Αφηρημένο

Ιστορικό

ακριβή ανίχνευση των χαρακτηριστικών πρωτεϊνών που εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου σε βιολογικά υγρά θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως ένας βιοδείκτης για την ασθένεια. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιοριστούν και την επικύρωση νέων βιοδεικτών του ορού και καταδεικνύουν πιθανή χρησιμότητα τους για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου

Μέθοδοι

Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε τρεις διαδοχικές φάσεις:. 1) ανακάλυψη βιοδεικτών, 2) την τεχνική και βιολογικών επικύρωση, και 3) απόδειξη της έννοιας για να δοκιμαστεί η πιθανή κλινική χρήση επιλεγμένων βιοδεικτών. Μια προτεραιότητα υποσύνολο των γονιδίων διαφορικά-εκφρασμένα μεταξύ τύπων ιστού (50 βλεννογόνου του παχέος εντέρου από καρκίνο χωρίς άτομα και 100 ζεύγη κανονική του όγκου από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου) ελέγχθηκε και δοκιμάστηκε περαιτέρω σε μια σειρά δειγμάτων ορού από 80 κόλον περιπτώσεων καρκίνου, 23 ασθενείς με αδένωμα και 77 του καρκίνου χωρίς ελέγχους.

αποτελέσματα

Στη φάση ανακάλυψης, εντοπίστηκαν 505 μοναδική υποψήφια βιοδείκτες, με ιδιαίτερα σημαντικά αποτελέσματα και υψηλή ικανότητα να διακρίνει μεταξύ των διαφορετικών τύπων ιστών. Μετά από επακόλουθη ιεράρχηση, ελέγχονται όλα τα γονίδια (Ν = 23) είχαν επιτυχώς επικυρωθούν σε ιστό, και ένας από αυτούς, COL10A1, έδειξε σημαντικές διαφορές στα επίπεδα ορού της πρωτεΐνης μεταξύ των ελέγχων, οι ασθενείς με αδένωμα (p = 0,0083) και των περιπτώσεων καρκίνου του παχέος εντέρου (p = 3.2e-6).

Συμπέρασμα

Σας παρουσιάζουμε μια διαδοχική διαδικασία για τον προσδιορισμό και την περαιτέρω επικύρωση των βιοδεικτών για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου που προσδιορίζει τα επίπεδα COL10A1 πρωτεΐνης στον ορό ως πιθανή διαγνωστική υποψήφιος για τον εντοπισμό των δύο βλάβες αδενώματος και καρκίνου.

επιπτώσεων

Η χρήση του ένα φτηνό ορού δοκιμής για τον προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου του παχέος εντέρου θα πρέπει να βελτιώσει τα ποσοστά συμμετοχής της και να συμβάλει στη μείωση της επιβάρυνσης της ασθένειας αυτής.

Παράθεση: Solé X, CROUS-Bou Μ, Cordero D, Olivares D, E Guinó, Sanz-Παμπλόνα R, et al. (2014) Ανακάλυψη και επικύρωση νέων πιθανών βιοδεικτών για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (9): e106748. doi: 10.1371 /journal.pone.0106748

Επιμέλεια: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Ισπανία

Ελήφθη: 23 Απρίλη του 2014? Δεκτές: 1 του Αυγούστου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Σεπτεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Solé et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Το σύνολο των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης είναι διαθέσιμη στο Εθνικό Κέντρο Gene Expression Omnibus Biotechnology Information με αριθμό ένταξης σειρά GEO GSE44076. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από την καταλανική Ινστιτούτο Ογκολογίας (ICO) και του ιδιωτικού Ιδρύματος Ιατροβιολογικών Ερευνών Ινστιτούτο Bellvitge (IDIBELL), η Instituto de Salud Carlos III [χορηγεί PI08-1635, PI08-1359, PS09-1037, PI11-1439], CIBERESP CB06 /02/2005 και το «Acción Εγκάρσια del Καρκίνου», η καταλανική κυβέρνηση DURSI [επιχορήγηση 2009SGR1489], η Fundació Προσωπικά Όλγα Τόρες (ΕΔΠ), η Ισπανική Ένωση κατά του Καρκίνου (AECC) Επιστημονικό Ίδρυμα, η Ευρωπαϊκή Επιτροπή [χορηγήσει FP7-COOP-Υγεία-2007-B HiPerDART], και Xarxa de Bancs de όγκοι de Catalunya χρηματοδοτείται από Pla Διευθυντής d’Oncología de Catalunya (XBTC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν καταθέσει δίπλωμα ευρεσιτεχνίας σχετικά με τη χρήση των COL10A1 ως βιοδείκτη για την έγκαιρη διάγνωση της καρκίνο του παχέος εντέρου με τίτλο: «ΟΡΟΣ βιοδεικτών για τη διάγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου». Ευρωπαϊκή αριθμός διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας: EP2680003A1 (28.06.2012) και την Ισπανία ES2436667A2 (03/01/2014). Οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι αυτό δεν μεταβάλλει την προσκόλλησή τους σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η κύρια αιτία θανάτου σε όλο τον κόσμο, με πάνω από το ένα εκατομμύρια νέες περιπτώσεις και μισό εκατομμύριο θανάτους σε όλο τον κόσμο κάθε χρόνο [1]. Πέντε χρόνια σχετικούς ρυθμούς επιβίωσης είναι κάτω από 50%, αλλά αυτό εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το στάδιο κατά το χρόνο της διάγνωσης [2]. Δεν πρωτογενή προληπτικό μέτρο έχει αποδεδειγμένη αποτελεσματικότητα στη μείωση της συχνότητας εμφάνισης, αλλά η έγκαιρη ανίχνευση μέσω του προσυμπτωματικού ελέγχου του πληθυσμού έχει βρεθεί για να μειώσει τη θνησιμότητα [3].

Σήμερα δεν υπάρχει συζήτηση σχετικά με το ποια δοκιμή θα πρέπει να χρησιμοποιείται για CRC έλεγχο. Μέχρι περαιτέρω στοιχεία συλλέγονται, τρέχουσες ευρωπαϊκές κατευθυντήριες γραμμές αποδέχονται την απόκρυφη κοπράνων εξέταση αίματος που ακολουθείται από επαναληπτική κολονοσκόπηση, η οποία είναι θεραπευτική, όταν χειρουργήσιμη αδενώματα προσδιορίζονται [4]. Τα περισσότερα προγράμματα προσυμπτωματικού ελέγχου βάσει πληθυσμού χρησιμοποιώντας guaiac Τεστ Κρυφού βάση το αίμα, το οποίο ανιχνεύει βιοχημικά μικρά ίχνη αίματος που προέρχεται από αιμορραγικών βλαβών στα κόπρανα, ή κοπράνων ανοσολογική δοκιμή, η οποία βασίζεται στην ανοσοανίχνευση της ανθρώπινης αιμοσφαιρίνης στα κόπρανα. Αυτές οι δοκιμές έχουν μια ευαισθησία 80% για CRC και 28% για αδενώματος & gt? 1 cm, και τις ιδιαιτερότητες στην περιοχή από 91 έως 94% [5]. Επιπλέον, η συμμόρφωση του ασθενούς με δοκιμασίες που βασίζονται σε σκαμνί τείνει να είναι χαμηλή [6]. Η χρήση της κολονοσκόπησης ως ένα χρυσό πρότυπο για CRC ελέγχου είναι αμφιλεγόμενη. Έχει αναφερθεί υψηλότερη ευαισθησία (97%) και ειδικότητα (98%) για την έγκαιρη ανίχνευση του CRC, αλλά έχει επίσης πολλές παγίδες που σχετίζονται με αυτό: αυξημένο οικονομικό κόστος? απαίτηση άρτια εκπαιδευμένο προσωπικό? άβολα προετοιμασία του εντέρου? εισβολής? κίνδυνο νοσηρότητας και θνησιμότητας που συνδέονται με τη διαδικασία [7], [8]. Επιπλέον, σε χώρες όπου η εθνική κολονοσκόπηση προσυμπτωματικού ελέγχου είναι διαθέσιμη, η συμμόρφωση ήταν συχνά χαμηλή [9].

δείκτες ορού βάση θα είναι ιδιαίτερα ελκυστική για CRC ελέγχου, δεδομένου ότι είναι ελάχιστα επεμβατική και θα μπορούσε να ενσωματωθεί σε οποιαδήποτε ρουτίνα της υγείας τσεκάπ χωρίς την ανάγκη επιπλέον δειγματοληψία κοπράνων, αυξάνοντας έτσι την αποδοχή μεταξύ των ασθενών. Οι τρέχουσες τεχνικές μοριακής βιολογίας επιτρέπουν την ευκολότερη δημιουργία πολλές υποθέσεις των υποψήφιων βιοδεικτών για τη διάγνωση, πρόγνωση ή θεραπευτική ανταπόκριση σε CRC, αλλά η ανάγκη για μια κατάλληλη επικύρωσης έχει συχνά αναφερθεί [10] – [12]. Η υποκείμενη υπόθεση είναι ότι τα καρκινικά κύτταρα του CRC, ακόμη και σε προ-επεμβατική στάδια, υποφέρουν σημαντικές γενετικές αλλοιώσεις που προκαλούν απελευθέρωση της χαρακτηριστικής πρωτεϊνών ή νουκλεϊνικών οξέων δυνητικά ανιχνεύσιμη σε βιολογικά υγρά που λαμβάνονται με μη επεμβατικές μεθόδους όπως αίμα ή κόπρανα [11] . Ανίχνευση με τεχνικές μοριακής βιολογίας αυτών των ουσιών θα χρησιμεύσει ως βιοδείκτη της νόσου για την ανάπτυξη διαγνωστικών δοκιμών με βελτιωμένη προβλεπτική ικανότητα των σημερινών τεστ διαλογής. Ως εκ τούτου, ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να προσδιοριστούν και την επικύρωση νέων βιοδεικτών του ορού και καταδεικνύουν πιθανή χρησιμότητα τους για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Μέθοδοι

Η αξιολόγηση βιοδεικτών σε αυτή τη μελέτη οργανώθηκε στο διαδοχική και διαδοχικές φάσεις για την ανακάλυψη, τεχνικών και βιολογικών επικύρωσης, καθώς και απόδειξη της έννοιας για να δοκιμαστεί η πιθανή κλινική χρήση επιλεγμένων βιοδεικτών. Πρώτον, τα δεδομένα μικροσυστοιχιών γονιδιακής έκφρασης αναλύθηκαν για τον εντοπισμό υποψήφιων βιοδεικτών σε δείγματα ιστών από περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου και του καρκίνου χωρίς ελέγχους (

Discovery Phase

). Δεύτερον, χρησιμοποιώντας μια εναλλακτική τεχνική που βασίζεται σε ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (RT-qPCR), μια επιλογή των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων ελέγχθηκε στο ίδιο σετ των βιοψιών ιστού (

Τεχνική Validation Phase

), καθώς και σε βιοψίες ελήφθησαν από ένα ανεξάρτητο σύνολο των ασθενών (

Βιολογικά Επικύρωση Φάση

). Τέλος, η δυνητική κλινική χρήση από τους πλέον υποσχόμενους επικυρωμένες υποψήφιοι δοκιμάστηκε σε δείγματα ορού από περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου, ένα μικρό σύνολο των αδενωμάτων και του καρκίνου χωρίς ελέγχους μέσω της ανίχνευσης της αντίστοιχης εκκρινόμενης πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας ενζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) δοκιμές (

Proof of Concept Phase

). Αναφέρθηκαν κατευθυντήριες γραμμές stard [13] ήταν η βάση για τον καθορισμό του πρωτοκόλλου μας.

Ασθενείς και δείγματα

Βασικά χαρακτηριστικά από τα θέματα που περιλαμβάνονται στην παρούσα μελέτη παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Colon του όγκου και σε συνδυασμό δίπλα (~5-10 cm) παθολογικά δείγματα φυσιολογικού ιστού βλεννογόνου που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης από μια σειρά υποθέσεων με ένα περιστατικό διάγνωση του αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου που παρακολουθεί την Bellvitge Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο (Βαρκελώνη, Ισπανία) μεταξύ του Ιανουαρίου 1996 και Δεκεμβρίου 2007. περιλαμβάνονται περιπτώσεις επιλέχθηκαν για να σχηματίσουν ένα ομοιογενές σειρά ασθενών με τη φάση ΙΙ, μικροδορυφόρων σταθερό σποραδικό καρκίνο του παχέος εντέρου. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε ριζική χειρουργική επέμβαση και δεν λαμβάνουν χημειοθεραπεία πριν από τη χειρουργική επέμβαση. Παθολόγοι επιβεβαίωσε όλες τις διαγνώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου και επιλεγμένα δείγματα φρέσκου ιστού από τον όγκο και το παρακείμενο βλεννογόνο που λαμβάνονται από το εγγύς περιθώριο εκτομή. Μία χρώση με αιματοξυλίνη-ηωσίνη πραγματοποιήθηκε σε μια διαφάνεια κόψιμο του δείγματος του όγκου για να καθοδηγήσει την παθολογοανατόμο στην επιλογή μιας περιοχής με τουλάχιστον 75% των κυττάρων του όγκου. Η ομαδοποίηση στάδιο ακολούθησε την αυθεντική οδηγό UICC «ΤΝΜ Atlas, 6η έκδοση». Η καλύτερη προσέγγιση για την ταξινόμηση αυτή προήλθε από τις πληροφορίες που συλλέγονται κατά τη στιγμή της διάγνωσης για κάθε περίπτωση.

Η

Τα δείγματα ιστών του βλεννογόνου του παχέος εντέρου από καρκίνο χωρίς ελέγχους ελήφθησαν μέσω κολονοσκόπηση μεταξύ Φεβρουαρίου και Μαΐου 2010. κλήθηκαν να συμμετάσχουν μια σειρά διαδοχικών ασθενών που υποβλήθηκαν σε κολονοσκόπηση που υποδεικνύεται από τα συμπτώματα (συνήθως αναιμία, αιμορραγία, γαστρεντερικό άλγος ή να τροποποιηθούν ρυθμού). Εκείνοι με αρνητικά αποτελέσματα (δηλαδή χωρίς κολική αλλοιώσεις) συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Κανένας από αυτούς δεν ανέφερε οικογενειακό ιστορικό καρκίνου.

Τέλος, επιλέχθηκαν δείγματα ορού από περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου και του καρκίνου χωρίς ελέγχους από μια επιδημιολογική μελέτη ασθενών-μαρτύρων στο αλληλεπιδράσεων γονιδίων-περιβάλλοντος που έχει ήδη περιγραφεί λεπτομερώς [ ,,,0],14]. Όλα τα δείγματα ορού συλλέχθηκαν πριν από την επέμβαση για τις περιπτώσεις και λίγο πριν την κολονοσκόπηση για τους ελέγχους.

Για την απλοποίηση της ονομασίας διαφορετικούς τύπους δειγμάτων, εδώ θα χρησιμοποιήσουμε

όγκου (Τ), όταν αναφέρεται σε δείγματα όγκων από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου,

παρακείμενο φυσιολογικό

(Α) όταν γίνεται αναφορά σε παθολογία φυσιολογικά δείγματα βλεννογόνου του παχέος εντέρου από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, και

καρκίνο δωρεάν download (F), όταν αναφέρεται σε δείγματα βλεννογόνου του παχέος εντέρου από καρκίνο-free άτομα.

Η Κλινική Έρευνα Επιτροπής Δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Bellvitge ενέκρινε το πρωτόκολλο της μελέτης, καθώς και όλα τα άτομα παρείχαν ενυπόγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση συμμετοχής και για γενετικές αναλύσεις που πρέπει να γίνουν σε δείγματα τους.

RNA εξόρυξη

το συνολικό RNA απομονώθηκε από δείγματα κατεψυγμένου ιστού χρησιμοποιώντας Exiqon miRCURY κιτ απομόνωσης RNA (Exiqon A /S, Δανία), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και λαμβάνοντας υπόψη όλες τις συνιστώμενες προφυλάξεις για να αποφευχθεί η υποβάθμιση του RNA από ΡΝάσες. Εκχυλίστηκε RNA ποσοτικοποιήθηκε με NanoDrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C. Η ποιότητα αυτών των δειγμάτων RNA περαιτέρω ελέγχεται με χρήση RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή, καθώς και επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση γέλης. αριθμούς ακεραιότητα του RNA (RIN) έδειξε καλή ποιότητα ([Q1 = 7,5? Median = 8,25? Q3 = 8,9] για όγκους, [Q1 = 7? Median = 7.5? Q3 = 8] για το γειτονικό φυσιολογικό και [Q1 = 7,8? Median = 8.3? Q3 = 8.65] για την υγιή κανονική). καθαρότητα του RNA μετρήθηκε με την αναλογία της απορρόφησης στα 260 nm και 280 nm (μέση τιμή = 1.96, SD = 0.04), χωρίς διαφορές μεταξύ των τύπων ιστού

σειράς Discovery -. συστοιχίες έκφρασης

Η σειρά ανακάλυψη περιλαμβάνονται 100 ζευγάρια των όγκων και των παρακείμενων φυσιολογικών δειγμάτων βλεννογόνο του παχέος εντέρου και 50 δείγματα του βλεννογόνου του παχέως εντέρου από καρκίνο-free άτομα (σύνολο n = 250). Ολικό RNA που εξάγεται από αυτά τα δείγματα υβριδοποιήθηκε σε τρυβλία συστοιχία Affymetrix Human Genome U219 (Affymetrix, Santa Clara, CA) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Τέσσερα δείγματα (δύο γειτονικά ζεύγη κανονικού όγκου) αποκλείστηκαν από το σύνολο δεδομένων μετά τον έλεγχο της ποιότητας. Έτσι, το τελικό σύνολο δεδομένων από 246 συστοιχίες χρησιμοποιήθηκε για τις επόμενες αναλύσεις.

Πρώτες δεδομένα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το Στιβαρή multiarray Μέση αλγόριθμο [15] εφαρμόζονται στο

Affy

πακέτο [16] του Bioconductor σουίτα (https://www.bioconductor.org) [17]. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό R στατιστικούς υπολογισμούς (https://www.r-project.org) [18].

Πριν διεξήχθη η ανάλυση διαφορικής έκφρασης, χαμηλής παραλλαγής και μεταγραφές Υ-χρωμόσωμα αφαιρέθηκαν από μεταγενέστερες αναλύσεις. Για τις υπόλοιπες probesets, χρησιμοποιήθηκαν t-τεστ τακτοποιηθεί-μαθητή να εντοπίσει σημαντικές υπερέκφραση μεταξύ γειτονικών κανονική (A) ή τα δείγματα όγκου (Τ) και του καρκίνου χωρίς βλεννογόνου (F). Bonferroni διόρθωση εφαρμόστηκε σε λογαριασμό για πολλαπλούς ελέγχους υποθέσεων. Για να περιορίσετε τα αρχικά απέκτησε τις λίστες, υποψήφιος probesets περαιτέρω φιλτράρεται με βάση διάφορα κριτήρια: χαμηλά επίπεδα έκφρασης και χαμηλή μεταβλητότητα στον καρκίνο χωρίς βλεννογόνου? μεγάλη μέση μεταβολή φορές μεταξύ Τ /Φ ή Α /F? και η ομοιογένεια των αποτελεσμάτων μεταξύ πολλαπλών ανιχνευτών για το ίδιο γονίδιο, όταν είναι διαθέσιμα. Probesets που πέρασαν τα κριτήρια φιλτραρίσματος χαρτογραφήθηκαν σε γονίδια, οι μονάδες των πληροφοριών που χρησιμοποιούνται για τους μεταγενέστερους αναλύσεις

Μια διαδικασία ιεράρχησης διεξήχθη για να επιλέξετε τα καλύτερα υποψήφια γονίδια για την επικύρωση χρησιμοποιώντας δημοσίως διαθέσιμα στοιχεία [19] – [24]. . Κριτήρια αντιπροσώπευαν είχαν σχέση με θέματα επαναληψιμότητα και ειδικότητα: παρατηρείται επαναληψιμότητα των διαφορών έκφρασης? πολύ χαμηλά επίπεδα έκφρασης σε ιστό αίμα? και την επιλογή των γονιδίων με μεγάλες έκφραση σε ιστό του παχέος εντέρου σε σύγκριση με άλλους ιστούς, σύμφωνα με τη βάση δεδομένων GeneCards (https://www.genecards.org) [25], αν και τα περισσότερα γονίδια εκφράστηκαν σε πολλαπλούς ιστούς. Το σύνολο των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης είναι διαθέσιμη στο Εθνικό Κέντρο για τη γονιδιακή έκφραση Βιοτεχνολογίας Πληροφορίας Omnibus [26] με GEO αριθμό προσχώρησης σειρά GSE44076 και στην ιστοσελίδα του έργου (https://www.colonomics.org).

Τεχνική και βιολογική επικύρωση – RT-qPCR για την αξιολόγηση της έκφρασης

τα επίπεδα έκφρασης των επιλεγμένων γονιδίων εκτιμήθηκαν με RT-qPCR τόσο για τη σειρά ανακάλυψη και για ένα πρόσθετο σύνολο των 104 δειγμάτων (70 ζεύγη παρακείμενων φυσιολογικών ιστών /όγκου από καρκίνο του παχέος εντέρου ασθενείς και 34 από καρκίνο χωρίς μάρτυρες). Αυτά τα δείγματα συλλέχθηκαν από τον Ιανουάριο του 1996 και τον Ιούνιο 2011 μετά το ίδιο πρωτόκολλο και αποθηκεύεται υπό τις ίδιες προϋποθέσεις με τη σειρά ανακάλυψης. cDNA συνετέθη από το mRNA εκχυλίζεται με το κιτ μεταγραφής σύνθεση πρώτου κλώνου cDNA (Roche Applied Science, Penzberg, Γερμανία) ακολουθώντας πρότυπες διαδικασίες.

Δύο σετ εκκινητών σχεδιάστηκαν για κάθε γονίδιο, και το κάθε σύνολο αναλύθηκε σε αντίγραφο. Τρία γονίδια ελέγχου περιλήφθηκαν στην ανάλυση:

ACTB

,

TPT1

, και

UBC

.

ACTB

επιλέχθηκε με βάση την εκτεταμένη προηγούμενη βιβλιογραφία που δείχνουν σαν ένα κατάλληλο γονίδιο οικοκυρική για γονιδιακή έκφραση αναλύσεις σε δείγματα κόλου [27] – [29].

UBC

και

TPT1

επιλέχθηκαν με βάση την υψηλή σταθερότητα των επιπέδων έκφρασης τους σε όλα τα δείγματα στα δεδομένα συστοιχία μας (Σχήματα S1 και S2). Είναι ενδιαφέρον, είχαν επίσης προηγουμένως υποτεθεί ως δυνητικά κατάλληλα γονίδια καθαριότητας για αναλύσεις γονιδιακής έκφρασης σε δείγματα του παχέος εντέρου [29].

Πολυπλεκτικά προσδιορισμούς RT-qPCRs έγιναν χρησιμοποιώντας BioMark δυναμικό πίνακα 96 × 96 Πλάκες (Fluidigm Corporation, San Francisco, CA). Προκύπτουσες εικόνες αναλύθηκαν με λογισμικό Fluidigm Biomark χρησιμοποιώντας πρότυπες παραμέτρους. Πρώτες δεδομένων qPCR υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με το πακέτο v1.10.0 HTqPCR [30]. Πριν από την αξιολόγηση της διαφορικής έκφρασης μεταξύ διαφορετικών τύπων ιστών, η μήτρα έκφραση διηθήθηκε για λόγους ποιότητας.

UBC

τελικά επιλεγεί ως τον έλεγχο καθαριότητας με βάση τη σταθερότητα των τιμών του κύκλου κατωφλίου (Εικόνα S2). δοκιμασίες Mann-Whitney χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση των επιπέδων έκφρασης μεταξύ του καρκίνου και χωρίς γειτονικά φυσιολογικά δείγματα και μεταξύ του καρκίνου και χωρίς καρκινικά δείγματα. Κάθε σετ εκκινητών αναλύθηκε ανεξάρτητα, και το σύνολο των εκκινητών που εμφανίζονται τα υψηλότερα σημαντικά αποτελέσματα στην ανάλυση της διαφορικής έκφρασης επιλέχθηκε ως αντιπροσωπευτικό

Αναγνώριση των βιοδεικτών του ορού. – Απόδειξη της έννοιας για την εγκυρότητα διαλογής

για να εξεταστεί η δυνητική αξία για την έγκαιρη ανίχνευση, οι πιο πολλά υποσχόμενοι υποψήφιοι από το βιολογικό επικύρωση προσδιορίστηκαν σε δείγματα ορού σε μια σειρά από 80 κόλον περιπτώσεων καρκίνου, 23 ασθενείς με αδένωμα και 77 χωρίς καρκίνο ελέγχους, όλα ελέγχονται εις διπλούν για να αυξηθεί η ακρίβεια του πειράματος. Δείγματα Δέκα-χιλιοστόλιτρο περιφερειακού φλεβικού αίματος συλλέχθηκαν από περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου, οι ασθενείς με αδενώματα και τους ελέγχους. Μετά φυγοκέντρησης για 15 λεπτά στις 1000 στροφές ανά λεπτό εντός 30 λεπτών από τη συλλογή, ορός δειγματίστηκε και φυλάχθηκε στους -80 ° C. κιτ ELISA Εμπορική από την Life Sciences Inc και R &? D Systems, ανάλογα με τη διαθεσιμότητα, χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για την αξιολόγηση συγκεντρώσεις πρωτεΐνης ορού. Όλες οι αναλύσεις χρησιμοποιούν ποσοτική sandwich τεχνική ανοσοδοκιμασίας ενζύμου. Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών στόχων σε κάθε δείγμα υπολογίστηκε από μία πρότυπη καμπύλη που γίνονται εις διπλούν σε κάθε πλάκα. Οι επιστήμονες εξετάζουν αυτά τα δείγματα ορού δεν γνώριζαν τη διάγνωση του ασθενούς. Ένα γραμμικό πρότυπο για την προσαρμογή ως προς την ηλικία, το φύλο και τις πιθανές επιδράσεις παρτίδα χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η στατιστική σημασία των επιπέδων διαφορικής πρωτεΐνης μεταξύ των ομάδων. Η συσχέτιση των δεικτών με τα χαρακτηριστικά του ασθενούς, όπως η ηλικία και το φύλο, πολλαπλούς επιδημιολογικών παραγόντων και τα χαρακτηριστικά του όγκου φαίνεται στον Πίνακα S1. Επειδή μερικοί δείκτες ορού έδειξε ακραίες τιμές για μερικά θέματα, ένα τεστ κατάταξης που βασίζεται επίσης πραγματοποιήθηκε. Τα αποτελέσματα δεν αλλάζουν σε σχετικό P-τιμές που προκύπτουν από τα γραμμικά μοντέλα αναφέρονται τρόπο και.

Ο αριθμός των δειγμάτων που χρησιμοποιούνται υπολογίστηκε για την επίτευξη μιας ακρίβειας 10% στις προβλέψεις ευαισθησία και ειδικότητα για αναμενόμενες τιμές των 75%. Αυτό απαιτούσε τουλάχιστον 72 άτομα ανά ομάδα. Για τη σειρά ανακάλυψη, αυτός ο αριθμός ήταν ισορροπημένη σε oversample όγκους, οι οποίες έχουν μεγαλύτερα μεταβλητότητα και ένα ευρύ φάσμα των υποψηφίων έπρεπε να αναλυθεί. Η σειρά επικύρωση στον ορό συμπληρώθηκε με μια μικρότερη υποομάδα αδένωμα (n = 23) για να διερευνήσει τη χρησιμότητα των δεικτών για την ανίχνευση αυτής της προκαρκινικών αλλοιώσεων.

Αποτελέσματα

βιοδεικτών ανακάλυψη

σε αυτό το καλά επιλεγμένο ομοιογενές σύνολο των δειγμάτων, οι διαφορές στην έκφραση του mRNA μετρήθηκε με πλάκες σειρά Affymetrix HG-U219 ήταν τόσο αξιοσημείωτο το γεγονός ότι μια ανεξέλεγκτη τεχνική (κύριες συνιστώσες ανάλυση) χρησιμοποιώντας το πλήρες σύνολο των probesets χωρίζονται σχεδόν απόλυτα τις τρεις τύπους ιστών ( Σχήμα 1α). Η πρώτη κύρια συνιστώσα χωρίζει σαφώς δείγματα όγκου των περιπτώσεων καρκίνου του παχέος εντέρου (Τ) και τα δείγματα μη-όγκου. Είναι αξιοσημείωτο ότι το δεύτερο κύριο συστατικό επίσης διάσπαση χωρίς καρκίνο (F) από γειτονικό φυσιολογικό δείγματα που ανήκουν σε ασθενείς με καρκίνο (Α).

A. ανάλυση κύριο συστατικό. B. διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια μεταξύ γειτονικών κανονικών και χωρίς καρκίνο δείγματα. Γ διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια μεταξύ των δειγμάτων όγκου και χωρίς καρκίνο.

Η

Από 33.853 σύνολα ανιχνευτή που περιλαμβάνονται στη συστοιχία με υψηλή μεταβλητότητα, 5503 ήταν υπερ-εκφράζεται σε Α, σε σύγκριση με F, και 11.229 ήταν πάνω -expressed σε Τ σε σύγκριση με F (p & lt? 0,05, Bonferroni διορθωμένο). Έχουμε επικεντρωθεί ειδικά στην υπερ-εκφρασμένων γονιδίων επειδή οι διαφορές αυτές είναι πιο πιθανό να ανιχνευθεί σε ορό, και ως εκ τούτου πιο κατάλληλο για να χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικό βιοδείκτες. Είναι ενδιαφέρον, ένα αξιοσημείωτο επίπεδο της επικάλυψης (3101 σετ καθετήρα, ~56%) βρέθηκε ανάμεσα σε αυτές τις δύο λίστες σετ καθετήρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο σε ασθενείς με καρκίνο είχαν ήδη βιώσει σημαντικές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση, και η αύξηση τη σημασία της χρήσης χωρίς καρκίνο βλεννογόνο ως ιστός αναφοράς. Οι παγκόσμιες αποτελέσματα από την ανάλυση διαφορικής έκφρασης φαίνονται στα Σχήματα 1b και 1c.

Για να δοθεί προτεραιότητα υποψήφιοι για διαγνωστικούς βιοδείκτες, ένα σύνολο φίλτρων εφαρμόστηκαν στο αρχικό σύνολο εκφράζονται διαφορικά σετ καθετήρα. Τα φίλτρα αυτά βασίστηκαν κυρίως σε στατιστικά κριτήρια (δηλ μεγάλο πολλαπλή μεταβολή μεταξύ Α /F ή T /F, χαμηλά επίπεδα έκφρασης και χαμηλή μεταβλητότητα σε δείγματα F). Αυτά τα φίλτρα έδωσαν ένα τελικό αριθμό των 242 επιλεγμένων ανιχνευτών μεταξύ Α /F και 443 μεταξύ Τ /Ρ, που αντιστοιχεί σε ένα σύνολο 194 και 352 γονίδια, αντίστοιχα (Πίνακας S2).

Αυτή η πρώτη επιλογή παρέχεται μια λίστα 505 μοναδική υποψήφια βιοδείκτες με πολύ σημαντικές διαφορές έκφρασης μεταξύ του όγκου και του καρκίνου χωρίς ιστό. Λόγω των τεχνικών δυσκολιών που προκύπτουν από την επικύρωση ενός τόσο μεγάλου ποσού των βιοδεικτών, εφαρμόστηκαν πρόσθετες τεχνικές και βιολογικά κριτήρια για να περιορίσετε περαιτέρω τη λίστα των πιθανών υποψηφίων. Αυτή η δεύτερη σειρά των φίλτρων βασίστηκαν στην αξιολόγηση της συνέπειας μεταξύ των διαφόρων probesets για κάθε γονίδιο? επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων μας σε ανεξάρτητες και διαθέσιμες στο κοινό σύνολα δεδομένων γονιδιακής έκφρασης? και μηδενική ή χαμηλά επίπεδα έκφρασης αυτών των γονιδίων σε δείγματα αίματος από καρκίνο ελεύθερα άτομα. Επιπλέον, η προηγούμενη γνώση και μοριακή πληροφορίες για κάθε γονίδιο συντάχθηκε από τη βιβλιογραφία και σε απευθείας σύνδεση βάσεις δεδομένων για να διασφαλιστεί η επιλογή των πιο αξιόπιστων υποψηφίων (δηλαδή την έκκριση της πρωτεΐνης, η εξειδίκευση του ιστού, η λειτουργία της πρωτεΐνης, προηγούμενα στοιχεία ως βιοδείκτη, μεταξύ άλλων). Μια λίστα των 23 καλύτερων υποψηφίων τελικά επιλεγεί για επικύρωση στο επόμενο βήμα (πίνακας 2, στήλες 1-2).

Η

Τεχνική και βιολογική επικύρωση

Για να διασφαλιστεί η αξιοπιστία της τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τις συστοιχίες γονιδιακής έκφρασης, η επιλογή των 23 βιοδεικτών επικυρώθηκε με μία εναλλακτική τεχνική (RT-qPCR) τόσο στο ίδιο σύνολο δειγμάτων (δηλαδή τεχνική επικύρωση), και επίσης σε μια ανεξάρτητη σειρά με ισοδύναμες κλινικά και επιδημιολογικά χαρακτηριστικά (δηλαδή βιολογικής επικύρωση).

Σχήμα 2 εμφανίζει αμφίδρομη γονιδίου και ομαδοποίηση δείγμα των τιμών έκφρασης RT-qPCR τόσο για τα αποτελέσματα της τεχνικής (Σχήμα 2α) και η βιολογική επικύρωση (Σχήμα 2β). Οριζόντιους άξονες των θερμικούς χάρτες (δηλαδή στήλες) δείχνουν σαφή διαχωρισμό των δειγμάτων όγκου από γειτονικό φυσιολογικό και ο καρκίνος-ελεύθερες ομάδες. Ο κάθετος άξονας των γονιδίων (δηλαδή σειρές) έδειξε δύο συστάδες γονιδίων, ένα για εκείνους που εκφράζονται διαφορικά μεταξύ Α /F και ένα άλλο για διαφορικά εκφραζόμενου μεταξύ Τ /F. Αυτά τα αποτελέσματα ιδιαίτερα αναπαράγουν το μοτίβο της έκφρασης που παρατηρήθηκε στις συστοιχίες στη φάση ανακάλυψη, ενισχύοντας τον πιθανό ρόλο των γονιδίων αυτών ως διαγνωστικοί βιοδείκτες του καρκίνου του παχέος εντέρου. Μια επίσημη σύγκριση των διαφορών εκφράσεως μεταξύ των τύπων δείγματος για την τεχνική και βιολογικές επικύρωσης παρουσιάζεται στον Πίνακα 2, στήλες 3-4. Παρά το γεγονός ότι μόνο οι p-τιμές που εμφανίζονται στον Πίνακα 2, τα επίπεδα έκφρασης όλων των επικυρωμένων γονιδίων συμπεριφέρθηκαν με συνέπεια σε όλες τις διαφορετικές φάσεις, όπως απεικονίζεται στο Σχήμα S3.

Τα δείγματα έχουν χρωματική κωδικοποίηση στην κορυφή των θερμικούς χάρτες με βάση ο τύπος ιστού (δηλαδή, χωρίς καρκίνο του βλεννογόνου = πράσινο, παρακείμενο φυσιολογικό ιστό από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου = μπλε, καρκινικός ιστός = κόκκινο)

η

η απόδειξη της έννοιας. – ταυτοποίηση βιοδεικτών του ορού

ως πιλοτικό απόδειξη της ιδέας να αποδείξουν πιθανή χρησιμότητα τους ως καρκίνος του παχέος εντέρου νωρίς διαγνωστικών βιοδεικτών, μια επιλογή από 9 γονιδίων δοκιμάστηκαν στον ορό χρησιμοποιώντας δοκιμές ELISA. Η ιεράρχηση των υποψηφίων αυτών βασίστηκε σε μια εκτεταμένη βιβλιογραφική ανασκόπηση και τη διαθεσιμότητα των εμπορικών kit ELISA.

Τα αποτελέσματα για κάθε πρωτεΐνη που φαίνεται στο Σχήμα 3. Αξίζει να σημειωθεί ότι, κολλαγόνο τύπου Χ α1 (COL10A1) εμφανίζονται πολύ υψηλές συγκεντρώσεις στο παχύ έντερο περιπτώσεις και αδενώματα του καρκίνου, σε σύγκριση με τους ελέγχους (ρ = 3.2e-6 και ρ = 0.0083, αντίστοιχα). Οι συγκεντρώσεις στον ορό των COL10A1 σε ελέγχους, αδενώματα και των περιπτώσεων του καρκίνου του παχέος εντέρου κατά το στάδιο που φαίνεται στο Σχήμα S4. Είναι ενδιαφέρον ότι, στατιστικά σημαντικές διαφορές βρέθηκαν όταν μάρτυρες σε σύγκριση με κάθε ένα από τα διάφορα στάδια του όγκου, εκτός του σταδίου Ι, πιθανώς λόγω του μικρού μεγέθους του δείγματος της ομάδας αυτής. Η περιοχή κάτω από το λειτουργικό χαρακτηριστικό (ROC) καμπύλη δέκτη ήταν 0,75 για τον καρκίνο και 0,76 όταν αδενώματος και καρκίνου του παχέος εντέρου θεωρήθηκαν μαζί (Σχήμα 4), που έχει δυνατότητες καλή ικανότητα ταξινόμησης. Μεταλλοπρωτεϊνάσης-7 (ΜΜΡ7) έδειξε επίσης μια σημαντική συσχέτιση, αλλά δεν εξετάστηκε περαιτέρω γιατί αυτό οφειλόταν σε μια υποέκφραση στα αδενώματα σε σύγκριση με τους μάρτυρες, που αντιπροσώπευε την αντίθετη έννοια της διαφορικής έκφρασης που προσπαθούσαμε να επικυρώσετε. Αριθ συνδυασμό COL10A1 με οποιαδήποτε από τις άλλες πρωτεΐνες αύξησε σημαντικά την περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

A. Δέκτη που λειτουργεί χαρακτηριστικές καμπύλες για τις δύο αδενωμάτων και καρκίνου του παχέος εντέρου μαζί (μωβ) και των περιπτώσεων καρκίνου του παχέος εντέρου μόνο (κόκκινο). Β σημεία αποκοπής Διαφορετικές δείκτη κατά τις καμπύλες ευαισθησίας και ειδικότητας.

Η

Συζήτηση

CRC έλεγχο με τεστ κοπράνων λανθάνουσας αιμορραγίας κατέδειξε αποτελεσματικότητα σε τυχαιοποιημένες μελέτες. Παρ ‘όλα αυτά, η χαμηλή εξειδίκευση της δοκιμής υποδεικνύει την ανάγκη της πιο ακριβή εναλλακτική λύση διαγνωστικές εξετάσεις. Σιγμοειδοσκόπηση, κολονοσκόπηση και Μηχανογραφημένη τομογραφία (δηλαδή εικονική κολονοσκόπηση) είναι ισχυρή εναλλακτική λύση υποψηφίων, αλλά όλες έχουν σημαντικούς περιορισμούς, κυρίως όσον αφορά το κόστος, τις πιθανές σοβαρές παρενέργειες και μειωμένη συμμετοχή. Η συμμετοχή είναι ένας σημαντικός παράγοντας για τη διαλογή της αποτελεσματικότητας, και είναι επίσης μια γενικευμένη παρατήρηση ότι η διαλογή με βάση Τεστ Κρυφού Αίματος έχει χαμηλά ποσοστά συμμετοχής [31] – [33]. Έτσι, ένα διαγνωστικό τεστ που βασίζεται σε μια συνηθισμένη εξέταση αίματος θα μπορούσε πιθανότατα να είναι σε θέση να επιτύχει ένα υψηλότερο ποσοστό του πληθυσμού, και των αρχών δημόσιας υγείας θα ευνοούσε μια τέτοια δοκιμή, αν η αποτελεσματικότητα και το κόστος ήταν παρόμοια με Τεστ Κρυφού Αίματος. Με αυτές τις εγκαταστάσεις στο μυαλό, αρχίσαμε αυτή τη μελέτη να ψάξετε για διαγνωστικούς βιοδείκτες που μπορούν να ανιχνευθούν στο αίμα με μια απλή και προσιτή δοκιμή ELISA.

Η μελέτη μας της γονιδιακής έκφρασης σε ιστό του παχέος εντέρου έχει επιβεβαιώσει προηγούμενες παρατηρήσεις ότι ένα μεγάλο αριθμός γονιδίων έχουν απελευθερωθεί σε όγκο σε σύγκριση με παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο. Από περίπου 20.000 γονίδια ανακρίνεται στη συστοιχία έκφρασης, και μετά από φιλτράρισμα από διάφορα περιοριστικά κριτήρια, έχουν 505 μοναδική υποψήφια βιοδείκτες έχουν ταυτοποιηθεί (Πίνακας S2), με ιδιαίτερα σημαντικά αποτελέσματα και υψηλή ικανότητα να διακρίνουν μεταξύ ζευγών παρακείμενων όγκων και φυσιολογικά δείγματα. Ένα ισχυρό χαρακτηριστικό του σχεδιασμού της μελέτης μας είναι η συμπερίληψη ενός συνόλου δειγμάτων από καρκίνο χωρίς ελέγχους (n = 50). Αυτό μας επέτρεψε την ταυτοποίηση γονιδίων τα οποία δεν παρουσιάζουν διαφορές έκφραση μεταξύ γειτονικών φυσιολογικών και καρκινικών ιστών από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, καθώς και για να επιβεβαιώσει ότι υπερεκφράζεται γονιδίων σε όγκους δεν εμφανίζουν υψηλά επίπεδα έκφρασης σε καρκίνο χωρίς ιστό του παχέος εντέρου, η οποία θα μπορούσε αποκλείει πιθανή χρήση τους ως βιοδείκτες. Έχουμε περιγράψει προηγουμένως ότι η έκφραση γονιδίου του παρακείμενο φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου σε έναν ασθενή με καρκίνο ήδη έχει αισθητά αλλοιωθεί σε σύγκριση με καρκίνο χωρίς βλεννογόνο του παχέος εντέρου [34], η οποία ενισχύει την ανάγκη της συμπερίληψης ιστού από καρκίνο χωρίς άτομα σε έργα που αποσκοπούν στη βρείτε βιοδείκτες διάγνωση για τον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Ο μεγάλος αριθμός των υποψηφίων που εντοπίζονται στην ανάλυση των δεδομένων έκφρασης μας οδήγησε στο να δοθεί προτεραιότητα ποια θα έπρεπε να επιλεγεί για περαιτέρω επικύρωση. Χρησιμοποιήσαμε ένα συνδυασμό κριτηρίων, η οποία περιελάμβανε τη συνοχή με άλλες διαθέσιμες δημόσια σύνολα δεδομένων και τη λογοτεχνία? χαμηλή ή καθόλου έκφραση σε επίπεδα χωρίς καρκίνο βλεννογόνου ή άλλους ιστούς? κυρίαρχη έκφραση σε ιστό καρκίνου του κόλου? και την επιλογή των εκκρινόμενης πρωτεϊνών. Δεδομένου ότι η ταυτοποίηση των πρωτεϊνών του ορού είναι δαπανηρή και χρονοβόρα, αναλάβαμε μια τεχνική και βιολογικών επικύρωση των καλύτερων υποψηφίων πριν προσπαθήσει δοκιμές ELISA. Η τεχνική επικύρωση (δηλαδή στο ίδιο σύνολο δειγμάτων, αλλά με μια διαφορετική τεχνική) έδειξε μια αξιοσημείωτη δυνατότητα αναπαραγωγής των διαφορών επίπεδο έκφρασης μετράται με RT-qPCR και μικροσυστοιχίες για όλες τις ελεγχόμενες γονίδια, επιβεβαιώνοντας έτσι ότι το σύνολο δεδομένων έκφρασης που λαμβάνονται με Affymetrix HG-U219 microarrays ήταν εξαιρετικής ποιότητας και αξιόπιστη αναγνώριση των διαφορών έκφρασης μεταξύ των διαφορετικών τύπων ιστών. Ως εκ τούτου, αναμένουμε ότι ο αριθμός των ψευδώς θετικών στα υπόλοιπα λίστα (όχι επικυρωμένη) των σημαντικών διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων μεταξύ τύπων ιστού να είναι χαμηλή. Επιπλέον, η επιβεβαίωση των ήδη εντοπιστεί διαφορές σε βιολογικά ανεξάρτητο σύνολο δεδομένων υπογραμμίζει επίσης την εγκυρότητα των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται με μικροσυστοιχίες.

Το επόμενο βήμα στη διαδοχική διαδικασία επικύρωσης μας προσπαθούσε να εντοπίσει στον ορό των αντίστοιχων πρωτεϊνών για μας υποψήφια γονίδια και να αξιολογήσει την πιθανή χρήση τους για την έγκαιρη διάγνωση. Συμπεριλάβαμε επίσης μια υποομάδα των ασθενών με αδένωμα, δεδομένου ότι αυτό είναι επίσης ένας σημαντικός στόχος για CRC διαλογής. Χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ ELISA θα μπορούσαμε να αξιολογούν τα επίπεδα της πρωτεΐνης όλων των γονιδίων προτεραιότητα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, COL10A1 έδειξε αρκετά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ελέγχων και των ασθενών με καρκίνο παχέος εντέρου (p = 3.2 × 10

-6) να προταθεί ως μια πιθανή διαγνωστική υποψήφιο. ΜΜΡ7 επίσης έδειξαν κάποιες διαφορές για αδενώματα (p = 0,0092), αλλά έδειξε μια αντίθετη κατεύθυνση προς την αναμενόμενη ένα.

Έχουμε προσδιορίσει την πρωτεΐνη COL10A1 το οποίο, όταν ανιχνεύεται σε υψηλές συγκεντρώσεις στο αίμα, μπορεί να είναι ενδεικτική της παρουσία μιας νεοπλασματικής βλάβης στο κόλον. Αυτή η πρωτεΐνη επιλέχθηκε μετά από μια διαδοχική διαδικασία κατά την οποία ξεκινήσαμε τη διερεύνηση των δεδομένων της έκφρασης του γονιδιώματος ολόκληρη στον ιστό του παχέος εντέρου. Αυξημένα επίπεδα COL10A1 ορού παρατηρήθηκαν τόσο για τους ασθενείς αδενώματος και καρκίνου του παχέος εντέρου. Η περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC ήταν 0,76, γεγονός που καθιστά COL10A1 ως μια πολλά υποσχόμενη διαγνωστικό βιοδείκτη. Το σημείο αποκοπής 280 ng /ml επιτυγχάνονται 0,63 ευαισθησία και ειδικότητα για 0,85 καρκίνο του παχέος εντέρου ή αδένωμα (Σχήμα 4). Παρόμοιες τιμές ελήφθησαν για μόνο τον καρκίνο. Λίγα χωρίς καρκίνο άτομα έδειξαν υψηλά επίπεδα COL10A1 στον ορό, υψηλότερο από το μέσο όρο για το αδένωμα, υποδεικνύοντας ότι άλλες διαδικασίες που δεν σχετίζονται με ορθοκολικό αλλοιώσεων μπορεί να αυξήσει τα επίπεδα COL10A1.

COL10A1

είναι ένα σύντομο κολλαγόνου αλυσίδα εκφράζεται κυρίως από τα χονδροκύτταρα κατά τη διάρκεια της οστεοποίησης. έχουν Ελαττώματα στην πρωτεΐνη αυτή έχει σχέση με χονδροδυσπλασία μεταφυσιακού Schmid-τύπου [35]. COL10A1 δεν εκφράζεται σε φυσιολογικό επιθήλιο του παχέος εντέρου, αλλά είναι ένας άμεσος μεταγραφικός στόχος του

RUNX2

[36], ένας παράγοντας μεταγραφής που εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα, και να έχει σχέση με πολλαπλούς καρκίνους. Η αυξημένη έκφραση του

COL10A1

παρατηρήθηκε σε όγκους μπορεί να είναι μια έμμεση επίδραση των ρυθμιστικών αλλαγών υψηλότερου επιπέδου που συμβαίνουν στον όγκο. Στην πραγματικότητα, έχουμε παρατηρήσει μια υψηλή συσχέτιση μεταξύ RUNX2 και

COL10A1

έκφρασης σε όγκους (Pearson R = 0,5, τα αποτελέσματα δεν φαίνονται). δεδομένων μας έκφραση εντοπίζει επίσης υψηλή συσχέτιση μεταξύ του

COL10A1

και άλλα γονίδια:

SFRP4

,

INHBA

,

TNFSF4

που εμπλέκονται στην κυτοκινών και σηματοδότηση Wnt