Αφηρημένο

Cortactin (CTTN), αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως ένα σημαντικό υπόστρωμα της κινάσης τυροσίνης Src, συμμετέχει ενεργά σε διακλάδωση συναρμολόγησης F-ακτίνης και σε κυτταρική κινητικότητα και την εισβολή.

CTTN

γονίδιο ενισχύεται και η πρωτεΐνη του υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους καρκίνου. Η φωσφορυλιωμένη μορφή της cortactin (ρΤγΓ

421) απαιτείται για τον καρκίνο κυτταρική κινητικότητα και εισβολή. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η πλειοψηφία των δοκιμαζόμενων πρωτογενών δειγμάτων ορθοκολικού όγκου δείχνουν ενισχύεται σε μεγάλο βαθμό την έκφραση του ρΤγΓ

421-CTTN, αλλά καμία αλλαγή στο επίπεδο του mRNA σε σύγκριση με υγιή άτομα, υποδεικνύοντας έτσι μετα-μεταφραστική ενεργοποίηση αντί γονιδιακή ενίσχυση σε αυτούς τους όγκους. Η κουρκουμίνη (diferulolylmethane), μια φυσική ένωση με ελπιδοφόρα χημειοπροληπτική και χημειοευαισθητοποίησης επιδράσεις, μείωσε την έμμεση σύνδεση των cortactin με το κλάσμα μεμβράνης πλάσματος πρωτεΐνης σε κύτταρα αδενοκαρκινώματος κόλου, όπως μετράται με επιφάνεια βιοτινυλίωση, φασματομετρία μάζας, και κηλίδωση Western. Η κουρκουμίνη μείωσε σημαντικά την ρΤγΓ

421-CTTN σε κύτταρα HCT116 και τα κύτταρα SW480, αλλά ήταν αναποτελεσματική σε κύτταρα ΗΤ-29. Η κουρκουμίνη σωματικά αλληλεπιδράσει με φωσφατάσες PTPN1 τυροσίνης να αυξήσει τη δραστηριότητά της και να οδηγήσει σε αποφωσφορυλίωση ρΤγΓ

421-CTTN. αναστολή PTPN1 εξαλειφθούν οι επιπτώσεις της κουρκουμίνης στην ρΤγΓ

421-CTTN. Μεταγωγή με αδενοϊικώς-κωδικοποιημένα CTTN αυξημένη μετανάστευση των HCT116, SW480, και HT-29. Η κουρκουμίνη μειωμένη μετανάστευση του HCT116 και SW480 κύτταρα τα οποία εκφράζουν υψηλά PTPN1, αλλά όχι από ΗΤ-29 κυττάρων με σημαντικά μειωμένη ενδογενή έκφραση του PTPN1. Η κουρκουμίνη μείωσε σημαντικά την φυσική αλληλεπίδραση των CTTN και ρΤγΓ

421-CTTN με p120 κατενίνης (CTNND1). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η κουρκουμίνη είναι ένας ενεργοποιητής της PTPN1 και μπορεί να μειώσει την κυτταρική κινητικότητα σε καρκίνο του παχέος εντέρου μέσω αποφωσφορυλίωση ρΤγΓ

421-CTTN τα οποία θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις στη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου βασίζεται σε όγκο ρΤγΓ

421 -CTTN έκφραση

Παράθεση:. Radhakrishnan VM, Kojs P, Νέοι G, Ramalingam R, Jagadish Β, Mash ΕΑ, et al. (2014) ρΤγΓ

421 Cortactin υπερεκφράζεται στον καρκίνο του παχέος εντέρου και αποφωσφορυλιώνεται από κουρκουμίνη: Συμμετοχή των Μη-υποδοχέα τύπου 1 φωσφατάσης τυροσίνης πρωτείνης (PTPN1). PLoS ONE 9 (1): e85796. doi: 10.1371 /journal.pone.0085796

Επιμέλεια: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 του Αυγ του 2013? Αποδεκτές: 2 Δεκέμβρη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Radhakrishnan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας [5 R01 DK067286 σε PRK και FKG]. NIH επιχορήγησης, Ρ30 CA 23074 [ΕΑΜ] NIEHS χορηγήσει ES006694 στη νοτιοδυτική Περιβαλλοντικό Κέντρο Επιστημών Υγείας (SWEHSC), ΝΙΗ /NCI επιχορήγηση CA023074 στο Κέντρο Καρκίνου της Αριζόνα και το BIO5 Ινστιτούτο του Πανεπιστημίου της Αριζόνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Cortactin, που κωδικοποιείται από το

CTTN EMS1

γονίδιο /, είναι ένα υπόστρωμα v-Src εντοπισμένο με φλοιώδη ακτίνης στη μεμβράνη του πλάσματος και υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκίνου [1]. Cortactin υπερέκφραση αποτελέσματα από την ενίσχυση χρωμοσωμική περιοχή 11q13.3 σε διάφορους καρκίνους, όπως κεφαλής και λαιμού πλακώδους καρκινώματος, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, του μαστού και του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, και συσχετίζεται με κακή πρόγνωση των ασθενών και μειωμένη επιβίωση [2] – [5]. Cortactin, γενικά υπάρχει σε αρκετούς διαφορετικούς τύπους κυττάρων, είναι εμπλουτισμένο σε φλοιώδη δομές όπως μεμβρανικές πτυχώσεις και ελασματοπόδια, και παίζει βασικό ρόλο στη διαμόρφωση των μικρονηματίων μεμβράνης αλληλεπιδράσεις καθώς επίσης στη μεταγωγή σημάτων από την κυτταρική επιφάνεια προς τον κυτταρικό σκελετό [6], [7 ]. Cortactin συμμετέχει ενεργά σε ARP2 /3 διαμεσολαβείται τον πολυμερισμό της ακτίνης που συνδέεται με τη μεμβράνη του πλάσματος [7] και δρα ως F-ακτίνης διαμορφωτή σε τυροσίνη αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού κινάση ρυθμίζονται [8] προτείνοντας ένα μηχανισμό για το ρόλο της στην κινητικότητα. Ο ρόλος της στη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή είναι καλά μελετηθεί σε επιθηλιακά κύτταρα, ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα, και καρκινικά κύτταρα μαστού [8] – [10]. Φωσφορυλίωση cortactin ποντικού σε Tyr

421, Tyr

466 (Tyr

470 στον άνθρωπο) και Tyr

482 (Tyr

486 στον άνθρωπο) είναι απαραίτητη για την αποτελεσματική κινητικότητα των κυττάρων σε πολλούς τύπους κυττάρων , υποδεικνύοντας ότι η φωσφορυλίωση τυροσίνης cortactin παίζει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση [8], [11], [12]. Σε γενικές γραμμές, η φωσφορυλίωση της τυροσίνης του cortactin πυροδοτεί την πρόσληψη πρωτεϊνών SH2-τομέα, συμπεριλαμβανομένων αρκετών κινασών και της πρωτεΐνης προσαρμογέα NCK NCK1, η οποία συνδέει cortactin με Wiskott-Aldrich σύνδρομο που μοιάζει με πρωτεΐνη (wasl, Ν-WASP) και /wasl αλληλεπιδρούν μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών 1 (WIF1, WIP). Αυτό με τη σειρά οδηγεί σε ενισχυμένη ενεργοποίηση του /3 συμπλόκου ARP2 (πρωτεΐνη ακτίνη που σχετίζονται με 2 ομόλογο /3 ομόλογο) και οδηγεί σε νήμα ακτίνης διακλάδωσης [13] – [16].

Πολυάριθμες επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι η φυτική βάση φαινολικών ενώσεων σε διαιτητικές παράγοντες παίζουν σημαντικό ρόλο στη χημειοπρόληψη του καρκίνου του παχέος εντέρου [17], η δεύτερη πιο κοινή μορφή καρκίνου στους άνδρες και τρίτη πιο κοινή σε γυναίκες. Η τακτική κατανάλωση φρούτων και λαχανικών που περιέχουν αυτές τις ενώσεις έχει συσχετιστεί με μειωμένη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου του παχέος εντέρου [18]. Μεταξύ των φυσικών bi-φαινολικές ενώσεις, κουρκουμίνη, ένα κουρκουμινοειδή από το ρίζωμα

Curcuma longa

, είναι γνωστή για την αντικαρκινική της, και αντι-φλεγμονώδη, αντιοξειδωτική δράση in vivo και in vitro [19] – [ ,,,0],21], και είναι καλά ανεκτή σε μεγάλες δόσεις. Σε μια μελέτη φάσης II με ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του παγκρέατος, η δόση των 8 g χορηγήθηκε για 2 μήνες με παρατηρείται τοξικότητα [22]. Μια άλλη κλινική δοκιμή Φάσης Ι αξιολόγησε την ανεκτικότητα της κουρκουμίνης σε 25 άτομα με υψηλό κίνδυνο προκαρκινικές αλλοιώσεις. Ιστολογική βελτιώσεις παρατηρήθηκαν σε 7 από τα 25 υποκείμενα, με καθόλου τοξικότητα σχετιζόμενη με τη θεραπεία έως και 8 g /ημέρα [23]. Οι αντικαρκινικές επιδράσεις της κουρκουμίνης και των παραγώγων της έχουν τυπικά αποδοθεί σε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, και /ή επαγωγή απόπτωσης [21], [24], [25]. Μία κλινική μελέτη έδειξε ότι η χορήγηση δόσεις έως 2,2 g

Curcuma

εκχύλισμα (που περιέχουν 180 mg της κουρκουμίνης) ανά ημέρα για μέχρι και 4 μήνες, έδειξε κλινικά οφέλη σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του παχέως εντέρου πυρίμαχο [26].

στην παρούσα μελέτη, αποδεικνύει ότι ρΤγΓ

421 cortactin υπερεκφράζεται στον καρκίνο του παχέος εντέρου χωρίς ταυτόχρονη αλλαγές στα επίπεδα mRNA. Η κουρκουμίνη μείωσε τα επίπεδα της ρΤγΓ

421 cortactin σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου

in vitro

με φυσική αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη φωσφατάση τύπου μη-υποδοχέα 1 τυροσίνης (PTPN1? ΡΤΡ1Β) να αυξήσει τη δραστηριότητά της, και αποφωσφορυλίωση cortactin, μειώνοντας έτσι τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν πιθανή χρησιμότητα της ρΤγΓ

421 cortactin ανοσοχρώση ως βιολογικός δείκτης του διηθητικού καρκίνου του παχέος εντέρου και να παρέχουν περαιτέρω κατανόηση του μηχανισμού χημειοπροληπτικές επιπτώσεις της κουρκουμίνης και το δυναμικό της ρόλο στην πρόληψη του μεταστατικού καρκίνου του παχέος εντέρου.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

η κουρκουμίνη με καθαρότητα 98,05% και ελεύθερη μολυσματικών κουρκουμινοειδή (δεμεθοξυ-κουρκουμίνη και δις-δεμεθοξυ κουρκουμίνη), ήταν έθιμο-καθαρίζεται με ChromaDex (Irvine, CA). αναστολέα PTPN1 XXII (3-(3,5-dibromo-4-hydroxy-benzoyl)-2-ethyl-benzofuran-6-sulfonicacid-(4-(thiazol-2-ylsulfamyl)-phenyl)-amide), ένα κύτταρο διαπερατό, εκλεκτικός, αναστρέψιμος, και ένας μη-ανταγωνιστικός αναστολέας αλλοστερική του PTPN1 [27] λήφθηκε από EMD Millipore (Billerica, ΜΑ). Η ανασυνδυασμένη αδενοϊικός cortactin ελήφθη από Vector Biolabs (Philadelphia, ΡΑ).

Αντισώματα, κυτταρικές σειρές και ανθρώπινους ιστούς

Τ-84 κύτταρα (ανθρώπινο καρκίνωμα παχέος) που αρχικά περιγράφηκε από Murakami και Masui [28 ] δόθηκαν από τον Dr. Declan McCole, Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια στο Σαν Ντιέγκο, CA. HCT116, ΗΤ29 και SW480 κύτταρα ελήφθησαν από την ATCC και καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle Medium (DMEM? Gemini Bio Products, West Sacramento, CA), 10% Εμβρυϊκό Βόειο Ορό (Cellgro, Manassas, VA), και 1% Πενικιλλίνη-Στρεπτομυκίνη (Life Technologies, Grand Island, Νέα Υόρκη). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ένα τρυβλίο 10 cm ή σε έξι φρεατίων (Greiner Βίο-One, Monroe, NC). ποντικού μονοκλωνικό αντι-GAPDH, πολυκλωνικά κουνελιού φωσφο-ειδικό (ρΤγΓ

421) cortactin αντίσωμα, και αντι-PTPN1 αντίσωμα αγοράστηκαν από EMD Millipore. Αντι-cortactin μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού και αντι-cortactin πολύκλωνα αντισώματα κουνελιού λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnologies, (Santa Cruz, CA). αντίσωμα αντι-κατενίνης ρ120 ποντικού μονοκλωνικό αγοράστηκε από την BD Biosciences, (San Jose, CA). Τα κατεψυγμένα δείγματα ανθρώπινου όγκου του παχέος εντέρου και μη κακοήθεις ιστούς που ελήφθησαν από Συνεταιριστική Ανθρώπινο Δίκτυο ιστών, Vanderbilt University Medical Center (Nashville, TN). επιλεγμένα 44 δείγματα με βάση τον τύπο του όγκου και το ποσοστό του περιεχομένου των κυττάρων του όγκου (& gt? 80%) μαζί με 37 φυσιολογικούς ιστούς. Οι μελέτες αυτές αξιολογήθηκαν από το Πανεπιστήμιο της Αριζόνα ανθρώπινα υποκείμενα Πρόγραμμα Προστασίας και κρίνονται απαλλάσσονται όπως τα δείγματα απο-προσδιορίζονται.

qRT-PCR

Το συνολικό RNA εξήχθη από τους ιστούς χρησιμοποιώντας ΤΡΙΖΟΙ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Life Sciences). 500 ng του συνολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με τη χρήση ενός κιτ σύνθεσης cDNA (Bio-Rad? Hercules, CA). Η qPCR διεξήχθη με Taqman qPCR μίγμα (Quanta BioSciences? Gaithersburg, MD) και προσχεδιασμένα εκκινητές TaqMan και ανιχνευτές (όλα από την Applied Biosystems /Life Technologies) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή με iCycler CFX96 (Bio-Rad). Η μέτρηση qPCR εκτιμήθηκε με βάση τη σχετική ποσοτικοποίηση του γονιδίου CTTN ρυθμίζεται σύμφωνα με την έκφραση του GAPDH. Τα δεδομένα εκφράζονται ως τιμές ΔCt και δοκιμασία t του Student χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων.

Ανοσοϊστοχημεία

παχέος συστοιχία καρκίνος ιστού ενσωματωμένα σε παραφίνη πυρήνων δείγμα ελήφθη από το US BioMax Inc (Rockville, MD). Phosphospecific αντι-ρΤγΓ

421 cortactin και το σύνολο των αντισωμάτων cortactin χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοχρώση. Οι πλάκες αποπαραφινοποιήθηκαν, ξεπλύθηκαν με Αλατόνερο Ρυθμισμένο με Φωσφορικό (PBS? ΡΗ 7.4) και δεσμεύτηκαν με ορό κατσίκας (Santa Cruz). Αυτά στη συνέχεια επωάστηκαν με τα πρωτογενή αντισώματα για 4 ώρες στους 4 ° C. Τα πλακίδια πλύθηκαν και κατόπιν επωάστηκαν με το αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού συζευγμένο με HRP αντίσωμα (Santa Cruz) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Οι πλάκες αναπτύχθηκαν με ένα κιτ υπόστρωμα ϋΑΒ (Vector Labs) και με αιματοξυλίνη.

κυτταρικής επιφάνειας βιοτινυλίωση

επιφάνεια βιοτινυλίωση Apical κυττάρου διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [29]. Εν συντομία, 2 × 10

5 Τ84 καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα σπάρθηκαν σε φίλτρα φρεατίων (Corning Incorporated) και αναπτύχθηκαν για 5 -7 ημέρες έως ότου η αντίσταση μονοστοιβάδα φθάσει σε τουλάχιστον 600 Ω

.cm

2. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με κουρκουμίνη (50 μΜ) ή διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, όχημα) στην κορυφαία πλευρά για 1 ώρα. επιφανειακές πρωτεΐνες βιοτινυλιώθηκαν με εφαρμογή 0,5 ml NHS-S-S-βιοτίνη (Pierce? Rockford, IL) σε PBS για 30 λεπτά στους 4 ° C στα κορυφαία πλευρά. Μετά τη σβέση, τα φίλτρα αποκόπηκαν και τα κύτταρα λύθηκαν με περιέχει αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης 0,5 ml RIPA ρυθμιστικό λύσης (αναστολέας πρωτεάσης Halt /φωσφατάση κοκτέιλ? Pierce). Τα λυθέντα δείγματα συντομία σε κατεργασία με υπερήχους, φυγοκεντρήθηκε σε 13.000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C, και το υπερκείμενο συλλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για δοκιμασία πρωτεϊνών και pull-down πειράματα. Βιοτινυλιωμένα πρωτεΐνες τραβήχτηκαν κάτω με σφαιρίδια στρεπταβιδίνης-αγαρόζης (Pierce). Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν με επώαση των σφαιριδίων σε ρυθμιστικό δοκιμασίας ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA? 50 mM Tris HCl ρΗ 7,42, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.25% Na-δεοξυχολικό, πρωτεάση και τον αναστολέα της φωσφατάσης κοκτέιλ, και φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο) στους 98 ° C για 5 λεπτά. Τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στις 10.000 rpm για 5 λεπτά, και το υπερκείμενο διαχωρίστηκε και αναμίχθηκε με 0,125 ml τριχλωροξικού οξέος (TCA), επωάστηκαν για 10 λεπτά επί πάγου και φυγοκεντρήθηκε στις 14.000 rpm για 5 λεπτά. Τα υπερκείμενα απορρίφθηκαν και τα σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο ακετόνη. Τα σφαιρίδια ξηραίνονται στον αέρα και πρωτεΐνη ποσοτικοποιηθεί πριν από την επεξεργασία για την ανάλυση MS. Για ανοσοστύπωση, οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, ακολουθούμενη από ανοσοστύπωμα με αντι-cortactin αντίσωμα. Ακόμα και φόρτωση των βιοτινυλιωμένων πρωτεϊνών επιφανείας επιβεβαιώθηκε με αντι-τρανσφερίνης αντίσωμα υποδοχέα κατσίκας πολυκλωνικό (Santa Cruz).

Αναγνώριση των πρωτεϊνών με τετραπολικό χρόνο διαδοχική φασματομετρία μάζας πτήσης (QTOF MS /MS)

Τέσσερις εκατό νανο γραμμάρια μεμβράνη πρωτεϊνών που σχετίζονται κύτταρο, που λαμβάνεται ως περιγράφεται ανωτέρω, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για τρυπτική πέψη και αναλύθηκε με φασματομετρία μάζας χρωματογραφία-υγρό από την Arizona Πρωτεομική Consortium κοινόχρηστη εγκατάσταση. QTOF MS /MS ανάλυση του θρυψίνη πέψη πρωτεϊνών διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα χρόνο-πτήσης τετραπολικό φασματογράφο μάζας (QTOF? Waters Q-TOF Premier, 2008). Τα πεπτίδια εκλούστηκαν χρησιμοποιώντας Vydac C18 (Hesperia, CA), χρησιμοποιώντας μια βαθμίδα 0-65% διαλύτη (98% μεθανόλη /2% νερό /0,5% μυρμηκικό οξύ /0,01% τριφθοροξικό οξύ) σε διάστημα 60 λεπτών περίοδος σε μία ταχύτητα ροής 350 nl /min. Το διάλυμα πεπτιδίου ψεκάστηκε σε ένα δυναμικό 1.6 kV και η θερμοκρασία τριχοειδούς στους 200 ° C. Εξαρτημένη σάρωση των δεδομένων έγινε με τη Xcalibur v 2.0 λογισμικό SR2 [30] με μια προκαθορισμένη χρέωση 2, ένα πλάτος απομόνωση του 1.5 amu, ένα πλάτος ενεργοποίηση του 35%, χρόνος ενεργοποίησης 30 msec, και μία ελάχιστη σήματος 10000 ιόντων μετράει . Παγκόσμια εξαρτάται από τις ρυθμίσεις των δεδομένων είχαν ως εξής: απορρίψουν μάζα πλάτος 1,5 amu, επέτρεψε τη δυναμική του αποκλεισμού, επαναλάβετε καταμέτρηση των 1, επαναλάβετε διάρκεια 1 λεπτό, και η διάρκεια του αποκλεισμού των 5 λεπτών. Σάρωση σειρά εκδήλωση περιελάμβανε μία πλήρη σάρωση με το φάσμα μάζας 350 – 2000 Da, ακολουθούμενη από 3 εξαρτώνται από σαρώσεις MS /MS της πιο έντονης ιόντων. Δυναμική αποκλεισμού τέθηκε σε λειτουργία για διάστημα 60 sec. Tandem MS φάσματα των πεπτιδίων αναλύθηκαν με Turbo SEQUEST ™ ν 3.1, ένα πρόγραμμα που επιτρέπει τη συσχέτιση των πειραματικών συνδυασμό δεδομένων MS με τη θεωρητική φασμάτων που δημιουργούνται από γνωστές αλληλουχίες πρωτεϊνών. Τα κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την έκδοση προδικαστικής θετική ταυτοποίηση πεπτιδίων είναι τα ίδια όπως περιγράφηκε προηγουμένως, δηλαδή πεπτίδιο πρόδρομος ιόντα με ένα φορτίο που έχει Xcorr & gt? 1.8, 2 Xcorr & gt? 2,5 και 3 Xcorr & gt? 3.5. Η βαθμολογία DCN & gt? 0,08 και λόγο ιόντος θραύσμα του πειραματικού /θεωρητική & gt? 50% χρησιμοποιήθηκαν επίσης ως κριτήρια φιλτραρίσματος για την αξιόπιστη ταυτοποίηση συμφωνημένα πεπτίδιο [31]. Όλα τα συμφωνημένα πεπτιδίων επιβεβαιώνεται με οπτική εξέταση των φασμάτων. Όλα τα φάσματα αναζητήθηκαν στη βάση δεδομένων πρωτεΐνης ipiHuman 3.72 το οποίο έχει σ ‘αυτό την ακολουθία του

Rhodobacter

και αλβουμίνη βόειου ορού. Συνήθως, αλβουμίνη βόειου ορού προστίθεται ως πρωτεΐνη αναφοράς αλλά αφού βοοειδούς και αλβουμίνη ανθρώπινου ορού είναι παρόμοια, χρησιμοποιήσαμε την μεταλλαγμένη αλληλουχία T33V του

Rhodobacter

. Ικρίωμα (έκδοση Scaffold_3.1.2, Proteome Software Inc., Portland, OR) χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση MS /MS βασισμένη πεπτιδίων και πρωτεϊνών ταυτοποιήσεις. ταυτοποιήσεις πεπτίδιο έγιναν δεκτές, εφόσον θα μπορούσε να δημιουργηθεί σε ποσοστό μεγαλύτερο του 90,0% πιθανότητα, όπως ορίζεται από το πεπτίδιο Προφήτη αλγόριθμο [30]. ταυτοποιήσεις πρωτεΐνης έγιναν δεκτές, εφόσον θα μπορούσε να δημιουργηθεί σε ποσοστό μεγαλύτερο του 90,0% πιθανότητα και περιείχε τουλάχιστον ένα αναγνωρισμένο πεπτίδιο. πιθανότητες πρωτεΐνης ανατεθεί από την πρωτεΐνη Προφήτη αλγόριθμο [32]. Πρωτεΐνες που περιείχαν παρόμοια πεπτίδια και δεν θα μπορούσε να διαφοροποιηθεί με βάση την ανάλυση MS /MS και μόνο ομαδοποιήθηκαν για να ικανοποιήσει τις αρχές της φειδούς.

Western και ανοσοκατακρημνίσεως

Οι πρωτεΐνες λύματα που προέρχονται από ιστούς όγκων του παχέος εντέρου και κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου παρασκευάστηκαν με ρυθμιστικό RIPA. Τα προδιαυγασθέν δείγματα πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν [DC χρωματομετρική κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης (συμβατό με το απορρυπαντικό)? Bio-Rad], και τα δείγματα διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE ακολουθούμενη από ανοσοαποτύπωση. Οι κηλίδες οπτικοποιήθηκαν με SuperSignal West Pico χημειοφωταύγειας υπόστρωμα (Pierce). Για ανοσοκατακρήμνιση, τα κύτταρα λύθηκαν με RIPA ρυθμιστικό διάλυμα και πρωτεΐνη ποσοτικοποιήθηκε με κιτ δοκιμασίας πρωτείνης DC (Bio-Rad). 5 μg αντι-ρΤγΓ

421 cortactin αντισώματος προστέθηκε σε 1 mg προϊόντων λύσης κυττάρου HCT-116 στους 4 ° C και επωάστηκε για όλη τη νύχτα. Τα δείγματα στη συνέχεια επωάστηκαν με σφαιρίδια αγαρόζης πρωτεΐνης Α /G (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) για 1 ώρα στους 4 ° C. Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη από τα πλυμένα και το μετουσιωμένο σύμπλοκα.

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε EZ-θαλάμους (Millipore), και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κουρκουμίνη σε συγκέντρωση 50 μΜ για 15 λεπτά και σταθεροποιήθηκαν με 2 % παραφορμαλδεϋδη σε ρυθμιστικό φωσφορικού 0,2 Μ, ρΗ 7,4 (45 λεπτά), διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 σε PBS (10 λεπτά), και επωάστηκαν διαδοχικά με αντι-φωσφο cortactin (Millipore) ή αντι-cortactin αντίσωμα (Santa Cruz) . Η Alexa Fluor 647 κατσίκας αντι-κουνελιού IgG, (Life Technologies) χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύον αντίσωμα. Οι πλάκες τοποθετούνται χρησιμοποιώντας μέσο στερέωσης φθορισμού (Dako? Carpinteria, CA) και εξετάστηκαν με ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο Zeiss εξοπλισμένο με ZEN λογισμικού (Carl Zeiss Μικροσκοπία, GmbH)

δοκιμασία δραστηριότητα

PTPB1B /PTPN1

HCT 116 κύτταρα αναπτύχθηκαν μέχρι τη συρροή και κατεργάζεται με κουρκουμίνη ή DMSO (όχημα) σε μέσα για 30 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και λύθηκαν με RIPA ρυθμιστικό διάλυμα, κατεργασμένο με υπερήχους για 5 δευτερόλεπτα, φυγοκεντρήθηκαν και προσδιορίστηκαν για συγκέντρωση πρωτεΐνης. Ένα κιτ Δοκιμασίας PTPB1B ελήφθη από την Millipore και χρησιμοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Αλληλούχηση PTPN1 περιοχής κωδικοποίησης

Ολικό RNA εξήχθη από HCT116, ΗΤ29 και κύτταρα SW480 χρησιμοποιώντας TRIZOL (Life Technologies ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, η αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας ένα κιτ σύνθεσης cDNA (Quanta), και ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας πρόσθιο εκκινητή, 5′-ATGGAGATGGAAAAGGAGTTCG-3 ‘και αντίστροφος εκκινητής 5′-CTATGTGTTGCTGTTGAACAGGA-3’ (με βάση Gene προσχώρησης NM_002827.2 ) και

Pfu

Taq DNA πολυμεράση (Life Technologies). Τα προϊόντα PCR καθαρίστηκαν σε πήκτωμα, υποκλωνοποιήθηκαν σε ρΟΕΜ-Τ Easy (Promega, CA), και η αλληλουχία από το 5 ‘και 3’ άκρα χρησιμοποιώντας Τ7 και SP6 εναρκτήρες αλληλούχισης.

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Η δοκιμασία μετανάστευσης transwell διεξήχθη όπως αναφέρθηκε νωρίτερα [33] με μικρές τροποποιήσεις. Εν συντομία, μεμβράνη Transwell (ένθετο 24-φρεατίων, μέγεθος πόρων 8 μm, πολυανθρακικό? Corning Inc, ΝΥ) χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η επίδραση της κουρκουμίνης στη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου

in vitro

. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν, και διατηρείται αιωρούνται σε μέσο χωρίς FBS. Στα κάτω φρεάτια των θαλάμων, η μετανάστευση επαγωγής μέσου (με 10% FBS) προστέθηκε. Άνω φρεάτια γεμίστηκαν με μέσο ελεύθερο ορού με κύτταρα (20,000 κύτταρα ανά φρεάτιο), σε ορισμένες περιπτώσεις, επίσης που περιέχει 25 μΜ της κουρκουμίνης. Στη συνέχεια, ο θάλαμος τοποθετήθηκε σε ένα υγροποιημένο CO

2 θερμοκοιτίδα. Μετά από 12 ώρες, οι δοκιμασίες τερματίστηκαν με απομάκρυνση του μέσου από τα ανώτερα φρεάτια και προσεκτική απομάκρυνση των φίλτρων. Τα φίλτρα σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη με σύντομη βύθισης και κυττάρων από πάνω πλευρά αφαιρέθηκαν με πλύση με PBS. Τα φίλτρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες χρώσης (0.2%, β /ο με αιθανόλη 2%, ν /ν, σε 0.5Μ Tris-HCl, ρΗ 7.8) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το χρωματισμένο στρώμα κυττάρων ξεπλύθηκε εξαντλητικά με 0.5 Μ Tris-HCl (ρΗ 7.8) τρεις φορές, τα φίλτρα ξηράνθηκαν στον αέρα, επωάστηκαν με 500 μΙ διαλύματος SDS (0,5% σε 50% αιθανόλη, 50% 0.5 Μ Tris-HCl, ρΗ 7.8 ) για 60 λεπτά στους 37 ° C, και αναγνώστηκε στα 586 nm χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο (Molecular Devices, CA). Για Ad-CTTN μεταδιηγερμένα κύτταρα, 24 ώρες μετά από μόλυνση με Ad-CTTN (10 ΜΟΙ), τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, πλύθηκαν με PBS, και προστίθεται στην άνω πλευρά του θαλάμου Transwell, και δοκιμασίες διεξήχθησαν όπως περιγράφεται παραπάνω.

Η χημική σύνθεση του βιοτινυλιωμένου κουρκουμίνη

οι αντιδράσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας υαλικά ξηρανθείσα με φλόγα κάτω από θετική πίεση αργού. Υγροσκοπικά διαλύτες μεταφέρθηκαν

μέσω

μια σύριγγα ή κάνουλα φούρνο-αποξηραμένα. Όλα τα αντιδραστήρια και οι διαλύτες ήταν εμπορικά διαθέσιμα και χρησιμοποιήθηκαν όπως λήφθηκαν. Τα διαλύματα συμπυκνώθηκαν

σε κενό

χρησιμοποιώντας ένα περιστροφικό εξατμιστήρα. Αναλυτική χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) εκτελέστηκε σε προ-επικαλυμμένες σίλικα τζελ 60 γυάλινες πλάκες F-254. TLC οπτικοποίηση απαιτείται χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο ιωδίου, υπεριώδες φως, και /ή διάλυμα ΡΜΑ (5 g φωσφομολυβδικό οξύ, 100 mL 95% EtOH) για χρώση. Flash χρωματογραφία και βαρύτητα έγιναν χρησιμοποιώντας πυριτική πηκτή 60 (230-400 mesh). Τα σημεία τήξεως είναι μη διορθωμένα. Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού πειράματα (NMR) πραγματοποιήθηκαν σε ένα φασματόμετρο 500 ΜΗζ. Τα φάσματα NMR αναφέρονται σε CD

3OD (3,31 ppm, 49,0 ppm). φασματομετρία μάζας διεξήχθη χρησιμοποιώντας ESI σε ένα όργανο Bruker Daltonics MALDI TOF.

Ν- (13-αμινο-4,7,10-trioxatridecanyl) βιοτιναμίδη (2).

Σε ένα θερμό διάλυμα βιοτίνης (0.24 g, 1.0 mmol) και

N

-hydroxysuccinamide (0.12 g, 1.0 mmol) σε DMF (8 κ.εκ.) προστέθηκε DCC (0,26 g, 1,3 mmol) και το μίγμα της αντίδρασης αναδεύτηκε όλη τη νύχτα σε δωμάτιο θερμοκρασία. Τα στερεά απομακρύνθηκαν με διήθηση, πλύθηκε με DMF (2 mL), και το διήθημα (~ 10 mL) προστίθεται στάγδην σε ένα αναδευόμενο διάλυμα του 4,7,10-τριοξα-1,13-δεκατριανιοδιαμίνη (2.20 g, 10.0 mmol, 2.2 κ.εκ.) σε DMF (20 mL). Μετά από 3 ώρες, ο διαλύτης απομακρύνθηκε υπό ελαττωμένη πίεση. Το προκύπτον έλαιο λειοτριβήθηκε με αιθέρα (50 mL) και το μίγμα αναδεύτηκε για 30 λεπτά. Το στερεό συλλέχθηκε με διήθηση και υποβλήθηκε σε flash χρωματογραφία στήλης επί πυριτικής πηκτής (50 g). Η έκλουση με μεθανόλη /EtOAc (4:01) έδωσε 2 (0.38 g, 0.85 mmol, 85% σε δύο στάδια) ως άχρωμο στερεό, σ.τ. 104-106 ° C, R

f

0.36 ( MeOH /EtOAc /υδατ. NH

4OH 8:02:01). Το

1 και

φάσματα 13C NMR ήταν σε συμφωνία με δημοσιευμένα στοιχεία [34].

5,21-Dioxo-25-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-10,13,16-trioxa-6,20-diazapentacosan-1-oic Οξύ (3).

Σε ένα διάλυμα της 2 (0,38 g, 0,85 mmol) σε μεθανόλη (4 mL) προστέθηκε γλουταρικός ανυδρίτης (0.12 g, 1.02 mmol) και το μίγμα αναδεύεται όλη τη νύκτα. Ο διαλύτης απομακρύνθηκε υπό ελαττωμένη πίεση και το υπόλειμμα υποβλήθηκε σε flash χρωματογραφία στήλης επί πυριτικής πηκτής (50 g). Η έκλουση με CH

2Cl

2 (200 mL) ακολουθούμενο από CH

2Cl

2 /MeOH (5:01) έδωσε 3 (0,40 g, 0,71 mmol, 84%) ως ένα λευκό στερεό, mp 124-126 ° C, R

f

0,42 (CH

2Cl

2 /MeOH 1:01).

1Η NMR (500 MHz, CD

3OD) δ 1.44 (2, m), 1,56-1,70 (4 Η, m), 1.70-1.78 (6 Η, m), 1.88 (2, πενταπλή,

J

= 7.5 Hz), 2.18 – 2.25 (4, m), 2.32 (2, m), 2.70 (2, m), 2.93 (2 Η, dd,

J

= 8 Hz, 5 Hz), 3.19 – 3.21 (2, m), 3.25 (4, t,

J

= 7 Hz), 3,52 (4, m), 3,59 (5, m), 3,64 (5, m) , 4.30 (1, m), 4,49 (1, m)?

13C NMR (125 MHz, CD

3OD) δ 22.3, 26.8, 29.5, 29.7, 30.4, 34.2, 36.1, 36.8, 37.8, 41.0, 56.9, 61.26, 63.3, 69.9 (2), 71,2, 71,5 , 166,1, 175,2, 175,9, 176,8? HRMS (ΜΑίϋΙ TOF) υπολογισμένο για C

25Η

45Ν

4O

8S 561.2952, παρατηρήθηκε 561.2930.

4-((1E,6E)-7-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-3,5-dioxohepata-1,6-dien-1-yl)-2-methoxyphenyl-5,21-dioxo-25-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-10,13,16-trioxa-6,20-diazapentacosan-1-oate (4).

Σε ένα διάλυμα της 3 (100 mg, 0.18 mmol) σε DMF (2 mL) προστέθηκε

N

-hydroxysuccinamide (21 mg, 0.18 mmol) ακολουθούμενο από DCC ( 48 mg, 0.23 mmol) και το μίγμα της αντίδρασης αναδεύεται όλη τη νύκτα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα στερεά απομακρύνθηκαν με διήθηση, πλύθηκε με DMF (2 mL), και το διήθημα (~ 4 mL) προστίθεται στάγδην σε ένα αναδευόμενο διάλυμα της κουρκουμίνης (330 mg, 0.89 mmol) και τριαιθυλαμίνη (45 mg, 0.44 mmol, 62 μί) εντός DMF (10 mL). Το μίγμα της αντίδρασης αναδεύτηκε όλη τη νύκτα σε θερμοκρασία δωματίου και τα πτητικά απομακρύνθηκαν υπό ελαττωμένη πίεση. Το υπόλειμμα υποβλήθηκε σε flash χρωματογραφία στήλης επί πυριτικής πηκτής (75 g). Η έκλουση με CH

2Cl

2 (200 mL) και CH

2Cl

2 /MeOH (50:1, 200 mL) έδωσε κουρκουμίνη. Περαιτέρω έκλουση με CH

2Cl

2 /MeOH (20:01), ακολουθούμενη από απομάκρυνση των διαλυτών, έδωσε 4 ως ένα σκούρο κίτρινο κόμμι το οποίο διαλύθηκε σε 20% ακετονιτρίλιο σε νερό και το διάλυμα λυοφιλοποιείται. Βιοτινυλιωμένο παράγωγο κουρκουμίνη 4 (78 mg, 0.085 mmol, 48% απόδοση σε δύο στάδια) λήφθηκε ως ένα χνουδωτό σκούρο κίτρινο στερεό, R

f

0.68 (CH

2Cl

2 /MeOH 5:01). ESI-MS: 911,2 (Μ + Η

+). Το φάσμα

1 NMR ήταν σε συμφωνία με δημοσιευμένα δεδομένα [35].

Η στατιστική ανάλυση

t-test κατά ζεύγη του Student χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση όλη.

Αποτελέσματα

ρΤγΓ

421cortactin έκφραση είναι αυξημένη σε πρωτογενείς ιστούς καρκίνου του κόλου

η υπερέκφραση του cortactin έχει βρεθεί σε διηθητικό καρκίνο, που περιλαμβάνει το γλοιοβλάστωμα, το μελάνωμα, ο καρκίνος του μαστού, και κεφαλής και λαιμού πλακωδών καρκινωμάτων, ως αποτέλεσμα της ενίσχυσης του γονιδίου EMS1 [36]. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε cortactin έκφρασης σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Αναλύσαμε πρώτα έκφραση cortactin mRNA σε 81 κατεψυγμένα δείγματα ιστού κόλον, η οποία περιελάμβανε 37 φυσιολογικούς ιστούς, 5 καλοήθη, και 39 κακοήθεις όγκους, με ποσοτική RT-PCR. όγκων του παχέος εντέρου και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών έδειξε καμία διαφορά στην έκφραση του mRNA cortactin (Σχήμα 1Α). Δεν παρατηρήσαμε καμία σημαντική διαφορά μεταξύ της έκφρασης CTTN mRNA σε φυσιολογικούς ιστούς και δείγματα όγκων κόλου (Σχήμα 1Β). Στη συνέχεια, εξετάσαμε 19 ζεύγη δειγμάτων όγκων του παχέος εντέρου για cortactin έκφραση της πρωτεΐνης με κηλίδα western. 14/19 (73%) έδειξαν αυξημένα επίπεδα ρΤγΓ

421 cortactin και συνολική cortactin (Εικ. 1 C, αριστερό πλαίσιο), 2/19 δείγματα εμφάνισαν μειωμένη έκφραση των δύο μορφών (ρΤγΓ

421 και σύνολο) των cortactin , και 3/19 εμφάνισαν καμία αλλαγή (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ανοσοϊστοχημική ανάλυση των συστοιχιών ιστού με 6 τομές φυσιολογικού και 18 τομές όγκων του παχέος εντέρου έδειξε έντονη χρώση μεμβράνης ρΤγΓ

421 cortactin και συνολική cortactin σε 13/18 δείγματα όγκων αναλύθηκαν σε σύγκριση με την κανονική τομές ιστού, όπως επεξηγείται στο Σχ. 1D. Ερευνήσαμε επίσης cortactin φωσφορυλίωση σε Tyr

482 και Tyr

470 σε δείγματα όγκων του παχέος εντέρου. Βρήκαμε ότι στο 50% των κακοηθών ιστών που αναλύθηκαν, υπήρξε αυξημένη έκφραση του ρΤγΓ

482, σε σύγκριση με μάρτυρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ωστόσο, η φωσφορυλίωση στη θέση αυτή δεν επηρεάστηκε από κουρκουμίνη σε κύτταρα HCT116 (δεν φαίνεται), και αφού Oser κ.ά. [37]. έδειξαν ότι ρΤγΓ

482 δεν συμβάλλει στη ρύθμιση της ο αριθμός των ελεύθερων αγκαθωτό καταλήγει σε invadopodia, δεν είχαμε συνεχίσει περαιτέρω αυτό το site. Δεν μπορέσαμε να αναλύσουμε αξιόπιστα την έκφραση του ρΤγΓ

470 σε δείγματα όγκων με οποιεσδήποτε εμπορικώς διαθέσιμα αντισώματα.

(Α) Ολικό RNA εξήχθη από κατεψυγμένα δείγματα φυσιολογικού και ιστών του όγκου και έκφραση cortactin mRNA προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ποσοτική RT-PCR. Τα οικόπεδα κουτί απεικονίζουν σχετικές ποσότητες των cortactin κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH σε φυσιολογικών και καρκινικών ιστών (n = 37 για φυσιολογικά δείγματα, η = 44 για δείγματα όγκου). (Β) ανάλυση πηκτώματος του DNA των προϊόντων PCR που λαμβάνονται από την ανάλυση qPCR (εκπρόσωπος του 37 φυσιολογικούς ιστούς, 5 καλοήθεις όγκοι, και 39 κακοήθων όγκων). (Γ) Τα προϊόντα λύσης ιστού ζεύγη (Ν-κανονικό, Μ-κακοήθη) των δειγμάτων κόλου που παρασκευάζονται από τα ίδια δείγματα όγκου όπως στο (Α) αναλύθηκαν η έκφραση του ρΤγΓ

421-cortactin (ρΤγΓ

421 -CTTN) και το συνολικό cortactin με κηλίδωση Western. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα φαίνονται από τρία ζεύγη. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Δ) Εκπρόσωπος ρΤγΓ

421-cortactin και συνολική cortactin ανοσοχρώση των δειγμάτων όγκου του παχέος εντέρου. συστοιχία ιστού που περιέχει μια σειρά από καρκινώματα του παχέος εντέρου βάφτηκαν για ρΤγΓ

421-CTTN και συνολική cortactin. Η χρώση ήταν κυρίως κυτταροπλασματική για το σύνολο cortactin, ενώ ρΤγΓ

421-CTTN δείχνει αυξημένη ένταση χρώσης στη μεμβράνη του πλάσματος.

Η

Διαφορές μεταξύ της έκφρασης αναλλοίωτη mRNA και αυξημένα επίπεδα ολικής και φωσφορυλιωμένης cortactin αποκλεισθεί η δυνατότητα γονιδιακής ενίσχυσης και πρότεινε πιθανές μετα-μεταφραστική τροποποίηση (ες) και οι αλλαγές στη σταθερότητα της πρωτεΐνης σε όγκους παχέος εντέρου.

αλλαγές στην κυτταρική επιφάνεια βιοτινυλιωμένες πρωτεΐνες μετά τη θεραπεία κουρκουμίνη σε κύτταρα Τ84

Τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου Τ84 έχουν χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα για να μελετηθεί η βιογένεση των επιθηλιακών κυττάρων πολικότητα [38] και σχηματίζουν καλά πολωμένο και σφιχτό μονοστοιβάδες όταν καλλιεργούνται σε ένα ημι-διαπερατό υποστήριγμα φίλτρου. Ερευνήσαμε πρώτα τη διανομή και τις επιδράσεις της κουρκουμίνης στις μεγάλες συνδεόμενες με μεμβράνη πρωτεΐνες σε μονοστιβάδες Τ84. Για να αναπαράγουν την έκθεση σε από του στόματος χορηγούμενη (ή διαιτητικές) κουρκουμίνη, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με την ένωση ή DMSO (φορέας) στην ακραία πλευρά. Τα ακραία μεμβράνη και μεμβράνη που σχετίζονται με πρωτεΐνες στη συνέχεια βιοτινυλιώθηκαν, τραβιέται κάτω με στρεπταβιδίνη συζευγμένη με αγαρόζη, και αναλύθηκαν με LC-MS /MS. Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων συνοψίζονται στο Σχ. 2. 56 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν μέσω LC-MS /MS. 13/56 έδειξε μειωμένη επιφάνεια ή επιφανειακή έκφραση σχετιζόμενη που κυμαίνεται από 20-80% σε κύτταρα κατεργασμένα με κουρκουμίνη σε σύγκριση με μάρτυρα DMSO (ρ & lt? 0.0001- ρ & lt? 0,05) (Σχ 2Α). Μόνο μία πρωτεΐνη [ισομορφή 1 του πλούσιου λευκίνης επανάληψης (σε FLII) πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης 2, LRRFIP2) έδειξε αυξημένη έκφραση (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αν και η λειτουργία του LRRFIP2 δεν είναι απολύτως σαφής, μία αναφορά έχει δείξει ότι παίζει έναν σημαντικό ρόλο ως ενεργοποιητής της κανονικής οδού σηματοδότησης Wnt, σε συνδυασμό με πρωτεΐνη τμήμα πολικότητα αναμαλλιασμένος ομόλογο DVL-3, ανάντη της β-κατενίνης (CTNNB1) , με αποτέλεσμα την σταθεροποίηση του τελευταίου [39]. Για τους σκοπούς της μελέτης αυτής, εστιάσαμε στα μειωμένα επίπεδα cortactin σε απόκριση σε θεραπεία κουρκουμίνη, επειδή είναι συχνά υπερεκφράζεται σε καρκίνους και έχει αναφερθεί ότι ενισχύει τη μετανάστευση καρκινικών κυττάρων και εισβολή [40]. Σύκο. 2Β απεικονίζει ρύθμιση προς τα κάτω του cortactin στην πρωτεΐνη κλάσμα μεμβράνης σχετιζόμενη από κύτταρα κουρκουμίνη-θεραπεία, μια παρατήρηση επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western σε κύτταρα επεξεργασμένα με 50 μΜ σε κορυφαία πλευρά για 1-4 ώρες (Σχ. 2C). υποδοχέα τρανσφερίνης (CD71), που χρησιμοποιείται εδώ ως μάρτυρας, δεν παρουσίασε καμία μεταβολή, παρόμοια με τα προηγούμενα έκθεσή μας [29].

(Α) Πίνακας με μεμβράνη πρωτεΐνες που συνδέονται 13ης πλάσμα προσδιορίζονται από QTOF-MS /MS, όπως μειώθηκε σημαντικά σε κυτταρικές μονοστιβάδες Τ84 που έλαβαν θεραπεία με κουρκουμίνη. Τα στοιχεία δείχνουν μέσος αριθμός μοναδικά πεπτίδια που ταυτοποιήθηκαν από τρία διαφορετικά πειράματα ± SD. (Β) Ποσοτική ανάλυση του cortactin έκφραση στα κύτταρα Τ84 με M /S. Οι τιμές φάσμα ελήφθησαν από τρία διαφορετικά πειράματα. Τα δεδομένα ποσοτικού προσδιορισμού για cortactin πρωτεΐνη που προέρχεται από το M /S χρησιμοποιώντας λογισμικό ικριωμάτων proteome (έκδοση Scaffold_3.1.2). Τα δεδομένα είναι μέσοι όροι ± SE, *

ρ

& lt? 0,05 σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα, δοκιμασία t του Student. (Γ) Επιβεβαίωση της έκφρασης πρωτεΐνης CTTN με κηλίδωση Western με κλάσμα βιοτινυλιωμένη πρωτεΐνη επιφανείας κυττάρου που παρασκευάζονται από κύτταρα Τ84 σε επεξεργασία με DMSO (CTRL) ή 50 μΜ κουρκουμίνη για 1-4 ώρες. CD71 (υποδοχέας τρανσφερίνης) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Όπως φαίνεται στο Σχ.