Αφηρημένο

οξυστερολών είναι προϊόντα οξείδωσης της χοληστερόλης. Χολεστάνης 3β, 5α, 6β-τριόλη (συντομογραφία τριόλη) είναι ένα από τα πιο άφθονα και ενεργό οξυστερόλες. Εδώ, αναφέρουμε ότι τριόλη εμφανίζει αντικαρκινική δράση έναντι ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Η επεξεργασία των κυττάρων με δοσοεξαρτώμενο τριόλη κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των LNCaP CDXR-3, DU-145, και PC-3 κύτταρα καρκίνου ανθρώπινου προστάτη και μειωμένο σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ. Η στοματική χορήγηση της τριόλης σε 20 mg /kg ημερησίως για τρεις εβδομάδες καθυστέρησε σημαντικά την ανάπτυξη των PC-3 ξενομοσχεύματα σε γυμνά ποντίκια. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι η θεραπεία τριόλης σε 10-40 μΜ προκάλεσε τη σύλληψη G1 του κυτταρικού κύκλου, ενώ η δοκιμασία TUNEL υπέδειξαν ότι η θεραπεία τριόλη στους 20-40 μΜ επαγόμενη απόπτωση σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές. Μικρο-Δυτική Πίνακες και παραδοσιακές δυτικές μεθόδους κηλίδωση έδειξε ότι η θεραπεία τριόλη οδήγησε σε μειωμένη έκφραση του Akt1, φωσφο-Akt Ser473, φωσφο-Akt Thr308, ΡϋΚ1, c-myc, και τα επίπεδα της πρωτεΐνης Skp2 καθώς και τη συσσώρευση του αναστολέα p27 του κυτταρικού κύκλου

Kip. θεραπεία τριόλη είχε επίσης ως αποτέλεσμα μειωμένη έκφραση Akt1 πρωτεΐνης σε PC-3 ξενομοσχεύματα. Η υπερέκφραση του Skp2 σε κύτταρα PC-3 διασώθηκαν μερικώς την αναστολή ανάπτυξης που προκαλείται από τριόλη. θεραπεία τριόλη κατέστειλε τη μετανάστευση και την εισβολή του DU-145, PC-3, και τα κύτταρα CDXR-3. Τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών που σχετίζονται με επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης καθώς και κινάσης εστιακής προσκόλλησης επηρεάστηκαν από τριόλης θεραπείας σε αυτά τα κύτταρα. θεραπεία τριόλη προκάλεσε αυξημένη έκφραση των επιπέδων της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης αλλά μειωμένη έκφραση του Ν-καδερίνης, βιμεντίνη, Slug, FAK, φωσφο-ΡΑΚ Ser722, και τα επίπεδα πρωτεΐνης φωσφο-ΡΑΚ Tyr861. Ομοεστιακό μικροσκόπιο λέιζερ έδειξε ανακατανομή του β-ακτίνης και α-τουμπουλίνης στην περιφέρεια των κυττάρων CDXR-3 και DU-145. Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι τριόλη μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική ουσία για προχωρημένους μεταστατικό καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Lin C-Y, Χούο C, Kuo L-K, Hiipakka RA, Jones RB, Lin Η-Ρ, et al. (2013) χοληστάνης-3β, 5α, 6β-τριόλη καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή των ανθρώπινων κυττάρων του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 8 (6): e65734. doi: 10.1371 /journal.pone.0065734

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Αυστρία

Ελήφθη: 28 Δεκέμβρη 2012? Αποδεκτές: 27, Απριλίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουνίου του 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το CS-101-PP-14 (Εθνικό Σύστημα Υγείας Ερευνητικά Ινστιτούτα), NSC 99 – 2320-B-400-015-my3 και NSC 101 – 2.325-B-400-014 (Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο) στην Ταϊβάν για CPC? DOH101-TD-C-111-004 (Υπουργείο Υγείας) στην Ταϊβάν για JYC και CPC. CYL υποστηρίζεται από DOH101-TD-C-111-004. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου

προστάτη είναι η δεύτερη πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος των ανδρών και η πέμπτη πιο κοινή μορφή καρκίνου συνολικά στον κόσμο. Το 2008, περισσότερα από 899.000 νέα κρούσματα διαγνώστηκαν (GLOBOCAN βάση δεδομένων 2008, έκδοση 1.2). Στις δυτικές χώρες, ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο κοινή μη-δερματικό καρκίνωμα των ανδρών. Σύμφωνα με τα στατιστικά στοιχεία της επιτήρησης Επιδημιολογίας και τελικά αποτελέσματα (SEER) του Εθνικού Ινστιτούτου για τον Καρκίνο, περισσότερες από 240.000 άνδρες διαγνώστηκαν με και περισσότερα από 28.000 άνδρες πέθαναν από καρκίνο του προστάτη το 2012 στις Ηνωμένες Πολιτείες. Παρά το γεγονός ότι η χειρουργική επέμβαση είναι συχνά επιτυχείς για όργανο-περιορισμένο καρκίνο του προστάτη, θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων είναι η κύρια θεραπεία για μεταστατικό καρκίνο του προστάτη. Δυστυχώς, οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνο του προστάτη που λαμβάνουν θεραπεία απόσπασης ανδρογόνων θα αναπτύξει τελικά υποτροπιάζουν, ευνουχισμός ανθεκτικά όγκους εντός 1-3 ετών μετά τη θεραπεία. Η διάμεση συνολική χρόνος επιβίωσης είναι 1-2 χρόνια μετά την υποτροπή του καρκίνου [1], [2]. Δεν υπάρχει αποτελεσματική καθιερωμένη θεραπεία για ασθενείς που υποτροπιάζουν με προχωρημένο καρκίνο του προστάτη. Η χημειοθεραπεία χρησιμοποιείται συχνά για τη θεραπεία του μεταστατικού ορμόνη πυρίμαχων 2,3 καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, χημειοθεραπείες δείξει γενικά μικρή επίδραση στην παράταση της επιβίωσης. Ως εκ τούτου, οι νέες θεραπείες για προχωρημένους καρκίνους του προστάτη που απαιτούνται.

οξυστερολών είναι προϊόντα οξείδωσης της χοληστερόλης. Οξυστερόλες παίζουν βασικούς ρόλους στη ρύθμιση της ομοιόστασης χοληστερόλης, τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων, την απόπτωση, και πρωτεΐνη πρενυλίωση [4]. Ωστόσο, οι οξυστερόλες συνδέονται με την ανάπτυξη αθηροσκλήρωσης, νευρολογικών ασθενειών, και καρκίνους [4]. Ορισμένα οξυστερόλες έχουν αναφερθεί ότι εμφανίζουν αντικαρκινικές επιδράσεις, ενδεχομένως μέσω διαφοροποίησης των εκροή χοληστερόλης, Akt, ή υποδοχείς συκώτι Χ (LXRs) [5], [6]. Για παράδειγμα, η θεραπεία με 22 (R) -hydroxycholesterol, 24 (S) -hydroxycholesterol, 7α-υδροξυχοληστερόλη, 7β-υδροξυχοληστερόλης, 25-υδροξυχοληστερόλης, και 5α, 6α-εποξυχοληστερόλη κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων προστάτη, του μαστού, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, και καρκίνος λευχαιμίας κυττάρων [7] – [14]. Αυτές οι οξυστερόλες προκληθεί είτε G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου [7] – [11] ή της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα [12] – [14]. Ως εκ τούτου, οξυστερόλες με κυτταροτοξική δραστηριότητα θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός παράγοντας για προχωρημένους καρκίνους του προστάτη.

χολεστάνης 3β, 5α, 6β-τριόλη (συντομογραφία τριόλη) είναι ένα από τα πιο άφθονα οξυστερόλες. Η τριόλη προέρχεται από τη χοληστερόλη από την οξείδωση μέσω σχηματισμού του 5α, 6α-εποξυχοληστερόλη και 5β, 6β-εποξυχοληστερόλη [15], [16] ως ενδιάμεσα. Προηγουμένως, 5α, 6α-εποξυχοληστερόλη αναφέρθηκε ότι εμφανίζουν αντικαρκινική δράση [13]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την ικανότητα της τριόλης να καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των προηγμένων ανθρώπινων κυτταρικών γραμμών καρκίνου του προστάτη και τα δύο

in vitro

και

in vivo

. Εφαρμόσαμε Micro-Δυτική Πίνακες, μια πρόσφατα αναπτύχθηκε βασισμένη σε αντισώματα, υψηλής απόδοσης δοκιμασία Western κηλίδωση [17] – [20], για να μελετήσει τις πρωτεΐνες σηματοδότησης που πλήττονται από τριόλη σε προχωρημένο καρκίνο του προστάτη κύτταρα. Οι παρατηρήσεις μας πρότεινε ότι τριόλη μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική ουσία για προχωρημένους μεταστατικό καρκίνο του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

χοληστάνης-3β, 5α, 6β-τριόλη αγοράστηκε από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). Matrigel αγοράστηκε από BD Bioscience (San Jose, CA, USA).

Cell Culture

Ο καρκίνος του προστάτη κυτταρικές σειρές PC-3, DU-145 και LNCaP sublines ήταν ένα δώρο από το εργαστήριο του καθηγητή Shutsung Liao (The University of Chicago, IL, USA). Αυτές οι κυτταρικές σειρές είχαν προηγουμένως περιγραφεί [7], [8], [10], [21] – [27]. LNCaP κύτταρα CDXR-3 ανακαλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7], [8], [10], [11], [21] – [23], [27]. DU-145 και PC-3 κύτταρα διατηρήθηκαν σε DMEM (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS? Atlas Biologicals, Fort Collins, CO, USA), πενικιλλίνη (100 U /ml ), και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml) (πλήρες μέσο) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Τα κύτταρα PZ-HPV-7 αγοράσθηκαν από Bioresource Συλλογή και Research Center (BCRC, Hsinchu City, Ταϊβάν) και καλλιεργήθηκαν σε ένα μέσο ελεύθερο από κερατινοκύτταρα στον ορό (Gibco /Invitrogen) με 5 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα και 50 μg /ml βόειας εκχύλισμα υπόφυσης.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 3 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε 100 μΐ πλήρους μέσου σε πλάκες 96 φρεατίων. δοκιμασίες πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκαν υπό συνθήκες συντήρησης (DMEM με 10% FBS για PC-3 και DU-145? DMEM με 10% CS-FBS για LNCaP CDXR-3). Σχετικό αριθμό κυττάρων αναλύθηκε με μέτρηση της περιεκτικότητας DNA των κυτταρολυμάτων με τη φθορίζουσα χρωστική Hoechst 33258 (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [8], [10], [11], [21], [ ,,,0],23], [24], [27], [28]. Όλες οι ενδείξεις κανονικοποιήθηκαν προς το μέσο όρο της κατάσταση ελέγχου (χωρίς θεραπεία τριόλη) σε κάθε πείραμα. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Δέκα φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε κατάσταση. Η μέση και τυπική απόκλιση αντιπροσώπευε τον μέσο όρο και την τυπική απόκλιση αντίστοιχα τα αποτελέσματα από όλα τα 30 φρεάτια στα τρία πειράματα.

Δοκιμασία Βιωσιμότητας Κυττάρων

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 3 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκα 96 φρεατίων (Βϋ Bioscience). Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της τριόλης για 48 ώρες ή 96 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με ΜΤΤ (3,4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2-5-βρωμιούχο διφαινυλοτετραζόλιο) δοκιμασία [29]. Η ποσότητα της φορμαζάνης προσδιορίσθηκε με μέτρηση της απορρόφησης στα 560 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας Tecan GENIOS ™ (ομάδα Tecan Ltd, Männedorf, Ελβετία) [29]. Όλα τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν με τη μέση του κατάσταση ελέγχου (χωρίς θεραπεία τριόλη) σε κάθε πείραμα. Το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Κάθε φορά δέκα φρεάτια χρησιμοποιήθηκαν για κάθε κατάσταση. Η μέση και τυπική απόκλιση αντιπροσωπεύονται τα αποτελέσματα από όλα τα 30 φρεάτια στα τρία πειράματα.

Ροή Ανάλυση κυτταρομετρίας

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

5 κύτταρα σε 10- cm πιάτα σε 10 mL μέσου και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες πριν από την προσθήκη της τριόλης. Μετά από 48 ώρες καλλιέργειας στην παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων της τριόλης, κύτταρα αφαιρέθηκαν με θρυψίνη και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) όλη τη νύχτα στους -20 ° C. Σταθερή κύτταρα πλύθηκαν με PBS, κατεργάστηκαν με 0,1 mg /mL RNase Α σε PBS για 30 λεπτά, και στη συνέχεια εναιωρήθηκε σε PBS που περιείχε 50 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου. προφίλ κυτταρικού κύκλου και οι κατανομές προσδιορίσθηκαν με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής των κυττάρων χρησιμοποιώντας μια ροή BD FACScan κυτταρόμετρο (BD Biosciences). Η κατανομή κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ΜΕ, USA) όπως περιγράφεται [10], [23], [24], [26], [27].

Soft άγαρ αποικίας Δοκιμασία σχηματισμού

PC-3 και LNCaP CDXR-3 κύτταρα (8 χ 10

3) αιωρήθηκαν σε 0,3% αγαρόζη χαμηλού σημείου τήξεως (Lonza, Allendale, NJ, USA) που περιέχει ϋΜΕΜ με 10% FBS ή 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FBS (CS-FBS), αντίστοιχα, και στη συνέχεια, σε επίπεδα πάνω από 3 ml στερεοποιήθηκε 0,5% αγαρόζη χαμηλού σημείου τήξεως που περιέχουν μέσο ϋΜΕΜ με 10% FBS (PC-3) ή 10% CS-FBS ( CDXR-3) σε 6 πιάτα cm. Τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν στους 37 ° C με 5% CO2 για 14 ημέρες (PC-3) ή 17 ημέρες (CDXR-3). Οι πλάκες βάφτηκαν με 0,005% κρυσταλλικό ιώδες σε 30% αιθανόλη για 6 ώρες για να ανιχνεύσει τις αποικίες των κυττάρων.

TUNEL Δοκιμασία

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν πάνω σε λουρίδες κάλυψης σε 24 φρεάτια και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 20, και 40 μΜ τριόλη για 48 ή 96 ώρες. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν δύο φορές με PBS και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία TUNEL χρησιμοποιώντας ApoAlert DNA κατακερματισμός Assay Kit (αρ. Καταλόγου 630108 από την Clontech, Mountain View, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι TUNEL-χρωματισμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν με την Olympus ομοεστιακό μικροσκόπιο σε 200 × (FV300, η ​​Olympus, Tokyo, Japan).

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις ο Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (Ταϊβάν). Το πρωτόκολλο εγκρίθηκε από την Εθνική Επιτροπή Ερευνών Υγείας Ιδρύματα φροντίδας ζώων και τη χρήση (NHRI-IACUC-101046-Α). Τα ποντίκια κρατήθηκαν υπό ελεγχόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες (22 ° C, 12 ώρες εναλλαγής φωτός-σκότους, 50% υγρασία, τα τρόφιμα και νερό κατά βούληση). Αναισθησία (ισοφλουράνιο 1%) χορηγήθηκε για τη μείωση του πόνου σε ποντίκια κατά την διάρκεια ενοφθαλμισμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. φροντίδα των ζώων έγινε σύμφωνα με τις τυποποιημένες κατευθυντήριες γραμμές ηθικά (Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας «Οδηγός για τη φροντίδα και τη χρήση των πειραματόζωων» και Κλινική ιατρική των εργαστηριακών ζώων (Κ Hrapkiewicz, L. Medina, και DD Holmes, 1998, Iowa State University Press). το πείραμα σχεδιάστηκε για να ελαχιστοποιηθεί ο αριθμός των άτριχων ποντικών που χρησιμοποιήθηκε.

Ξενομοσχεύματα όγκου σε αθυμικούς ποντικούς

Τα πειράματα αφορούν ποντίκια εγκριθεί από την Εθνική Έρευνα Υγείας Ινστιτούτα Θεσμικών φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση ( NHRI-IACUC-101046-Α). Αρσενικά Balb /c ηυ /ηυ ποντίκια (NCI Frederick, MD), ηλικίας 6-8 εβδομάδων, δέχθηκαν υποδόρια ένεση σε αμφότερες τις πλευρές με 5 × 10

5 PC-3 κύτταρα αιωρούνται σε 0,5 ml του Matrigel (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA). η παρακολούθηση της ανάπτυξης του όγκου άρχισε μία εβδομάδα μετά τον εμβολιασμό του όγκου. τα ποντίκια χωρίστηκαν σε ομάδες ελέγχου και θεραπείας. 5 ποντίκια που φέρουν 10 όγκους περιλάμβανε την ομάδα ελέγχου και 5 ποντίκια μεταφέρουν 8 όγκους περιλάμβανε την ομάδα αγωγής. Τρεις εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό του PC-3 κύτταρα, οι ποντικοί στην ομάδα θεραπείας υποβλήθηκαν σε αγωγή από το στόμα 5 ημέρες /εβδομάδα με 20 mg /kg τριόλη. Η τριόλη χορηγήθηκε σε ένα όχημα που περιείχε 1% Tween 20, 25% διμεθυλοσουλφοξείδιο σε PBS. Οι ποντικοί της ομάδας ελέγχου καθετηριάστηκαν με μόνο όχημα. θεραπεία τριόλη ξεκίνησε 21 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των κυττάρων και συνεχίστηκε για 21 ημέρες. Οι όγκοι μετρήθηκαν εβδομαδιαία χρήση δαγκάνες και ο όγκος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον όγκο τύπο = μήκος Χ πλάτος Χ ύψος Χ 0,52 [7], [21] – [23].

λουσιφεράσης-ρεπόρτερ Δοκιμασία

κύτταρα PC-3 σπάρθηκαν σε 2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε μία πλάκα 12 φρεατίων σε ϋΜΕΜ που περιείχε 10% FBS. 24 ώρες μετά την επίστρωση, τα κύτταρα PC-3 διαμολύνθηκαν με πλασμίδιο λουσιφεράσης ρΡΙ_-ΤΚ-Renilla (διάνυσμα ομαλοποίηση? 5 ng /φρεάτιο), pSG5RXRα και pSG5LXRα (400 ng /φρεάτιο), 4xDR4Δ56cfos pGL3 (διάνυσμα γονιδίου αναφοράς? 500 ng /φρεάτιο ) χρησιμοποιώντας το Polyjet ™ in vitro αντιδραστηρίου επιμόλυνσης DNA (SigmaGen Laboratories, Rockville, MD, USA). 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις τριόλης ή T0901317. Μετά επιπλέον 24 ώρες, τα κύτταρα λύθηκαν σε 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως παθητική (Promega, Madison, WI, USA) και η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ Dual-Luciferase (Promega) σε ένα 20/20

n φωτόμετρο Turner Biosystems .

Western Blotting Ανάλυση

δείγματα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης SDS (240 mM τρις-οξικό, 1% SDS, 1% γλυκερόλη, 5 mM EDTA ρΗ 8.0, 0.1 mM διθειοθρεϊτόλη) που περιέχει οι αναστολείς πρωτεάσης 1 mM 4- (2-αμινοαιθυλο) βενζολοσουλφονυλο φθορίδιο (AEBSF), 0.8 μΜ απροτινίνης, 40 μΜ βεστατίνης, 14 μΜ Ε-64, 20 μΜ leupeptin, 15 μΜ πεπστατίνη Α (Sigma-Aldrich, P8340) και το φωσφατάση αναστολείς cantharidin, bromotetramisole και μικροκυστίνης LR (Sigma-Aldrich, P2850). Δείγματα ιστοί παρασκευάστηκαν από ιστό ομογενοποιείται σε 2 χ Laemmli ρυθμιστικού διαλύματος όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7], [21] – [24]. Η έκφραση των πρωτεϊνών που περιλαμβάνουν Akt1, Skp2, φωσφο-Ακί Ser473, φωσφο-Akt Thr308, ΡϋΚ1, φωσφο-ρ44 /42 ΜΑΡΚ Thr202 /Tyr204, CDK2, CDK6, συνθάσης λιπαρού οξέος (FASN), GSK-3α, η GSK-3β, Rb , κυκλίνη Β1, κυκλίνη D1, φωσφο-ρ38 ΜΑΡΚ Thr180 /Tyr182, φωσφο-ΡϋΚ1 Ser241, φωσφο-Rb Ser780, FAK και ΜΜΡ9 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA). E-cadherin, N-cadherin, και ρ27

Kip1 αντισώματα ήταν από Βϋ Biosciences (San Jose, CA, USA). Αντισώματα για την ανίχνευση του c-myc, κασπάσης 3, κασπάσης 8, της κασπάσης 9, ΡΤΕΝ ήταν από Epitomics (Burlingame, CA, USA). αντίσωμα Slug αγοράσθηκε από Abgent (San Diego, CA, USA). Vimentin αντίσωμα ήταν από Θέρμο (Waltham, Μασαχουσέτη, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Τα αντισώματα έναντι Akt1, Akt2, Akt3, Bcl-2, ρ53, CDK4, ΝΡ-κΒ, κυκλίνη Α, κυκλίνη Ε1, Ε2 κυκλίνης, E2F-1, φωσφο-GSK-3α Ser21, φωσφο-GSK-3β Ser9, φωσφο- c-Myc Thr58 /Ser62, φωσφο-ΡΤΕΝ Ser385, φωσφο-ΡΑΚ Ser722, φωσφο-ΡΑΚ Tyr861, και α-τουμπουλίνης ήταν από την Millipore (Billerica, ΜΑ, USA). Αντισώματα ανίχνευσης α-τουμπουλίνης, β-ακτίνη, GAPDH και αγοράστηκαν από Novus (Littleton, CO, USA). Αντισώματα για Skp2, p21

ΠΑΚ, και ρ27

Kip ήταν από την Santa Cruz (Dallas, TX, USA). Υπεροξειδάση χράνου-συζευγμένο αντι-κουνελιού και αντι-ποντικού IgG δευτερογενή αντισώματα ήταν από την Santa Cruz. Το σήμα του ραφανιδική υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα σημασμένα ανιχνεύθηκε με ενισχυμένη αντίδραση χημειοφωταύγεια (ECL κιτ ανίχνευσης Western Blotting) (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ, USA). GAPDH, α-τουμπουλίνης, και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης.

μικρο-Δυτικής Arrays

CDXR-3 και DU-145 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα (DMSO) ή 10 μΜ τριολικό για 48 ώρες. Μικρο-Western Arrays διεξήχθησαν για να μετρηθεί η έκφραση της πρωτεΐνης και την τροποποίηση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17], [18], [20], [24].

Skp2 υπερέκφραση σε κύτταρα PC-3

η έκτοπη έκφραση του Skp2 επιτεύχθηκε με μόλυνση PC-3 κυττάρων με ένα ρετροϊό που παράγεται από το πλασμίδιο που περιέχει LPCX αγρίου τύπου ανθρώπινο Skp2 cDNA όπως περιγράφεται [10]. Πουρομυκίνη ανθεκτικές αποικίες επεκτάθηκαν και ελέγχθηκαν για αυξημένη έκφραση της πρωτεΐνης Skp2 με ανάλυση κηλίδας Western. PC-3 κύτταρα μολυσμένα με ένα άδειο ρετροϊό LPCX χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες [10]. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό Laemmli χωρίς βρωμοφαινόλης μπλε χρωστική ουσία.

πραγματικού χρόνου ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

RNA εκχυλίστηκε από τα PC-3 και DU-145 κύτταρα κατεργασμένα με 0, 10, και 20 μΜ τριόλη για 48 ώρες με τη χρήση του RNeasy MINIKIT (cat. Νο 74104, Qiagen, Venlo, Ολλανδία) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το γονιδιωματικό DNA απομακρύνθηκε με DNase-on-στήλη θεραπεία που παρέχεται με το μίνι κιτ. Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε φασματοφωτομετρικά στα 260 nm. Ίσες ποσότητες RNA χρησιμοποιήθηκαν στις αντιδράσεις σύνθεσης cDNA χρησιμοποιώντας την αντίστροφη μεταγραφής του SystemRevertAid ™ Η Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas /Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ, USA). Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7], [8], [21] – [23], [28] χρησιμοποιώντας SYBR Green σύστημα /«αντιδραστήρια σε ένα οπτικό δίσκο και την ποδηλασία συνθήκες των 96 φρεατίων που αποτελείται από 2 λεπτά στους 50 ° C, 10 min st 95 ° C, 40 κύκλοι των 15 sec στους 95 ° C, και 60 sec στους 60 ° C σε ένα σύστημα ΑΒΙ Prism (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Οι αλληλουχίες των εκκινητών για την ΑΤΡ-δέσμευσης μεταφορέα κασέτας Α1 (ABCA1) ήταν TGTCCAGTCCAGTAATGGTTC (προς τα εμπρός) και AAGCGAGATATGGTCCGGATT (reverse). Το επίπεδο μεταγραφής του ABCA1 προσδιορίστηκε σε PC-3 και DU-145 κύτταρα μετά από επεξεργασία με 0, 10, και 20 μΜ τριόλη επί 48 ώρες και ομαλοποιήθηκε σε επίπεδα GAPDH σε κάθε δείγμα.

Transwell δοκιμασία μετανάστευσης

δοκιμασίες μετανάστευση με PC-3 κύτταρα πραγματοποιήθηκαν με κιτ transwell από BD Bioscience (αριθμός καταλόγου 353097). PC-3, DU-145, και τα κύτταρα CDXR-3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 10, και 20 μΜ τριόλη για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια απομακρύνθηκαν από πλακίδια καλλιέργειας ιστού με τρυψίνη και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Η τριόλη-κατεργασμένα κύτταρα (1 χ 10

4) σε 250 μΐ DMEM χωρίς ορό τοποθετήθηκαν στον άνω θάλαμο εισβολή και το κάτω διαμέρισμα φορτώθηκε με ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS. Ο θάλαμος κυτταρική μετανάστευση εισήχθη εντός του κάτω διαμερίσματος και επωάστηκαν για 6 είτε (PC-3, DU-145) ή 24 (CDXR-3) ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα στο επάνω μέρος του φίλτρου απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα. Τα κύτταρα που συνδέονται με το φίλτρο στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη για 10 λεπτά. Τα κύτταρα που συνδέονται με το φίλτρο στη συνέχεια βάφτηκαν με χρώση Giemsa (5%) για 1 ώρα. Τα φίλτρα απο-χρωματίστηκαν με πλύσιμο με νερό και ο αριθμός των κυττάρων που συνδέονται με το φίλτρο κατόπιν ποσοτικά με απαρίθμηση κυττάρων σε φωτογραφίες των χρωματισμένων φίλτρων.

Transwell Δοκιμασία Invasion

Μία δοκιμασία εισβολή με κύτταρα PC-3 πραγματοποιήθηκε με μειωμένη θαλάμους αυξητικό παράγοντα BD Biocoat Matrigel εισβολής (BD Biosciences) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της τριόλης για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Κύτταρα από κάθε συνθήκη σπάρθηκαν σε 4 Χ 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε ϋΜΕΜ ελεύθερο ορού στο άνω διαμέρισμα, και μέσο DMEM με 10% FBS τοποθετήθηκε στο κάτω διαμέρισμα του θαλάμου ως χημειο-προσελκυστικό. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα μη-εισβάλλοντα κύτταρα επί της άνω πλευράς του θαλάμου απομακρύνθηκαν και οι μεμβράνες σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη, εκπλύθηκαν και χρωματίστηκαν με διάλυμα Giemsa του. Διηθητικότητα αξιολογήθηκε μετρώντας τα εισβάλλοντα κύτταρα κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Επούλωση Δοκιμασία

CDXR-3 κύτταρα προεπεξεργασμένα με 0, 10, και 20 μΜ τριόλη για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια απομακρύνθηκαν από πλακίδια καλλιέργειας ιστού με τρυψίνη και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια συγκέντρωση 3.5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 12 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, μία δοκιμασία επούλωσης πληγών διεξήχθη με απόξεση των κυττάρων με 200 μΙ ρύγχος πιπέτας. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν σε 0, 8, και 24 ώρες μετά την απόξεση και φωτογραφήθηκαν με ένα ζωντανό μικροσκόπιο απεικόνισης (Leica AF 6000 LX, Leica, Wetzlar, Germany). Η απόσταση μετανάστευσης μετρήθηκε αυτόματα από το πρόγραμμα μέσα ζώντων μικροσκόπιο απεικόνισης.

Ομοεστιακή Μικροσκοπία

CDXR-3 και DU-145 κύτταρα κατεργάστηκαν με 0 ή 10 μΜ τριόλης για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν 3 φορές με ρυθμιστικό διάλυμα PBS για 5 λεπτά ανά πλύση σε θερμοκρασία δωματίου (RT), μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά σε RT, και ξεπλένονται με PBS 3 φορές για 5 λεπτά ανά πλύση και διαπερατά για 10 λεπτά σε RT με 0,1% Triton Χ-100 σε PBS. Τα κύτταρα αποκλείστηκαν για μη ειδική σύνδεση πρωτεΐνης με 2% αλβουμίνη βόειου ορού σε PBS για 30 λεπτά, ξεπλύθηκαν με PBS τρεις φορές για 5 λεπτά η κάθε μία. Τα κύτταρα επωάστηκαν με β-ακτίνη ή αντίσωμα α-τουμπουλίνης για μία ώρα. Μετά την πλύση, τα κύτταρα επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με FITC για μία ώρα. Μετά την πλύση, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε θερμοκήπιο slides και σφραγίζεται με Permount. Εικόνες από κύτταρα παρατηρήθηκαν με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο της Olympus σε 400 × (οφθαλμικό φακό 10 ×? Αντικειμενικό φακό 40 ×). (FV300, η ​​Olympus, Tokyo, Japan)

Ανάλυση Δεδομένων

Τα στοιχεία είναι παρουσιάζονται ως μέσος όρος +/- SD τριών τουλάχιστον πειραμάτων ή είναι αντιπροσωπευτικά πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. t δοκιμή Student (two-tailed, unpaired) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της στατιστικής σημασίας των αποτελεσμάτων από τα πειράματα δοκιμασία πολλαπλασιασμού. Μια Microsoft Excel ED50V10 πρόσθετο πρόγραμμα που χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό το μισό της μέγιστης αποτελεσματικής συγκέντρωσης (ΕΚ

50).

Αποτελέσματα

Η τριόλη Καταστολής τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κύτταρα καρκίνου προστάτη

πρώτα προσπάθησαν να καθοριστεί η επίδραση της θεραπείας τριόλης στη βιωσιμότητα και τον πολλαπλασιασμό του τρία που χρησιμοποιούνται συνήθως κυτταρικές γραμμές καρκίνου ανθρώπινου προστάτη (Εικ. 1). Τα LNCaP CDXR-3 κύτταρα υποδοχέα ανδρογόνου (AR) -θετικό, υποτροπίασαν, ανεξάρτητου από ανδρογόνο κύτταρα που προέρχονται από τη γονική AR-θετικά εξαρτώμενων από ανδρογόνα LNCaP κύτταρα 104-S [27]. DU-145 και PC-3 και οι δύο είναι AR-αρνητικά ανδρογόνα-ευαίσθητο κύτταρα ιδρύθηκε από δυναμική του εγκεφάλου [30] και προθέσεις οστών [31] που προέρχεται μετάστασης, αντίστοιχα. Μία δοκιμασία ΜΤΤ και ένα Hoechst χρωστική που βασίζεται δοκιμασίες πολλαπλασιασμού έδειξαν ότι τριόλη κατέστειλε τόσο τη βιωσιμότητα των κυττάρων και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Εικ. 1). Το ανασταλτικό αποτέλεσμα επί του πολλαπλασιασμού ήταν δοσοεξαρτώμενη και αυξήθηκε με την πάροδο του χρόνου (Εικ. 1, Πίνακας S1). Η ΕΚ

50 για τριόλης στη δοκιμασία ΜΤΤ ήταν παρόμοια με την ΕΚ

50 μετράται με τη δοκιμασία Hoechst χρωστική που βασίζεται σε πολλαπλασιασμό (Πίνακας S1), υποδηλώνοντας ότι η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων ήταν υπεύθυνος για τη μείωση των βιώσιμων κυττάρων που προκαλείται από μεταχείριση τριόλης σε όλες τις τρεις ανθρώπινες προχωρημένο καρκίνο του προστάτη κυτταρικές γραμμές.

LNCaP CDXR-3, DU-145, και PC-3 προστατικά καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις της τριόλης για 48 ώρες (Α) (C) ή 96 ώρες (Β) (D). Σχετική βιωσιμότητα και σχετικό αριθμό κυττάρων των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη προσδιορίστηκε με ΜΤΤ (3,4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2-5-βρωμιούχο διφαινυλοτετραζόλιο) δοκιμασίας 96-φρεατίων (Α) (Β) και χρωστική Hoechst 33258- με βάση δοκιμασία πολλαπλασιασμού των 96 φρεατίων (Γ) (Δ), αντίστοιχα, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Οι αριθμοί των κυττάρων κανονικοποιήθηκαν για τον έλεγχο (διμεθυλοσουλφοξείδιο) του κάθε κυτταρική γραμμή. Αστερίσκο (*, **, ***) αντιπροσωπεύει στατιστικά σημαντική διαφορά (

σ

& lt? 0,05,

σ

& lt? 0,01,

σ

& lt? 0.001) μεταξύ η ομάδα θεραπείας και την ομάδα ελέγχου.

η

η τριόλη επεξεργασία ανέστειλε αποικία Σχηματισμός PC-3 και CDXR-3 κύτταρα σε μαλακό άγαρ

η θεραπεία του PC-3 και LNCaP CDXR-3 κυττάρων με 25 μΜ και 50 μΜ τριόλη ανέστειλε σημαντικά το σχηματισμό PC-3 και LNCaP CDXR-3 αποικίες σε μαλακό άγαρ, επιβεβαιώνοντας την αντικαρκινική δράση της τριόλης. DU-145 κύτταρα αναπτύχθηκαν πολύ αργά σε μαλακό άγαρ για την ανίχνευση επαρκής αποικίες για περαιτέρω ανάλυση (Εικ. 2).

PC-3 (Α) και τα κύτταρα LNCaP CDXR-3 (Β) υποβάλλεται σε επεξεργασία με 0, 10, ή 20 μΜ τριόλης για 14 και 17 ημέρες, αντίστοιχα. Η εικόνα είναι ένα αντιπροσωπευτικό αποτέλεσμα τριών βιολογικών επαναλήψεων.

Η

Η τριόλη Θεραπεία καθυστερημένη ανάπτυξη των ανδρογόνων-ευαίσθητο καρκίνο του προστάτη Ξενομοσχεύματα σε άτριχα ποντίκια

Για να προσδιορίσετε αν τριόλη θα μπορούσε να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

, πραγματοποιήσαμε μια πιλοτική μελέτη με DU-145 ξενομοσχεύματα σε γυμνά ποντίκια. Η ενδοπεριτοναϊκή (ί.ρ.) ένεση 1 mg (50 mg /kg) της τριόλης ημερησίως για 14 ημέρες προκάλεσε μείωση κατά 36% του μέσου όγκου των DU-145 ξενομοσχεύματα αναπτύσσονται σε γυμνά ποντίκια (Σχ. S1). θεραπεία τριόλη για 14 ημέρες δεν επηρέασε το βάρος του σώματος των ποντικών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να προσδιοριστεί εάν χαμηλότερες δόσεις από του στόματος τριόλης μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων PC-3 προστάτη. εμείς χορηγούνται από του στόματος τριόλης σε 20 mg /kg πέντε φορές την εβδομάδα. Από του στόματος χορήγηση 20 mg /kg τριόλης (5 φορές ανά εβδομάδα) από την 3

rd έως 6

ου εβδομάδες προκάλεσε μια μείωση κατά 65% κατά μέσο όρο όγκου του όγκου (ρ = 0,0002) στην ομάδα θεραπείας σε σύγκριση με τον όγκο του όγκου στην ομάδα ελέγχου οχήματος (Σχ. 3Α). Το σωματικό βάρος και των δύο οχημάτων και των ομάδων τριόλη επεξεργασμένο μειώθηκε σταδιακά (Εικ. 3Β). Αυτό μπορεί να οφείλεται σε cachetic επιδράσεις των PC-3 ξενομοσχεύματα. Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαίωσαν ότι η στοματική χορήγηση της τριόλης θα μπορούσε να επιβραδύνει την ανάπτυξη του προστάτη όγκων

in vivo

.

Αρσενικά Balb /c ηυ /ηυ ποντίκια, ηλικίας 6-8 εβδομάδων, δέχθηκαν υποδόρια ένεση σε και οι δύο πλευρές με 5 × 10

5 PC-3 κύτταρα αιωρούνται σε 0,5 ml Matrigel. Οι όγκοι μετρήθηκαν καθημερινά χρησιμοποιώντας καλίμπρες και ο όγκος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο όγκος = μήκος Χ πλάτος Χ ύψος × 0,52. Παρακολούθηση της ανάπτυξης του όγκου άρχισε μία εβδομάδα μετά τον εμβολιασμό του όγκου. Οι ποντικοί χωρίστηκαν σε ομάδες ελέγχου και θεραπείας. Η ομάδα ελέγχου είχε 5 ποντίκια που φέρουν όγκους 10 και η ομάδα θεραπείας είχε 5 ποντίκια που φέρουν 8 όγκους. Τρεις εβδομάδες μετά τον αρχικό εμβολιασμό, η ομάδα θεραπείας από το στόμα χορηγείται τριόλη ημερησίως σε μία δόση των 20 mg /kg, 5 ημέρες /εβδομάδα. Οι ποντικοί της ομάδας ελέγχου καθετηριάστηκαν με μόνο όχημα. Η θεραπεία άρχισε την ημέρα 22 και έληξε την 42η ημέρα μετά τον εμβολιασμό του όγκου. Οι όγκοι των όγκων δείχνονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (Α), ενώ το σωματικό βάρος ποντικών παρουσιάζονται ως μέσος ± τυπική απόκλιση (Β).

Η

Η τριόλη Θεραπεία Προκαλείται G1 του κυτταρικού κύκλου σύλληψης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη

επόμενο εκτελείται ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για να καθορίσει εάν εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη επηρεάστηκε από τριόλη. Η θεραπεία με 10 μΜ τριόλη για 48 ώρες προκάλεσε αύξηση στον πληθυσμό των κυττάρων G1 φάση και μια μείωση στην S και G2 /M φάση του πληθυσμούς LNCaP CDXR-3 και DU-145 κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχ. 4Α, 4Β). Η τριόλη στα 10 μΜ δεν επηρέασε την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου του PC-3 κύτταρα. Ωστόσο, 20 μΜ τριόλη προκάλεσε σημαντική αύξηση στο G1 και μείωση της S και G2 /M πληθυσμών των PC-3 κύτταρα (Σχ. 4C). Επομένως, η θεραπεία με 10-20 μΜ επαγόμενη τριόλη G1 κύτταρο διακοπή κύκλου σε LNCaP, DU-145, και τα κύτταρα PC-3. Δεν παρατηρήσαμε καμία αύξηση του πληθυσμού υπο-G1 σε αυτές τις τρεις γραμμές κυττάρων καρκίνου του προστάτη. Για να καθοριστεί εάν υψηλότερες συγκεντρώσεις της τριόλης θα αυξήσει τον πληθυσμό των κυττάρων σε υπο-G1, υποβάλλαμε σε αγωγή DU-145 κύτταρα με 0, 20, και 40 μΜ τριόλη (Εικ. 4D). Μείωση του πληθυσμού φάσης S και επαγωγή του πληθυσμού φάση G1 του DU-145 κύτταρα ήταν ακόμη πιο σημαντική μετά τη θεραπεία με 40 μΜ τριόλη. Ωστόσο, δεν υπήρξε σημαντική αύξηση των κυττάρων του πληθυσμού υπο-G1.

LNCaP CDXR-3 (Α) και DU-145 κύτταρα (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0 ή 10 μΜ τριόλης για 48 ώρες. PC-3 κύτταρα (C) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 10, ή 20 μΜ τριόλης για 48 ώρες. (D) DU-145 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 20, και 40 μΜ τριόλη για 48 ώρες. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Αστερίσκο (*, **, ***) αντιπροσωπεύει στατιστικά σημαντική διαφορά (

σ

& lt? 0,05,

σ

& lt? 0,01, και

σ

& lt? 0.001, αντίστοιχα) μεταξύ της ομάδας υπό θεραπεία και της ομάδας ελέγχου.

η

η θεραπεία με υψηλή συγκέντρωση τριόλη επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα προστάτη Cancer

Όπως ιωδιούχο προπίδιο ανάλυση κυτταρομετρίας ροής χρώση δεν αποτελεί αξιόπιστη μέθοδος για την ανίχνευση απόπτωσης, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμασία TUNEL για να προσδιοριστεί εάν η θεραπεία τριόλης σε υψηλότερες συγκεντρώσεις απόπτωση που επάγεται σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Εμείς αντιμετωπίζεται CDXR-3, DU-145 και PC-3 κύτταρα με 0, 20, και 40 μΜ τριόλη για 48 ή 96 ώρες. Σε συμφωνία με την κυτταρομετρία ροής δεδομένων ανάλυση, η θεραπεία με τριόλη για 48 ώρες παρήγαγε μόνο ένα μικρό πληθυσμό των αποπτωτικών κυττάρων σε όλες αυτές τις κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η θεραπεία με τριόλη για 96 ώρες με δοσοεξαρτώμενο αποτέλεσμα την αύξηση του πληθυσμού των αποπτωτικών κυττάρων σε όλες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη τρία (Εικ. 5). Παρά το γεγονός ότι η θεραπεία με 20 μΜ τριόλη για 96 ώρες μόνο ελαφρώς αύξησε τον αποπτωτικό πληθυσμό, η θεραπεία με 40 μΜ τριόλη οδήγησε σε σημαντική αύξηση στην απόπτωση σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη τρία.

LNCaP CDXR-3, DU-145 , και τα κύτταρα PC-3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0, 20, και 40 μΜ τριόλη για 48 ώρες. μορφολογία των κυττάρων προσδιορίστηκε με μικροσκοπία φωτός. δοκιμασία TUNEL διεξήχθη όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι για τον προσδιορισμό του πληθυσμού αποπτωτικό κύτταρο. Πράσινο φως φθορισμού έδειξε αποπτωτικά κύτταρα βάφονται με δοκιμασία TUNEL. Οι εικόνες προβληθούν σε 200 × με την Olympus ομοεστιακό μικροσκόπιο.

Η

μικρο-Δυτική Array αποκάλυψε σηματοδότησης Πρωτεΐνες επηρεάζεται από τριόλης Θεραπεία

Υποθέσαμε ότι τριόλη μπορεί να μειώσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων μέσω της επίδρασής της στην πρωτεΐνη δίκτυα σηματοδότησης. Προκειμένου να προσδιοριστεί τι πρωτεΐνες σηματοδότησης μπορεί να επηρεαστεί από τη θεραπεία τριόλη, χρησιμοποιήσαμε Micro-Δυτική Πίνακες (MWAs), μια δοκιμασία Western υψηλής απόδοσης κηλίδωση [17] – [20], [24], για τη διαλογή πρωτεϊνών σηματοδότησης που πλήττονται από θεραπεία με 10 μΜ τριόλη στο CDXR-3 και DU-145 κύτταρα. ΡΤΕΝ συχνά διαγράφεται στον καρκίνο του προστάτη, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότηση [32]. ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότηση διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην επιβίωση και την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη κύτταρα [32], [33]. Up-ρύθμιση του ΡΙ3Κ /Akt ενεργότητα σχετίζεται με κακή κλινική έκβαση του καρκίνου του προστάτη [34]. Χρησιμοποιήσαμε 48 αντισώματα τα οποία είναι ικανά να ανιχνεύουν πρωτεΐνες που ρυθμίζουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, την κυτταρική επιβίωση και την απόπτωση, Akt που σχετίζονται με οδούς σηματοδότησης, και αρκετές επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) δείκτες (Σχήμα S2, Πίνακας S2) για το τμήμα διαλογή MWA μας μελέτης (Εικ. 6). Οι διαφορές στο προφίλ έκφρασης πρωτεΐνης με την απουσία και παρουσία 20 μΜ τριόλης φαίνεται στο Σχ. 7. Κάθε μια από τις τρεις κυτταρικές γραμμές είχε ένα μοναδικό απόκριση έκφραση πρωτεΐνης σε τριολικό θεραπεία. Τα προφίλ πρωτεΐνης του CDXR-3 και PC-3 κύτταρα μετά από θεραπεία με 20 μΜ τριόλη ήταν περισσότερο όμοια μεταξύ τους παρά με DU-145 κύτταρα.