Αφηρημένο

Η παγκόσμια ρυθμιστική γονίδιο Ειδική ΑΤ-πλούσια αλληλουχία δέσμευσης της πρωτεΐνης-1 (SATB1) έχει αναφερθεί να προκαλεί EMT-όπως αλλαγές και να σχετίζεται με την κακή κλινική έκβαση σε πολλές μορφές καρκίνου. Η μελέτη αυτή έχει ως στόχο να αξιολογήσει κατά πόσον SATB1 επηρεάζει τις βιολογικές συμπεριφορές του καρκινώματος της ουροδόχου κύστης από μεταβατικό επιθήλιο (BTCC) και περαιτέρω διαλεύκανση αν το αποτέλεσμα αυτό λειτουργεί μέσω ενός επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) μονοπάτι. Η έκφραση του SATB1, Ε-καδερίνης (επιθηλιακό δείκτες), βιμεντίνη (δείκτες μεσεγχυματικά) σε ιστούς BTCC και των παρακείμενων noncancerous ιστούς, καθώς και σε δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης διερευνήθηκαν. Αν η έκφραση SATB1 συνδέεται με κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες ή δεν αναλύθηκαν στατιστικά. Κυττάρων εισβολή και τη μετανάστευση, κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την απόπτωση αξιολογήθηκαν σε SATB1 knockdown και υπερεκφράζεται κυτταρικές σειρές. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η έκφραση του SATB1 ήταν αξιοσημείωτα τα πάνω ρυθμισμένη τόσο σε ιστούς BTCC και στην κύστη καρκινικές κυτταρικές γραμμές με υψηλό δυναμικό μετάστασης. Τα αποτελέσματα συσχετίστηκαν επίσης με δείκτες EMT και κακή πρόγνωση των ασθενών BTCC. Επιπλέον, SATB1 επαγόμενη διεργασίες ΕΜΤ μέσω προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης, προς τα πάνω ρύθμιση καταστολείς Ε-καδερίνης (σαλιγκάρι, Slug και βιμεντίνη). SATB1 προωθείται επίσης εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, η κυτταρική εισβολή και τη μετανάστευση των κυττάρων, αλλά δεν μετέβαλε την επιβίωση των κυττάρων. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι SATB1 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης με τη ρύθμιση γονιδίων που ελέγχουν τις διαδικασίες EMT. Περαιτέρω, μπορεί να είναι ένα μυθιστόρημα θεραπευτικό στόχο για επιθετικών καρκίνων της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Wan F, Cheng C, Wang Ζ, Xiao Χ, Zeng Η, Xing S, et al. (2015) SATB1 υπερέκφραση Ρυθμίζει την ανάπτυξη και την εξέλιξη σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης μέσω της EMT. PLoS ONE 10 (2): e0117518. doi: 10.1371 /journal.pone.0117518

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Neil A. Hotchin, Πανεπιστήμιο του Birmingham, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 7, Αυγ, 2014? Αποδεκτές: 26 Δεκεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 23 του Φλεβάρη του 2015

Copyright: © 2015 Wan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έλαβαν καμία ειδική χρηματοδότηση για το έργο αυτό

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

καρκίνος της ουροδόχου κύστης (BC) είναι ένα από τα πιο κοινά κακοήθη νεοπλάσματα του επένδυση της ουροδόχου κύστης, με κατ ‘εκτίμηση 386.300 νέες περιπτώσεις και 150.200 θάνατοι από τη νόσο παγκοσμίως, ανά έτος [1]. Στην Κίνα, έχει αναφερθεί ότι η BC είναι η πιο κοινή κακοήθεια ουροποιογεννητικού, και η συχνότητα εμφάνισης της νόσου έχει αυξηθεί κατά τα τελευταία [2] δεκαετίες. Λόγω της υψηλής τοπικής υποτροπής του όγκου, την περαιτέρω εξέλιξη και απομακρυσμένες μεταστάσεις, η κακή κλινική έκβαση έχει αποδειχθεί για τους ασθενείς π.Χ., παρά τις σημαντικές βελτιώσεις στις χειρουργικές τεχνικές και επικουρική θεραπεία [3-6]. Εν τω μεταξύ, οι πολύπλοκες οδούς κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης και η απρόβλεπτη βιολογική συμπεριφορά του καρκίνου είναι ακόμη πλήρως κατανοητό και επηρεάζεται από περιβαλλοντικούς και γενετικούς παράγοντες [7]. Ως εκ τούτου, ταυτοποίηση νέων μοριακών δεικτών που θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως πρότυπο προγνωστικούς παράγοντες απαιτείται για την έγκαιρη διάγνωση και για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπείας για τους ασθενείς. Π.Χ.

Έχει γενικά παραδεκτό ότι η κακή πρόγνωση των κακοηθειών συνδέεται με επιθετικότητα του όγκου. Αυτό συμβαίνει όταν τα κύτταρα γίνονται μη επεμβατική επεμβατική μέσω διαφόρων μεταστατικό βήματα, όπως τα επιθηλιακά κύτταρα χάνουν την πολικότητα και την περαιτέρω εισβολή των αγγειακών και λεμφικών διαμερίσματα [8]. Η επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) είναι η βασική διαδικασία που λαμβάνει χώρα αρχικά σε κρίσιμα στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης στην οποία τα κύτταρα χάνουν τα επιθηλιακά τους χαρακτηριστικά και τις επαφές κυττάρου-κυττάρου, και ταυτόχρονα να αποκτήσουν μεταναστευτικών και επεμβατική ιδιότητες των μεσεγχυματικών κυττάρων [9-11]. Επιπλέον, παρόμοιες διαδικασίες ΕΜΤ-όπως θα μπορούσε να συμβεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου σε καρκινώματα και έχουν μια προώθηση ρόλο στην πρόληψη της απόπτωσης και γήρανση των κυττάρων του όγκου, που συμβάλλουν στην ανοσοκαταστολή [12]. Η απώλεια της έκφρασης Ε-καδερίνης είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της διαδικασίας EMT [9]. Και πάλι, σε πρόσφατες μελέτες, παράγοντες μεταγραφής όπως σαλιγκαριών και Slug έχουν αναγνωριστεί ως άμεσο καταστολείς της Ε-καδερίνης και επαγωγείς του EMT, το οποίο προκαλεί περαιτέρω πλήρη EMTs τόσο η μορφολογικά και συμπεριφορικές επίπεδα όταν υπερεκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα [13-15] . Επιπλέον, ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία δείχνουν ότι η EMT διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην έναρξη και την ανάπτυξη των μεταστάσεων κατά τη διάρκεια της εισβολής του όγκου και της εξέλιξης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης

in vivo

και

in vitro

[16 -18].

Ειδικά ΑΤ-πλούσιες σε πρωτεΐνη πρόσδεσης 1 (SATB1) είναι μια πυρηνική μήτρα περιοχή προσάρτησης (MAR) πρωτεΐνη δέσμευσης DNA το οποίο δρα ως οργανωτής γονιδιώματος και ρυθμιστής γονιδίου μέσω ρύθμισης της χωρικής διαμόρφωσης της χρωματίνης. Επίσης, συμμετέχει σε μια ποικιλία βιολογικά σημαντικών διεργασιών όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, την απόπτωση και τον επαναπρογραμματισμό του προφίλ έκφρασης [19-21]. Σε πρόσφατες μελέτες, η ρύθμιση προς τα άνω του SATB1 έχει βρεθεί ότι συσχετίζεται με την εισβολή και τη μετάσταση των πολλών τύπων malignances, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του στομάχου, ο καρκίνος του μαστού, ο καρκίνος του ορθού, καρκίνο του ήπατος, και του καρκίνου του προστάτη. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι SATB1 είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας και ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος σε καρκίνους του ανθρώπου [21-26]. Για παράδειγμα, Han et al βρήκαν ότι η εξάντληση SATB1 θα μπορούσε να αντιστρέψει τη διαδικασία της ΕΜΤ μέσω κάτω ρύθμιση των καταστολείς Ε-καδερίνης, όπως σαλιγκαριών και SIPI και προς τα πάνω ρύθμιση Ε-καδερίνης σε εξαιρετικά επιθετική (MDA-MB-231) τα καρκινικά κύτταρα [21] . Μια άλλη μελέτη ανέφερε ότι χημειοθεραπευτικών καταστολή του miR-448 αυξάνει τα επίπεδα του mRNA της SATB1 και προωθεί την EMT. Αυτά τα ευρήματα παρέχουν δυνητικές νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις για τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Ενώ καρκίνωμα της ουροδόχου κύστης από μεταβατικό επιθήλιο (BTCC) είναι ένα από τα πιο κοινά υπο-τύποι BC, η τρέχουσα γνώση σχετικά με τον ειδικό μηχανισμό του BTCC εισβολή και μετάσταση είναι εξακολουθεί να είναι περιορισμένη. Σε μία πρόσφατη μελέτη, Bin Han et al βρήκαν ότι SATB1 υπερεκφράστηκε σε ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης και των συναφών με το βαθμό του όγκου και το στάδιο. Επιπλέον, βρήκαν επίσης ότι η εξάντληση SATB1 μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αυξημένη κυτταρική απόπτωση σε 5637 και τα κύτταρα Τ24 [27]. Ωστόσο, το πώς η έκφραση της SATB1 επηρεάζει τη βιολογική συμπεριφορά του BTCC και αν SATB1 προκαλεί την EMT στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι ακόμα ανεξερεύνητο. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την έκφραση του SATB1 σε δείγματα BTCC και καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρικές γραμμές αν και ανοσοϊστοχημική χρώση, Real-Time RT-PCR προσδιορισμούς και στύπωση western ανάλυση και διαπίστωσε ότι η έκφρασή του συσχετίζεται με κλινικά παθολογικά χαρακτηριστικά. Σε καθορισμένες κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης, αποδείξαμε επίσης ότι υπερεκφράζεται ή σιγήσει SATB1 ρύθμιζε την κυτταρική μετανάστευση, εισβολή και πολλαπλασιασμός, μαζί με τον κυτταρικό κύκλο.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

δείγματα Πρωτοβάθμια καρκίνου της ουροδόχου κύστης και συμφωνημένα μη καρκινικούς ιστούς ελήφθησαν από 126 ασθενείς (μέση ηλικία 65,2 χρόνια, εύρος 45-78) διαγνώστηκαν με καρκίνο της ουροδόχου κύστης που υποβλήθηκαν σε χειρουργική εκτομή για ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις στο Νοσοκομείο Ένωσης στο Τμήμα Ουρολογίας (Wuhan , Κίνα) μεταξύ Απριλίου 2007 και Οκτωβρίου 2012. τμήματα των δειγμάτων ιστού μονιμοποιήθηκαν σε φορμόλη και ενσωματωμένο σε παραφίνη. Όλοι οι ασθενείς δεν έλαβαν προεγχειρητική θεραπεία, όπως χημειοθεραπεία ή ακτινοβολία. Όλοι οι συμμετέχοντες έδωσαν γραπτή συγκατάθεση τους να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη και η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Νοσοκομείου Ένωσης, Tongji Medical College, Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας (HUST). Κλινικές και παθολογικές πληροφορίες που λαμβάνονται από μια αναδρομική ανασκόπηση των καλά τεκμηριωμένες ιατρικά αρχεία. Οι όγκοι είχαν ταξινομηθεί ιστολογικά ως μη διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (NMIBC) (στάδιο PTA) ή των μυών διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (MIBC) (στάδιο ρΤ3) σύμφωνα με όγκο κόμβους-μετάσταση (TNM) ταξινόμηση για το στάδιο [28]. Βαθμολογία ανατέθηκε σύμφωνα με την ταξινόμηση των όγκων του ουροποιητικού συστήματος και ανδρικών γεννητικών οργάνων (2004) [28] του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας. Όλοι οι θάνατοι οφείλονταν σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Τα χαρακτηριστικά των ασθενών που περιγράφονται στον Πίνακα 1. Ανθρώπινα καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρικές σειρές BIU-87 και Τ24 διατηρήθηκαν στο εργαστήριο μας (Κεντρικό Εργαστήριο του Νοσοκομείου Ένωσης, Tongji Medical College, HUST, Wuhan, Κίνα). BIU-87 κύτταρα προέρχονται από ένα βαθμού II, μη-διηθητικό (ρΤ1) ανθρώπινο BTCC της ουροδόχου κύστης. κύτταρα Τ24, η οποία είναι ελάχιστα διαφοροποιημένα και διαθέτουν ένα υψηλότερο δυναμικό της μετάστασης και να εμφανίσει ένα τυπικό ινοβλαστική μορφολογία μικροσκοπικά προήλθαν από ένα καρκίνωμα της ουροδόχου κύστης βαθμού III [29]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 100 μg /ml πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Gibco, Carlsbad, CA, USA), και επωάστηκαν με υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2 στους 37 ° C.

η

ανοσοϊστοχημική χρώση ανάλυση

έκφραση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση για SATB1, E-caderin και βιμεντίνης, με την στρεπταβιδίνη βιοτίνης-υπεροξειδάσης μέθοδο χρησιμοποιώντας SABC κιτ (Boster Ltd., Wuhan, Κίνα) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα δείγματα ιστού σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη, αφυδατώθηκαν και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Στη συνέχεια, οι τομές αποπαραφινώθηκαν και επανυδατώθηκαν. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου εφαρμόστηκε για να εμποδίσει την ενδογενή δραστηριότητα του υπεροξειδίου για 10 λεπτά. Μετά ανάκτηση αντιγόνου χρησιμοποιώντας έναν φούρνο μικροκυμάτων, τα τμήματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να μειωθεί η μη ειδική ικανότητα σύνδεσης. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού SATB1, E-caderin και βιμεντίνης (Abcam Inc., Cambridge, ΜΑ, USA) σε αραίωση 1:70. Αυτά αφέθηκαν σε υγροποιημένο θάλαμο επί μία νύκτα στους 4 ° C. Μετά από πλύση τρεις φορές με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) για 5 λεπτά κάθε φορά, οι τομές επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα για 40 λεπτά και στη συνέχεια με Στρεπταβιδίνη βιοτίνης-υπεροξειδάσης για 40 λεπτά στους 37 ° C. Μετά την έκπλυση, διαμινοβενζιδίνη (DAB? Abcam Inc., Cambridge, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο και οι τομές με αιματοξυλίνη. Δείγματα επωάστηκαν με PBS αντί του πρωτογενούς αντισώματος χρησίμευσαν ως αρνητικοί έλεγχοι. SATB1staining στο πυρηνικό ορίστηκε ως ανιχνεύσιμη ανοσοαντιδράσεις και E-caderin και χρώση βιμεντίνη σε πλασμαλήμμα ή κυτταρόπλασμα ορίστηκε ως ανιχνεύσιμη ανοσοαντιδράσεις. Η θετική χρώση βαθμολογήθηκε με βάση την ένταση και το ποσοστό των κυττάρων με πυρηνική χρώση SATB1. Σύμφωνα με την επικρατούσα ένταση, η ένταση χρώσης ήταν δηλώνεται στην ακόλουθη κλίμακα: 0 στείλει, αρνητικά πυρηνική χρώση για όλα τα καρκινικά κύτταρα? θα σκοράρει 1, ασθενής πυρηνική χρώση? σκοράρει 2, μέτρια πυρηνική χρώση? βαθμολογία: 3, ισχυρή πυρηνική χρώση. Σύμφωνα με το ποσοστό των θετικώς χρωματισμένων κυττάρων, η βαθμολογία της χρώσης πυκνότητα δόθηκε ως ακολούθως: 0, λιγότερο από 5%? 1, 5 έως 25%? 2, 25 έως 50%? 3, περισσότερο από 50%. Το τελικό σκορ ήταν υπολογίζονται με την προσθήκη των δύο παραπάνω αποτελέσματα. Οι βαθμολογίες 0-2 ορίστηκαν ως χαμηλές βαθμολογίες έκφραση, και 3-6 ορίστηκαν ως υψηλά σκορ.

εκχύλιση RNA και ποσοτικές αναλύσεις PCR πραγματικού χρόνου

Το συνολικό RNA εκχυλίζεται και καθαρίζεται από Κάθε δείγμα ιστού και κυτταρικές γραμμές με χρήση του αντιδραστηρίου ΤπζοΙ (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ αντίστροφης μεταγραφής (Takara Biotechnology Dalian, Κίνα) με τους ακόλουθους όρους: αντίστροφη μεταγραφή στους 37 ° C για 25 λεπτά, ακολουθούμενη από επώαση στους 85 ° C για 5 sec σε 20 μΐ όγκου αντίδρασης. Στη συνέχεια, το cDNA παρασκευάστηκε και χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπο για ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (ΡΤ-PCR) πραγματοποιήθηκε σε ένα ΑΒΙ StepOnePlus PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) χρησιμοποιώντας το SYBR Green Σε πραγματικό time PCR Master Mix (Takara Clontech, Κιότο, Ιαπωνία). Αυτό έγινε με τις ακόλουθες συνθήκες: μετουσίωση στους 95 ° C για 30 δευτερόλεπτα, ακολουθούμενη από 40 κύκλους ενίσχυσης (95 ° C για 5 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας NCBI Primer-BLAST ως εξής: SATB1 (προς τα εμπρός, 5′-GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3 ‘? Αντίστροφη, 5′-CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3′), Ε-καδερίνης (προς τα εμπρός, 5’-CTG GACGCTCGGCCTGAAGT-3 ‘? Αντίστροφη , 5’-GGGTCAGTATCAGCCGCTTT-3 ‘), βιμεντίνη (προς τα εμπρός, 5′-ACAGGCTTTAG CGAGTTATT-3′? αντίστροφη, 5’-GGGCTCCTAGCGGTTTAG-3 ‘), Twist (προς τα εμπρός, 5′-CAGCGCACCCAGTCGCTGAA-3’? αντιστραφεί, 5 ‘ -CCAGGCCCCCTCCATCCTCC-3 ‘), σαλιγκάρι (προς τα εμπρός, 5′-ATCCGAAGCCACACGCTGCC-3′? αντίστροφη, 5’-CACGGCTGCAGTGGGGACAG-3 ‘), Slug (προς τα εμπρός, 5′-CGCTCCTTCCTGGTCAAGA-3′? αντίστροφη, 5’-TTGCGTCACTCAGTGTGC-3 ‘), ZEB1: (προς τα εμπρός, 5′-TGCTCCCTGTGCAGTTACACCTT-3′? αντίστροφη, 5’-CCAGACTGCGTCACATGTCTTTGA-3 ‘), ZEB2: (προς τα εμπρός, 5′-ATACCGCGGTGCCATCCTTGTACAGTGGTT-3′? αντίστροφη, 5’-GCGCTGCAGAGTAATTGGAAAAAAACAAA-3 ‘) , GAPDH (προς τα εμπρός, 5’-TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ‘? αντίστροφη, 5′-TGCCATGGGTGGAATCATATTGGA-3’). Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν για να είναι εσώνια που εκτείνονται. Οι κατώφλι κύκλου (CT), οι τιμές καθορίστηκαν σε τιμές CT του GAPDH. Τα σχετικά επίπεδα των μεμονωμένων mRNA σε κάθε δείγμα μεταγραφής σε σύγκριση με τον έλεγχο GAPDH υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο.

κηλίδωση Western ανάλυση

Η ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από κάθε δείγμα ιστού και κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας RIPA ρυθμιστικό (Sigma, St Louis, ΜΟ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίζονται με BCA Protein Assay Kit (Boster Ltd., Wuhan, Κίνα). Ίσες ποσότητες που συγκομίζονται δειγμάτων πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε ηλεκτροφόρηση θειικού δωδεκυλ-πολυακρυλαμιδίου 10% γέλη (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, USA) που ακολουθείται από μπλοκάρισμα με ρυθμιστικό διάλυμα TBST που αποτελείται από 50 mM Tris (ρΗ 7,6), 150 mM NaCl, και 0,05% Tween συμπληρωμένο με 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε 4 ° C για 2 ώρες. Οι στυπώθηκαν μεμβράνες επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού SATB1, Ε-καδερίνης, βιμεντίνη (Abcam Inc., Cambridge, CA, USA) (1: 800), ZEB1, ZEB2, σαλιγκάρι και γυμνοσάλιαγκα (Santa Cruz Biotechnology Inc ., Santa Cruz, CA, USA) (1: 500). Χρησιμοποιήσαμε GAPDH (Boster Ltd., Wuhan, Κίνα) ως μάρτυρας φόρτωσης. σύνδεση αντισώματος ανιχνεύθηκε με τη χρήση συζευγμένης με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα (Boster Ltd., Wuhan, Κίνα) για άλλες 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες έγιναν ορατές με ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης στύπωσης Western ECL (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) και την ένταση των ζωνών ανιχνεύεται αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα πρόγραμμα Image J.

SATB1-knockdown κυττάρων

Ένα προηγουμένως επικυρωθεί shRNA χρησιμοποιήθηκε [21]. Η αλληλουχία του shRNA είχε ως εξής: 5′-GGATTTGGAAGAGAGTGTC-3 ‘. Η shRNA συνετέθη και κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα pGenesil2 (GenePharma Co., Ltd. Σαγκάη, Κίνα) και στη συνέχεια επιμολύνθηκε σε 50% -confluent Τ24 κυτταρική γραμμή μαζί με έναν φορέα ελέγχου pGenesil2 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 αντιδραστήριο (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή . Συγκεντρωτικά πληθυσμοί knockdown κυττάρων που ελήφθησαν μετά από δύο εβδομάδες επιλογής φαρμάκου με 400 μg /ml G418, μετά από επώαση για 24 ώρες. Στη συνέχεια, οι σταθερές RNA-παρεμβολή μεσολάβηση SATB1-knockdown κυτταρικές σειρές που ορίζονται ως pGenesil2-SATB1-shRNA και καλλιεργήθηκαν περαιτέρω για τα επόμενα πειράματα. Τ24 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με pGenesil2-ομελέτα-shRNA (5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘), η οποία δεν στοχεύει κανένα συγκεκριμένο γονίδιο χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδες ελέγχου.

SATB1-κύτταρα που υπερεκφράζουν

Το ανθρώπινο πλήρους μήκους SATB1 cDNA κλωνοποιήθηκε στον φορέα έκφρασης pcDNA3.1 αγοράστηκε από GenePharma Co., Ltd. (Σαγκάη, Κίνα). Αφού επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση του DNA, το pcDNA3.1-SATB1 φορέα έκφρασης και ελέγχου pcDNA3.1 φορέα μορφομετατράπηκαν εντός 50% -confluent κύτταρα BIU-87 χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 αντίστοιχα (Invitrogen). Μετά την επιμόλυνση, επιλέχθηκαν σταθερές κυτταρικές σειρές μετά από επώαση με 600 μg /ml του G418 σε μέσο RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου για δύο εβδομάδες. Αυτά στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για τα επόμενα πειράματα. Οι SATB1-κύτταρα που υπερεκφράζουν BIU καθορίστηκαν και τα επίπεδα έκφρασης SATB1 φαίνεται από αυτά τα κύτταρα επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας Real-Time RT-PCR ανάλυση. Μη διαμολυσμένα BIU-87 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως οι ομάδες ελέγχου.

ανοσοφθορισμού ανάλυση

Για τον προσδιορισμό πρωτεΐνης κυτταρικό εντοπισμό για SATB1 και Ε-καδερίνης, ανοσοφθορισμός χρησιμοποιώντας ένα A1Si λέιζερ σάρωσης ομοεστιακό μικροσκόπιο. Εν συντομία, BIU-87 και Τ24 κύτταρα επιμολυσμένα με pcDNA3.1-SATB1 και φορείς έκφρασης pGenesil2-SATB1-shRNA σπάρθηκαν πάνω σε γυάλινες καλυπτρίδες και τοποθετούνται σε πλάκες 24 φρεατίων. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά στους 37 ° C μετά από επώαση για 3 ημέρες, και στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS δύο φορές για 10 λεπτά το καθένα. Τα σταθερά κύτταρα διαπερατά με 0,3% Triton- Χ 100 για 15 λεπτά, αποκλείστηκε σε 10% ορό κατσίκας για 1 ώρα, και μετά πλύθηκαν με PBS δύο φορές για 10 λεπτά το καθένα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα ως εξής: πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού SATB1, και Ε-καδερίνη (Abcam Inc., Cambridge, CA, USA) (1:50) στους 4 ° C όλη τη νύκτα ακολουθούμενο από ανίχνευση με Cy5-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα και FITC-επισημασμένο φαλλοϊδίνη (5 μg /ml) (Sigma) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. DAPI χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για τη χρώση των πυρήνων. Εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon A1Si συνεστιακό λέιζερ μικροσκόπιο σάρωσης (Nikon, Ιαπωνία).

Δοκιμασίες

κυττάρων εισβολής και της μετανάστευσης in vitro

BIU και T24cells επιμολυσμένα με pcDNA3.1-SATB1 πλασμίδια, pGenesil2 φορέας που περιέχει SATB1 ειδικά shRNA καθώς και την αρνητική φορέα ελέγχου προστέθηκαν στο άνω διαμέρισμα των πλακών transwell με 6,5 mm φίλτρα πολυ-ανθρακικό και το μέγεθος 8.0μm πόρου (Corning Costar, MD, USA). Αυτό έγινε σε 100μL του μέσου χωρίς ορό και 500μL του RPMI-1640 που περιείχε 10% FBS. Για δοκιμασίες κυτταρικής εισβολής, τα ένθετα φίλτρο Transwell καλύφθηκαν με 50 μι Matrigel (BD Biosciences, NJ, USA). Μετά από επώαση για 12 ώρες στους 37 ° C, 5% CO

2 ατμόσφαιρα, τα κύτταρα του όγκου που διαπέρασε το κάτω μέρος του ενθέτου μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες (Boster Ltd., Wuhan, Κίνα) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, οι επεμβατικές χρωματισμένα κύτταρα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός σε 10 τυχαία επιλεγμένα πεδία σε 200 × μεγέθυνση. Για δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης, επιμολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν στο άνω θαλάμους χωρίς επιστρωμένο Matrigel. Μετά από επώαση για 12 ώρες στους 37 ° C, 5% CO

2 ατμόσφαιρα, τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν στην κάτω πλευρά του φίλτρου μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και στη συνέχεια μετρήθηκαν και αναλύθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Τρία πανομοιότυπα φρεάτια ελέγχθηκαν ανά δοκιμασία, και κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. Φασματοφωτόμετρο χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της οπτικής πυκνότητας στα 560 nm, και η ικανότητα του κυττάρου εισβολής υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το ποσοστό των κυττάρων που διείσδυσαν τα επικαλυμμένα με Matrigel φίλτρα.

κυτταρικού κύκλου και ανάλυση του πολλαπλασιασμού

για την επικύρωση των επιπτώσεων της SATB1 επί του κυτταρικού κύκλου, κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε σε ανάλυση το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου μετά από χρώση των κυττάρων με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (Keygentec, Κίνα) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, BIU και Τ24 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο PBS και σταθεροποιήθηκαν με 70% αιθανόλη σε πάγο. Στη συνέχεια, οι σταθερές φρεάτια βάφτηκαν με διάλυμα ΡΙ για 30 λεπτά και αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής

CCK-8 δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων (CCK-8 kit? Boster Ltd., Wuhan, Κίνα). Χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει το κύτταρο ρυθμοί ανάπτυξης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τις καθιερωμένες SATB1-knockdown κυττάρων Τ24 και SATB1 υπερεκφράζουν BIU-87 κύτταρα σε 4 × 10

3 ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε επίπεδου πυθμένα των 96 φρεατίων και επωάστηκαν για 48 ώρες στους 37 ° C, σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων, τα κύτταρα επωάστηκαν με ένα διάλυμα CCK-8 (10 μΐ /φρεάτιο) για 1,5 ώρες στους 37 ° C. Στη συνέχεια, οι τιμές απορρόφησης των καρκινικών κυττάρων μετρήθηκαν στα 450 nm σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία με χρήση αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-Rad, Tokyo, Japan). Τρία πανομοιότυπα φρεάτια ελέγχθηκαν ανά δοκιμασία, και κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

Προσδιορισμός απόπτωσης

Για την ανίχνευση των επιπτώσεων της SATB1 στην κυτταρική απόπτωση, κυτταρομετρία ροής διεξήχθη για να αναλυθεί το ποσοστό apoptotics χρησιμοποιώντας Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Keygentec, Κίνα) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, BIU και Τ24 κύτταρα επιμολυσμένα με πλασμίδια pcDNA3.1-SATB1 και του φορέα που περιέχει pGenesil2 SATB1 ειδικά shRNA καθώς και αρνητικά φορέα ελέγχου απλώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα (1×10

6) βάφτηκαν με Annexin-V και ΡΙ και αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκαν με το κιτ ανίχνευσης απόπτωσης αννεξίνης V-FITC και εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα όργανο FACSCalibur.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου (SEM). Τρία πανομοιότυπα φρεάτια ελέγχθηκαν ανά δοκιμασία, και κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. Στατιστικές συγκρίσεις μεταξύ των ομάδων καθορίζεται από

του φοιτητή t-test

. ανάλυση πολλαπλής τραπέζι πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας chi-τετράγωνο του Pearson (χ

2) δοκιμή ή την ακριβή δοκιμασία του Fisher για να αναλύσει τη σημασία των συσχετίσεων μεταξύ της έκφρασης SATB1 και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Kaplan-Meier για χρησιμοποιήθηκαν για να εκτιμηθεί η προγνωστική σημασία της SATB1 σε μια μονοπαραγοντική ανάλυση. Η πολυπαραγοντική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια δοκιμή COX αναλογικού κινδύνου. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν αμφίδρομες και η στατιστική σημαντικότητα θεωρήθηκε για την P & lt? 0.05.

Αποτελέσματα

SATB1 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε ανθρώπινους ιστούς BTCC και του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρική σειρά με υψηλό μεταστατικό δυναμικό

Για να διερευνηθεί αν η ανώμαλη έκφραση της SATB1 σχετίζεται με ανάπτυξη καρκίνου της ουροδόχου κύστης και της εξέλιξης και εμπλέκονται επίσης στην ρύθμιση EMT σε ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης, ανοσοϊστοχημεία, σε πραγματικό χρόνο RT-PCR και κηλίδωση Western αναλύσεις αρχικά εκτελείται για να προσδιορίσει την έκφραση του SATB1. Περαιτέρω χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση Ε-καδερίνης και βιμεντίνη σε 126 δείγματα ιστού του ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης, που αντιστοιχούν σε παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς και καρκίνου της ουροδόχου κύστης κυτταρικές γραμμές, αντίστοιχα. Τα επίπεδα έκφρασης του SATB1 και βιμεντίνης βρέθηκαν να είναι σημαντικά επάνω ρυθμισμένη σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε NMIBC και MIBC ιστούς σε σύγκριση με εκείνες στις αντίστοιχες παρακείμενες μη νεοπλαστικές δείγματα (Σχήμα 1Α και C?. * Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt ? 0.001). Βρήκαμε επίσης ότι υπήρχαν αξιοσημείωτες μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης του SATB1 και βιμεντίνης μεταξύ NMIBC και MIBC ιστούς, η οποία αποκάλυψε ότι MIBC ιστοί έδειξαν υψηλότερα επίπεδα SATB1 και βιμεντίνης από ότι σε ιστούς NMIBC (Εικ 1Α και C?. * Ρ & lt? 0.05). Τα επίπεδα έκφρασης του SATB1 RNA και πρωτεΐνη ήταν σημαντικά υψηλότερα σε μεταστατική κυτταρική γραμμή όγκου (Τ24) από ότι στις μη μεταστατική κυτταρική γραμμή όγκου (BIU-87) (Εικ 1Α και C?. ** Ρ & lt? 0.001), προτείνοντας SATB1 έκφραση συσχετίστηκε με την επιθετική φαινοτύπους όγκου. Επιπλέον, η έκφραση της βιμεντίνης ήταν εντυπωσιακά ρυθμίζεται αυξητικά στα επίπεδα του RNA και της πρωτεΐνης στην κυτταρική σειρά Τ24 σε σύγκριση με εκείνους σε κυτταρικές γραμμές BIU-87 (Σχήμα 1Α και C?. * Ρ & lt? 0,05). Αντίθετα, η έκφραση Ε-καδερίνης ήταν αξιοσημείωτα χαμηλή ή χάνονται σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης σε NMIBC ιστούς, οι ιστοί MIBC και υψηλού μεταστατικού Τ24 κυτταρική γραμμή όγκου αλλά σημαντικά υψηλό σε αντίστοιχες παρακείμενες μη νεοπλασματικά δείγματα και τη γραμμή BIU-87cell (Εικ. 1Α και Γ? * P & lt? 0.05, ** P & lt? 0.001). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν από την ανάλυση χρώσεως ανοσοϊστοχημείας για τον εντοπισμό SATB1, Ε-καδερίνης και βιμεντίνης, η οποία έδειξε ότι ήταν κυρίως SATB1 εντοπισμένη στους πυρήνες του ιστού καρκίνου της ουροδόχου κύστης, με χαμηλή ανοσοδραστικότητα σε φυσιολογικούς ιστούς ουροδόχου κύστης (Σχ. 1Β). Ωστόσο, βιμεντίνη βρέθηκε να βάφονται κυρίως στην πλασμαλήμμα ιστών καρκίνου της ουροδόχου κύστης, με απώλεια ή χαμηλής χρώσης Ε-καδερίνης (Εικ. 1Β). Μεταξύ των ασθενών πρωτοπαθή καρκίνο της ουροδόχου κύστης με θετική έκφραση SATB1 εμφανίζονται τα χαμένα ή χαμηλή έκφραση Ε-καδερίνης, αλλά υψηλή έκφραση vimentin. Σε αντίθεση, SATB1-αρνητικούς ασθενείς εμφάνισαν ισχυρή χρώση E-cadherin, αλλά μια ελαφριά χρώση βιμεντίνη (Εικ. 1D), γεγονός που υποδηλώνει μια ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ SATB1 και των δεικτών EMT στο BTCC.

Εκφράσεις των επιπέδων mRNA του SATB1, Ε-καδερίνη και βιμεντίνη σε ιστούς καρκινώματος ανθρώπινης κύστης και δύο κυτταρικές σειρές καρκινώματος ουροδόχου κύστης αξιολογήθηκαν με ποσοτική RT-PCR (Α? * Ρ & lt? 0,05, ** Ρ & lt? 0.001). IHC χρώση των ιστών ανθρώπινου καρκινώματος της ουροδόχου κύστης και των αντίστοιχων γειτονικών μη-καρκινικούς ιστούς για SATB1, Ε-καδερίνη και βιμεντίνη διεξήχθη. χρώση SATB1 παρατηρήθηκε στους πυρήνες των κυττάρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης, βιμεντίνη βρέθηκε να βάφονται κυρίως στην πλασμαλήμμα των καρκινικών κυττάρων κύστης, αλλά χρώση Ε-καδερίνης παρατηρήθηκε κυρίως σε πλασμαλήμμα του μη καρκινικών κυττάρων ουροδόχου κύστης (Β)? δείγματα καρκίνου της ουροδόχου κύστης με SATB1 θετικά βάφτηκαν με vimentin αλλά όχι E-cadherin. Ωστόσο, τα δείγματα όγκου με SATB1 αρνητικά βάφτηκαν με Ε-καδερίνης αλλά όχι βιμεντίνη (D). Η αρχική μεγέθυνση ήταν χ 400Χ (Β και D). Τα επίπεδα πρωτεΐνης του SATB1, Ε-καδερίνης και βιμεντίνης εξετάστηκαν με κηλίδα western (C). Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν S.E.M., η = 3 πειράματα.

Η

Η υπερέκφραση του SATB1 συνδέεται με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους και συσχετίζεται με κακή πρόγνωση

Οι σχέσεις μεταξύ της έκφρασης SATB1mRNA και κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες ερευνήθηκαν. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, η υψηλή έκφραση του SATB1 συσχετίστηκε σημαντικά με την ηλικία (≥55 vs. & lt? 55, ρ = 0,034), τα πρωτογενή βάθος του όγκου της εισβολής (Τ1 + Τ2 εναντίον Τ3 + Τ4, Ρ & lt? 0.001), ΤΝΜ στάδιο (στάδια Ι + ΙΙ έναντι των σταδίων III + IV, Ρ = 0,015), την παρουσία του λεμφαδένα μετάσταση (Ρ = 0,013) και παρουσία μακρινή μετάσταση (Ρ = 0,012). Ωστόσο, δεν εντοπίστηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ υψηλή έκφραση SATB1 και είτε το φύλο (αρσενικό εναντίον των γυναικών, P = 0,143) ή της διαφοροποίησης του όγκου (G1 εναντίον G2 + G3, P = 0,111). Η ανάλυση Kaplan-Meier διεξήχθη για να προσδιοριστεί η προγνωστική σημασία του SATB1. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2, η ανάλυση αποκάλυψε μια συσχέτιση μεταξύ υψηλότερα επίπεδα SATB1expression και μικρότερους χρόνους συνολική επιβίωση (P & lt? 0.001). Επιπλέον, πολυπαραγοντική ανάλυση παλινδρόμησης Cox επιβεβαίωσε ότι η έκφραση SATB1 είναι ένας σημαντικός και ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για την ανθρώπινη κύστη μεταβατικό καρκίνωμα κυττάρου μετά την προσαρμογή για τους άλλους παράγοντες, όπως φαίνεται στον Πίνακα 2 (Ρ = 0,005).

Το 5 χρόνια συνολικό ποσοστό επιβίωσης σε ασθενείς με υψηλή έκφραση SATB1 ήταν σημαντικά χειρότερες από εκείνες με χαμηλή έκφραση SATB1 (P & lt? 0,001? δοκιμασία log-rank)

Η

έκτοπη έκφραση SABT1 προκαλεί EMT σε μια καθιερωμένη. ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου, αυξάνοντας επεμβατική ικανότητα

Προηγούμενες μελέτες τους έχουν συνδέσει SATB1expression με επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) [21,24]. Για να ελεγχθεί αν η έκτοπη έκφραση του SATB1 θα μπορούσε να προκαλέσει EMT σε μη μεταστατικά κύτταρα όγκου, η κύστη κυτταρική σειρά καρκίνου του ανθρώπου (BIU-87) με πολύ χαμηλή έκφραση SATB1 επιμολύνθηκε με τα πλασμίδια έκφρασης pcDNA3.1-SATB1 η δημιουργία ενός σταθερού SATB1 υπερεκφράζουν κυτταρική γραμμή, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα της πραγματικού χρόνου RT-PCR και κηλίδωση Western έδειξε ότι SATB1 mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης των επιμολυσμένων ομάδα αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με την μη επιμολυσμένων ομάδα και τον έλεγχο των φορέων-επιμολυσμένα ομάδα (σχήμα 3Α?. ** Ρ & lt? 0.001). Ωστόσο, δεν υπήρχαν αξιοσημείωτες αλλαγές στην έκφραση του SATB1 στην ομάδα φορέα επιμολυσμένα ελέγχου και μη επιμολυσμένων ομάδα (Ρ & gt? 0,05). Παρόμοια αποτελέσματα θα μπορούσαν να ληφθούν με ανάλυση ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση SATB1 (Σχ. 3C). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι η επιμόλυνση του BIU-87 κύτταρα προκάλεσε σημαντική αύξηση του σαλιγκαριού και Slug (mRNA και πρωτεΐνη) και μια συνακόλουθη επαγωγή βιμεντίνη (mRNA και πρωτεΐνη). Τα επίπεδα mRNA της έκφρασης Ε-καδερίνης μειώθηκαν μετά την επιμόλυνση των πλασμιδίων έκφρασης pcDNA3.1-SATB1 (Σχήμα 4Α?. Ρ & lt? 0,05). Ωστόσο, δεν υπήρχαν αξιοσημείωτες αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης μεταξύ του φορέα ελέγχου και την ομάδα που pcDNA3.1SATB1 (Σχήμα 4Β?. Ρ & gt? 0,05). Υπήρχε μόνο μια τάση για μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης, και ο ανέστειλε αποτέλεσμα δεν ήταν τόσο έντονη επειδή η αναστολή μπορεί να είναι μετα-μεταφραστική.

Η έκφραση SATB1 του BIU-87 κύτταρα και τα κύτταρα Τ24 επιμολυσμένα με pcDNA3.1-SATB1 και pGenesil2-SATB1-shRNA εξετάστηκαν από qRT-PCR και Western blot (Α και Β? ** P & lt? 0.001). Μη επιμολυσμένα BIU-87 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδα ελέγχου. Τ24 κύτταρα κατεργασμένα με φορέα ελέγχου pGenesil2 που δεν στοχεύουν κανένα συγκεκριμένο γονίδιο χρησιμοποιήθηκαν ως ομάδες ελέγχου. Η ανάλυση ανοσοφθορισμού διεξήχθη για την ανίχνευση της SATB1staining σε κάθε κύτταρο ομάδες. εικόνες ανοσοφθορισμού στα 200 × μεγέθυνση (C και D). Οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν SEM, η = 3 πειράματα

Η

Η έκφραση σαλιγκάρι και Slug, δύο αναστολείς της Ε-καδερίνης, και η βιμεντίνη μεσεγχυματικά δείκτης ήταν προς τα πάνω ρυθμισμένη μετά την έκφραση SATB1 ενισχύθηκε (Α?. ** P & lt? 0.001). Τα επίπεδα mRNA της έκφρασης Ε-καδερίνης μειώθηκαν μετά την επιμόλυνση των πλασμιδίων έκφρασης pcDNA3.1-SATB1 (Α? Ρ & lt? 0,05). Υπήρχε μια τάση για μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης σε BIU-87 κυττάρων με αυξημένη έκφραση SATB1 (Β? Ρ & gt? 0,05). Μετά την έκφραση SATB1 σίγησε με SATB1 shRNA στα κύτταρα Τ24, η έκφραση των σαλιγκάρι, γυμνοσάλιαγκας και δείκτες μεσεγχυματικών vimentin ήταν μειωτικά. Η έκφραση των επιθηλιακών δείκτη, Ε-καδερίνης, ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα και κύτταρα ελέγχου φορέα-επιμολυσμένα (C και D? * Ρ & lt? 0,05? ** Ρ & lt? 0.001). Δεν υπήρξαν αξιοσημείωτες αλλαγές στις εκφράσεις του ZEB1, ZEB2 και Twist, άλλοι γνωστοί αναστολείς της E-cadherin, το BIU-87 με αυξημένη έκφραση και Τ24 κύτταρα SATB1 με μειωμένη έκφραση SATB1, αντίστοιχα.

Η

Ωστόσο, δεν υπήρχαν αξιοσημείωτες αλλαγές στην έκφραση των ZEB1, ZEB2 και Twist, η οποία είναι γνωστή ως άλλους αναστολείς της Ε-καδερίνης, στις τρεις ομάδες κυττάρων (Ρ & gt? 0,05).