την επιφάνεια με 90 έως 100% αποτελεσματικότητα αποδέσμευσης σε μικροδομή χωρίς ευθεία κανάλια. Ωστόσο, η χαμηλή βιωσιμότητα των κυττάρων και ασυνεπής ποσοστά ανάκτησης δεν έχουν αντιμετωπιστεί σωστά [43-45].

Μεταξύ αυτών των μελετών, ωστόσο, τα αποτελέσματα της επιφάνειας έχουν αγνοηθεί. Εννοιολογικά, μια «μη-ρύπανση» επιφάνεια, δηλαδή, μια επιφάνεια με ελάχιστη φυσική αλληλεπίδραση με τα κύτταρα, θα μπορούσε να μειώσει την διατμητική τάση που απαιτείται για να ξεπλύνετε μακριά μη ειδικά προσκολλημένα κύτταρα και παρέχει μια ευκαιρία να μειώσουν το απαραίτητο για την κυτταρική εκρόφηση δύναμη. Επιπλέον, επιχρίσματα με αδύναμα συγκόλληση στην επιφάνεια, όπως physisorption θα μπορούσε να παράσχει μη διαταράσσουν σημεία διάσπασης (οι πιο αδύναμοι κρίκοι), όταν ασκεί διεπιφανειακή τάση (όπως φυσαλίδες αέρα). Η ικανότητα να διακόπτει την επιφανειακή επικάλυψη εμποδίζει την άμεση διάσπαση των ομολόγων υποδοχέα κυτταρικής μεμβράνης, οι οποίες τις περισσότερες φορές να οδηγήσει σε βλάβη των κυττάρων. Στην ανακοίνωση αυτή, περιγράφουμε μια έξυπνη επένδυση σε ένα μικρορευστονικής πλατφόρμα που παρέχει «μη-ρύπανση» ιδιότητα να αυξάνουν την απόρριψη των ανεπιθύμητων υλικών στο αίμα και τους «αδύναμους κρίκους» για την απελευθέρωση των κυττάρων. Εδώ αναφέρουμε τη διπλοστοιβάδα υποστηρίζεται λιπιδίων (SLB) επικαλυμμένα μικρορροϊκή σύστημα, την πλατφόρμα CMx ( «κύτταρα σταματούν σε Μέγιστο»), και να αποδειχθεί ιδιαίτερα ευαίσθητη και ειδική για τη σύλληψη δύο μονά ΚΜΑ και CTMs και λειτουργία με εύκολη-να-απελευθέρωση πλατφόρμα για απόκτηση βιώσιμων ΚΜΑ? όλα απαιτεί μόνο 2 mL πλήρους αίματος. Μια κλινική μελέτη στην οποία συμμετείχαν απαρίθμηση των δύο ΚΜΑ και CTMs βασίζονται σε 9 υγιείς δότες επιβεβαιώνεται από την κολονοσκόπηση και 54 ασθενείς με στάδιο Ι έως IV του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) επιβεβαίωσε περαιτέρω την ανώτερη ευαισθησία και την κλινική χρησιμότητα του επικαλυμμένου πλατφόρμας ρευστό λιπιδίων. Ταυτόχρονη CTC τον πολιτισμό και την μετάλλαξη ανάλυση των ασθενών που προέρχονται, βελτίωσε περαιτέρω τη σκοπιμότητα και τη χρησιμότητα τόσο για τη βασική έρευνα και την κλινική θεραπεία της πλατφόρμας CMx.

Υλικά και Μέθοδοι

μικοτσίπ Προετοιμασία και επιφάνεια επικάλυψης

Η κατασκευή του εθίμου microfluidic τσιπ αντίσωμα συζευγμένο SLB (Ab-SLB) επικάλυψη, την πλατφόρμα CMx, περιγράφεται ως εξής: Ένα εμπορικό CO

2 λέιζερ χαράκτη (Epilog Helix 24, Χρυσή, CO) είναι χρησιμοποιείται για τη δημιουργία micropatterns στο πολυ (μεθακρυλικό μεθύλιο) (ΡΜΜΑ) slide (μέγεθος = 76 mm χ 25,4 mm, πάχος = 1,5 mm). Το λέιζερ χρησιμοποιείται επίσης για να χαράξουμε μια 63 μm πάχους διπλής όψης κολλητική ταινία (8018PT? 3M Corp, Maplewood, ΜΝ) για να χαράξει τα σύνορα γύρω από τις μικρορευστονικής πρότυπα για το PMMA. Οι microtrenched σχέδια και μικροδομές στη διαφάνεια PMMA αντλήθηκαν χρησιμοποιώντας CorelDraw (Corel, Οτάβα, Καναδάς) και στη συνέχεια μεταφέρθηκε στο scriber λέιζερ για άμεση μηχανική κατεργασία στο υπόστρωμα. Σε αυτή τη μελέτη, έξι τύπους τσιπ ήταν έτοιμοι. Τα χαραγμένα τα τσιπ ήταν συνδεδεμένα με το γυάλινο πλακίδιο κατεργασμένο πλάσμα με την τοποθέτηση του χάραξαν κολλητική ταινία της 3M (σάντουιτς) μεταξύ της κορυφής (PMMA διαφανειών) και μια γυάλινη αντικειμενοφόρο πλάκα στο κάτω μέρος για να σχηματίσουν σφραγισμένο κανάλια. Η παρασκευή των λιπιδικών κυστιδίων, βιοτινυλίωση του αντισώματος EpCAM, EpAb4-1, και η διαδοχική παρασκευή του αντι-ΕρΟΑΜ-υποστηριζόμενη επικάλυψη λιπιδική διπλοστοιβάδα στην μικοτσίπ έχουν περιγραφεί προηγουμένως [46]. Εν συντομία, τα εσωτερικά τοιχώματα των μικροκαναλιών υποβλήθηκαν σε θεραπεία με λιπιδικά κυστίδια που αποτελούνται από 1-παλμιτοϋλ-2-ελαιοϋλ- ™

sn

-γλυκερο-3-φωσφοχολίνη (POPC) και 1,2-διπαλμιτοϋλο

sn

γλυκερο-3-φωσφο-Ν-cap-βιοτινυλ (β-PE) σε μοριακές αναλογίες 95/5 για να σχηματίσουν SLB. Για φθορισμού συζευγμένο SLB (Texas Red-SLB), οι μικροκαναλιών επικαλύφθηκαν με λιπιδικά κυστίδια που αποτελούνται από POPC, b-ΡΕ, και Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-γλυκερο-3-Φωσφοαιθανολαμίνη (Texas Red-DHPE? ThermoFisher Επιστημονική, Waltham, ΜΑ) σε μοριακή αναλογία 94,5 /5 /0,5 ακολουθούν τις ίδιες διαδικασίες σε λιπιδικά κυστίδια παρασκεύασμα. Μετά την απομάκρυνση της περίσσειας λιπιδίων, Neutravidin ™ (ΝΑ) συζεύχθηκε με την β-ΡΕ στο SLB μέσω NA-βιοτίνης αναγνώριση, που ακολουθείται από σύζευξη του βιοτινυλιωμένου EpAb4-1 (b-EpAb4-1) προς την ΕΜ να ολοκληρωθεί ο σχηματισμός επιφάνεια .

κυτταρική γραμμή που χρησιμοποιείται και Πολιτισμού κυττάρων

Το ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά HCT116 και παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα κυτταρικής σειράς AsPC1 είχαν αρχικά αγοραστεί από Bioresource Συλλογή και Ερευνητικό Κέντρο (BCRC, Ταϊβάν) και να χρησιμοποιηθούν ως EpCAM θετική κυτταρική γραμμή. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε Μέσο Eagle Τροποποιημένο Μέσο (ϋΜΕΜ για HCT116? Gibco, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) ή RPMI-1640 (για AsPC1? Gibco) με 1% αντιβιοτικό-αντιμυκητικό (ThermoFisher Scientific) και 10% ορό εμβρύου μόσχου ( FBS? Gibco) κάτω από 5% CO

2 υγροποιημένη ατμόσφαιρα. Τα καρκινικά κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν προ-βάφτηκαν με CellTracker Πράσινο CMFDA χρωστικής (Life Technologies, Carlsbad, CA) ή έκτοπη έκφραση της πρωτεΐνης ερυθρών φθορισμού (RFP), πριν καρφώσει πειράματα. Το μέσο σφαίρα καλλιέργειας (μέσον SPH) τυποποιήθηκε ως 10 ng /mL επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF, Gibco), 10 ng /mL του αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGF? BD Biosciences, San Jose, CA), 10 ng /mL ινσουλίνης (Sigma Aldrich, Saint Louis, ΜΟ), και Β27 (Gibco) σε μέσο DMEM ελεύθερο ορού. Τα εκλούεται βιώσιμα κύτταρα στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν είτε με πλήρες μέσο ή SPH ϋΜΕΜ μέσο με φυσιολογική δίσκο καλλιέργειας συνημμένο (Corning, Corning, ΝΥ) ή καλλιέργεια εναιωρήματος χρησιμοποιώντας ένα εξαιρετικά χαμηλό πλάκα στερέωσης (Corning). Live /Dead δοκιμασίας (Life Technologies) εκτελέσθηκε ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η HS68 δέρμα που προέρχεται από μη-ογκογονική ανθρώπινη κυτταρική σειρά ινοβλαστών διατηρήθηκε σε χαμηλής γλυκόζης μέσο DMEM (Gibco) με 1% αντιβιοτικά και 10% FBS. Για τις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτό το χειρόγραφο, το HCT116 και AsPC1 είχαν αρχικά αγοραστεί από Bioresource Συλλογή και Ερευνητικό Κέντρο (BCRC, Ταϊβάν).

Σύλληψη Αποδοτικότητα Δοκιμή της πλατφόρμας CMx

Η απόδοση της δέσμευσης της πλατφόρμας CMx χαρακτηρίστηκε χρησιμοποιώντας ανθρώπινο ορθοκολικό καρκίνο κυτταρική σειρά HCT116. Τα απλά κύτταρα HCT116 προ-βάφτηκαν με CellTracker Πράσινο CMFDA (ϋίβ Technologies) εμπλουτίστηκαν σε φρεάτια ποτήρι πυθμένα (διάμετρος: 6 mm, ύψος: 5 mm) και 10 λεπτά αφέθηκε για τα κύτταρα να ηρεμήσει. Οι πυθμένες καλά απεικονίστηκαν πριν και μετά τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε ολόκληρο το αίμα που συλλέγεται από υγιή άτομα με μικροσκοπία φθορισμού (Leica AF 6000 Σύνθετη φθορισμού σύστημα απεικόνισης) για να εξασφαλίζεται η ακριβής μετρήσεις. Ο πραγματικός αριθμός των αιχμηρών κυττάρων ορίστηκε ως (αριθμός κυττάρων σε καλά πριν τη μεταφορά) μείον (αριθμός κυττάρων που παραμένουν σε καλά μετά τη μεταφορά). Μετά από κατάλληλη, ήπια ανάμιξη, το μίγμα κυττάρων-αίμα έρευσε διαμέσου των λειτουργοποιημένο μικροδιαύλου υπό την ταχύτητα ροής 1,5 ml /h. Στη συνέχεια, ο μικροδιαύλου πλύθηκε με 0,5 mL διαλύματος ρυθμισμένου με φωσφορικό (PBS) υπό ρυθμό ροής 4 κ.εκ. /ώρα και χρωματίστηκαν με 0,3 mL του διαλύματος Hoechst (1 μg /mL σε PBS) για πυρήνες λεκέ. Το κανάλι φωτογραφήθηκε κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού (Leica DM16000B) να απαριθμήσει το συνολικό αριθμό των κυττάρων που κατέλαβε στο κανάλι. Τα καρκινικά κύτταρα συλλαμβάνοντας απόδοση ορίζεται ως ο λόγος του αριθμού των κυττάρων HCT116 δεσμεύεται στο τσιπ προς τον αριθμό των κυττάρων που αποστέλλονται στο τσιπ. Για τη δοκιμή της δέσμευσης και την απελευθέρωση της αποτελεσματικότητας των κυττάρων του συμπλέγματος, ατελής πέψη κύτταρα HCT116 επιλέχθηκαν με μικροχειριστή υπό μικροσκόπιο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6] και εμπλουτίστηκαν απευθείας στην πλατφόρμα CMx. Τόσο για κυτταρική γραμμή και επικύρωσης κλινικά δείγματα, ΚΜΑ και CTMs συλλήφθηκαν υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες με ρυθμό ροής ίδια ένεση (1,5 ml /h) και ο ρυθμός καθαρισμού PBS (4 mL /h).

ανοσοφθορισμού χρώσης

Τα συλληφθέντα κύτταρα, απελευθερώνεται από το τσιπ επί της μεμβράνης φίλτρου, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 σε 1χ PBS, και αποκλείστηκαν με αλβουμίνη βόειου ορού (Millipore, Bedford, ΜΑ). Ακολούθως, τα κύτταρα βάφτηκαν με αντι-ανθρώπινο κυτοκερατίνης 20 (ΟΚ20? Abcam, Cambridge, UK) και αντι-ανθρώπινο CD45 αρουραίου (Abcam) όλη τη νύκτα στους 4 ° C και ακολουθείται από PBS πλύση. Μετά PBS πλύση, τα κύτταρα επωάστηκαν με το αντίσωμα FITC συζευγμένο γίδινο αντι-αρουραίου IgG (Abcam) και το

® 568 αντίσωμα Alexa Fluor αντι-κουνελιού IgG (Life Technologies) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, η περίσσεια αντισώματα αφαιρέθηκαν στη συνέχεια με PBS πλύσιμο και φωτογραφήθηκε με μικροσκόπιο φθορισμού (Leica DM16000B). Για ανοσοχρώση των κυττάρων ινοβλαστών, α-λείου μυός ακτίνη (α-SMA, ϋΑΚΟ, Denmark) και υποδοχέα αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (FGFR, Abcam) χρησιμοποιήθηκαν ως δείκτες ινοβλαστών.

Δήλωση Ηθικής και κλινικά δείγματα Collection

Τα δείγματα περιφερικού αίματος ελήφθησαν από 54 ασθενείς CRC με τα στάδια Ι (n = 11), II (η = 13), III (η = 12) και IV (n = 18) χωρίς προηγούμενη θεραπεία του καρκίνου και του παχέος εντέρου δωρητές ελεύθερη νόσου (n = 9) ως αρνητικοί έλεγχοι περιλήφθηκαν σε μια διπλή τυφλή, προοπτική μελέτη (31 θηλυκά και 32 αρσενικά). Σύνολο 2 mL δείγματος ολικού αίματος συλλέχθηκαν με οξύ (EDTA) σωλήνες Vacutainer αιθυλενο-διαμίνη-τετρα-οξικό (BD Biosciences) από κάθε ασθενή και χρησιμοποιήθηκε τόσο για CTC και CTM σύλληψη στην πλατφόρμα μας για περαιτέρω ανάλυση. Οι ασθενείς CRC έγιναν δεκτές στη συγκεκριμένη μελέτη έχει καμία προηγούμενη θεραπείες για τον καρκίνο, τη λήψη αίματος κλήρωση πριν από τη χειρουργική επέμβαση την ίδια ημέρα ή μια ημέρα πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Οι υγιείς δότες επιβεβαιώθηκαν από την κολονοσκόπηση εξέταση χωρίς τη νόσο του παχέος εντέρου και έλαβε κλήρωση του αίματος πριν από τη διαδικασία. Μέσος όρος ηλικίας των ασθενών και υγιών δοτών είναι 62 και 47 ετών, αντίστοιχα. Οι ασθενείς είχαν προσληφθεί από τον Ιούνιο έως τον Οκτώβριο 2012 στο Chang Gung Memorial Hospital, Linkou, Ταϊβάν. Όλα τα δείγματα υποβάλλονται σε επεξεργασία σε Academia Sinica, Ταϊπέι, Ταϊβάν. Η κλινική κατάσταση και τα αποτελέσματα της CTC ήταν διπλά τυφλή. Το πρωτόκολλο της μελέτης, συμπεριλαμβανομένων πειραματικό σχεδιασμό και εκτέλεση της παρούσας μελέτης περιγράφεται με σαφήνεια και αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από τις Institutional Review Boards του Academia Sinica (AS · IRBOI-12040) και Chang Gung Memorial Hospital (100-1023B). Η γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς, συμπεριλαμβανομένων υγιών εθελοντών και ασθενών CRC πριν από τη μελέτη.

Μοριακή Ανάλυση

Συνολικά 7 hotspots μετάλλαξη KRAS (G12V, G12D), ρ53 (R248W, R175H , R248Q) και APC (E1309fs * 4, 1556fs * 3) την κατάσταση μετάλλαξης ανιχνεύθηκαν με δοκιμασία εμπορικά διαθέσιμο TaqMan® ανίχνευση μετάλλαξης (Life Technologies) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, ο προσδιορισμός χρησιμοποιεί ανταγωνιστική αλληλόμορφο-ειδική TaqMan (τεχνολογία castPCR) PCR. Κάθε άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο αλληλόμορφο δοκιμασία αποτελείται από μια τροποποιημένη ή μη τροποποιημένη αλληλόμορφο-ειδική προς τα εμπρός εκκινητή, ειδικής θέσεως TaqMan® διερευνητή, ειδικό γενετικό τόπο αντίστροφο εκκινητή, και αλληλόμορφο-ειδική MGB blocker. Κάθε δείγμα δοκιμής εκτελέστηκε με μία δοκιμασία (ες) μεταλλαγμένο αλληλόμορφο και το αντίστοιχο δοκιμασία αναφοράς γονιδίου. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με την έκδοση Seq Detection System 2.3 για να δημιουργήσει τις αξίες της CT

στόχου και CT

αναφοράς. Η τιμή αποκοπής ανιχνεύεται ΔCt χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το όριο της εκατοστιαίας μετάλλαξης σε ένα δείγμα ότι η δοκιμασία μεταλλαγμένο αλληλόμορφο μπορεί να ανιχνεύσει. Ο τύπος μετατροπής μεταξύ% και ΔCt είναι 2

– (ΔΟΙ) × 100%. Το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο ευαισθησία της δοκιμασίας ήταν 0.1%. Ως εκ τούτου, η αξία των ΔCt ≤ 9,96 θεωρείται ως θετική και η αξία των ΔCt & gt? 9.96 ως αρνητική.

Στατιστική Ανάλυση

Σύλληψη αποδοτικότητα αναφέρθηκε ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. Τα μέσα ομάδα συγκρίθηκαν από ένα ανεξάρτητο t-test. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές σε επίπεδο εμπιστοσύνης 95% (

σ

& lt? 0,05).

Αποτελέσματα

Στρατηγική της ΚΜΑ και CTMs Capture, καθαρισμός, και αφήστε

Η σύλληψη, τον καθαρισμό και τη στρατηγική απελευθέρωση εκμεταλλεύεται SLBs να ενσωματώσει μητρική κατάσταση πρωτεΐνες [46-53] και να ενεργεί ως διεπαφή μεταξύ του εσωτερικού τοιχώματος του μικοτσίπ και αντισωμάτων. Τα βιομιμητικά SLBs εγγενώς δημιουργούν ένα στρώμα λιπαντικού απορρίπτοντας τα συστατικά του αίματος ( «μη-ρύπανση») και βοηθούν την κινητικότητα του αντισώματος για να σχηματίσουν μια εξαιρετική πλατφόρμα για τη σύλληψη των κυττάρων. Στην εργασία αυτή, ένα στρώμα από αντίσωμα για επιθηλιακών μόρια κυτταρικής προσκόλλησης (αντι-ΕρΟΑΜ), την κλωνοποίηση EpAb4-1, είναι συζευγμένο με τις SLBs για επιλεκτική CTCs συλλάβει [46]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η πρωτεΐνη-συζευγμένο SLBs μπορούν να δημιουργήσουν ένα εξαιρετικό διαλογή κυττάρων και την πλατφόρμα του πολιτισμού? Επιπλέον, η πλευρική ρευστότητα του SLBs επιτρέπει την ομαδοποίηση των πρωτεϊνών αυξάνοντας έτσι τη συγγένεια πρόσδεσης και την ειδικότητα των κυττάρων-στόχων [47,49]. Επιπλέον, η αμφιτεριονική φύση των λιπιδικών μορίων στο SLB ελαχιστοποιεί περαιτέρω μη-ειδική πρωτεΐνη ή /και κύτταρο προσρόφηση [48,49,54-56], μειώνοντας έτσι ρύπανση της επιφάνειας από περιφερικό αίμα. Έχουμε ενσωματωθεί στην επιφάνεια αντι-EpCAM-SLB σε μικοτσίπ με χαραγμένα σχέδια που αποσκοπούν στην ενίσχυση χαοτική ανάμιξη [57]. Με τον έλεγχο των παραμέτρων της ροής του υγρού, πρέπει πρώτα να συλλάβει ΚΜΑ πάνω στην επιφάνεια και στη συνέχεια να αυξήσει την ταχύτητα ροής του ρυθμιστικού για να μειωθεί η μη ειδική κύτταρα προσροφημένο αίματος χωρίς μετατόπιση οποιοδήποτε από τα δεσμευμένα ΚΜΑ (Σχήμα 1Α). Τέλος, τα καθαρισμένα CTCs εκλούονται από το τσιπ μέσω διατάραξη της συναρμολόγησης SLB, όχι η μεμβράνη κυττάρου ή πρωτεΐνη θέσεις δέσμευσης, με ένα απαλό σκούπισμα του αφρού αέρα. Αυτή η συνδυασμένη στρατηγική είναι σε θέση να ολοκληρώσει τη σύλληψη και τον καθαρισμό της ΚΜΑ, στη συνέχεια, επιτρέποντάς τους να κυκλοφορήσει απαλά για περαιτέρω κατάντη μοριακή ανάλυση ή την καλλιέργεια. Η επισκόπηση και η ρύθμιση του plarform CMx είχαν φαίνεται στο σχήμα 1Β.

(A) Στρατηγικές για να συλλάβει, να καθαρίσει και να απελευθερώσει ΚΜΑ της πλατφόρμας CMx. Στην επάνω σειρά, το αίμα ρέει μέσα από ένα κανάλι μικροροής επικαλυμμένο με αντι-ΕρΟΑΜ συζευγμένο με NeutrAvidin το οποίο προσκολλάται σε ένα στρώμα επί του υποστρώματος SLB. Επιλεκτική δέσμευση των ΚΜΑ σε αντι-ΕρΟΑΜ είναι ενισχυθεί από τα αποτελέσματα συσταδοποίησης αντίσωμα μέσω της κινητικότητας του ρευστού στρώματος SLB, ενώ άλλα κύτταρα του αίματος είναι εύκολα στο ίδιο επίπεδο μακριά από το ρευστό επιφάνεια. Η κάτω σειρά έδειξε τη διαδικασία απελευθέρωσης, στην οποία εισήχθη φυσαλίδες αέρα να διαταράξει τις πιο αδύναμους κρίκους μεταξύ του υποστρώματος και του στρώματος SLB επιτρέποντας έκλουση ανέπαφη ΚΜΑ για τη συλλογή έξω από το μικοτσίπ. (Β) Επισκόπηση της πλατφόρμας CMx και περίληψη της ροής εργασιών πλατφόρμας CMx. Περίπου 2 mL του συνόλου των δειγμάτων αίματος που λαμβάνονται προσφάτως από τους ασθενείς CRC φορτώθηκαν εξ ίσου σε κάθε διατάξεις συλλήψεως CTC. Όλες οι μάρκες μπήκαν μέσω της δέσμευσης των κυττάρων, τον καθαρισμό, και κυκλοφόρησε για διάφορες κατάντη εφαρμογές, συμπεριλαμβανομένων χρώση ανοσοφθορισμού, καταμέτρηση των κυττάρων, μοριακή ανάλυση,

ex vivo

κυτταρικής καλλιέργειας και /ή cryobanking.

Η

Αποτελεσματικότητα της Target συνδέσεως κυττάρων και Capture

τα εσωτερικά τοιχώματα των μικροκαναλιών τροποποιήθηκαν με λιπιδικά κυστίδια που αποτελούνται από POPC και β-ΡΕ και συζευγμένο του b-EpAb4-1 μέσω NA-βιοτίνης αναγνώρισης [46]. Μια σειρά μικροροής μάρκες με διαφορετικές διαδρομές ροής, τις διαστάσεις, και μικροδομές ακολουθήθηκαν με τον ίδιο επιφανειακή τροποποίηση (Σχήμα 2Α). Ανθρώπινα ορθοκολικού καρκίνου κυτταρική γραμμή HCT116 προ-βάφτηκαν με CellTracker Πράσινο CMFDA στη συνέχεια προστίθενται σε 1 mL ολικού αίματος που συλλέγεται από υγιή άτομα σε σωλήνες EDTA για σύλληψη κύτταρο στόχο σε ένα λειτουργοποιημένο μικροκανάλι και ακολούθησε με καθαρισμό PBS και πυρηνική χρώση Hoechst. Το συνολικό ποσό των καρκινικών κυττάρων συλλαμβάνεται από το τσιπ κατόπιν απεικονίστηκαν και απαριθμήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού. Τα διπλά-θετικών κυττάρων με αμφότερα CellTracker Green και πυρηνική χρώση ταυτοποιήθηκαν ως καρκινικά κύτταρα. Τα μοναδική θετική πυρηνική χρώση μόνο κύτταρα ταυτοποιήθηκαν ως μη-ειδικά συνδεμένη λευκά αιμοσφαίρια (WBCs). Η απόδοση σύλληψης ορίζεται ως ο λόγος του αριθμού των κυττάρων HCT116 δεσμεύεται στο τσιπ με το συνολικό αριθμό των κυττάρων που κορυφώθηκαν στο τσιπ [21].

(Α) Η γεωμετρία και τα πρότυπα της 6ης διαφορετικά σχέδια microfluidic κανάλι (αριστερά) και η απόδοση της δέσμευσης αυτών των μικρορευστονικής πλατφόρμες (δεξιά), όπως ορίζεται από τη διαίρεση κατέλαβε κύτταρα επί του συνόλου εμπλουτίστηκε κύτταρα. (Β) Οι περικομμένη φθορίζουσες εικόνες (5,5 mm x 5,5 χιλιοστά) μέσα στο κανάλι ροής και η απαρίθμηση των HCT116 (πράσινο) και λευκά αιμοσφαίρια (μπλε) στο Ab-SLB ή επικαλυμμένα Ab-σιλανίου Τύπος E μάρκες. (Γ) απόδοση της κυψέλης αποκόλλησης (%, Υ-άξονας) έναντι ρυθμούς ροής (ml /h, κατώτερο Χ-άξονας) και του αντίστοιχου τάση διατμήσεως (άνω άξονα Χ). Οι ρυθμοί ροής διατηρείται γενικά κάτω από 4 ml /h για να αποφευχθεί οποιαδήποτε πιθανή απώλεια των συλληφθέντων ΚΜΑ. σύλληψης (D) Ιδιαίτερα CTM και απόδοση ανάκτησης της πλακίδιο Ab-SLB. Το ποσοστό απόδοσης σύλληψη και την ανάκτηση των HCT116-RFP δημιουργείται microemboli όγκου έδειξε στο δεξιό πίνακα. Οι κυκλοφορήσει συστάδες HCT116-RFP CTC με χρώση DAPI ήταν έδειξε στο αριστερό πάνελ. *:

σ

& lt? 0,05? **:

σ

& lt? 0.01.

Η

Το σχήμα 2Α απεικονίζει την γεωμετρία και τα πρότυπα των 6 διαφορετικά σχέδια microfluidic κανάλι (τύποι Α έως ΣΤ). Τύπος Α αντιπροσωπεύει γραμμικό σχήμα μικρο-κανάλι χωρίς μικρο-σχέδια, τύπου Β αντιπροσωπεύει γραμμικό σχήμα μικρο-καναλιών με γραμμικά διατεταγμένα μικρο-σχέδια, τύπου C αντιπροσωπεύει γραμμικό σχήμα μικρο-καναλιών με διπλή σειρά γραμμικά διατεταγμένα μικρο-σχέδια, τύπου D αντιπροσωπεύει γραμμική διαμορφώνουν μικρο-κανάλι με τον αναπληρωτή μετάθεση γραμμική μικρο-σχέδια, Τύπος Ε αντιπροσωπεύει U-σχήμα μικρο-κανάλι με τον αναπληρωτή μετάθεση γραμμική μικρο-σχέδια, και τύπου F αντιπροσωπεύει μικρορευστονικής τεσσάρων καναλιών με τον αναπληρωτή μετάθεση γραμμική μικρο-πρότυπα. Σχετικά έργα επίσημα χορηγήθηκε τον Σεπτέμβριο του 2014 ΗΠΑ Διπλωμάτων Ευρεσιτεχνίας και Εμπορικών Σημάτων (US 20140255976 Α1). Τα ίσια κανάλια με απλά σχέδια στο πλαίσιο ίδια γραμμική ταχύτητα αντιπροσωπεύουν πολύ χαμηλών επιδόσεων σύλληψη λόγω του περιορισμένου χρόνου κατακράτησης και η έλλειψη της ανάμειξης μοτίβο ροής: Η απόδοση σύλληψη του τύπου Α τσιπ = 1.2 ± 0.6% και το chip τύπου Β = 4.5 ± 2.2%. Όταν ο αριθμός των πολύ μικρών μοντέλων αυξάνει για να δημιουργήσει αποτελεσματική ανάμειξη, αποδοτικότητα σύλληψη αυξήσει σημαντικά: τσιπ τύπου C = 17,9 ± 3,0% και το chip Τύπος D = 33,5 ± 6,6%. Περαιτέρω διπλασιάζοντας το μήκος του καναλιού αυξήθηκε ελαφρά μόνο βελτίωση της αποτελεσματικότητας σε 37,0 ± 10,5% (Τύπος E), ενώ 4 παράλληλα κανάλια βελτίωσε περαιτέρω την αποτελεσματικότητα σύλληψης σε 93,7 ± 8,9% (τύπος F). Οι αριθμοί εμβολιασμού των κυττάρων μειώθηκαν πάλι στο φάσμα των ~ 5 ~ 100 ανά 2 ml αίματος για να επιβεβαιωθεί η γραμμικότητα της απόδοσης σύλληψης σε τσιπ τύπου F (S1 Α Σχήμα).

Μη ρύπανση Ακινήτου των επικαλυμμένων SLB επιφάνειας και στόχος κυττάρων Καθαρισμός

Για την περαιτέρω αξιολόγηση της επίδρασης επιφάνειας, τύπου Ε τσιπ επικαλύφθηκε με τα συμβατικά αντι-EpCAM δεμένοι σιλανίου (Ab-σιλανίου) ή αντι-EpCAM συζευγμένο SLB (Ab-SLB). Σχήμα 2Β έδειξαν ότι η απόδοση σύλληψη του HCT116 είναι περίπου 15% επί του επικαλυμμένου τσιπ Ab-σιλάνιο, με πάνω από 2000 λευκά αιμοσφαίρια είναι μη ειδικά δεσμευμένο πάνω στο τσιπ. Σε σύγκριση, το επικαλυμμένο Ab-SLB τσιπ ενισχυθεί σημαντικά συλληπτήρια και μειωμένη μη ειδική WBC στο τσιπ.

Η καθαρότητα των συλληφθέντων κυττάρων μπορεί να βελτιωθεί περαιτέρω με την απλή αύξηση του ρυθμού ροής του ρυθμιστικού έκπλυσης PBS σε ένα πλακίδιο αντίσωμα-SLB. Καθώς ο ρυθμός ροής του PBS αυξήθηκε, το ποσοστό των διατηρούμενων WBCs μειώθηκαν σημαντικά. Στη μελέτη μας, η αυξημένη διατμητική τάση να αφαιρέσει το 55 ~ 80% λευκά αιμοσφαίρια ενώ διατηρεί περισσότερο από το 90% HCT116 απαιτεί ~ 4-8 dynes /cm

2 (που αντιστοιχεί σε ροή ποσοστά ~ 5-10 mL /h, Εικ 2C). Η διατμητική τάση που απαιτείται για να καθαρίσει τα κύτταρα-στόχους είναι σημαντικά χαμηλότερο από ό, τι είχε αναφερθεί σε προηγούμενες μελέτες κυτταρικής αποκόλλησης με βάση τις συμβατικές επιφάνειες αντισώματος σιλανιούχων και θεωρείται αρκετά χαμηλή για να έχουν ελάχιστη ή καμία επίπτωση στην βιωσιμότητα των κυττάρων ή η έκφραση της πρωτεΐνης [40,58]. Αντιθέτως, HCT116 παρέμεινε δεσμευμένη ακόμη και σε 50 mL /h, λόγω της ισχυρής αλληλεπίδρασης αντισώματος-αντιγόνου (S1 Ταινία). Για τα κλινικά δείγματα, επιλέξαμε ένα μικρότερο ρυθμό ροής 4 ml /h για να αποφευχθεί οποιαδήποτε πιθανή απώλεια της ΚΜΑ.

Απελευθέρωση των Συλλαμβάνονται βιώσιμα κύτταρα-στόχοι

Απελευθέρωση βιώσιμη ΚΜΑ από τις microfluidic τσιπ είναι ένα κρίσιμο βήμα που επιτρέπει εύκολη συντήρηση κυττάρων, κυτταρική καλλιέργεια, και κατάντη μοριακή ανάλυση. Προηγούμενες προσπάθειες χρησιμοποιώντας ενζυμική διάσπαση [34,36] ή μηχανικές δυνάμεις [40,58] για να αποκολληθούν τα κύτταρα έχουν δείξει είτε μερική αποδέσμευση ή αναπόφευκτο θάνατο των κυττάρων, που δόθηκε από την θραύση του αντισώματος-αντιγόνου δεσμούς ή ρήξη της μεμβράνης. Το SLB είναι ένα λιπίδιο μοριακό συναρμολόγησης στο νερό στερεό διεπαφή σταθεροποιούνται με προς τα μέσα υδρόφοβες-υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις των μακριές αλυσίδες υδρογονανθράκων των λιπιδικών μορίων και προς τα έξω υδρόφιλες ομάδες κεφαλής που αλληλεπιδρούν με νερό ή υδρόφιλες επιφάνειες οξείδιο του πυριτίου (δηλαδή, γυαλί). Το συγκρότημα SLB θα μπορούσε εύκολα να αποσυντεθεί από εισαγάγει ένα υδρόφοβο συστατικό τόσο απλό όσο φυσαλίδες αέρα. Προσφέραμε μια στρατηγική για να απελευθερώσει απαλά κόλλα ΚΜΑ χωρίς να διαταράσσει τα ομόλογα αντισώματος-αντιγόνου με την έγχυση συνεχούς αφρού αέρα στο μικρορροϊκή (S2 Ταινία). Το διάλυμα αφρώδες δημιουργήθηκε από ένα μίγμα αέρα με μέσο κυτταρικής καλλιέργειας και στροβιλίζεται ήπια για δημιουργία αφρού. Η μέση απόδοση απελευθέρωση χρησιμοποιώντας 250 μl διαλύματος αφρώδες ήταν 99,7% σε 3 επαναλήψεις (S1B σχήμα). Προκειμένου να επαληθεύσει την ακεραιότητα των κυττάρων που απελευθερώνεται από τα microfluidic τσιπ χρήση αφρού αέρα, τα κύτταρα HCT116 είχαν προ-βάφονται με CellTracker Πράσινο CMFDA και η Texas Red-SLB χρησιμοποιήθηκαν για την ένδειξη επίστρωση της επιφάνειας. Μετά απελευθερώνεται από αφρό αέρα, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ πυρηνική χρώση και φωτογραφήθηκε κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού. Σχήμα 3Α έδειξε ότι η έκλουση των κυττάρων ήταν τυλιγμένο με λιπίδια, υποδεικνύοντας απελευθέρωση των κυττάρων μέσω ξεφλούδισμα SLB από τον αέρα. Live /Dead δοκιμασία διεξήχθη αμέσως μετά την έκλουση κύτταρο? αποτελέσματα έδειξαν 86% των εκλούεται κύτταρα παραμένουν βιώσιμα σε σύγκριση με 0% βιωσιμότητα από το συμβατικά με επικάλυψη αντι EpCAM-σιλανιούχων τσιπ (S2 σχήμα). Με την εισαγωγή υδρόφοβων αφρών αέρα, απαλή απελευθέρωση των συλληφθέντων CTCs θα μπορούσε να επιτευχθεί χωρίς να καταστρέφει τα κύτταρα. Ως αποτέλεσμα, το μη ρυπαντικό SLB επιφάνεια διατηρηθεί ανέπαφα κυτταρική μορφολογία και δεσμεύεται βιώσιμα κύτταρα για περαιτέρω διερεύνηση.

(Α) Οι φθορισμού εικόνες του καρκινικού κυττάρου HCT116 απελευθερώνεται από το επικαλυμμένο τσιπ Texas Red-SLB. Το κελί ήταν τυλιγμένο με Texas Red-SLB μόρια λιπιδίων γύρω από τη μεμβράνη (μπλε: DAPI? Πράσινο: προ-χρωματισμένο CellTracker Πράσινο CMFDA? Κόκκινο: Texas Red συζευγμένο λιπιδίων μόριο). (Β και Γ) επικαλύπτονται φθορίζουσες εικόνες του κυκλοφόρησε μόνο CTC και CTM για τον χαρακτηρισμό των κυττάρων. Εκλούεται κύτταρα από κλινικά δείγματα ταξινομήθηκαν ως CTC με βάση το μέγεθος, τη μορφολογία και immunostainning (DAPI + /ΟΚ20 + /CD45-). Λευκά αιμοσφαίρια εντοπίστηκαν από DAPI + /CK20- /CD45 + ανοσοχρώση (μπλε: DAPI? Πράσινο: CD45? Κόκκινο: ΟΚ20).

Η

Σύλληψη και Απελευθέρωση της CTMs

Για να είναι έγκυρη η ικανότητα του Ab-SLB επικάλυψη μικοτσίπ για τη σύλληψη CTMs και την απελευθέρωση, το RFP εκτοπικά εξέφρασε HCT116 χρησιμοποιήθηκαν. Η

ex vivo

έμβολα όγκου προσομοιώθηκαν χρησιμοποιώντας ατελής πέψη με θρυψίνη και επιλέγονται από μικροχειριστή υπό μικροσκόπιο όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [6]. Ποικίλο αριθμό επιλεγμένων εμβόλων HCT116-RFP εμπλουτίστηκαν στα microfluidic τσιπ για την περαιτέρω σύλληψη και την απελευθέρωση δοκιμές αποτελεσματικότητας. Οι κυκλοφορήσει έμβολα στη συνέχεια απεικονίζονται κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού μετά DAPI πυρηνική χρώση (Σχήμα 2D, αριστερό πάνελ).