Αφηρημένο

AZD6244 (Arry-142886) είναι ένας αναστολέας της ΜΕΚ 1/2 και μπορεί να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή να επάγει απόπτωση σε ένα κυτταρικό τύπο εξαρτώμενο τρόπο. Ο ακριβής μοριακός μηχανισμός του AZD6244 επαγόμενη απόπτωση δεν είναι σαφής. Για να διερευνήσουν τους μηχανισμούς του AZD6244 απόπτωση που επάγεται στον καρκίνο του ανθρώπινου πνεύμονα, προσδιορίσαμε τις μοριακές αλλαγές του δύο υποομάδες των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών καρκίνου του πνεύμονα τα οποία είναι είτε ευαίσθητα ή ανθεκτικά στη θεραπεία AZD6244. Βρήκαμε ότι AZD6244 προκάλεσε μεγάλη αύξηση των πρωτεϊνών Bim και μικρότερη αύξηση των πρωτεϊνών PUMA και NOXA, και επάγεται κυτταρικό θάνατο σε ευαίσθητα κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, αλλά δεν είχε καμία επίδραση επί άλλες σχετικές πρωτεΐνες Bcl-2 σε αυτές τις κυτταρικές σειρές. Νοκ ντάουν του Bim από siRNA αύξησε σημαντικά την IC

50 και μειωμένη απόπτωση για AZD6244 επεξεργασμένα κύτταρα. Βρήκαμε επίσης ότι τα επίπεδα της ενδογενούς p-Thr32-FOXO3a και p-Ser253-FOXO3a ήταν χαμηλότερες σε AZD6244-ευαίσθητα κύτταρα από ό, τι στην AZD6244-ανθεκτικά κύτταρα. Στα ευαίσθητα κύτταρα, AZD6244 που προκαλείται FOXO3a πυρηνική μετατόπιση που απαιτείται για την ενεργοποίηση Bim. Επιπλέον, η αποσιώπηση των FOXO3a από siRNA καταργηθεί AZD6244 επαγόμενη κυτταρική απόπτωση. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η επιμόλυνση μόνιμα ενεργών ΑΚΤ πάνω ρυθμισμένα ρ-Thr32-FOXO3a και ρ-Ser253-FOXO3a έκφραση και ανέστειλε AZD6244 επαγόμενη Bim έκφραση σε ευαίσθητα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Bim παίζει σημαντικό ρόλο στην AZD6244 επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα και ότι η οδός ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /FOXO3a εμπλέκεται στη ρύθμιση Bim και την επιδεκτικότητα του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων σε AZD6244. Τα αποτελέσματα αυτά έχουν επιπτώσεις στην ανάπτυξη στρατηγικών για να ξεπεράσει την αντίσταση σε αναστολείς ΜΕΚ

Παράθεση:. Meng J, Fang Β, Liao Υ, Chresta CM, Smith PD, Roth JA (2010) Η απόπτωση επαγωγή από ΜΕΚ Αναστολή στην ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα προκαλείται από Bim. PLoS ONE 5 (9): e13026. doi: 10.1371 /journal.pone.0013026

Συντάκτης: Gen Sheng Wu, Wayne State University, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 23, 2010? Αποδεκτές: 31ης Αυγούστου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 27, Σεπτεμβρίου 2010

Copyright: © 2010 Meng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το National Cancer Institute εξειδικευμένο πρόγραμμα της ερευνητικής αριστείας (SPORE) Επιχορήγηση CA-70907 (J. Minna και J. Roth), R01 Grant CA-092 487 (Β Fang), και το Αντικαρκινικό Κέντρο υποστήριξης Grant CA-16672. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από μια Έρευνας Σύνδεσμοι Επιχορήγηση από την AstraZeneca Φαρμακευτική ο οποίος είχε ένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από μια Έρευνας Σύνδεσμοι Επιχορήγηση από την AstraZeneca Φαρμακευτική. Ο χρηματοδότης της AstraZeneca είχε έναν ρόλο είτε στον σχεδιασμό της μελέτης, η συλλογή και ανάλυση δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

ενεργοποίηση της Ras /Raf /MEK /MAP κινάσης έχει εμπλακεί στην ανεξέλεγκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της ανάπτυξης του όγκου. AZD6244 (Arry-142886), μία νέα, επιλεκτική, ΑΤΡ-μη ανταγωνιστικός αναστολέας της ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάση πρωτεϊνικής κινάσης 1/2 (ΜΕΚ1 /2), έχει δείξει δραστικότητα σε νανομοριακές συγκεντρώσεις έναντι απομονωμένο ένζυμο ΜΕΚ και πολλές καρκινικές κυτταρικές γραμμές [1] . Μελέτες in vitro έδειξαν ότι AZD6244 κάτω ρυθμισμένα επίπεδα ρ-ERK αποτελεσματικά. AZD6244 έχει δείξει δραστικότητα σε διάφορα μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου ανθρώπινου καρκίνου [2] – [4]. Σε κλινικές δοκιμές, ενώ οι ασθενείς από διάφορους τύπους όγκων έχουν δείξει αποκρίσεις σε αναστολέα μονοθεραπεία ΜΕΚ, όγκοι άλλους ασθενείς, ιδιαίτερα σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, είναι εγγενώς ανθεκτική στην αναστολή ΜΕΚ. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς που διέπουν την ευθύνη για την αντίσταση στην αναστολή της ΜΕΚ σε περίπτωση καθίσταται σημαντικό θεραπευτικό τροπικότητα σε αυτή την πολύ κοινή μορφή καρκίνου.

προηγούμενη μελέτη μας [5] έδειξε ότι η AZD6244 αναστολέας ΜΕΚ ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό σε νανομοριακές συγκεντρώσεις σε Calu-6, H2347, H3122 και ο καρκίνος του πνεύμονα κυτταρικές σειρές, αλλά είχε μικρή επίδραση στη H196, Calu-3, Η522, ή κυτταρικές σειρές HCC2450. Επιπλέον, βρήκαμε ότι εξής υπο-G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου, 20-40% των AZD6244-ευαίσθητα κύτταρα υπέστησαν απόπτωση, παρατηρήσαμε καμία απόπτωση σε AZD6244-ανθεκτικά κύτταρα. Έχουμε προηγουμένως έδειξαν ότι η Ρ-ΑΚΤ έκφραση είναι χαμηλή σε AZD6244 ευαίσθητη κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, αλλά υψηλή σε ανθεκτικά κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι το ρ-ΑΚΤ είναι ένας μεσολαβητής της αντίστασης στη θεραπεία AZD6244. Σε αυτή την εργασία ερευνούμε κατάντη μεσολαβητών σε AZD6244 απόπτωση στα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

Η απόπτωση μπορεί να ρυθμιστεί μέσω της εξωγενούς (υποδοχέα θανάτου) ή ενδογενή μονοπάτια (μιτοχονδριακό) κυτταρικό θάνατο. Εγγενής απόπτωση προκαλείται από τις πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2, που αποτελείται από τρία υπο-οικογένειες: τα μέλη προ-επιβίωσης, όπως Bcl-2 ή Mcl-1, η προ-αποπτωτική υποομάδα Βαχ /Bak, και το προ-αποπτωτικών Bcl-2 ομολογία 3-μόνο (ΒΗ3-μόνο) πρωτεΐνες. Τα αποπτωτικά ερεθίσματα ενεργοποιούν ενεργοποίηση ειδικών ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες, οι οποίες στη συνέχεια εμπλέκονται με τα προ-επιβίωσης Bcl-2 μελών της οικογένειας και να απελευθερώσουν τα κατάντη δράστες, Βαχ και Bak, να εκμαιεύσει μιτοχονδριακής διαπερατότητας της εξωτερικής μεμβράνης, την απελευθέρωση του καταρράκτη κασπάσης και πιστοποιείται με κυτταρικό θάνατο. Bim, ρ53-up-ρυθμίζονται ρυθμιστής της απόπτωσης (PUMA) και NOXA έχουν πρόσφατα αναφερθεί ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη χημειοθεραπεία και στοχευμένη θεραπεία απόπτωση που επάγεται στον καρκίνο του μαστού [6], λευχαιμία [7], μυέλωμα [8] και NSCLC [ ,,,0],9] κύτταρα.

Η μεταγραφή FOXO μέλη παράγοντας προώθηση ή την αδρανοποίηση πολλών γονιδίων στόχων που εμπλέκονται στην καταστολή του όγκου, όπως

Bim

,

FasL

, και

TRAIL

γονίδια για επαγωγή της απόπτωσης [10], [11],

p27kip1

,

κυκλίνης D15

για ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου [12], και

GADD45a

για την επισκευή βλάβης του DNA [13]. FOXO3a είναι ένα από τα πιο σημαντικά οικογένεια FOXO παραγόντων μεταγραφής που έχουν ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών λειτουργιών. FOXO3a είναι φωσφορυλιωμένη και αδρανοποιημένα με ΑΚΤ μέσω φωσφορυλίωσης σε Thr32, Ser253, Ser315 και η οποία οδηγεί σε πυρηνική εξαγωγή και αναστολή της δράσης της μεταγραφής του [14], [15]. FOXO3a έχει επίσης δειχθεί ότι ρυθμίζεται από την ογκοπρωτεΐνη ERK [16] σε τρεις θέσεις φωσφορυλίωσης ERK, Ser 294, Ser 344, και Ser 425. Όπως και με ΑΚΤ, η φωσφορυλίωση αυτών των υπολειμμάτων σερίνης με ERK αυξημένη FOXO3a κυτταροπλασματική διανομή και την πυρηνική εξαγωγή.

Επειδή η ισορροπία μεταξύ αντιαποπτωτικών και προαποπτωτική πρωτεϊνών είναι κρίσιμη για το φάρμακο που προκαλείται από απόπτωση, αξιολογήσαμε αλλαγές στην Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών σε ευαίσθητα και ανθεκτικά καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές σειρές AZD6244 και βρήκαν ότι ο αναστολέας ΜΕΚ AZD6244 ρυθμίζει ανοδικά οι προ-αποπτωτικών ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες Bim, PUMA και NOXA, μια διαδικασία που σχετίζεται με την επακόλουθη κυτταρικό θάνατο. Βρήκαμε επίσης ότι η φίμωση είτε FOXO3a, ένα μεταγραφικό ρυθμιστή του Bim, ή Bim με μικρά RNA παρεμβολής (siRNA) πολύ ανέστειλε την απόπτωση. Επιπλέον, η έκφραση της ΑΚΤ μόνιμα ενεργών (caAKT) σε ευαίσθητα κύτταρα ανέστειλε AZD6244 επαγόμενη Bim υπερ-έκφραση και οδήγησε σε αντίσταση AZD6244. Αντίθετα, σταθερή επιμόλυνση των κυρίαρχων-αρνητικών ΑΚΤ σε ανθεκτικά κύτταρα ενισχυμένη AZD6244 που προκαλείται Bim πάνω-exrpession.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

AZD6244, που παρέχονται από την AstraZeneca Pharmaceuticals (Μάκλσφιλντ, Ηνωμένο Βασίλειο), διαλύθηκε σε 25 mM σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και αποθηκεύονται στους -80 ° C. Αντίσωμα έναντι Bim αγοράστηκε από την Calbiochem (San Diego, CA). Αντισώματα έναντι ρ-ΕΚΚ, FOXO3a, ρ-FOXO3a (Thr32), ρ-FOXO3a (Ser253), Bad, PARP, NOXA και Puma, και ο κιτ δοκιμασίας ΑΚΤ κινάσης αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Αντισώματα έναντι Bak, Bcl-XL και κασπάση-9 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Προσχεδιασμένα FOXO3a siRNA αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), και Bim και siRNA ελέγχου ήταν από Qiagene (Valencia, CA). Το πλήρους μήκους ανθρώπινο cDNA BimEL, το οποίο κλωνοποιείται εντός του φορέα έκφρασης pCMV6-XL4, αγοράστηκε από ΟηΟεηε Technologies (Rockville, MD). Κοκτέιλ Αναστολέα Πρωτεάσης, αντίσωμα β-ακτίνης, και σουλφοροδαμίνης Β (SRB) ήταν από την Sigma Chemical Corporation (St. Louis, ΜΟ). υλικά δοκιμασίας πρωτεϊνών και SYBR Green Supermix αγοράσθηκαν από την Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA), και Geneticin ήταν από την Life Technologies Corporation (Carlsbad, CA). Lipofactamin 2000 και το αντιδραστήριο ΤπζοΙ αγοράσθηκαν από την Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA), και αντίστροφη μεταγραφή αντιδραστήρια ήταν από την Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA). Αδιέξοδο ™ Flurometic ΤΟΥΝΕΛ σύστημα αγοράστηκε από την Promega (Madison, WI).

καλλιέργειας κυττάρων

Οι κυτταρικές σειρές H2347, H3122, H196, HCC2450 και Η522 δόθηκαν από τους Drs. Α Gazdar και J. Minna, Hamon Κέντρο Θεραπευτικής Ογκολογίας Έρευνας, το Πανεπιστήμιο του Τέξας Southwestern Medical Center, Dallas, TX. Όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα διατηρήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο υψηλής γλυκόζης ϋυΐββοοο Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS), 100 μg /mL αμπικιλλίνη και 0.1 mg /mL στρεπτομυκίνη? τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 και 95% αέρα.

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμασία SRB, και κάθε δοκιμασία διεξήχθη εις τετραπλούν. Πνεύμονα καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν σε περίπου 3000 ανά φρεάτιο σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάζονται για 24 ώρες σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με AZD6244 στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις που ήταν ισοδύναμες με συγκεντρώσεις στον ορό επιτυγχάνονται σε ασθενείς μετά από του στόματος χορήγηση. Κύτταρα κατεργασμένα με DMSO χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν 96 ώρες μετά την κατεργασία με την προσθήκη 50 μL του 10% τριχλωροξικού οξέος σε 4 ° C για 1 ώρα. Αυτά στη συνέχεια χρωματίστηκαν με 70 μι 0,4% SRB για 60 λεπτά και πλύθηκαν με 1% οξικό οξύ? Προστέθηκε? 200 μι βάσης Tris (ρΗ, 10.5 10 mmol /L). αναγνώσεις απορρόφησης στα 570 nm προσδιορίστηκαν με τη χρήση ενός αναλυτή μικροπλάκας. Το ποσοστό σχετικής επιβίωσης (%) υπολογίστηκε από την εξίσωση OD

T /OD

C χ 100% (με OD

T αντιπροσωπεύει την απορρόφηση των ομάδων θεραπείας, και OD

C η απορρόφηση του ελέγχου ομάδες). Μέσος ανασταλτικές συγκεντρώσεις (IC

50 τιμές) προσδιορίστηκαν με χρήση CurveExpert 1,3 λογισμικό και παρουσιάζεται στο διάγραμμα καμπύλες δόσης-απόκρισης. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Western ανάλυση κηλίδος

ολόκληρου-κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν με έκπλυση των κυττάρων με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και την υποβολή τους σε λύση με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος Laemmli συμπληρωμένο με αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ. Αφού τα προϊόντα λύσης υποβλήθηκαν σε υπερήχους για 15 δευτερόλεπτα, οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν ποσοτικά με τη χρήση του κιτ προσδιορισμού πρωτεΐνης Bio-Rad. Ισοδύναμες πρωτεΐνες φορτώθηκαν, διαχωρίστηκαν με 10% ή ηλεκτροφόρηση πήγματος 12% νάτριο δωδεκυλ θειικού πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE), και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης σε 80 V για 2 ώρες. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν για 1 ώρα με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμιστικό Tris που περιέχει 0.1% Tween (TBST) και ανιχνεύθηκαν με αραιωμένο πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές σε ρυθμιστικό TBST και ανιχνεύθηκαν με υπέρυθρο χρωστική-επισημασμένο δευτερογενή αντισώματα? οι ανοσοαντιδραστικές ζώνες οπτικοποιήθηκαν με τη χρήση του Odyssey® Imager (Li-COR Biosciences, Lincoln, ΝΕ).

κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης δοκιμασία

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, πλύθηκαν δύο φορές σε ψυχρό PBS, μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη 70% μεθανόλη, και επωάζονται στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 25 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου που περιείχε 30 μg /mL ριβονουκλεάση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα αναλύθηκαν σε ένα EPICS Profile ροής II κυτταρόμετρο (Coulter Corp., Hialeah, FL) με το πρόγραμμα Systems Multicycle Phoenix Flow (Systems Flow Phoenix, San Diego, CA). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Μέτρηση της απόπτωσης με TUNEL (τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης μεσολάβηση nick-end επισήμανση) δοκιμασία

Η δοκιμασία TUNEL έγινε ακολουθώντας τις οδηγίες που παρέχονται από τον κατασκευαστή του α διαθέσιμο στο εμπόριο κιτ (αδιέξοδο ™ Φθορομετρικής ΤΟΥΝΕΛ System) από την Promega. Τα αποπτωτικά κύτταρα εμφανίζουν μια ισχυρή πυρηνική πράσινο φθορισμό που θα μπορούσε να ανιχνευθεί χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο φίλτρο φλουορεσκεϊνης. Όλα τα κύτταρα χρωματίστηκαν με DAPI εμφανίζουν ισχυρή μπλε πυρηνικό φθορισμό. Τα πλακίδια παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φθορισμού με σχετική αποπτωτικά κύτταρα προσδιορίστηκε με μέτρηση TUNEL-θετικών κυττάρων σε πέντε τυχαία πεδία (σε μεγέθυνση χ 100) για κάθε δείγμα.

Real-time PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε με το αντιδραστήριο ΤπζοΙ χρησιμοποιώντας και αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως, χρησιμοποιήσαμε Bim πριμοδότες [6] στη μελέτη μας. Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) εκτελέστηκε σε 25 μί μίγματος, με 12,5 μι 2 χ SYBR Green Supermix, 1 μΜ από κάθε προς τα εμπρός και αντίστροφο εκκινητή, και 4 έως 12 ng του εκμαγείου, με τη χρήση του πραγματικού χρόνου PCR ανίχνευση CFX96 σύστημα (Bio-Rad). PCR διεξήχθη για αρχική μετουσίωση 10 λεπτά στους 95 ° C που ακολουθείται από 39 κύκλους των 15 δευτερολέπτων στους 95 ° C, 30 δευτερόλεπτα στους 58 ° C, και 30 δευτερόλεπτα στους 72 ° C. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν εις τριπλούν, και τα ανθρώπινα γλυκεραλδεϋδης 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως ένα ενδογενές ελέγχου. Σχετική έκφραση υπολογίστηκε με τη χρήση της μεθόδου 2-δδCt.

siRNA και ΒΙΜ cDNA διαμόλυνση

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων μέχρι 70% συρροή και επιμολύνθηκαν με 200 nmol /L του ελέγχου μη ειδική siRNA, ΒΙΜ-στοχευμένες siRNA, ή FOXO3a στοχευμένες siRNA με τη χρήση Lipofectamine ™ 2000 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO (έλεγχος) ή AZD6244 σε ενδεικνυόμενες δόσεις και χρονικά σημεία. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέγονται και υφίστανται επεξεργασία για ανοσοκηλίδωση ή χρώση ιωδιούχου προπιδίου για την δοκιμασία κυτταρικού κύκλου.

Για την επιμόλυνση Bim cDNA, τα κύτταρα επίσης καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 6 φρεατίων μέχρι 70% συρροή και επιμολύνθηκαν με φορέα μάρτυρα ή BimEL φορέα έκφρασης, σε συγκέντρωση 4 μg σε 250 μΙ μέσου, χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανοσοκηλίδωση ή μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη για δοκιμασία TUNEL.

δραστικότητα κινάσης ΑΚΤ δοκιμασία

κυττάρων πλύθηκαν δύο φορές με PBS, υποβλήθηκαν σε λύση σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης κυττάρου, και κατεργασία με υπερήχους για 15 δευτερόλεπτα. Τα εκχυλίσματα φυγοκεντρήθηκαν για να απομακρυνθούν τα κυτταρικά υπολείμματα, και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των υπερκειμένων προσδιορίστηκαν με χρήση αντιδραστηρίου ποσοτικού προσδιορισμού πρωτεΐνης Bio-Rad. Ένα 200- μλ δείγμα κυτταρολύματος επωάστηκε με 20 μΙ ακινητοποιημένου αντι-ΑΚΤ αντίσωμα σε 4 ° C όλη τη νύκτα με ήπια ανακίνηση. Τα προκύπτοντα ανοσοϊζήματα πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και δύο φορές με ρυθμιστικό ΑΚΤ κινάσης. Εκτελέστηκαν προσδιορισμοί κινάσης για 30 λεπτά στους 30 ° C υπό συνεχή ανάδευση σε ρυθμιστικό διάλυμα κινάσης που περιέχει 200 ​​μΜ ΑΤΡ και 1 μg της GSK-3 πρωτείνη σύντηξης. Τα προϊόντα της αντίδρασης διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PGAE, που ακολουθείται από κηλίδωση Western με ένα /β αντίσωμα αντι-φωσφο-GSK-3α σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για τη δοκιμασία κινάσης ΑΚΤ μη ραδιενεργό. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

ανοσοφθορισμού χρώση

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε CultureSlides (BD Biosciences, CA). Το μέσο αναρροφήθηκε, και τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με πρόσφατα παρασκευασθέν 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από μια άλλη στάδιο έκπλυσης με PBS, τα κύτταρα διαπερατά για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με τη χρήση ρυθμιστικού διαλύματος PBS που περιείχε 0,2% Triton Χ-100 και 0,1% κιτρικό νάτριο. Στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν σε PBS που περιέχει 5% άπαχο ξηρό γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Πρωτογενής επώαση αντισώματος διεξήχθη με αντι-FOXO3a (1:100 αραιώσεις) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από μια άλλη στάδιο έκπλυσης με PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με το δευτερογενές αντίσωμα, συζευγμένο με FITC αντίσωμα αντι-κουνελιού (1:100? Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, ΡΑ) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Όλα τα αντισώματα αραιώθηκαν σε PBS συν 5% άπαχο ξηρό γάλα. Τα πλακίδια στη συνέχεια χρωματίζονται με αντιξεθωριάσματος διάλυμα Prolong (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου που ακολουθείται από έκπλυση τρεις φορές σε PBS. Οι εικόνες ελήφθησαν με μικροσκόπιο φθορισμού με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο Zeiss λέιζερ σάρωσης. Μεμονωμένα πυρήνες που περιγράφονται με τη χρήση φθορισμού DAPI, και η πυρηνική φθορισμός του Cy3 ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης εικόνας Zeiss KS400 (Carl Zeiss, Inc., Oberkochen, Germany). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD και υπολογίζονται ως μέσες τιμές με διαστήματα εμπιστοσύνης 95%. Η στατιστική σύγκριση μεταξύ των πειραματικών ομάδων διεξήχθη με αμφίδρομη δοκιμή ANOVA με τη χρήση λογισμικού Microsoft Excel. Οι τιμές των

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

AZD6244 αυξάνει την έκφραση Bim σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα

προηγούμενη μελέτη μας [5 ] έδειξε ότι η AZD6244 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό σε Calu-6, H2347, H3122 και ο καρκίνος του πνεύμονα κυτταρικές σειρές, αλλά είχε μικρή επίδραση στη H196, Calu-3, Η522, ή κυτταρικές σειρές HCC2450. Επιπλέον, βρήκαμε ότι μετά τη σύλληψή του κύκλου υπο-G

1 κύτταρο, 20-40% των AZD6244-ευαίσθητα κύτταρα υπέστησαν απόπτωση, αλλά παρατηρήσαμε καμία απόπτωση σε AZD6244-ανθεκτικά κύτταρα. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε αυτές τις ίδιες κυτταρικές σειρές για να καθορίσει περαιτέρω τους μηχανισμούς του AZD6244 απόπτωση

Το μιτοχονδριακό αποπτωτικό μονοπάτι είναι γνωστό ότι παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην κινάσης τυροσίνης που προκαλείται από αναστολέα της απόπτωσης [6] -. [ ,,,0],9]. Για να αξιολογηθεί ποια μέλη οικογένειας Bcl-2 επηρεάζονται κριτικά με επεξεργασία AZD6244, προσδιορίσαμε τα επίπεδα της πρωτεΐνης τους σε τρεις ευαίσθητους κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα μετά από αγωγή με 3 μΜ AZD6244, η συγκέντρωση έφθασε στον ορό των ασθενών που έλαβαν από του στόματος AZD6244. Calu-6 έχει ένα μεταλλαγμένο KRAS και άγριου τύπου BRAF, ενώ H2347 στο μεταλλαγμένο ΕΡΑ και H3122 [17] έχουν τόσο άγριου τύπου KRAS και BRAF. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι η θεραπεία με AZD6244 που προκαλείται ταχεία και συνεχείς αυξήσεις των επιπέδων BimEL και, σε μικρότερο βαθμό, των BimL και bims, σε όλες τις ευαίσθητες κυτταρικές σειρές (Σχ. 1Α). Επιπλέον, η θεραπεία με συγκεντρώσεις υπο-μικρομοριακή (0.03, 0.1, 0.3, 1, και 3 μΜ) του AZD6244 για 24 ώρες επάγεται σημαντική αύξηση στα επίπεδα του Bim (Εικ. 1 C). Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι AZD6244 επάγεται αποτελέσματά του στην έκφραση Bim από τη συγκέντρωση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Ωστόσο, σε αυτά τα κύτταρα, τα επίπεδα των άλλων μελών οικογένειας Bcl-2 (Βαχ, Bak, και Bcl-XL) δεν άλλαξε αισθητά σε οποιαδήποτε συγκέντρωση του AZD6244 ή σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο (Σχ. 1Α). Σε αντίθεση, AZD6244 δεν προκάλεσε εμφανείς αλλαγές στην έκφραση Bim σε ανθεκτικούς κυτταρικές σειρές (Σχ. 1Β). Οι ανθεκτικές κυτταρικές σειρές είναι όλα άγριου τύπου για BRAF και KRAS. Διαπιστώσαμε επίσης καταστολή της έκφρασης ρ-ERK με AZD6244 τόσο ευαίσθητων και ανθεκτικών κυττάρων (Εικ. 1Α και 1Β). Ερευνήσαμε επίσης την έκφραση του ΒΗ3-μόνο πρωτεΐνες PUMA και NOXA μετά τη θεραπεία AZD6244 3 μΜ. PUMA και NOXA εκφράσεις αυξήθηκαν κατά την κατεργασία AZD6244, ωστόσο, τα επίπεδα της αύξησης ήταν πολύ λιγότερο από εκείνο που παρατηρήθηκε με Bim (Εικ. 1Α). Δεδομένου ότι η προς τα πάνω ρύθμιση του Bim είναι πολύ πιο δραματική από PUMA και NOXA σε κύτταρα AZD6244 επεξεργασμένα, εστιάσαμε στο ρόλο των Bim σε μετέπειτα μελέτες.

κηλίδες Western των μελών της οικογένειας Bcl-2 μετά από θεραπεία με AZD6244. (Α) Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα (Calu-6 H2347, H3122 και) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 3 μΜ AZD6244 για 4, 8, 24, 48, και 72 ώρες. (Β) Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα (Calu-3, H196, Η522, και HCC2450) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 3 μΜ AZD6244 για 4, 24, και 72 ώρες. (C) Calu-6, H2347, H196 και Η522 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0,03, 0,1, 0,3, 1 και 3 μΜ AZD6244 για 24 ώρες. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

AZD6244 επαγόμενη Bim υπερέκφραση προκαλείται τόσο από αυξημένη μεταγραφή και αυξημένη σταθερότητα της πρωτεΐνης

Για να διερευνηθούν οι μηχανισμοί του AZD6244 που προκαλείται Bim έκφραση, αναλύσαμε τα επίπεδα Bim mRNA μετά από κατεργασία με AZD6244. Ευαίσθητες και ανθεκτικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 μΜ AZD6244 για 4 και 24 ώρες, και τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR. Τα επίπεδα mRNA του GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι, μετά από κανονικοποίηση με εσωτερικούς ελέγχους, η θεραπεία με AZD6244 οδήγησε σε σημαντική αύξηση των επιπέδων του mRNA του Bim σε ένα χρονο-εξαρτώμενο τρόπο στα ευαίσθητα κύτταρα Calu-6, H2347, H3122 και. AZD6244, σε μια συγκέντρωση 3 μΜ, αυξήθηκε Bim mRNA μεταξύ 2.2- έως 2.5-φορές μετά από 4 ώρες, και 2,9 έως 3,8 φορές μετά από 24 ώρες επώαση σε αυτές τις τρεις κυτταρικές σειρές (Σχ. 2Α). Υπάρχουν σημαντικές διαφορές στην έκφραση mRNA Bim μεταξύ των ομάδων θεραπείας και ελέγχου ή μεταξύ των 4 ώρες και 24 ώρες ομάδες θεραπείας (

P

& lt? 0,05 μεταξύ όλων των κατά ζεύγη σύγκριση). Σε αντίθεση, AZD6244 δεν μπορούσε να επάγει την έκφραση mRNA Bim στις τέσσερις ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές H196, HCC2450, Calu-3 και Η522.

(Α) Ολικό RNA απομονώθηκε παράλληλα. Έκφραση του

Bim

μετρήθηκε με PCR πραγματικού χρόνου, και ομαλοποιήθηκε ως προς το επίπεδο του

GAPDH

. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD. *,

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα. (Β) Calu-6, H2347, H3122 και τα κύτταρα H196 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 30 μΜ MG132 για 2, 4, 6, και 8 ώρες και ανάλυση κηλίδας Western με έκφραση Bim εκτελέστηκε. (C) Calu-6, H2347, H3122 και τα κύτταρα H196 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO, 3 μΜ AZD6244, ή 30 μΜ MG132 για 6 ώρες, και στη συνέχεια με 25 μg /ml κυκλοεξιμιδίου να εμποδίσει την πρωτεϊνική σύνθεση. Διεξήχθη ανάλυση κηλίδος Western με έκφραση Bim. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Επειδή η ενεργοποίηση της οδού ERK1 /2 σηματοδότηση φωσφορυλιώνει Bim και προωθεί πρωτεασώματος εξαρτώμενη αποδόμηση των Bim [18], ελέγξαμε αν Bim πρωτεΐνη σταθεροποιείται με AZD6244 θεραπεία. Για το σκοπό αυτό, θα αντιμετωπίζονται πρώτα ευαίσθητα (H196) κύτταρα (Calu-6 H2347 και H3122) και ανθεκτικά με αναστολέα πρωτεοσώματος MG132 στους 30 μΜ για 2, 4, 6 και 8 ώρες, συλλέχθηκαν τα κύτταρα και ανιχνεύεται έκφραση Bim με κηλίδα Western ( Σχ. 2Β). Bim επίπεδα πρωτεΐνης αυξήθηκαν 2 ώρες μετά την έκθεση σε MG132 και συνέχισε να αυξάνεται κατά 6-8 ώρες. Εμείς στη συνέχεια κατεργάζεται αυτά τα κύτταρα με DMSO, 3 μΜ AZD6244, ή 30 μΜ MG132 για 4 ώρες και στη συνέχεια προστίθενται 25 μg /ml κυκλοεξιμιδίου να εμποδίσει τη σύνθεση πρωτεΐνης στα κύτταρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν την πάροδο του χρόνου και η έκφραση Bim ανιχνεύθηκε με ανάλυση στυπώματος Western (Σχ. 2C). Βρήκαμε ότι Bim πρωτεΐνη αποικοδομήθηκε γρήγορα σε κύτταρα επεξεργασμένα με DMSO σε όλες τις τέσσερις εξετασθείσες κυτταρικές γραμμές. Αντιθέτως, σε κύτταρα κατεργασμένα με AZD6244 ή MG132, τα επίπεδα πρωτεΐνης Bim σταθεροποιήθηκαν ακόμη και μετά από 6 ώρες θεραπείας κυκλοεξιμίδιο, υποδεικνύοντας ότι η υποβάθμιση του Bim πρωτεΐνη αποκλείστηκε με κατεργασία με AZD6244. Μαζί, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η αυξημένη έκφραση BimEL επάγεται από την αγωγή AZD6244 θα μπορούσε να προκληθεί με δύο μηχανισμούς: αύξηση

Bim

γονιδιακής μεταγραφής και μια αναστολή της πρωτεϊνικής αποδόμησης Bim. Όπως AZD6244 μπορεί να αναστέλλουν αποικοδόμηση πρωτεΐνης Bim σε αμφότερες τις ευαίσθητες και ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές, η αύξηση του

Bim

γονιδιακής μεταγραφής μπορεί να είναι πιο σημαντικές στην επαγωγή AZD6244 επαγόμενη απόπτωση.

Bim απαιτείται για AZD6244- επαγόμενη απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα

για να εξεταστεί ο ρόλος του Bim σε AZD6244 επαγόμενη απόπτωση κυττάρων, δημιουργήσαμε ειδικές κατασκευές siRNA για Bim σε κυτταρικές σειρές Calu-6 και H3122. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, siRNA knockdown του Bim ανέστειλε σημαντικά την έκφραση του Bim μετά από αγωγή με 3 μΜ AZD6244 για 48 ώρες. διάσπαση PARP και κασπάσης-9 διάσπασης /ενεργοποίησης ανεστάλησαν.

(Α) Calu-6 και H3122 κύτταρα επιμολύνθηκαν με ΒΙΜ-ειδικές ή ελέγχουν siRNA και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 3 μΜ AZD6244 για 48 ώρες. Έκφραση των Bim, PARP και κασπάση-9 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. (Β) Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις του AZD6244 για 96 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με σουλφοροδαμίνη Β, και η σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων παραστάθηκε γραφικά όπως περιγράφεται στο τμήμα Υλικά και Μέθοδοι. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέσο όρο ± SD τριών ανεξαρτήτων προσδιορισμών εις τριπλούν. (Γ) Παράλληλες κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με αιθανόλη και βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο? περιεχόμενο DNA αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν ποσοστά των αποπτωτικών υπο-G

1-φάσης κύτταρα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD. *,

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με το siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα. (Δ) Παράλληλες κύτταρα καθορίζεται επίσης για χρώση TUNEL και DAPI. πυρήνες αποπτωτικός κυτταρικός σε χρώση TUNEL σημάνθηκαν με FITC και οπτικοποιήθηκαν υπό μικροσκοπία φθορισμού. Οι σχετικές αποπτωτικά κύτταρα προσδιορίστηκε με μέτρηση TUNEL θετικά κύτταρα σε πέντε τυχαία πεδία (στα 100 χ μεγέθυνση) για κάθε δείγμα.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD. *,

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με το siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα. Οι αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες των Calu-6 που φαίνεται στο άνω φύλλο και το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων τόσο Calu-6 και H3122 ήταν έδειξε στο κάτω πάνελ. (Ε) Calu-6 κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορέα έκφρασης BimEL και φορέα ελέγχου για 48 ώρες. Έκφραση των Bim αναλύθηκε με Western και αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με δοκιμασία TUNEL.

Η

Δοκιμάσαμε επίσης την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του AZD6244 για τον έλεγχο και Bim siRNA επιμολυσμένα κύτταρα με δοκιμασία SRB και καθορίζεται IC

50 τιμές. Βρήκαμε ότι το IC

50 έως AZD6244 αυξήθηκε από 0,7 έως 76,3 μΜ σε Calu-6 κυττάρων όσο και από 1,4 έως 89,3 μΜ σε H3122 κύτταρα (Εικ. 3Β). Ο έλεγχος και η Bim siRNA-επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 3 μΜ AZD6244 για 72 ώρες, και τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση κυτταρικού κύκλου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μετά τη θεραπεία με AZD6244, το ποσοστό των αποπτωτικών (υπο-G

1) κυττάρων μειώθηκε από 38,6% σε 8,4% το Bim siRNA επιμολυσμένα Calu-6 κυττάρων και από 29,8% σε 7,5% το Bim siRNA επιμολυσμένα κύτταρα H3122 (Σχ. 3C). Η δοκιμασία TUNEL ανέφερε επίσης Bim siRNA διαμόλυνση ανέστειλε AZD6244 επαγόμενη απόπτωση, από 56,6% έως 12,1% σε Calu-6 και από 65,3% σε 18,5% σε H3122 κύτταρα αντίστοιχα (Εικ. 3D).

περαιτέρω δοκιμή εάν η αυξημένη έκφραση Bim είναι επαρκής για να επάγει απόπτωση. Ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί πλήρους μήκους BimEL διαμολύνθηκε παροδικά σε Calu-6 και την απόπτωση των επιμολυσμένων κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία TUNEL. Βρήκαμε ότι σχεδόν όλα τα κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα ελέγχου είναι TUNEL-αρνητικά μετά από 48 ώρες, ενώ, BimEL φορέα έκφρασης επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν σημαντικά αυξημένη TUNEL θετικά απόπτωση (Σχ. 3Ε).

Ο ρόλος των FOXO3a σε AZD6244 επαγόμενη Bim έκφραση

έχει αναφερθεί ότι η ενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής FOXO επάγει την έκφραση mRNA Bim και προάγει την κυτταρική απόπτωση σε ΒΙΜ-εξαρτώμενο τρόπο [19], [20]. Οι παράγοντες μεταγραφής FOXO φωσφορυλιώνεται από ΑΚΤ σε τρεις εξαιρετικά διατηρημένες περιοχές, Thr32, Ser253 και Ser315, η οποία οδηγεί στην κυτταροπλασματική κατακράτηση και απομείωση FOXO δραστηριότητας πυρηνική μεταγραφικής. ERK έχει επίσης δειχθεί να φωσφορυλιώνει FOXO3a και να αυξηθεί η πυρηνική εξαγωγή του. Σε προηγούμενη μελέτη μας [5], βρήκαμε ότι το ρ-ΑΚΤ έκφραση ήταν πολύ υψηλότερη σε ανθεκτικά κύτταρα σε σύγκριση με τα ευαίσθητα κύτταρα. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα ενδογενή επίπεδα του p-Thr32-FOXO3a και ρ-Ser253-FOXO3a ήταν υψηλότερα σε ανθεκτικά κύτταρα από ό, τι σε ευαίσθητα κύτταρα (Σχ. 4Α). Δεν συνεπής παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων για το σύνολο FOXO3a.

(Α) Ενδογενής έκφραση του ρ-Thr32-FOXO3a, ρ-Ser253-FOXO3a, και η συνολική FOXO3a ανιχνεύτηκε σε 8 κυτταρικές σειρές. (Β) υποκυτταρικός εντοπισμός της FOXO3a σε Calu-6 και Η522 κύτταρα ανιχνεύθηκε με χρώση ανοσοφθορισμού μετά την επεξεργασία AZD6244. (C) Calu-6 κύτταρα είτε ψευδο-επιμολυσμένα ή επιμολυσμένα με έναν FOXO3a ειδικό μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 3 μΜ AZD6244 για 4 ώρες. Έκφραση των FOXO3a, Bim, PARP και κασπάση-9 αναλύθηκαν με κηλίδωση Western. (D) Παράλληλα, Calu-6 κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με αιθανόλη και βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο? περιεχόμενο DNA αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Οι αριθμοί αντιπροσωπεύουν ποσοστά των αποπτωτικών υπο-G

1-φάσης κύτταρα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα.

Στήλες

, μέση?

μπαρ

, SD. *,

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με το siRNA ελέγχου επιμολυσμένα κύτταρα. (Ε) δοκιμασίες TUNEL διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στο Σχ. 3D. Οι αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες της Calu-6 φαίνεται.

Η

Η μεταγραφική ενεργοποίηση του FOXO3a επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από την ενδοκυττάρια κατανομή της σε μια διαδικασία στενά ρυθμίζεται από ΑΚΤ και ERK. Ερευνήσαμε εάν η θεραπεία AZD6244 προκάλεσε FOXO3a να μετεγκατασταθούν στον πυρήνα όπου δραστηριοποιείται. χρώση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι σε ευαίσθητες Calu-6 κυττάρων, η θεραπεία με 3 μΜ AZD6244 επάγεται σημαντική υποκυτταρική εντόπιση του FOXO3a από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα. Ωστόσο, σε ανθεκτικά κύτταρα Η522, εντοπίσαμε κανένα προφανή αλλαγές στην υποκυτταρική εντόπιση του FOXO3a μετά τη θεραπεία AZD6244. Επιπλέον, έχουμε παρατηρήσει ότι σε μη επεξεργασμένα κύτταρα Calu-6, FOXO3a διέμεναν τόσο στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα? σε μη επεξεργασμένα κύτταρα Η522, το μεγαλύτερο μέρος της FOXO3a διαμείνει στο κυτταρόπλασμα, και πυρηνική χρώση ήταν σχετικά αμελητέα (Σχ. 4Β). Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με εκείνα που ανιχνεύονται σε Western κηλίδωση του p-FOXO3a έκφρασης (Εικ. 4Α).

Για να εξεταστεί ο ρόλος των FOXO3a σε AZD6244 που προκαλείται Bim, αξιολογήσαμε την επίδραση συγκεκριμένων κατασκευασμάτων siRNA για FOXO3a στην Calu-6 και H3122 κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4C, siRNA knockdown του FOXO3a ανέστειλε την έκφραση του FOXO3a, η οποία οδήγησε σε ισχυρή καταστολή του AZD6244 που προκαλείται Bim, διάσπαση PARP και κασπάσης-9 διάσπασης /ενεργοποίησης μετά από θεραπεία για 24 ώρες. Ανάλυση απόπτωσης μετά FOXO3a siRNA επιμόλυνση σε ευαίσθητα κύτταρα μετά την επεξεργασία AZD6244 έδειξε το ποσοστό των υπο-G

1 αποπτωτικά κύτταρα μειώθηκε από 32,5% σε 10,9% μετά από θεραπεία με AZD6244 για 72 ώρες (Εικ. 4D). Η δοκιμασία TUNEL έδειξε επίσης ότι FOXO3a siRNA επιμόλυνση ανέστειλε σημαντικά AZD6244 επαγόμενη απόπτωση από 56,7% σε 18,4% το Calu-6 (

P

& lt?. 0.05, Σχήμα 4Ε). Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι η ενεργοποίηση FOXO3a απαιτείται για AZD6244 επαγόμενη Bim έκφραση.

caAKT διαμόλυνση up-ρυθμίζει την έκφραση του ρ-FOXO3a και ανέστειλε AZD6244 επαγόμενη απόπτωση

προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι οι υψηλές Όπως φαίνεται στο Σχ.