Αφηρημένο

Για τον προσδιορισμό μοριακών μηχανισμών επιθετικότητα που σχετίζεται και των υποψηφίων βιοδεικτών του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, πραγματοποιήσαμε μια SILAC (σταθερό ισότοπο Επισήμανση από αμινο οξέα σε καλλιέργεια κυττάρων) πρωτεομική ανάλυση συγκρίνοντας μια επεμβατική Τ24 και ένα επιθετικό μεταστατικό προέρχεται T24T καρκίνο της ουροδόχου κύστης κυτταρική σειρά. Ένα σύνολο 289 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν εκφράζονται διαφορικά μεταξύ αυτών των κυττάρων με υψηλή εμπιστοσύνη. Συμπληρωματικές και επικύρωση αναλύει περιεχόμενη σύγκριση των δεδομένων πρωτεΐνης SILAC με αναλογίες έκφραση του mRNA που λαμβάνεται από ολιγονουκλεοτιδίων microarrays, και ανοσοαποτύπωση. Cul3, ένα υπερεκφρασμένο πρωτεΐνη σε T24T, που εμπλέκονται στην ουβικιτινίωση και μετέπειτα αποικοδόμηση του πρωτεασώματος των πρωτεϊνών στόχων, επιλέχθηκε για περαιτέρω έρευνα. Λειτουργικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι Cul3 φίμωση μειωμένη πολλαπλασιαστική, τη μετανάστευση και επεμβατική ποσοστά των κυττάρων T24T, και αποκατέστησε την έκφραση των πρωτεϊνών κυτταροσκελετού που προσδιορίζονται να υποεκφράζεται σε T24T κύτταρα με SILAC, όπως εζρίνη, μοεσίνη, filamin ή caveolin. Cul3 ανοσοϊστοχημική μοτίβα πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκαν σε όγκους της ουροδόχου κύστης κηλίδα επί μικροσυστοιχίες ιστού (n = 284), συνδέθηκαν με σταδιοποίηση των όγκων, λεμφαδένες μετάσταση στους λεμφαδένες και συγκεκριμένες νόσους επιβίωση. Έτσι, η προσέγγιση SILAC προσδιορίζεται ότι Cul3 διαμορφωμένου την επιθετική φαινότυπο των κυττάρων T24T τροποποιώντας την έκφραση των πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού που εμπλέκονται στην επιθετικότητα του καρκίνου της ουροδόχου κύστης? και έπαιξε ένα ρόλο βιοδεικτών για την πρόοδο του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, κομβικό μετάσταση και την αξιολόγηση του κλινικού αποτελέσματος

Παράθεση:. Grau L, Luque-Γκαρσία JL, González-Peramato P, Theodorescu D, Palou J, Fernandez-Gomez JM, et al. (2013) Μία ποσοτική πρωτεομική ανάλυση αποκαλύπτει τη συνάφεια των CUL3 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης Επιθετικότητα. PLoS ONE 8 (1): e53328. doi: 10.1371 /journal.pone.0053328

Επιμέλεια: Ιωάννης Ματθαίος Koomen, Moffitt Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 19, 2012? Αποδεκτές: 30 Νοεμβρίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 8 Ιαν 2013

Copyright: © 2013 Grau et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση (SAF2009-13035) από το ισπανικό Υπουργείο Παιδείας και Πολιτισμού (για το MS-C.). J.L.L.-G. υποστηρίχθηκε από το πρόγραμμα «Ramón y Cajal», και τη χορήγηση CTQ2010-18644 από το Υπουργείο Οικονομίας και Ανταγωνιστικότητας ισπανικά. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης αποτελεί την 4η πιο κοινή κακοήθεια μεταξύ των ανδρών και το 8ο πιο συχνή αιτία της ανδρικής θανάτων από καρκίνο [1]. Κλινικά, το 75% περίπου του μεταβατικού καρκινώματα (TCC) είναι μη επεμβατική μυός (TIS, Ta, και Τ1), το 20% των μυών που διηθούν (Τ2-Τ4), και 5% μεταστατική κατά τη στιγμή της διάγνωσης [1]. όγκους χαμηλού βαθμού είναι θηλώδες και συνήθως μη επεμβατική, ενώ οι όγκοι υψηλής ποιότητας μπορεί να είναι είτε θηλώδες ή μη θηλώδη, και συχνά επεμβατικές. Οι ασθενείς που διαγιγνώσκονται με εντοπισμένο TCC έχουν ποσοστό επιβίωσης 5 ετών πάνω από 90%. Ωστόσο, οι ασθενείς με τις περιφερειακές και μακρινό μεταστατικής νόσου έχουν ποσοστό επιβίωσης 5 ετών κάτω από 50% και 10%, αντίστοιχα [1]. εξέλιξης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης εξής συγκρότημα διαδοχικά στάδια, δεν είναι πλήρως κατανοητός [2] – [4]. Οι διαφορές στη συμπεριφορά επιθετικότητα έχουν περιγραφεί μεταξύ της διεισδυτικής Τ24 κύστη κυτταρική σειρά καρκίνου και την πιο επιθετική παραλλαγή T24T που αναπτύσσεται μεταστάσεις μετά την ένεση στην φλέβα της ουράς [5] – [9]. Ταυτοποίηση διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών μεταξύ αυτών των κυττάρων θα μπορούσε να αποκαλύψει μοριακούς μηχανισμούς που σχετίζονται με την επιθετικότητα του όγκου in vitro οδηγούν δυνητικά σε μετάσταση. Πρωτεΐνες που συμμετέχουν σε τέτοιες πορείες θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως βιοδείκτες είτε για τον έγκαιρο εντοπισμό των επιθετικών αποτέλεσμα ή /και δυνητικά να είναι θεραπευτικά δυνατότητα στόχευσης.

Η ποσοτική πρωτεομική συμβάλλει στην ανακάλυψη των στόχων και βιολογικών δεικτών που αφορούν συγκεκριμένες νόσους υποψήφιο. Ενώ συστοιχίες πρωτεΐνη και το αντίσωμα επιτρέπει διαφορική ποσοτικοποίηση γνωστών πρωτεϊνών [10], [11], οι τεχνικές φασματομετρίας μάζας για ταυτοποίηση οδηγήσει πρωτεΐνη [12]. Σταθερό επισήμανση ισότοπο από τα αμινοξέα σε καλλιέργεια κυττάρων (SILAC) περιλαμβάνει την προσθήκη του (12) C- και (13) C-επισημασμένα αμινοξέα για ανάπτυξη των μέσων ενημέρωσης χωριστά καλλιεργημένα κύτταρα, προκαλώντας τα κύτταρα που περιέχουν «φως» ή «βαριά» πρωτεΐνες, αντίστοιχα [12] – [31]. Για τις γνώσεις μας, SILAC δεν έχει αναφερθεί σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Εδώ, μια ποσοτική πρωτεομική ανάλυση εφαρμόστηκε σε Τ24 και T24T κύτταρα για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών και μονοπατιών που σχετίζονται με την απόκλιση επιθετικότητα τους εξής πειραματικό σχεδιασμό μας (Εικόνα 1).

Λειτουργική αναλύσεις διεξήχθησαν για να εκτιμηθεί η διαφορική επιθετική φαινότυπο T24 και του καρκίνου της ουροδόχου κύστης T24T κύτταρα σε: Α) τον πολλαπλασιασμό, Β) εισβολή, και Γ) τη μετανάστευση. Ο μέσος όρος των διπλών πειραμάτων για κάθε λειτουργική δοκιμασία αυτών των κυττάρων σε διάφορα χρονικά σημεία αντιπροσωπεύεται σε κάθε πάνελ. Δ) Σχηματικό διάγραμμα που δείχνει τη ροή εργασίας που χρησιμοποιούνται για τα πειράματα πολυπλεγμένων SILAC που βασίζεται. Εσωτερική επισήμανση διεξήχθη

in vitro

, τα εκχυλίσματα πρωτεΐνης κλασματώθηκαν μέσω SDS-PAGE, πέψη με θρυψίνη σε γέλη, και πέψης θρυπτικού αναλύθηκαν με LC-MS /MS τόσο τον εντοπισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό οι πρωτεΐνες που υπάρχουν. Ε) Σύγκριση των πρωτεϊνικών αλλαγών που προσδιορίζονται από SILAC διεξήχθη με εκείνες που παρατηρήθηκαν με συστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων. ΣΤ) Επικύρωση των πρωτεϊνών αλλαγές που προσδιορίζονται από SILAC στη Δυτική κηλίδες εκχυλισμάτων πρωτεΐνης που λαμβάνεται από κύτταρα Τ24-T24T. Ζ) Η ανοσοϊστοχημεία σε συστοιχίες ιστού που περιέχει όγκους της ουροδόχου κύστης υπηρέτησε για την επικύρωση ενώσεις που προσδιορίζονται πρωτεΐνες με κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. H) siRNA αποσιώπηση των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών και η επακόλουθη λειτουργική αναλύσεις και ανοσοαποτύπωση επικύρωση χρησίμευσε για να αξιολογήσει τον αντίκτυπο των εντοπισθέντων υποψηφίων για την επιθετική φαινότυπο της T24T και τη ρύθμιση άλλων διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών που προσδιορίζονται από SILAC.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

1. Λειτουργική ανάλυση των Τ24 και T24T καρκινικών κυττάρων κύστης

κυτταρικής καλλιέργειας.

Τ24 ελήφθη από την American Type Culture Collection και καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32], [33]. T24T προήλθε από Τ24 σε εργαστηριακή Dr Theodorescu [5] – [9]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 4-6 περάσματα και συλλέχθηκαν σε 75% -90% συρροή. Τα κυτταρικά ιζήματα πλύθηκαν τρεις φορές σε ψυχρό PBS και καταψύχθηκαν στους -20 ° C πριν RNA και πρωτεΐνης εκχύλισης.

Δοκιμασία πολλαπλασιασμού

1.2×10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε 96 -Καλά πλάκες εις τριπλούν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS. Μετά από καλλιέργεια για 24, 48, 72 και 96 ώρες, ο πολλαπλασιασμός μετρήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ (Roche, Mannheim, Germany).

επούλωσης τραυμάτων δοκιμασία.

3.5Χ10

5 κυττάρων σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων, και ένα τραύμα έγινε στην μονοστιβάδα χρησιμοποιώντας ένα στείρο ρύγχος πιπέτας μόλις τα κύτταρα έφθασαν συρροή. Φωτογραφίες από κύτταρα εισβάλλουν το τραύμα ελήφθησαν στους χρόνους που υποδεικνύονται.

δοκιμασία εισβολή.

καλλιέργειας κυττάρων 24 φρεατίων ένθετα (μέγεθος πόρων 8 μm, BD Biosciences, San Jose, CA) ήταν σπάρθηκε με 2.5×10

4 Τ24 και T24T κύτταρα, καθώς επίσης και με κύτταρα T24T μετά από 24 και 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με Cul3 siRNA (50 ηΜ) σε 500 μι μέσου ϋΜΕΜ με 0,1% FBS στον άνω θάλαμο. Medium με 10% FBS (500 μL) προστέθηκε στον κάτω θάλαμο ως χημειοτακτικό παράγοντα. θάλαμοι Matrigel εισβολής (BD) διατηρήθηκαν για 24 ώρες σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C, 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Τα κύτταρα και στις δύο πλευρές του θαλάμου matrigel μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά, πλύθηκαν με PBS, χρωματίστηκαν με 1 μg /mL 4′-6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλης (DAPI: Sigma, St Louis, ΜΟ) για 10 λεπτά και αναλύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία (Leica TCS-SP5, Wetzlar, Germany). Ο αριθμός των εισβάλλοντας κυττάρων εκτιμήθηκε με το λογισμικό Imaris (Bit αεροπλάνο, Ζυρίχη, Ελβετία), εκτίμηση του ποσοστού της εισβολής, όπως:.. Τον αριθμό της εισβολής κυττάρων /αριθμός συνολικών κυττάρων × 100

Cul3 αποσιώπηση

Cul3 νοκ-κάτω έγινε σε T24T από παροδική επιμόλυνση με Λιποφεκταμίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA) με τη χρήση ελέγχου (δεν στόχευσης) μικρά παρεμβαλλόμενα RNA διπλής έλικας (siRNA) και την έξυπνη πισίνα siRNA που στοχεύουν ενάντια Cul3 (τόσο από Dharmacon, Waltham, ΜΑ). Cul3 αποσιώπηση μορφομετατροπέων που εκτίθενται σε 50 ηΜ και 100Nm στοχευμένων siRNA συλλέχθηκαν στις 24 ώρες και 48 ώρες για πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση ή την εισβολή προσδιορισμούς, όπως περιγράφεται ανωτέρω. Cul3 σίγηση επιβεβαιώθηκε με ανοσοαποτύπωση.

2. SILAC πρωτεΐνη προφίλ

Κυτταροκαλλιέργεια και Μεταβολική επισήμανση.

Τ24 και T24T κύτταρα διατηρήθηκαν σε λυσίνη και αργινίνη-εξαντλημένο DMEM (Millipore, Billerica, ΜΑ) συμπληρωμένο με 10% διαλυμένο FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 μονάδες /κ.εκ πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Invitrogen) και είτε φυσικά απαντώμενες αναλογία ισοτόπων ( «ελαφρά») (Τ24) ή σταθερές ραδιοεπισημασμένες ( «βαρύ»)

13C

6 λυσίνη και

13C

6 αργινίνης αμινοξέα (Cambridge Isotope Labs, Andover, ΜΑ) (T24T). Τα μέσα καλλιέργειας ανανεώνεται ανά 2 ημέρες αφαιρώντας το ήμισυ του όγκου που υπάρχουν σε κάθε πλάκα και την αντικατάστασή του με φρέσκο ​​μέσο. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για τουλάχιστον 6 διπλασιασμούς να επιτρέψει την πλήρη ενσωμάτωση των επισημασμένων αμινοξέων. Δύο μεγάλης κλίμακας επαναλήψεις SILAC (2 × 10

7 κύτταρα ανά συνθήκη) πραγματοποιήθηκαν. Πλήρης ενσωμάτωση του

13C-Arg και

13C-Lys σε Τ24 και τα κύτταρα T24T μετά από έξι κυτταρικές διαιρέσεις σε ισότοπα βαρύ μέσο (άμεση και αντίστροφη επισήμανση) επιβεβαιώθηκε με MS μιας πρωτεΐνης πέψης.

πρωτεΐνη κλασματοποίηση.

Για να μειωθεί η πολυπλοκότητα του δείγματος, μια πυρηνική /κυτταρόπλασμα κλασματοποίηση εκτελέστηκε. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ένα ρυθμιστικό λύσης (20 mM HEPES, ρΗ 7.0, 10 mM KCl, 2 mM MgCl, 0.5% Nonidet Ρ40, 1 mM Na

3νο

4, 1 mM PMSF, 0,15 U mL

-1 απρωτινίνη) και ομογενοποιήθηκε με 30 κτυπήματα σε ομογενοποιητή Dounce ένα. Το ομογενοποίημα φυγοκεντρήθηκε στα 1500 g για 5 λεπτά για να καθιζάνουν οι πυρήνες. Το υπερκείμενο στη συνέχεια resedimented στα 15.000 g για 5 λεπτά, και το προκύπτον υπερκείμενο αποτέλεσε τη μη πυρηνική ή κυτοσόλιο κλάσμα. Το πυρηνικό σφαιρίδιο πλύθηκε τρεις φορές και επαναιωρήθηκαν στο ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 0,5 Μ NaCl. Το εκχυλισθέν υλικό καταβυθίστηκε στα 15.000 g για 10 λεπτά και το υπερκείμενο που προέκυψε ονομάζεται το πυρηνικό κλάσμα.

SDS-PAGE και σε γέλη πέψη.

Πρωτεΐνες σε κυτοσολικά και πυρηνικά κλάσματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE σε 10% πήγματα SDS-πολυακρυλαμιδίου. Ένα σύνολο 80 μα πρωτείνης φορτώθηκαν ανά λωρίδα. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές με χρώση με Coomassie blue και η λωρίδα γέλη κόπηκε οριζόντια σε 20 τμήματα. Αποκομμένα ζώνες γέλη κόπηκαν σε μικρά κομμάτια και αποχρωματίζονται σε 50:50 25 mM διττανθρακικού αμμωνίου /ακετονιτρίλιο, αφυδατωμένα με ακετονιτρίλιο και ξηραίνεται. τεμάχια γέλης επαναϋδατώθηκαν με 30 μι 12,5 ng /mL διάλυμα θρυψίνης εντός 25 mM διττανθρακικού αμμωνίου και επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Τα πεπτίδια εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας ακετονιτρίλιο και 5% μυρμηκικό οξύ, ξηραίνεται με φυγοκέντρηση υπό κενό και επαναιωρήθηκε σε 15 μί 2% ακετονιτρίλιο σε 0.1% μυρμηκικό οξύ. Όλα τα δείγματα υποβλήθηκαν σε κατεργασία υπερήχων για 10 λεπτά πριν από την ανάλυση MS.

λεπτής ροής LC-MS /MS.

Το πεπτίδιο μίγμα από τρυπτική πέψεις in-gel (χρησιμοποιώντας 30 μΙ τρυψίνης σε 12,5 ng /mL ) αναλύθηκε με τη χρήση λεπτής ροής LC-MS /MS. Τα πεπτίδια φορτώθηκαν πάνω σε μία στήλη παγίδα (Reprosil C

18, 3 μm μέγεθος σωματιδίων, 0,3 χ 10 mm, 120 Α μέγεθος πόρων, SGE) και στη συνέχεια εκλούστηκε με την αναλυτική στήλη (Acclaim ΡΕΡΜΑΡ 100, C

18, 3 μm μέγεθος σωματιδίων, 75 μm χ 15 cm, 100 Α μέγεθος πόρων, Dionex, LC Packings) με μια γραμμική κλίση από 5-80% ακετονιτρίλιο σε 0.1% μυρμηκικό οξύ. Δείγμα παραδόθηκε πάνω από 120 λεπτά από μια εξαιρετικά 1D νανο-LC συν συστήματος (Eksigent) σε ένα ρυθμό ροής 200 nL /min σε ένα ανοξείδωτο χάλυβα νανο-οπής πομπού (OD 150 μm, ID 30 μm, Proxeon, Odense, Δανία) . Τα πεπτίδια σαρώθηκαν και κατακερματισμένη με ένα φασματόμετρο μάζας παγίδας γραμμική ιόντων LTQ XL (Thermo, San Jose, CA) το οποίο λειτουργεί στα δεδομένα που εξαρτώνται από ZoomScan και MS /MS λειτουργία μεταγωγής χρησιμοποιώντας τα τρία πιο έντονη πρόδρομοι ανιχνευθεί με σάρωση έρευνα από το 400 να 1600 u (τρεις μscans). ZoomScan παράθυρο μάζα ορίστηκε σε 12 Da που επιτρέπει την παρακολούθηση του συνόλου

12C /

13C ισοτοπική φάκελο των πιο διπλά και τριπλά φορτισμένα πεπτίδια. Μεμονωμένα φορτισμένα ιόντα αποκλείστηκαν για ανάλυση MS /MS. Κανονικοποιημένη ενέργεια σύγκρουσης ορίστηκε στο 35% και η δυναμική του αποκλεισμού εφαρμόστηκε κατά τη διάρκεια των 3 περιόδων λεπτά για να αποφύγουν τις επαναλαμβανόμενες ιόντα κατακερματισμού.

ταυτοποίηση πρωτεϊνών και ποσοτικοποίηση.

Δημιουργημένο .raw αρχεία μετατράπηκαν σε .mgf αρχεία για ΜΑΣΚΩΤ αναζήτηση της βάσης δεδομένων. Μια βάση δεδομένων που περιέχει τις ακολουθίες NCBInr Homo Sapiens που περιέχει 34.180 εγγραφές πρωτεΐνη (από 04-03-2008) ερευνήθηκε χρησιμοποιώντας ΜΑΣΚΩΤ λογισμικού (έκδοση 2.3 Matrix Science) για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών. κριτήρια που περιλαμβάνονται ειδικότητα θρυψίνη με μία χαμένη διάσπαση επιτρέπεται, και την οξείδωση της μεθειονίνης,

13C-Arg και

13C-Lys ως μεταβλητή τροποποιήσεις. Ένα ελάχιστο πρόδρομος ακρίβεια θραύσμα ιόντων μάζα 1.2 και 0.3 Da, αντίστοιχα, και η απαίτηση τουλάχιστον δύο τολμηρό κόκκινο (μοναδικά πεπτίδια) ανά πρωτεΐνης που απαιτείται για την πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση. Cut-off τιμές για δεκάδες μασκότ πεπτίδια και πρωτεΐνες που σε 39 (

σ

& lt? 0,05) και 46 (

σ

& lt? 0,01), αντίστοιχα, για να τους θεωρούν ως ακριβή ταυτοποιήσεις . Το ποσοστό ψευδώς θετικών υπολογίστηκε ψάχνουν την ίδια φάσματα εναντίον των NCBInr Homo Sapiens δόλωμα τυχαιοποιημένη βάση δεδομένων. Σχετικές αναλογίες ποσοτικοποίηση των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας QuiXoT (έκδοση 1.3.26). αναλογίες /Τ24 SILAC T24T ορίστηκαν από τις εντάσεις των βαρέων πεπτίδια (C

13) διαιρούμενο με τις εντάσεις των φωτεινών πεπτίδια (C

12). αναλογίες πρωτεϊνών που λαμβάνονται από QuiXoT ήταν το χέρι επαληθεύεται για όλα τα πεπτίδια. Ένα ποσοστό των

13C

6-Arg μετετράπη σε

13C

5-Pro ​​οδηγεί σε μείωση της έντασης του ισοτόπου-επισημασμένο πεπτίδιο κορυφή? αυτό διορθώθηκε για όλα τα πεπτίδια που περιέχουν ένα ή περισσότερα υπολείμματα προλίνης, με την προσθήκη της έντασης αποτελέσματα για το πεπτίδιο που περιέχει

13C

6-Arg

13C

5-Pro ​​ή

13C

6 -Lys

13C

5-Pro ​​με την ένταση της κορυφής που περιέχουν μόνο

13C

6-Arg ή

13C

6-Lys. Μια συνδυασμένη λίστα των πρωτεϊνών που εντοπίζονται σε όλα τα πειράματα συμπυκνώνεται στο 80% ομολογία με τη χρήση του πακέτου λογισμικού ProteinCenter (Proxeon Βιοπληροφορική, Odense, Δανία) για να αφαιρέσετε περιττές αναγνωριστικά, όπως τα ανθρώπινα ορθόλογες ακολουθίες, περιττές καταχωρήσεις στη βάση δεδομένων, και να διακριθεί ισομορφές βάσει της παρατηρούμενης πεπτίδιο κάλυψη. Υποκυτταρικό εντοπισμό και λειτουργικές διαδικασίες των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται από SILAC είχαν ανατεθεί με βάση τη βιολογική γνώση που είναι διαθέσιμη στην Γονιδιακή Οντολογία (GO) σχολιασμούς. Το λογισμικό Ingenuity Διαδρομή (IPA) χρησιμοποιήθηκε επίσης για να παρέχουν πληροφορίες για βιολογικά δίκτυα [33], [34].

3. Gene Expression Profiling με Oligonucleotide πίνακες

εκχύλιση RNA.

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ (Life Technologies, Carlsbad, CA) που ακολουθείται από καθαρισμό RNeasy. ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε με βάση 260:280 αναλογίες απορρόφησης, και την ακεραιότητα ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης με τη χρήση του 2100 Bioanalyzer (Agilent, ΡβΙο Alto, CA) [32], [34].

συστοιχίες Gene.

Συμπληρωματικό DNA συντέθηκε από

in vitro

μεταγραφή από 1,5 μg του ολικού RNA καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας Τ7-ολιγο (dT) Φορέας Primer Δοκιμασία (Affymetrix, Santa Clara, CA), επισημασμένα με βιοτινυλιωμένο νουκλεοτίδια (Enzo Biochem, Farmingdale, ΝΥ), και υβριδοποιήθηκε σε δοκιμή GeneChips (Affymetrix), για την εκτίμηση της ποιότητας του δείγματος πριν από την υβριδοποίηση επί των U133A ανθρώπινη GeneChips περιέχει 22.283 ανιχνευτές που αντιπροσωπεύουν γνωστά γονίδια και ετικέτες αλληλουχίας έκφρασης (Affymetrix) [34].

η ανάλυση των δεδομένων.

σαρωμένων αρχείων εικόνας ήταν οπτικά για αντικείμενα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Affymetrix Microarray Suite 5.0 (MAS 5.0). Η διαφορική έκφραση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας σήματος ως κύριο μέτρο απόκριση εκχυλίζεται για κάθε γονίδιο σε κάθε δείγμα, όπως προσδιορίζεται από τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις του MAS 5.0. Οι συσχετίσεις μεταξύ των δεικτών του γονιδίου και της πρωτεΐνης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ tau Kendall του. Για να συγκρίνετε SILAC και ολιγονουκλεοτιδίων συστοιχίες αποτελέσματα, η αθροιστική πιθανότητα της αναμενόμενης και τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν εκπροσωπήθηκαν σε όλο το εύρος της διαφοράς αναλογιών έκφρασης.

4. Επικύρωση με ανοσοκηλίδωση

Η ολική πρωτεΐνη εκχυλίστηκε από καρκίνο της ουροδόχου κύστης κύτταρα χρησιμοποιώντας RIPA ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως και ποσοτικοποιούνται με τη δοκιμασία Bradford χρησιμοποιώντας BSA ως πρότυπο (δοκιμασία πρωτεΐνης, Bio-Rad, Hercules, CA). εκχυλίσματα συνολική πρωτεΐνη (50 μg) αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος 5χ SDS (62,5 mM TrisHCl [ρΗ 6,8], 2% SDS, 10% γλυκερόλη, 5% β-μερκαπτοαιθανόλη, 0.005% κυανό βρωμοφαινόλης) και αναλύθηκαν με SDS-PAGE σε 10 πηκτές% ακρυλαμιδίου. Οι πρωτεΐνες ηλεκτρομεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore, Bedford, MC) και ενεργοποίηση με μεθανόλη. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε PBS και 0,1% Tween-20 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα εναντίον: Annexin2 (39 kDa, ποντίκι, 1:2000, # 610068 , BD Transduction Laboratories, Σαν Χοσέ, Καλιφόρνια ΗΠΑ), Bcas2 (26 kDa, ποντίκι, 1:6000, # H00010286-M01, Abnova, Χαϊδελβέργη, Γερμανία), L-καλδεσμόνη (80kDa, ποντίκι, 1:100, # C56520, BD Transduction Laboratories), Καλρετικουλίνης (48 kDa, κουνέλι, 1:5000, # C4606, Sigma, St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ), Caveolin1 (20-22 kDa, ποντίκι, 1:100, # C37120, BD Transduction Laboratories) , cdc2 (34 kDa, κουνέλι, 1:1000, # sc-954, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, ΗΠΑ), CD44 (80 kDa, ποντίκι, 1:50, # NCL-CD44v3, Novocastra, Wetzlar, Γερμανία) , Copine3 (38 kDa, κουνέλι, 1:100, ευγενικά από τον Dr. Piris, που βρίσκεται στο CNIO, Μαδρίτη, Ισπανία), Cul3 (89 kDa, κουνέλι, 1:100, # RB1575PCS, NeoMarkers, Fremont, CA, ΗΠΑ) , Cytokeratin18 (48 kDa, ποντίκι, 1:100, # IF14, Oncogene-Merck, Darmstad, Γερμανία), DDX21 (87 kDa, κουνέλι, 1:3500, # 10.528 – 1-ΑΡ, Proteintech, US), DNMT1 (183 kDa, ποντίκι, 1:100, # IMG-261, Imgenex, San Diego, CA, ΗΠΑ), Dynactin p50 (44 kDa, ποντίκι, 1:100, # D74620, BD Transduction Laboratories), Dynamin (ποντίκι, 97 kDa, 1:5000, # D25520, BD Transduction Laboratories,), EGFR (175 kDa, το ποντίκι, 1:100, # GRO1, Oncogene-Merck), Ezrin (80 kDa, ποντίκι, 1:7000, # E8897, Sigma), Filamin Α (250 kDa, το ποντίκι, 1:50, # NCL-ΦΙΛ, Novocastra, UK), γκελσολίνη (47 kDa, ποντίκι, 1:100, # G4896, Sigma), HSP70 (70 kDa, ποντίκι, 1:200, # SC-66048, Σάντα Κρουζ), importin 9 (116 kDa, κατσίκα, 1:100, SC-103567, Santa Cruz), MCM6 (92 kDa, κουνέλι, 1:200, ευγενικά από τον Dr. Mendez, που βρίσκεται στο CNIO, Μαδρίτη, Ισπανία), ΜΑΡΚ-4 (65 kDa, κουνέλι, 1:1000, SC-68169, Σάντα Κρουζ), μοεσίνη (68-77 kDa, ποντίκι, 1:50, # MS-727-P0, NeoMarkers), MSH6 (152 kDa, το ποντίκι, 1:200, # 610918, BD Laboratories μεταγωγή), Nucleophosmin /Β23 (32kDa, ποντίκι, 1:5000, # 18 – 7288, Zymed, SF, CA, ΗΠΑ), NUP133 (133 kDa, το ποντίκι , 1:500, # SC-101290, Santa Cruz), Rab14 (23 kDa, κουνέλι, 1:100, # PRO-873, Avivasybio, San Diego, CA), RCC1 (44 kDa, κατσίκα, 1:300, # SC-1161, Santa Cruz), VDAC (30 kDa, κουνέλι, 1:100, # 4866, κυτταρική σηματοδότηση, Beverly, ΜΑ). Οι κηλίδες πλύθηκαν σε PBS και 0.1% Tween-20, και επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου: κατά ποντικού (1:1000), αντι-κουνελιού (1:2000) και αντι-κατσίκα ( 1:2000, όλα Dako, Glostrup, Δανία). τη δέσμευση του αντισώματος οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης ανοσοαποτύπωση χημειοφωταύγειας (ECL, GE Healthcare). α-τουμπουλίνης (50kDa, ποντίκι, 1:4000, # T5168, Sigma) χρησιμοποιήθηκε ως φόρτωση και για την εξομάλυνση ελέγχου. Τα ανοσοστυπώματα σαρώθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ1.43u (Wayne Rasband, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας).

5. Κλινική αξιολόγηση της έκφρασης των μεταστάσεων σχετίζονται βιοδεικτών

δείγματα ιστών και microarrays.

Επτά custom-made καρκίνου της ουροδόχου κύστης μικροσυστοιχίες ιστού κατασκευάστηκαν στο Μαρκαδόροι Ομάδα όγκων, συμπεριλαμβανομένων τριπλούν ή quadriplicate πυρήνες (1,0 mm) πρωτογενών όγκων της ουροδόχου κύστης (n = 284) μετά τυχαιοποιημένη σχέδια. Παραφίνη-ενσωματωμένες όγκων για την κατασκευή συστοιχίας ιστού συλλέχθηκαν και ο χειρισμός ανώνυμα μετά από τις ηθικές και νομικές κατευθυντήριες γραμμές προστασίας των ανθρώπινων υποκειμένων μετά από γραπτή έγκριση συγκατάθεση και Institutional Review Board (IRB) εγκεκριμένα πρωτόκολλα που αντιστοιχεί στο SAF2009-13035 ερευνητικό έργο στα συνεργαζόμενα ιδρύματα: Fundacio Puigvert και νοσοκομείο της Κεντρικής de Asturias. Δημογραφικά στοιχεία έδειξαν την παρουσία 251 άνδρες και 33 γυναίκες, με μέση ηλικία τα 66,0 χρόνια (εύρος: 25-81). διανομή στάδιο του όγκου ήταν: ρΤ1 (n = 87), ρΤ2 (n = 121), ρΤ3 (n = 48) και ρΤ4 (n = 28), και τη διανομή βαθμός του όγκου ήταν: χαμηλού βαθμού (n = 58) και υψηλής βαθμός (n = 226), η οποία ορίζεται σύμφωνα με τα κριτήρια συναίνεση [35]. Δύο από αυτές τις μικροσυστοιχίες ιστού συμπεριλαμβανομένου ενός συνόλου 71 διηθητικό (pT2 +) υψηλής ποιότητας TCC όγκους της ουροδόχου κύστης με γνωστή λεμφαδένων μεταστατική κατάσταση (N0 = 37, N + = 34). Κλινικοπαθολογικοί και σχολιασμένο συνέχεια τις πληροφορίες που επιτρέπονται ενώσεις Cul3 με ιστοπαθολογική εξέταση και την έκβαση.

ανοσοϊστοχημεία.

Πρωτεΐνη έκφραση Cul3 εκτιμήθηκε με ανοσοϊστοχημεία σε μικροσυστοιχίες ιστό χρησιμοποιώντας διαδικασίες ανοσοϋπεροξειδάσης αβιδίνης-βιοτίνης. ανάκτηση αντιγόνου (0,01% κιτρικό οξύ για 15 λεπτά υπό μικροκύματα) χρησιμοποιήθηκε πριν από την επώαση όλη τη νύκτα στους 4 ° C με το αντίσωμα κουνελιού Cul3 χρησιμοποιούνται σε ανοσοκηλίδωση (1:300 αραίωση). Η σύνδεση αντισώματος ανιχνεύθηκε με ένα δεύτερο αντίσωμα βιοτινυλιωμένο κατσίκας αντι-κουνελιού (1:1000, Vector Laboratories). Απουσία του πρωτογενούς αντισώματος χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Όρχεων χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Διαμινοβενζιδίνη χρησιμοποιήθηκε ως το τελικό χρωμογόνο και αιματοξυλίνη ως πυρηνική αντιχρωστικό [32] -.. [34]

Στατιστική Ανάλυση

Μέσα ευρήματα από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές από όλα τα δοκίμια από κάθε δείγμα όγκου μαζεύτηκαν χρησιμοποιήθηκαν για στατιστικές αναλύσεις. Σύλλογοι της έκφρασης Cul3 με ανοσοϊστοχημεία με ιστοπαθολογική σκηνή και όγκου βαθμού αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας το μη-παραμετρικό Wilcoxon-Mann-Whitney και Kruskall-Wallis τεστ [36]. Cul3 έκφραση αξιολογήθηκε ως συνεχή μεταβλητή με βάση τον αριθμό των κυττάρων που εκφράζουν την πρωτεΐνη στον πυρήνα. Η ένταση της χρώσης κατηγοριοποιήθηκε ως αρνητικό (-) για να χαμηλή (+), το ενδιάμεσο (++) και υψηλή (+++). Εκτός από την ενδοκυτταρική εντόπιση, ήταν επίσης αξιολογήθηκε το εάν η πρωτεΐνη ήταν παρούσα ή όχι στην εξωκυτταρική μήτρα που περιβάλλει τα νεοπλασματικά κύτταρα. επιλέχθηκε Cul3 επίπεδο αποκοπής για την προγνωστική αξιολόγηση βάσει των μέσων τιμών της έκφρασης μεταξύ των ομάδων σύμφωνα με τις αναλύσεις. Σύλλογος Cul3 με συγκεκριμένες νόσους επιβίωση αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία log-rank σε περιπτώσεις με τα διαθέσιμα παρακολούθηση. Ασθένεια-συγκεκριμένο χρόνο επιβίωσης ορίστηκε ως τους μήνες παρήλθαν μεταξύ διουρηθρική εκτομή ή κυστεκτομή και το θάνατο ως αποτέλεσμα της ασθένειας (ή την τελευταία παρακολούθηση ημερομηνία). Ασθενείς ζωντανός κατά την τελευταία παρακολούθηση ή χαθεί κατά την παρακολούθηση είχαν λογοκριθεί. Οι καμπύλες επιβίωσης σχεδιάζονται χρησιμοποιώντας Kaplan-Meier μεθοδολογία [36]. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS στατιστικό πακέτο (έκδοση 17.0).

Αποτελέσματα

Λειτουργική αναλύσεις

in vitro

Η

Αρκετές πτυχές επιθετικότητα των κυττάρων T24-T24T αρχικά αναλύονται. T24T είχαν σημαντικά υψηλότερα ποσοστά πολλαπλασιασμού από Τ24 σε τέσσερα χρονικά σημεία που μελετήθηκαν (p & lt? 0.05, Σχήμα 1Α). δοκιμασίες Εισβολή έδειξαν ότι Τ24 ήταν κατά μέσο όρο 50% λιγότερο επεμβατική από T24T κύτταρα σε 48 h (Σχήμα 1Β). Επούλωση των πληγών αναλύσεις αποκάλυψαν σημαντικά ταχύτερο ρυθμό μετανάστευσης για T24T (Σχήμα 1C). I

n vitro

αναλύσεις πρότειναν ότι τα κύτταρα T24T είχε πιο επιθετικό φαινότυπο.

Αλλαγές σε πρωτεΐνες αφθονία μεταξύ των κυττάρων Τ24 και T24T χρησιμοποιώντας SILAC

Ένα σύνολο των 1830 πρωτεϊνών εντοπίστηκαν στην τα δύο πειράματα SILAC, από τα οποία 831 ήταν ταυτόχρονα εντοπίστηκαν και στις δύο επαναλήψεις και πέρασε τα κριτήρια που έχουν καθοριστεί για την πρωτεΐνη ποσοτικοποίηση. Το συνολικό ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη ήταν 2,1% που υπολογίζεται από τον αριθμό των επισκέψεων κατά την αντίστροφη σειρά /συνολικές επισκέψεις (p & lt? 0,01). Η μέση σχετική τυπική απόκλιση (SD) των δεικτών που λαμβάνονται από τις επαναλήψεις ήταν 0,24, υποδεικνύοντας καλή συμφωνία μεταξύ των πειραμάτων.

Όσον αφορά τη διανομή αναλογίες SILAC, οι περισσότερες από τις πρωτεΐνες που εντοπίστηκαν ήταν εντός του εύρους αναλογία SILAC μεταξύ 1,5 και 0,67, όπως αναμένεται, κατά την ανάλυση που συνδέονται στενά με κυτταρικές γραμμές σε ένα 1:01 μίγμα πρωτεΐνης (Εικόνα 2Α). Χρησιμοποιώντας 1,5 ως ο λόγος του ορίου, 289 πρωτεΐνες που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών, 88 από τα οποία ήταν περισσότερο άφθονη στο T24T. Μεταξύ των 289 διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών (Πίνακας S1), ο Πίνακας 1 περιλαμβάνει εκείνες τις πρωτεΐνες που σχετίζονται με την προηγουμένως ουροδόχου κύστης μεταστάσεις του καρκίνου, και εκείνες που έχουν επικυρωθεί με ανοσοστύπωση. Ο πλήρης κατάλογος των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται στις δύο επαναλήψεις (n = 831) με τη χρήση SILAC είναι στον Πίνακα S2.

Οι πρωτεΐνες ταξινομήθηκαν και σχεδιάστηκαν με την αναλογία SILAC. Όπως ήταν αναμενόμενο για ένα μίγμα 1:01, οι περισσότερες πρωτεΐνες έδειξε αναλογία SILAC εντός των 1,5 και 0,67 αποκοπές. Η κατάταξη των πρωτεϊνών ταυτοποιείται με βάση την λειτουργική τους σχολιασμούς τους, χρησιμοποιώντας το Gene Ontology: Β) Μοριακό λειτουργίας, Γ) Οι βιολογικές διαδικασίες και D) κυτταρικά συστατικά. Αυτές οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τις 289 πρωτεΐνες βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά. Όταν περισσότερες από μία εργασία ήταν διαθέσιμη για μια δεδομένη πρωτεΐνη, όλες οι λειτουργικές σχολιασμούς θεωρήθηκαν στις αναλύσεις. Αυτές οι ταξινομήσεις ήταν περιττή (πάνω από 100%) και πρωτεΐνες θα μπορούσαν να σχολιάζονται σε περισσότερες από μία εργασία.

Η

Λειτουργική ταξινόμηση των πρωτεϊνών προσδιορίζονται

Η λειτουργική σχολιασμό του 289 διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών σε Τ24 και T24T κύτταρα ανατέθηκε αρχικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό Κέντρο πρωτεΐνη. Τρεις κύριοι τύποι σχολιασμών ελήφθησαν από GO ιστοσελίδα κοινοπραξία: κυτταρικά συστατικά, μοριακές λειτουργίες και βιολογικές διεργασίες (Σχήμα 2Β, C, D). Μια προσέγγιση GOslim ορίζεται ειδικά για ProteinCenter μείωσε τις πολλαπλές σχολιασμούς πάω σε ένα διαχειρίσιμο σύνολο περίπου 20 όρους υψηλού επιπέδου που χρησιμοποιήθηκαν για να φιλτράρετε τις πληροφορίες σε ποσοστό εκτιμήσεις. Σημαντικές μοριακό λειτουργίες που περιλαμβάνονται δέσμευσης πρωτεΐνης (78%) ή καταλυτική δραστικότητα (67%). Μεταβολικών διεργασιών (84%) και την κυτταρική οργάνωση και βιογένεση (54%) ήταν συχνές βιολογικές διεργασίες. κατανομή της πρωτεΐνης σχολιασμό υποστήριξε τις

in vitro

λειτουργικές δοκιμασίες που περιγράφονται παραπάνω σύνδεση κυτταρική αναδιοργάνωση με τη μετανάστευση και την εισβολή φαινοτύπων (Σχήμα 1). Ένας μεγάλος αριθμός των πρωτεϊνών εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα (87%) βρέθηκε σε σύγκριση προς τον πυρήνα (48%). Η παρατήρηση αυτή μας οδήγησε να επικεντρωθεί σε πρωτεΐνες που θα μπορούσαν να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στην κυτταροσκελετική αναδιοργάνωση και τον επιθετικό φαινότυπο των T24T.

Η σύγκριση των δεικτών του γονιδίου και την έκφραση της πρωτεΐνης

αναλογίες έκφραση της πρωτεΐνης SILAC συγκρίθηκαν με η έκφραση του mRNA που παρέχονται από μικροδιατάξεις ολιγονουκλεοτιδίων για τους υποψηφίους που προσδιορίζονται από τις δύο μεθόδους (n = 438) (Πίνακας 1, Πίνακας S3). Ένα θετικό συντελεστή συσχέτισης (Kendalĺs tau) από 0,206 (p & lt? 0.0005) ελήφθη (Σχήμα S1 Α). Είναι σημαντικό ότι, η διάμεση αναλογία έκφρασης πρωτεΐνης SILAC ήταν 0,98 για αυτούς τους υποψηφίους (εύρος: 0,16 – 9,44), η οποία ήταν παρόμοια με τη διάμεση τιμή των 1,02 που παρατηρήθηκε για συστοιχίες ολιγονουκλεοτίδιο (εύρος: 0,01 – 100,80). Εξαιρουμένων δύο ακραίες τιμές ανιχνεύονται με τις δύο τεχνικές αύξησε το συντελεστή συσχέτισης με 0,210 (p & lt? 0.0005, Ν = 438: Εικόνα S1B). Για να ερμηνεύσει τις διαφορές μεταξύ της αναμενόμενης και τις παρατηρούμενες συσχετίσεις μεταξύ RNA και έκφρασης πρωτεΐνης, η αθροιστική πιθανότητα της παρατηρούμενης αναλογία για διαφορική έκφραση εκπροσωπήθηκε κατά την αναμενόμενη αναλογία και για τις δύο τεχνικές (Σχήμα S1c, D). Τα στοιχεία που επισημαίνονται τις ευρύτερες περιοχές της διαφορικής έκφρασης που παρατηρείται σε συστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων σε σύγκριση με τους ίδιους υποψήφιους σε αναλύσεις SILAC.

Επικύρωση SILAC προσδιορίζονται οι υποψήφιοι χρησιμοποιούν ανοσοαποτύπωση

Για να επικυρώσετε αναλογίες έκφραση SILAC των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται και στα δύο αντίγραφα, ανοσοκηλίδωση διεξήχθη (Σχήμα 3). Αυξημένη έκφραση σε T24T παρατηρήθηκε για γελσολίνη, Cul3, importins, nucleoporins και EGFR, και μειωμένη έκφραση βρέθηκε για εζρίνης, μοεσίνη, filamin, caveolin ή CD44, μεταξύ άλλων. Τα ανοσοστυπώματα ποσοτικοποιήθηκαν να συσχετίζονται με αναλογίες έκφραση που λαμβάνεται με SILAC και σε συστοιχίες γονιδίων. Με βάση την καλή συμφωνία αυτών των παρατηρήσεων για Cul3, μια πρωτεΐνη που είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στην ουβικιτινίωση και επακόλουθη υποβάθμιση των πρωτεϊνών στόχων, επιλέχθηκε για περαιτέρω αναλύσεις για: α) να αξιολογήσει κλινική σημασία της ως υποψήφια βιοδείκτη για την αξιολόγηση επιθετική κλινική συμπεριφορά , και β) να αξιολογήσει τις επιπτώσεις Cul3 στην επιθετική φαινότυπο του T24T και για ρύθμιση έκφρασης των άλλων διαφορικά εκφρασμένων πρωτεϊνών προσδιορίζονται από SILAC. Εικόνα S2 έδειξε την πρόσθετη επικύρωση από ανοσοστυπώματα των υποψηφίων διαφορικά εκφράζεται σε κύτταρα T24T σε συστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων που δεν ποσοτικοποιούνται με SILAC, και

αντίστροφα

, για την οποία τα αντισώματα ήταν διαθέσιμα. Δεν παρατηρούμε σημαντικές διαφορές σε πειραματικά μοριακά βάρη σε σύγκριση με το προβλεπόμενο μέγεθος.

(Α) Επικύρωση των αποτελεσμάτων SILAC επιλεγμένων πρωτεϊνών στα ανοσοστυπώματα των πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων από τα καρκινικά κύτταρα κύστης που αναλύθηκαν. Τα αποτελέσματα επικυρώθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών προσδιορίζονται από την πρωτεομική προσέγγιση, συμπεριλαμβανομένων διαφορικά και μη διαφορικά εκφραζόμενα υποψηφίων. έγιναν δεκτές Αντισώματα εμφανίζοντας μία μόνο κύρια ζώνη στα αναμενόμενα μοριακά βάρη: και α-τουμπουλίνης, χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. GSN, γκελσολίνη? Cul3, Cullin 3? IPO9. Importin 9? EGFR, υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα? NUP133, Nucleoporin 133? HSP70, πρωτεΐνη θερμικού σοκ 70kDa? MCM6, συντήρηση των μίνι χρωμοσωμάτων Complex Component 6? RCC1, Ρυθμιστής των χρωμοσωμάτων Συμπύκνωση 1? BCAS2, καρκίνωμα στήθους ενισχυμένη ακολουθία 2? DNM, Dynamin? NPM, Nucleophosmin? DCTN, Dynactin? CALR, Calreticulin? ΜΑΡΚ, Mitogen-Activated Protein Kinase? DDX21, DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) πολυπεπτίδιο κουτί 21? CDC2: Κυτταρικού Κύκλου Division 2? DNMT1, DNA (κυτοσίνη-5) μεθυλτρανσφεράσης 1? MSH6, MutS ομόλογο 6? RAB14, ΘΤΡάση Rab14? VDAC, Τάσης-εξαρτημένων ανιόντων κανάλι? CK18, Cytokeratin 18? CALD, καλδεσμόνη? CD44, CD44 ισομορφή αντιγόνο 1 πρόδρομος 2? EZR, Ezrin? MSN, μοεσίνη? ANXA2, αννεξίνη Α2? CPNE3, Copine 3? FLNA, Filamin Α?