Αφηρημένο

Ένα μεγάλο σώμα της στοιχεία υποστηρίζει καθοριστικό ρόλο για τη δυσλειτουργία των τελομερών στην καρκινογένεση λόγω η επαγωγή της χρωμοσωμικής αστάθειας. Για τη μελέτη των τελομερών σε προκαρκινικές αλλοιώσεις του παγκρέατος, μετρήσαμε τελομερών μήκη χρησιμοποιώντας ποσοτικές φθορισμού

in situ υβριδισμού

στην κανονική παγκρεατικού επιθηλίου πόρου, του παγκρέατος ενδοεπιθηλιακή νεοπλασίες (PanINs), και καρκίνους. Τα υλικά που χρησιμοποιούνται περιλαμβάνονται χειρουργικά δείγματα του παγκρέατος χωρίς καρκίνο (n = 33) και με διηθητικό καρκίνωμα πόρου (n = 36), καθώς και τον έλεγχο αυτοψία περιπτώσεις (n = 150). Σε σύγκριση με την κανονική αγωγούς, το μήκος των τελομερών ήταν μειωμένη σε PanIN-1, -2 και -3 και τον καρκίνο. Επιπλέον, τα τελομερή ήταν μικρότερη στον καρκίνο από ό, τι στην PanIN-1 και -2. το μήκος των τελομερών σε καρκίνο δεν συσχετίστηκε με ιστολογικό τύπο, τη θέση της βλάβης, ή το στάδιο του καρκίνου. PanINs με ή χωρίς καρκίνο έδειξε παρόμοια μήκη των τελομερών. Οι συχνότητες των άτυπων μίτωσης και ανάφαση γέφυρες, οι οποίες είναι μορφολογικά χαρακτηριστικά της χρωμοσωμικής αστάθειας, είχαν αρνητική συσχέτιση με το μήκος των τελομερών. Τα τελομερή σε φυσιολογικό επιθήλιο αγωγό έγινε μικρότερη με τη γήρανση, και εκείνες στις PanINs ή καρκίνους ήταν μικρότερη από ό, τι στους μάρτυρες ίδιας ηλικίας, γεγονός που υποδηλώνει ότι βράχυνσης των τελομερών συμβαίνει ακόμα και όταν ιστολογικές αλλαγές απουσιάζουν. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν έντονα ότι τελομερών συμβαίνει στα πρώιμα στάδια της παγκρεατικής καρκινογένεσης και εξελίσσεται με προκαρκινικές ανάπτυξη. Η περικοπή τελομερούς και χρωμοσωμική αστάθεια στο επιθήλιο αγωγό μπορεί να σχετίζεται με την καρκινογένεση του παγκρέατος. Προσδιορισμός του μήκους των τελομερών στα παγκρεατικού πόρου βλάβες μπορεί να είναι πολύτιμη για την ακριβή ανίχνευση και αξιολόγηση του κινδύνου καρκίνου του παγκρέατος

Παράθεση:. Matsuda Υ, Ishiwata Τ, Izumiyama-Shimomura Ν, Hamayasu Η, Fujiwara Μ, Tomita Ki, et al. (2015) Σταδιακή βράχυνσης των τελομερών και αύξηση χρωμοσωμική αστάθεια μεταξύ των τάξεων PanIN και Κανονική πορογενές Επιθήλια με και χωρίς καρκίνο στο πάγκρεας. PLoS ONE 10 (2): e0117575. doi: 10.1371 /journal.pone.0117575

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Arthur J. Lustig, Πανεπιστήμιο Επιστημών Υγείας Κέντρο Tulane, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 28 Οκτωβρίου 2014? Αποδεκτές: 28, Δεκεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 6 Φεβ 2015

Copyright: © 2015 Matsuda et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από μια επιχορήγηση-in-βοήθειας από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (C, Νο 25462127) και επιχορηγήσεις από το Cancer Research Institute του Πανεπιστημίου Kanazawa και ο Σύλλογος Αποφοίτων του Πανεπιστημίου Kagawa Ιατρική Σχολή Sanjukai με το Υ Matsuda. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η ετήσια επίπτωση του καρκίνου του παγκρέατος έχει αυξηθεί σε όλο τον κόσμο [1], και είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται [2]. Η πρόγνωση του καρκίνου του παγκρέατος παραμένει φτωχή με συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών περίπου 5% [1] λόγω της επιθετικής ανάπτυξης και το υψηλό ποσοστό της μετάστασης. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι ο καρκίνος του παγκρέατος δεν τίθεται de novo, αλλά μάλλον εξελίσσεται μέσω μιας διαδικασίας πολλών σταδίων που περιλαμβάνει μη επεμβατικές πρόδρομος αλλοιώσεις γνωστές ως παγκρεατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασίες (PanINs), η οποία πιστοποιείται με διηθητικό καρκίνο [3,4,5]. Μεταλλάξεις του

KRAS, CDKN2A, TP53

, και

Smad4

, οι οποίες είναι οι μεταλλάξεις του οδηγού σε καρκίνους του παγκρέατος, συσσωρεύονται σύμφωνα με τον ιστολογικό βαθμό PanINs και το αυτοκίνητο νεοπλασματικό μετασχηματισμό και την εξέλιξη του όγκου [6,7 ]. Υπάρχει μια εντυπωσιακή σχέση μεταξύ προχωρημένη ηλικία και αυξημένη συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του παγκρέατος [8,9], και αυτό μπορεί να αντιπροσωπεύει τις συνδυασμένες επιπτώσεις του φορτίου μετάλλαξης, επιγενετική ρύθμιση, δυσλειτουργία των τελομερών, και ένα περιβάλλον αλλαγμένη στρωματικά [10,11].

τα τελομερή είναι διαδοχικές επαναλήψεις του ΤΤΑΟΟΟ ακολουθία σε χρωμοσωμικές καταλήγει σε ευκαρυωτικά κύτταρα, και διαδραματίζουν καίριο ρόλο στην πρόληψη χρωμοσωμική αστάθεια [12,13,14]. Ενώ τελομεράση μεσολάβηση διατήρηση της λειτουργίας των τελομερών έχει αποδειχθεί ότι προάγει την ανάπτυξη προηγμένων κακοηθειών [15], υπάρχει εξίσου συναρπαστικό πειραματική απόδειξη ότι η έλλειψη της δράσης της τελομεράσης και ένα παροδικό χρονικό βράχυνσης των τελομερών και την έναρξη του καρκίνου κίνησης δυσλειτουργία με επαγωγή της χρωμοσωμικής αστάθειας [11,16]. Ο καρκίνος του παγκρέατος χαρακτηρίζεται από γενωμική πολυπλοκότητα και αστάθεια? βράχυνσης των τελομερών, απώλεια TP53,

K-RAS

μετάλλαξη, ανώμαλη μίτωση και την πυρηνική ανωμαλίες είναι όλοι συνεισφέρουν σε αυτό το φαινότυπο [17]. PanIN ελλιμενίζει επίσης χρωμοσωμική αστάθεια όπως βράχυνσης των τελομερών [18], ανευπλοειδία [19], η απώλεια της ετεροζυγωτίας [20], και μια απόκριση βλάβης του DNA που προκαλούνται από την ενεργοποίηση του αταξία-τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένη (ΑΤΜ) οδοφράγματος των β-κυττάρων του κύκλου κινάση-2 (Chk2) οδοφράγματος της οδού [21]. Βράχυνσης των τελομερών φαίνεται να προηγείται της ανάπτυξης του

TP53

μεταλλάξεις κατά τη διάρκεια του παγκρέατος καρκινογένεση [18,22,23]. Ωστόσο, τυχόν μεταβολές της λειτουργίας των τελομερών κατά το στάδιο της καρκινογένεσης παρέμειναν ασαφείς.

Χρησιμοποιώντας κηλίδωση Southern, έχουμε αναλύσει τα μήκη των τελομερών στα περισσότερα ανθρωπίνων οργάνων και ιστών, συμπεριλαμβανομένου και του παγκρέατος κεφάλι, και επιβεβαίωσε ότι τα τελομερή συντομεύσει με την ηλικία, εκτός από εκείνες εγκεφαλικό ιστό [24,25,26,27,28,29]. Το εκτιμώμενο ετήσιο ποσοστό μείωσης του μήκους των τελομερών στο πάγκρεας ήταν 36 ζεύγη βάσεων [27]. Έχουμε επιβεβαιώσει επίσης τις κατανομές του μήκους των τελομερών των διαφορετικών τύπων κυττάρων στο γλώσσα, του οισοφάγου, του στομάχου, του μαστού, του δέρματος, και νησιδίων του παγκρέατος χρήση ποσοτικών φθορισμού

σε in situ υβριδισμού

(Q-FISH) και την αρχική μας λογισμικού, Tissue Τέλο, χρησιμοποιώντας την τελομερών: αναλογία των τελομερών /κεντρομερίδιο (TCR) ή κανονικοποιημένη TCR (NTCR) [30,31,32,33,34,35,36,37,38]. Τελομερή στο αμέτοχος επιθήλιο που περιβάλλει το καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων

in situ

(CIS) της γλώσσας και του οισοφάγου ήταν μικρότερη από ό, τι εκείνες της ίδιας ηλικίας ελέγχους [34,39,40].

Στην παρούσα μελέτη, η υπόθεση ότι ο καρκίνος του παγκρέατος είναι πιθανό να προκύψουν σε αγωγό επιθήλιο με κοντή τελομερή και χρωμοσωμική αστάθεια. Χρησιμοποιώντας την τεχνική της μέτρησης Q-FISH μας, μήκους των τελομερών εκτιμήθηκαν σε παγκρεατικά επιθήλιο αγωγό με ή χωρίς καρκίνο, PanINs, και του παγκρέατος. Συγκρίναμε το μήκος των τελομερών των παγκρεατικών επιθηλίου αγωγού μεταξύ των περιπτώσεων που δείχνει καρκινικών αλλαγών και περιπτώσεις ελέγχου ίδιας ηλικίας. Μπορούμε επίσης ιστολογικά εκτιμάται ότι η παρουσία των άτυπων μίτωσης και ανάφαση γέφυρες όσο το δυνατόν μορφολογικά δείκτες της χρωμοσωμικής αστάθειας [41].

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και ιστοί

Τα παγκρεατικά ιστούς που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική θεραπεία στο Τόκιο Metropolitan Γηριατρικής Νοσοκομείο (S1 πίνακα). Για να αναλύσουμε το μήκος των τελομερών σε δείγματα πάγκρεας, χωρίς καμία παθολογική μεταβολή, χρησιμοποιήσαμε δείγματα αυτοψίας που λαμβάνονται στο Τόκιο Metropolitan Γηριατρικής Νοσοκομείο και το ιαπωνικό Ερυθρό Σταυρό Medical Center (S2 Πίνακας). Αυτά τα δείγματα αυτοψίας χρησιμοποιήθηκαν λόγω της δυσκολίας στη λήψη δειγμάτων του φυσιολογικού παγκρέατος unassociated με κακοήθεια ή φλεγμονή από χειρουργικά υλικά. Παρά το γεγονός ότι είχαμε την ανησυχία ότι μετά θάνατον αλλαγές θα μπορούσαν να επηρεάσουν τελομερών μήκος, είχαμε μελετήσει προηγουμένως μήκη των τελομερών σε δείγματα εγκεφάλου και της καρδιάς που λαμβάνεται μετά από διάφορα χρονικά διαστήματα μετά θάνατον χρησιμοποιώντας κηλίδωση Southern, και δεν βρήκε σημαντικές αλλαγές μεταξύ των χρονικών σημείων δειγματοληψίας [26]. Η παρούσα μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που περιέχονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι, το 2013, και όλα τα πειράματα έχουν εγκριθεί από τις επιτροπές δεοντολογίας του Τόκιο Metropolitan Γηριατρικής Νοσοκομείο και Ιατρικό Κέντρο Ιαπωνικού Ερυθρού Σταυρού. Ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση για τη χρήση των ιστών λήφθηκε από όλους τους ασθενείς ή οικογένειες των θυμάτων.

επεξεργασία ιστών και ιστολογική

αξιολόγηση

Οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε 10% ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε τυπική επεξεργασία των ιστών και εμβάπτιση σε παραφίνη. Οι ιστοί κόπηκαν σειριακά σε τμήματα των 3 μm πάχους για αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) χρώση, και σε τμήματα 2 μm πάχους για την Q-FISH. Παθολογικά δείγματα διαγνώστηκαν με παθολόγους μας (ΥΜ, HH, JA, TA, και ΚΤ) με βάση την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας Ταξινόμηση όγκοι του πεπτικού συστήματος [42]. Δείγματα της κανονικής παγκρεατικού πόρου χωρίστηκαν σε δύο ομάδες: φυσιολογικό επιθήλιο μικρό αγωγό (Ν-μικρά, παρεμβαλλόμενο αγωγός να ενδολόβιες αγωγό), και η κανονική μεγάλο αγωγό επιθήλιο (Ν-μεγάλο, interlobular αγωγός στο κύριο παγκρεατικό πόρο) (S1A Σχ.) . PanIN βλάβες ταξινομήθηκαν ως PanIN-1, -2 ή -3 [3,4] (S1A Εικ.). Πολλοί PanINs βρέθηκαν σε αμφότερες τις περιπτώσεις, χειρουργικά και αυτοψία περιπτώσεις (S1 Σχ. Β και C). Για την ανάλυση της κανονικής αγωγού και PanINs, εμείς επιλεγμένες περιοχές χωρίς φλεγμονή, η φλεγμονή είναι γνωστό ότι επηρεάζει το μήκος των τελομερών [43].

Ποσοτική φθορισμού

σε in situ υβριδισμού

(Q-FISH) για τη ανάλυση των τελομερών

Οι πλάκες υποβάλλονται σε επεξεργασία με τη μέθοδο FISH, όπως έχει ήδη αναφερθεί [30,31,32,33,39]. Τομές ιστού υβριδοποιήθηκαν με ανιχνευτές ΡΝΑ για την τελομερούς (TELO ιχνηλάτη C-Cy3, «5-CCCTAACCCTAACCCTAA-3 ‘? Fasmac, Kanagawa, Ιαπωνία) και η κεντρομεριδίου (Cenp1-FITC ανιχνευτή,« 5-CTTCGTTGGAAACGGGGT-3’? Fasmac) , και οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI (Molecular Probes, Eugene, OR, USA).

εικόνες FISH συλλήφθηκαν από μια κάμερα CCD (ORCA-ER-1394, Hamamatsu Photonics ΚΚ, Hamamatsu, Ιαπωνία) τοποθετημένα σε ένα μικροσκόπιο (80i, Nikon, Tokyo, Japan). ελέγχου μικροσκόπιο και απόκτησης εικόνας διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το πακέτο Image-Pro Plus λογισμικό (έκδοση 5.0, Media Κυβερνητικής & ΣΙΑ ΕΠΕ, Silver Spring, MD, USA). Οι εικόνες που έχουν ληφθεί αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το δικό μας λογισμικό, «TissueTelo Ver. 3.1 », η οποία εκτιμά τις TCRs των ατομικών πυρήνων, όπως έχει ήδη αναφερθεί [30,31,32,33,44]. Δεδομένου ότι δεν υπάρχει εγγύηση ότι η όλη πυρήνας θα συλληφθεί μέσα σε οποιαδήποτε δεδομένη τμήμα ιστού, το συνολικό διορθωμένο σήμα των τελομερών για κάθε πυρήνα κανονικοποιείται από την αντίστοιχη ολοκληρωμένη βέλτιστη πυκνότητα του κεντρομερίδιο [30,32]. τιμές TCR προσδιορίστηκαν από μεμονωμένα κύτταρα του Ν-μικρά, Ν-large, PanIN και ο καρκίνος, με βάση τα ιστολογικά ευρήματα της σειριακής Η &? Ε-χρωματισμένες τομές. Πάνω από 100 κύτταρα (μέση 187) αναλύθηκαν για κάθε δείγμα. Έχουμε λάβει επαρκή δεδομένα FISH για 66 Ν-μικρά, 61 Ν-large, 42 PanIN-1, 27 PanIN-2, 15 PanIN-3, και 34 δείγματα καρκίνου από χειρουργικά δείγματα και 150 Ν-μεγάλα δείγματα από δείγματα αυτοψίας.

Ως έλεγχος για τις διακυμάνσεις στην προετοιμασία του δείγματος, εκτελέσαμε επίσης Q-FISH σε τμήματα ενός παρασκευάσματος μπλοκ ενός καλλιεργημένου κυτταρικού στελέχους, TIG-1 (34 PDL: τελομερών μήκος, 8,57 kbp με ανάλυση κηλίδος Southern) [ ,,,0],45], και τα τοποθέτησαν στις ίδιες διαφάνειες όπως τα παγκρεατικά τμήματα. Η μέτρηση TCR για κάθε παγκρεατικών κυττάρων διαιρείται με το διάμεσο TCR για το μπλοκ κύτταρο ελέγχου στο ίδιο διαφάνεια για να δώσει το NTCR του κυττάρου [30,31].

Ανάλυση των άτυπων μιτωτικών αριθμών και γέφυρες ανάφαση

στοιχεία Μεταφασικά παρατηρήθηκαν σε × 400 μεγέθυνσης χρησιμοποιώντας εκπρόσωπος H & amp? Ε διαφάνειες από δύο παθολόγους μας (ΥΜ και JA). Πυκνωτικούς πυρήνες ή πυρήνες με βασεόφιλο κυτταρόπλασμα δεν θεωρήθηκαν ως μίτωση. Ένα άτυπο σχήμα μιτωτική ορίστηκε οτιδήποτε άλλο εκτός από την τυπική μορφή της κανονικής μίτωσης, συμπεριλαμβανομένων πολυπολικό μίτωση, μίτωση δαχτυλίδι, διασκορπισμένα μίτωση, ασύμμετρη μίτωση και υστέρηση τύπου μίτωσης [46]. Μια γέφυρα ανάφαση ορίστηκε ως νηματοειδή σύνδεση που συνδέει δύο καλά διαχωρισμένα και παράλληλες ευθυγραμμισμένες ομάδες χρωμοσωμάτων ανάφαση [41]. Μετρήσαμε τον αριθμό των μιτώσεων, άτυπα μιτώσεις και ανάφαση γέφυρες ανά 1000 πυρήνες στην κανονική αγωγό επιθήλιο, PanIN και ο καρκίνος, και υπολογίζονται τα αντίστοιχα ποσοστά των συνολικών μιτώσεις, άτυπα μιτώσεις και γέφυρες ανάφαση. Ο συνολικός αριθμός των μίτωση περιλαμβάνονται άτυπες μιτώσεις και γέφυρες ανάφαση.

Δήλωση Ηθικής

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που περιέχονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι, το 2008, και γραπτή συγκατάθεση για τη χρήση ιστών λήφθηκε από όλους τους ασθενείς ή οικογένειες των θυμάτων τους. Τα πειράματα που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Τόκιο Metropolitan Γηριατρικής Νοσοκομείο και Ινστιτούτο Γεροντολογίας (που καθιστά δυνατή τη # 260219).

Η στατιστική ανάλυση

Οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Φοιτητών

t

test ή Mann-Whitney U. Διαφορές μεταξύ πολλών ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία post hoc. Το τεστ chi-τετράγωνο χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. Το επίπεδο σημαντικότητας ορίστηκε στο

P & lt? 0

0.05 για όλες τις αναλύσεις. Με βάση την TCR, χαρακτηριστικό δέκτη-χειριστή (ROC) αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν, και η περιοχή κάτω από την τιμή της καμπύλης (AUC) προσδιορίστηκε. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του StatView J έκδοση 5.0 του λογισμικού πακέτου (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA) και XLSTAT (Addinsoft, New York, ΝΥ, USA).

Αποτελέσματα

τελομερών σε παγκρεατικά προκαρκινικές αλλοιώσεις

Ως μάρτυρας στην ανάλυση Q-FISH, ένα μπλοκ των κυττάρων TIG-1 τοποθετήθηκε στην ίδια αντικειμενοφόρο, μαζί με κάθε πάγκρεας δείγμα (Εικ. 1Α). Τα τελομερή (κόκκινο) ήταν εμφανείς στους πυρήνες του κανονικού αγωγού (Εικ. 1 Β και C, τα βέλη), ενώ PanIN-1, -2 και -3, και του καρκίνου έδειξαν ασθενή σήματα των τελομερών (Εικ. 1 D, Ε, F και G ). Προσδιορίσαμε την TCR κάθε βλάβης, χρησιμοποιώντας τον ιστό Telo πακέτο λογισμικού. Οι κατανομές της έντασης των τελομερών που υποδεικνύεται από TCR έδειξε μία μείωση του μήκους των τελομερών σε PanINs και καρκίνων σε σύγκριση με την κανονική αγωγό (S2 Σχ. Α και Β). Σε σύγκριση με το κανονικό αγωγό (Ν-μικρών και Ν-μεγάλο), οι τιμές NTCR για PanIN-1, -2, και -3 και ο καρκίνος ήταν σημαντικά μειωμένη (Εικ 1Η,

P & lt?. 0

0.05 ). Επιπλέον, οι τιμές NTCR για τον καρκίνο ήταν χαμηλότερες από εκείνες για PanIN-1 και -2 (Σχήμα 1,

P & lt?. 0

.05). Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των μικρών και μεγάλων επιθήλιο αεραγωγών. Η NTCR για την κανονική αγωγών και PanINs με και χωρίς καρκίνους έδειξε επίσης σημαντικές διαφορές (S3 Εικ., Γκρι γραμμή vs λευκή γραμμή). Η NTCR για καρκίνους του παγκρέατος δεν έδειξε συσχέτιση με το στάδιο του όγκου, την τοποθεσία ή ιστολογική ταξινόμηση (S3 Πίνακας).

Original μεγέθυνση, χ400. Κόκκινο, τελομερών-Cy3 σήμα? πράσινο, κεντρομερίδιο-FITC σήμα? μπλε, DAPI αντικηλίδωση για το DNA. (Α) Q-FISH εικόνα του ελέγχου μπλοκ κυττάρων TIG-1 τοποθετείται στην ίδια αντικειμενοφόρο, μαζί με τα τμήματα του παγκρέατος. (Bg) εικόνες Q-FISH της κανονικής μικρό αγωγού (Ν-small) (β), η κανονική μεγάλο αγωγό (Ν-large) (γ), PanIN-1 (δ), PanIN-2 (ε), PanIN-3 ( στ), και παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα επεμβατική (g). σήματα τελομερούς ήταν εμφανείς σε φυσιολογικά μικρό αγωγό (b, βέλη) και κανονικό μεγάλο αγωγού (c, βέλη), ενώ τα σήματα των τελομερών μειώθηκε από PanIN-1 προς PanIN-3 με βάση την οπτική εκτίμηση (d, e και f). σήματα τελομερούς ήταν μόλις ορατές σε καρκινικά κύτταρα (g). (H) Θηκόγραμμα-και-whisker του NTCR για κάθε μία από τις παγκρεατικού πόρου αλλοιώσεις χειρουργικά από ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος (n = 36) και χωρίς καρκίνο του παγκρέατος (η = 33). *

P & lt?. 0

05

vs Ν-μικρές και Ν-μεγάλο. †

P & lt?.. 0

05

vs Ν-μικρά, Ν-μεγάλα, PanIN-1 και -2

Η

το μήκος των τελομερών και χρωμοσωμική αστάθεια

τα άτυπα μιτώσεις συμπεριλαμβανομένων πολυπολικό μιτώσεις (Εικ. 2Α) και μιτώσεις δακτυλίου (Σχ. 2Β), καθώς και ανάφαση γέφυρες (Σχ. 2C), παρατηρήθηκαν σε καρκίνους του παγκρέατος. Μιτώσεις ήταν πολύ λίγες στην κανονική αγωγό, ενώ PanIN και τον καρκίνο έδειξε μια αύξηση του αριθμού των μιτώσεων (Πίνακας 1, *

P & lt? 0

05, ** P & lt?.. 0

01

). Άτυπα μιτώσεις και γέφυρες ανάφαση δεν ανιχνεύθηκαν στο κανονικό αγωγό, αλλά αυξήθηκαν σε καρκίνο (Πίνακας 1, *

P & lt? 0

05, ** P & lt?.. 0

01

). Καρκίνοι του παγκρέατος είχε ένα μιτωτικό δείκτη 0,7%, και το 26% των μιτώσεις ήταν άτυπη ή εμπλέκονται γέφυρες ανάφαση.

(α-γ) Εκπρόσωπος άτυπη μιτωτικά σχήματα. Τα βέλη υποδεικνύουν πολυπολικό μίτωση (α), της μίτωσης δακτύλιο (b), και ένα γέφυρα ανάφαση (γ). (Δ και ε) Συσχέτιση μεταξύ NTCR και μίτωση για τις βλάβες στο σύνολό της (δ) και τη συνολική του καρκίνου μείον (ε). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το ποσοστό του συνολικού μιτωτικών Σχημάτων μεταξύ του συνολικού αριθμού των κυττάρων. (Στ και ζ) Συσχέτιση μεταξύ NTCR και το ποσοστό των άτυπων μιτώσεων ή γέφυρες ανάφαση μεταξύ των βλαβών στο σύνολό της (στ) και η συνολική του καρκίνου μείον (g). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το ποσοστό των άτυπων μιτώσεων ή γέφυρες ανάφαση μεταξύ του συνολικού αριθμού των μιτωτικής στοιχεία.

Η

Βρήκαμε μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ της NTCR και τη συχνότητα των μιτώσεων (Εικ. 2D, όλες οι βλάβες,

P & lt? 0

0001

, R

2 = 0.075?… Σχήμα 2Ε, βλάβες εκτός από τους καρκίνους,

P = 0

0098

, R

2 = 0,031). Η συχνότητα των άτυπων μιτώσεων ή γέφυρες ανάφαση έδειξαν επίσης μια αρνητική συσχέτιση με NTCR (Σχήμα 2F, όλες οι βλάβες,

P & lt?. 0

0001

, R

2 = 0,121? Εικ. . 2G, βλάβες εκτός από τους καρκίνους,

P = 0

.

0262

, R

2 = 0.023).

τελομερών σε μη καρκινικό επιθήλιο αγωγού

Για την εκτίμηση μεταβολές των τελομερών στα κύτταρα, χωρίς ιστολογική αλλαγή, αναλύσαμε το μήκος των τελομερών σε μη καρκινικό επιθήλιο αγωγού (Ν-μεγάλο), χρησιμοποιώντας δείγματα αυτοψίας. Η NTCR για φυσιολογικό επιθήλιο του αγωγού σχετίστηκε αρνητικά με την αύξηση της ηλικίας (Σχήμα 3Α, μαύρη γραμμή,

P & lt?.. 0

0001

, R

2 = 0.327). Χωρίσαμε τις αυτοψία περιπτώσεις σε δύο ομάδες, δηλαδή αυτές με και χωρίς PanINs, και οι ασθενείς με PanIN ήταν μεγαλύτερα από ασθενείς της ομάδας ελέγχου (S2 πίνακα, ***

P & lt?. 0

0001

). Στις ομάδες ελέγχου και PanIN, υπήρχε μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ NTCR και την ηλικία (Σχήμα 3Α?. Έλεγχος, μπλε γραμμή,

P & lt?. 0

0001

, R

2 = 0.296? PanIN, πράσινη γραμμή,

P & lt?. 0

0001

, R

2 = 0.252). Η NTCR για την κανονική επιθήλιο αγωγό μειώθηκε κατά 29% στην ομάδα PanIN σχέση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 3Β, **

P & lt?.. 0

01

vs ελέγχου). αναλύσεις ίδιας ηλικίας αποκάλυψε μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ της NTCR για φυσιολογικό επιθήλιο του αγωγού και την ηλικία (Σχ. 3C, μαύρη γραμμή,

P = 0

.

0001

, R

2 = 0,111 ). Στην ομάδα PanIN υπήρχε μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ NTCR για το φυσιολογικό επιθήλιο του αγωγού και την ηλικία (Σχήμα 3C?.. Πράσινη γραμμή,

P = 0

0002

, R

2 = 0,183), ενώ η σχέση αυτή δεν ήταν στατιστικά σημαντική στην ομάδα ελέγχου (Σχήμα 3C?. μπλε γραμμή,

P = 0

1934

, R

2 = 0,041).. Η NTCR για το φυσιολογικό επιθήλιο αγωγό μειώθηκε κατά 16% στην ομάδα PanIN σε σχέση με την ηλικία μάρτυρες (Σχήμα 3D, *

P & lt?.. 0

05

vs ελέγχου)

(α) NTCR στο φυσιολογικό επιθήλιο του αγωγού σε 150 αυτοψία περιπτώσεις σχετίστηκε αρνητικά με την ηλικία για τις περιπτώσεις συνολικά (n = 150, μαύρο), η ομάδα ελέγχου (n = 77, μπλε) και η ομάδα PanIN ( n = 73, πράσινο). (Β) Σύγκριση των NTCR στο φυσιολογικό επιθήλιο αγωγός μεταξύ του ελέγχου και των ομάδων PanIN. **

P & lt?. 0

01

vs ελέγχου. (Γ) NTCR σε φυσιολογικό επιθήλιο αγωγό από άτομα ηλικίας άνω των 50 ετών (n = 113). Μπλε, ελέγχου (n = 43)? πράσινο, ομάδα PanIN (n = 70). (Δ) Σύγκριση των NTCR στο φυσιολογικό επιθήλιο αγωγός μεταξύ του ελέγχου και των ομάδων PanIN. *

P & lt? 0

05

vs έλεγχο

Η

Για συνολικό αναλύσεις της αυτοψίας και χειρουργικά περιπτώσεις, χωρίσαμε τις περιπτώσεις σε τρεις ομάδες:.. Ελέγχους ( χωρίς PanIN και τον καρκίνο του παγκρέατος), περιπτώσεις με PanIN, και περιπτώσεις με καρκίνο του παγκρέατος. Η NTCR για το φυσιολογικό επιθήλιο αγωγό παρουσίασε αρνητική συσχέτιση με την ηλικία (Σχήμα 4Α?. Μαύρη γραμμή,

P & lt? 0

0001

, R

2 = 0.290.). Στον έλεγχο και ομάδες PanIN, NTCR σχετίστηκε αρνητικά με την ηλικία (Σχήμα 4Α?. Έλεγχος, μπλε γραμμή,

P & lt? 0

0001

, R

2 = 0,293?. PanIN , πράσινη γραμμή,

P & lt?. 0

0001

, R

2 = 0.220). Στην ομάδα του καρκίνου του παγκρέατος, η σχέση μεταξύ της ηλικίας και NTCR δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Εικ. 4Α, κόκκινη γραμμή,

P = 0

.

5147

, R

2 = 0.015) . Στην ομάδα PanIN και της ομάδας καρκίνου του παγκρέατος, ο NTCR μειώθηκε κατά 26% και 23%, αντίστοιχα, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 4Β, *

P & lt?.. 0

05

**

P & lt?. 0

01

vs ελέγχου). αναλύσεις ίδιας ηλικίας έδειξαν μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ της NTCR για το φυσιολογικό επιθήλιο του αγωγού και την ηλικία (Εικ. 4C, μαύρη γραμμή,

P = 0

.

0001

, R

2 = 0,081). Οι ομάδες PanIN έδειξαν επίσης μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ NTCR και την ηλικία (Εικ. 4C, πράσινη γραμμή,

P = 0

.

0002

, R

2 = 0,155), ενώ καμία τέτοια συσχέτιση ήταν εμφανής στις ομάδες ελέγχου και του καρκίνου του παγκρέατος (Σχήμα 4C?. έλεγχος, μπλε γραμμή,

P = 0

1004

, R

2 = 0.048?. καρκίνο του παγκρέατος, κόκκινο γραμμή,

P = 0

.

5147

, R

2 = 0.015). Η NTCR μειώθηκε κατά 15% στην ομάδα PanIN και κατά 9% στο παγκρέατος ομάδα του καρκίνου σε σχέση με τα αντίστοιχης ηλικίας μάρτυρες (Σχήμα 4D, *

P & lt?.. 0

05

vs ελέγχου).

(α) NTCR στο φυσιολογικό επιθήλιο αγωγό σε 150 αυτοψία και 69 χειρουργικά περιπτώσεις σχετίστηκε αρνητικά με την ηλικία, στις περιπτώσεις συνολικά (n = 219, μαύρο), η ομάδα ελέγχου (n = 91, μπλε) και η ομάδα PanIN (n = 92, πράσινο), αλλά η σχέση δεν ήταν στατιστικά σημαντική στην ομάδα καρκίνου του παγκρέατος (η = 36, κόκκινο). (Β) Σύγκριση των NTCR στο φυσιολογικό επιθήλιο αγωγός μεταξύ του ελέγχου, PanIN και παγκρεατικό καρκίνο ομάδες. *

P & lt?. 0

05

vs ελέγχου. **

P & lt?. 0

01

vs ελέγχου. (Γ) NTCR στο φυσιολογικό επιθήλιο αγωγού από άτομα ηλικίας άνω των 50 ετών (n = 182). Μπλε, ελέγχου (n = 57)? πράσινο, PanIN (n = 189)? κόκκινο, παγκρεατικό καρκίνο ομάδα (n = 36). (Δ) Σύγκριση των NTCR στο φυσιολογικό επιθήλιο αγωγού μεταξύ των ελέγχου, PanIN και παγκρεατικό καρκίνο ομάδες. *

P & lt?.. 0

05

vs έλεγχο

Η

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη αποκάλυψε ότι τα τελομερή στα ιστολογικά φυσιολογικό επιθήλιο αγωγό που συνδέεται με PanINs ή καρκίνους ήταν μικρότερη από αυτές σε κανονικό επιθήλιο αγωγό unassociated με PanINs ή καρκίνους, και ότι τα τελομερή μειωθεί προοδευτικά από PanIN-1 προς PanIN-3. Aging, μαζί με την αυξημένη συχνότητα εμφάνισης PanINs, επίσης συσχετίστηκε με σημαντική βράχυνση των τελομερών σε φυσιολογικό επιθήλιο αγωγού. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι σε ηλικιωμένους, το επιθήλιο αγωγός, που φιλοξενεί συντομευμένη τελομερή, μπορεί να οδηγήσουν σε PanINs και του παγκρέατος. Επιπλέον, σε σύγκριση με τους ελέγχους της ίδιας ηλικίας, τα τελομερή σε ιστολογικά φυσιολογικό επιθήλιο πόρου ήταν μικρότερη σε άτομα με PanINs ή καρκίνους, υποδηλώνοντας ότι παράγοντες άλλοι από ηλικία θα μπορούσε να επηρεάσει το μήκος των τελομερών. Προηγουμένως, έχουμε αναφερθεί ότι το επιθήλιο υπόβαθρο της ΚΑΚ στον οισοφάγο, τη γλώσσα, και το δέρμα έχει μικρότερη τελομερή και πιο χρωμοσωμική αστάθεια από ιστό ελέγχου [34,36,40]. Στο σύνολό τους, κρίσιμη δυσλειτουργία των τελομερών στο παρασκήνιο, πιθανώς λόγω των υψηλότερων ετήσιων φθορά των τελομερών, ενδέχεται να οδηγήσει σε χρωμοσωμική αστάθεια και την καρκινογένεση στο παγκρεατικού πόρου επιθήλιο.

Μια προηγούμενη μελέτη χρησιμοποιώντας ανάλυση FISH έχει δείξει ότι η βράχυνση των τελομερών ήταν σχεδόν καθολική σε όλες τις ιστολογικές ποιότητες PanIN [18]. Στη μελέτη αυτή, Heek et al. καθορισμένο μήκος των τελομερών σε 10 πυρήνες από κάθε αλλοίωση, και ως εκ τούτου η ετερογένεια της κατανομής μήκους του τελομερούς μπορεί να επηρέασαν τα αποτελέσματά τους. Σε αντίθεση, προσδιορίσαμε το μήκος των τελομερών σε πάνω από 100 πυρήνες από κάθε αλλοίωση, και βρήκε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του μήκους των τελομερών και PanIN ιστολογική βαθμού. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τελομερών σε μη επεμβατική βλάβες του παγκρεατικού πόρου επάγουν συσσώρευση των χρωμοσωμικών ανωμαλιών, που οδηγεί στην ανάπτυξη της διεισδυτικής πορογενές αδενοκαρκινώματα.

Τόσο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τη δράση της τελομεράσης επιρροή των τελομερών. Στην παρούσα μελέτη, ο μιτωτικός δείκτης σχετίστηκε αρνητικά με το μήκος των τελομερών, αντανακλώντας το γεγονός ότι τα τελομερή γίνονται μειωθεί Κάθε φορά που ένα κύτταρο διαιρείται. Ένα υψηλότερο ποσοστό κυτταρικού πολλαπλασιασμού οφείλεται σε φλεγμονή και επακόλουθη αναγέννηση του ιστού μπορεί να οδηγήσει σε ταχύτερη βράχυνση των τελομερών. Ωστόσο, δεν αναλύει την σχέση μεταξύ της δραστηριότητας της τελομεράσης, αναλογία κυτταρικής ανάπτυξης και του μήκους των τελομερών, επειδή η χρήση του μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη εγκλεισμένοι σε παραφίνη ιστοί κάνει αυτό αδύνατο.

καρκίνων του παγκρέατος, προσδιορίσαμε επίσης υψηλή συχνότητα εμφάνισης ανάφαση γέφυρες και άτυπες μιτώσεις, αντιπροσωπεύοντας περίπου το ένα τέταρτο του συνόλου των μιτώσεων. Μια προηγούμενη μελέτη του παγκρεατικού κυτταρικές σειρές καρκίνου έδειξε ότι οι γέφυρες ανάφαση ήταν ανιχνεύσιμα σε 14-50% των κυττάρων ανάφαση σε συνδυασμό με τον κύκλο γέφυρα-θραύση σύντηξης που προκαλείται από δυσλειτουργία τελομερών [18]. Οι κακοήθεις όγκοι φαίνεται να αντιπροσωπεύουν μία ετερογενή ομάδα που μπορεί να ταξινομούνται με βάση τόσο χρωμοσωμική αστάθεια και το μηχανισμό συντήρησης τελομερούς. Μεταξύ του ορθού, εκείνα με χρωμοσωμική αστάθεια δείχνουν μικρότερη τελομερή και την ενεργοποίηση της τελομεράσης, ενώ εκείνα με χρωμοσωμική σταθερότητα δείχνουν επιμήκυνση των τελομερών χωρίς λίπος και την ενεργοποίηση της τελομεράσης [47]. Στην παρούσα μελέτη, όλοι οι επεμβατικές παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα εμφάνισαν σημαντικά μικρότερη τελομερή. Μια προηγούμενη έκθεση έδειξε ότι κυψελωτά-to-πορογενές μεταπλασία συνυπάρχουν με PanIN παρουσιάζει επίσης τελομερών? Ως εκ τούτου, κυψελοειδή-to-πόρου μεταπλασία έχει θεωρηθεί πρόδρομος αλλοίωση παγκρεατικού καρκίνου [48]. Στο σύνολό τους, τα διαθέσιμα στοιχεία δείχνουν ότι τελομερών που εξαρτάται από χρωμοσωμική αστάθεια μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση του παγκρέατος.

ευρήματα της μελέτης μας δείχνουν ότι ο προσδιορισμός του μήκους των τελομερών στα κύτταρα που λαμβάνονται με βιοψία ή σε δείγματα του παγκρέατος χυμός μπορεί να είναι της αξίας τόσο για τον εντοπισμό και την αξιολόγηση του κινδύνου καρκίνου του παγκρέατος. ROC αναλύσεις για διάκριση μεταξύ βλαβών στο πάγκρεας καρκίνο (συμπεριλαμβανομένων PanIN-3 και καρκίνοι) και μη-καρκινικό ιστό (συμπεριλαμβανομένων των κανονικών αγωγού, PanIN-1 και -2) με χρήση NTCR αποκάλυψε την χρησιμότητα του μήκους του τελομερούς ως δείκτη της ευαισθησίας στον καρκίνο (S4 Εικ .). Η AUC για NTCR ήταν 0.869, είναι παρόμοια με εκείνη του CA19-9 ορού [49,50].

παγκρέατος νευροενδοκρινείς όγκους συχνά παρουσιάζουν αλλαγμένη επιμήκυνση των τελομερών (ALT), που ανιχνεύονται με τις μεγαλύτερες κηλίδες των σημάτων των τελομερών [51], αλλά στην παρούσα μελέτη, δεν είναι μεγαλύτερο κηλίδες των σημάτων των τελομερών ήταν εμφανείς στο παγκρεατικό πόρο και καρκίνους. Αν και η μέθοδος Q-FISH μας είναι εξαιρετικά ακριβή και να αναπαραχθούν, έχει αρκετά μειονεκτήματα: (1) δεν μπορεί να αξιολογηθεί Η παρουσία της σύντηξης των τελομερών. (2) Κάθε ανωμαλία του κεντρομερίδιο θα μπορούσαν να επηρεάσουν την αναλογία των τελομερών /κεντρομερίδιο. (3) Όπως και με άλλες μεθόδους FISH, δεν είναι δυνατόν να ανιχνευθούν σήματα τελομερών και κεντρομεριδίου εάν οι μέθοδοι σταθεροποίησης ή άλλες τεχνικές προετοιμασίας του δείγματος είναι ακατάλληλα.

Εν κατακλείδι, τελομερών εμφανίζεται στο παγκρεατικού πόρου επιθήλιο στο πρώιμο στάδιο της καρκινογένεσης σε απουσία οποιωνδήποτε εμφανής ιστολογικές αλλαγές. Κρίσιμα συντομευθεί τελομερή στον παγκρεατικό επιθήλιο αγωγού και σε μη επεμβατική πόρου αλλοιώσεις οδηγούν σε συσσώρευση των χρωμοσωμικών ανωμαλιών, και με τη σειρά του στην ανάπτυξη του παγκρεατικού πόρου επεμβατική αδενοκαρκινώματα μέσω PanINs. Προσδιορισμός του μήκους των τελομερών στα παγκρεατικού πόρου βλάβες μπορεί να είναι χρήσιμες για την ακριβή εκτίμηση ανίχνευση και τον κίνδυνο καρκίνου του παγκρέατος.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Παγκρεατικού πόρου, μη επεμβατική πόρου αλλοιώσεις και επεμβατική πορογενές αδενοκαρκινώματα.

(Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του Ν-μικρών (ενδολόβιες αγωγός, βέλη), Ν-μεγάλα (interlobular αγωγοί, βέλη), PanIN-1, -2, -3 και , και τον καρκίνο του παγκρέατος. (Β και γ) Επίπτωση των PanIN κατά ηλικία σε χειρουργικά (b, n = 36) και αυτοψία (c, n = 150) περιπτώσεις του καρκίνου του παγκρέατος. PanIN-1 έγινε πιο κοινά με την αύξηση της ηλικίας, ενώ PanIN-3 δεν βρέθηκε σε περιπτώσεις χωρίς καρκίνο του παγκρέατος

doi:. 10.1371 /journal.pone.0117575.s001

(ΔΕΘ)

S2 Εικ. Κατανομές ένταση των τελομερών που εκφράζεται ως TCR σε TIG-1 κύτταρα, παγκρεατικού πόρου, και πορογενές αλλοιώσεων.

TCR έτεινε να είναι χαμηλότερη σε PanIN και τον καρκίνο βλάβες σε σχέση με το φυσιολογικό επιθήλιο αγωγού (Ν-μικρών και Ν-μεγάλο) σε μια περίπτωση του καρκίνου του παγκρέατος (α) και σε μια περίπτωση χωρίς καρκίνο του παγκρέατος (β)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0117575.s002

(ΔΕΘ)

S3 Εικ. Σύγκριση NTCR σε διάφορους τύπους ιστού μεταξύ του παγκρέατος περιπτώσεων και ελέγχων καρκίνου.

Δεν υπήρχαν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε NTCR μεταξύ περιπτώσεων καρκίνου (γκρι μπάρα) και τους ελέγχους (λευκή ράβδος). ΝΔ, καμία διαφορά

doi:. 10.1371 /journal.pone.0117575.s003

(ΔΕΘ)

S4 Εικ. ROC ανάλυση καμπύλης του NTCR για την ανίχνευση του καρκίνου του παγκρέατος.

NTCR για χειρουργικά περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκε στην ανάλυση ROC για διάκριση μεταξύ καρκίνο του παγκρέατος (συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου και PanIN-3) και μη-καρκινικές αγωγός (συμπεριλαμβανομένων φυσιολογικών αγωγού και PanIN-1 . και -2)

doi: 10.1371 /journal.pone.0117575.s004

(ΔΕΘ)

S1 πίνακα. Χαρακτηριστικά και συχνότητα των PanINs σε χειρουργικά περιπτώσεις

doi:. 10.1371 /journal.pone.0117575.s005

(DOCX)

S2 πίνακα. Χαρακτηριστικά και συχνότητα των PanINs σε αυτοψία περιπτώσεις

doi:. 10.1371 /journal.pone.0117575.s006

(DOCX)

S3 πίνακα. το μήκος των τελομερών και κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικά χειρουργικά παγκρέατος περιπτώσεις καρκίνου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0117575.s007

(DOCX)