Αφηρημένο

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι CXCR2 σηματοδότησης είναι ζωτικής σημασίας για την εξέλιξη του καρκίνου, και ανταγωνιστής SB225002 της προκαλεί απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του Wilms. Εδώ, ερευνήσαμε την επίδραση του SB225002 στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και η επαγωγή απόπτωσης

in vitro

, χρησιμοποιώντας CDDP ευαίσθητη και ανθεκτικών OVCA κυτταρικές γραμμές με διαφορετικό καθεστώς ρ53 (άγριου τύπου, μεταλλάγματος ή null). μόλυνση αδενοϊού άγριου τύπου ρ53 ή επιμόλυνση ρ53 siRNA χρησιμοποιήθηκε για να υπερεκφράζουν ή knock-down ρ53. του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής ή χρώση Hoechst και η παρατήρηση της πυρηνικής μορφολογίας. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι SB225002 επαγόμενη απόπτωση τόσο σε άγριου τύπου και τα κύτταρα p53-ανεπαρκή καρκίνο των ωοθηκών (OVCA) μέσω εναλλακτικών μηχανισμών. SB225002 προωθείται μιτωτική καταστροφή, όπως αποδεικνύεται από τη συσσώρευση της μιτωτικής κυττάρων με ανωμαλίες της ατράκτου, χρωμόσωμα mis-διαχωρισμό, διαίρεση πολυπολικό κυττάρων, πολλαπλών πυρήνων, ανευπλοειδίας /πολυπλοειδίας και την επακόλουθη εκτεταμένη απόπτωση. SB225002 επαγόμενη μιτωτική καταστροφή φαίνεται να διαμεσολαβείται από τα κάτω ρύθμιση σημείου ελέγχου Chk1 κινάσης και ενεργοποίηση Cdk1-κυκλίνη Β. Σε κύτταρα που εκφράζουν άγριου τύπου ρ53 (Ον2008 και C13 *), SB225002 αυξημένη συνολική και τα επίπεδα ρ53 φωσφο-Ser, και ρ53 knock-down μειώθηκε SB225002 επαγόμενη απόπτωση, χωρίς να επηρεάζει την πρόωρη μίτωση. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι SB225002 επάγει ρ53-εξαρτώμενη απόπτωση, και προκαλεί μιτωτική καταστροφή σε ρ53-ανεξάρτητο τρόπο σε κύτταρα άγριου τύπου ρ53. Ανασύσταση με άγριου τύπου Ρ53 σε Ρ53-null SKOV3 κυττάρων εξασθενημένος SB225002 που προκαλείται από μιτωτική καταστροφή, γεγονός που υποδηλώνει p53 εμπόδισε μιτωτική καταστροφή που προκαλείται από SB225002 σε OVCA κύτταρα p53-ανεπαρκή. Τέλος, η επίδραση του SB225002 δεν θα μπορούσε να προληφθεί με προκατεργασία με συνδέτη CXCR2 ή εξουδετερωτικού αντισώματος της. Οι παρούσες μελέτες αποδεικνύουν για πρώτη φορά ότι SB225002 έχει διπλή δράσεις OVCA κύτταρα, επάγοντας κλασικό απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης ρ53 και προκαλώντας μιτωτική καταστροφή τόσο άγριου τύπου ρ53 και κύτταρα με ανεπαρκές από την αναστολή Chk1 και ενεργοποίηση ΟϋΚ. Τα ευρήματα αυτά εγείρουν την πιθανότητα του SB225002 ως νέο υποψήφιο μόριο για θεραπεία OVCA ανεξάρτητα από την κατάσταση p53

Παράθεση:. Du Μ, Qiu Q, Gruslin Α, Gordon J, Ο Μ Ο Chan CC, et al. (2013) SB225002 Προωθεί μιτωτική καταστροφή σε χημειοθεραπείες-Ευαίσθητο και -Ανθεκτικό καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα Ανεξάρτητα από p53 Κατάσταση

In Vitro

. PLoS ONE 8 (1): e54572. doi: 10.1371 /journal.pone.0054572

Επεξεργαστής: Ο Carl G. Μάκη, του Πανεπιστημίου Rush Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Οκτωβρίου 2012? Αποδεκτές: 12, Δεκ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 24η του Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Du et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μεγάλες διεθνείς Έργο Κοινό Κέντρο Ερευνών του Εθνικού Ιδρύματος Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30910103909 για DJ Li), Εθνικό και Σαγκάη κορυφαία ακαδημαϊκά Πειθαρχία Έργου (211XK22 να DJL), Πρόγραμμα για τη σημαντική ιατρική Ακαδημαϊκό ηγέτης της Σαγκάης (σε DJL), και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81070537 έως MRD), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (31171437 έως MRD), και στη Σαγκάη pujiang ταλέντο Πρόγραμμα (10PJ1401600 να MRD), και επιχορηγήσεις από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (MOP-15691 για να BKT) και το World Class Πανεπιστήμιο προγράμματος (WCU) μέσω του Υπουργείου Παιδείας, Επιστημών και Τεχνολογίας της Κορέας και χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών της Κορέας (R31-10056 να BKT). . Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Παρά το γεγονός ότι δύο από τους συγγραφείς (Miao Αυτός και ο Chi Chung Chan) είναι υπάλληλοι του Η εταιρεία WuXi AppTech Co., Ltd., αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Η εταιρεία δεν έχει δηλώσεις σχετικά με την απασχόληση, παροχή συμβουλών, διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα στην ανάπτυξη ή διατίθενται στην αγορά προϊόντα που σχετίζονται με αυτό το έργο /χειρόγραφο. Άλλοι συγγραφείς αυτού του χειρογράφου (Meirong Du, Qing Qiu, Andree Gruslin, Τζον Γκόρντον, Dajin Λι και ο Βενιαμίν Κ Tsang) δεν έχουν κανένα οικονομικό ή άλλο συμφέρον με την εταιρεία και έχουν επιβεβαιώσει τη δήλωση τους, που δεν έχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα, όπως ορίζεται από PLoS ΕΝΑ.

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών (OVCA) είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια που έχει απογοητευτεί τόσο τους κλινικούς ιατρούς και ερευνητές για πολλές δεκαετίες. Είναι η πέμπτη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται θανάτου μεταξύ των γυναικών, με κατ ‘εκτίμηση 21.990 νέα κρούσματα και 15.460 θάνατοι συμβαίνουν στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2011 (https://seer.cancer.gov/statfacts/html/ovary.html). Αν και η χημειοθεραπεία και η χειρουργική επέμβαση κυτταρομειωτικής είναι σήμερα πρότυπο τρόπους για τη θεραπεία OVCA, χημειο-αντίσταση παραμένει μια σημαντική αιτία των χημειοθεραπευτικών αποτυχίας. Διάφοροι μηχανισμοί έχουν ενοχοποιηθεί για χημειοαντίσταση, συμπεριλαμβανομένων των αλλαγμένη μεταφοράς φαρμάκου, βελτιωμένη επιδιόρθωση του DNA και αυξημένη ανοχή σε βλάβη του DNA [1], [2], [3]. Επιπλέον, κύτταρα θηλαστικών εμφανίζουν πολύπλοκες κυτταρικές αποκρίσεις σε γενοτοξικό στρες, συμπεριλαμβανομένων σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, την επιδιόρθωση του DNA και απόπτωση, και την ενεργοποίηση του γονιδίου είναι ένα κρίσιμο πρώτο βήμα κατά τη διάρκεια της κυτταρικής απόκρισης σε βλάβη του DNA. Αν και επικουρική χημειοθεραπεία με πακλιταξέλη και σισπλατίνη επιτυγχάνει κλινική ανταπόκριση σε ένα υψηλό ποσοστό περιπτώσεων, η συστημική τοξικότητα περιορίζει σοβαρά ευκαιρία θεραπεία [4]. Έτσι, πιο αποτελεσματικές και ασφαλείς θεραπευτικές στρατηγικές απαιτούνται επειγόντως για την καταπολέμηση αυτής της ασθένειας.

Η απόπτωση χαρακτηρίζεται μορφολογικά από κυτταροπλασματική συρρίκνωση, συμπύκνωση της χρωματίνης και πυρηνική κατάτμηση με chromatinolysis [5], και βιοχημικά από την ενεργοποίηση της κασπάσης και διαπερατότητας του εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη [6], [7], [8]. Η μιτωτική καταστροφή είναι μια ειδική περίπτωση της απόπτωσης, και συμβαίνει κατά τη διάρκεια της μίτωσης με ένα συνδυασμό των σημείων ελέγχου με ανεπάρκεια του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικής βλάβης [9]. βλάβη του DNA ενεργοποιεί τα σημεία ελέγχου για να καθυστερήσει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. P53 ρυθμίζει G1 /S μετάβαση (G1-σημείου ελέγχου), ενώ CHK1 εμποδίζει την είσοδο των κυττάρων του DNA υποστεί βλάβη σε Μ-φάσης (σημείο G2 έλεγχος). Στην περίπτωση του χημειοαντίσταση, DNA βλάβη που προκαλείται από τους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες αποτυγχάνει να συλλάβουν τα καρκινικά κύτταρα στην G1 φάση και να προωθήσει την απόπτωση κυρίως λόγω του ανεπαρκούς σηματοδότησης ρ53. Ωστόσο, βλάβες στο DNA μπορεί να ενεργοποιήσει την οδό CHK1, επάγουν S- και G2-σημεία ελέγχου σύλληψης [10], [11] και να διευκολυνθεί η επιδιόρθωση του DNA πριν από την έναρξη μίτωση (Μ φάση). Συνεπώς, είναι κατανοητό ότι παράγοντες ικανοί να προκαλέσουν τα συμβατικά απόπτωσης (από τη βλάβη του DNA και την ενεργοποίηση Ρ53), και την προώθηση της μιτωτικής καταστροφής (μέσω αδρανοποίησης CHK1 και κατάργηση του G /M σύλληψη) μπορεί να προσφέρει δυνητικά νέα θεραπευτικά πλεονεκτήματα.

Οι χημειοκίνες , μία υπερ-οικογένεια μικρών κυτοκίνη όπως πρωτεΐνες, είναι γνωστά για την θεμελιώδη ρόλο τους ως ρυθμιστές στην κυτταρική μετανάστευση, μεσοκυττάρια επικοινωνιών και την εξέλιξη του όγκου, προσφέροντας ένα κατάλληλο μικροπεριβάλλον του όγκου [12], [13], [14]. CXCR2, ένα λειτουργικό υποδοχέα για ELR

+ χημειοκινών, εκφράζεται κυρίως σε ενδοθηλιακά κύτταρα και είναι ένας ισχυρός υποκινητής αγγειογένεσης σε στερεών καρκίνων. Τα στοιχεία δείχνουν ότι η κυτταρική εξαλλαγή από ογκογόνους ras επάγει υψηλή έκφραση όλων των συνδετήρων CXCR2, και συμβάλλει στην ανάπτυξη πολλαπλών όγκων. Σε OVCA, ELR

+ χημειοκίνες, όπως IL-8, GRO-1 και ΕΝΑ-78, είναι σημαντικά τα επάνω ρυθμισμένη [15], [16], [17], [18]. Το υψηλό επίπεδο GRO-1 επάγει την γήρανση των ινοβλαστών και προωθεί κακοήθη μετασχηματισμό των επιθηλιακών κυττάρων των ωοθηκών και ανάπτυξη OVCA κυττάρου [19] SB225002 [Ν- (2-υδροξυ-4-νιτροφαινυλ) -Ν ‘(2-βρωμοφαινυλ) ουρία ] πιστεύεται ότι είναι ένας ισχυρός επιλεκτικός μη-πεπτίδιο ανταγωνιστής CXCR2 αναστέλλοντας την σύνδεση τόσο IL-8 και ΟΡΟ-1 ως CXCR2 [20]. Παρόλο SB225002 αναπτύχθηκε αρχικά για τη θεραπεία φλεγμονωδών ασθενειών [20], [21], πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι μολύνσεων από ρετροϊούς, όγκο Wilms και της νόσου του Alzheimer μπορεί να είναι πιθανές θεραπευτικές ενδείξεις για ανταγωνιστής CXCR2 [22] [23], [24, ]. SB225002 έχει αναφερθεί ότι επάγουν απόπτωση σε κύτταρα όγκου του Wilms, αν και ο υποκείμενος μηχανισμός δεν είναι σαφής [23].

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την επίδραση της SB225002 στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και η επαγωγή απόπτωσης em

in vitro

, χρησιμοποιώντας CDDP-ευαίσθητο και ανθεκτικών OVCA κυτταρικές σειρές με διαφορετικό καθεστώς p53 (άγριου τύπου, μεταλλαγμένη ή null). Βρήκαμε ότι SB225002, ανεξάρτητα από CXCR2, που επάγεται κλασικό απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης Ρ53 και προκάλεσε μιτωτική καταστροφή τόσο άγριου τύπου ρ53 και ελλειμματικά κύτταρα μέσω σημείου ελέγχου κινάση 1 (Chk1) αναστολή και ενεργοποίηση ΟϋΚ. Εκτός από την ανασταλτική δράση της αγγειογένεσης των όγκων μέσω κυτταρική σηματοδότηση CXCR2 μεσολάβηση (Matsuo

et al

., 2009), η μελέτη μας δείχνει ότι SB225002 θα μπορούσε να είναι μια πιθανή θεραπευτικοί παράγοντες για χημειοθεραπεία OVCA μέσω της δράσης της σε κυτταρικό κύκλο εξέλιξης και την απόπτωση ανεξάρτητη από την μεσολαβούμενη από υποδοχέα.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Cis-diaminedichloroplatinum (CDDP) και Hoechst 33258 αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). SB265610 αγοράστηκε από Tocris Bioscience (USA). SB225002 αγοράστηκε από την Calbiochem (San Diego, CA, USA), μικρά ανασταλτική RNA (siRNA) για ρ53 ήταν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, CA). Ελέγχου siRNA ήταν από Dharmacon inc. (Lafayette, CO, USA). αντιδραστήριο επιμόλυνσης Ribojuice siRNA ήταν από την Novagen Inc. (San Diego, CA, USA). Πρωτογενή αντισώματα για στύπωμα Western ήταν πολυκλωνικό κουνελιού αντι-PARP, αντι-φωσφο-Chk1 (S345) και φωσφο-ρ53 (S15? Cell Signaling Technology), μονοκλωνικό ποντικού αντι-Chk1, αντι-κασπάση 3, αντι-φωσφο-ιστόνης Η3 ( Σερίνη 10), και αντι-ρ21

WAF1 /Cip1 (Cell Signaling Technology), αντι-ρ53 (DO-1, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-IL-8 και GRO-1 (R & amp? σύστημα D, Minneapolis, ΜΝ) και αντι-GAPDH (ab8245, Abcam, Cambridge, UK). Τα συζευγμένα με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα χρένο ήταν από την Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Πρωτογενή αντισώματα για ανοσοκυτταροχημεία ήταν πολυκλωνικό κουνελιού Alexa Fluor® 488-συζευγμένο αντι-φωσφο-ιστόνης Η3 (Ser 10? Cell Signaling Technology,) και ΡΙΤΟ-συζευγμένο αντι-β-τουμπουλίνης (Κλώνος TUB 2.1, Sigma). Το μονοκλωνικό αντι-ανθρώπινο CXCR2 ΡΕ, ανθρώπινη ανασυνδυασμένη IL8 και GRO1 ήταν από R &? D System. Προ-χρωματισμένο πρότυπα ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου ήταν από BioRad. Αδενοϊικοί ρ53 άγριου τύπου και LacZ cDNA παρασχέθηκαν από τον Dr. Ruth Slack (Ερευνητικό Ινστιτούτο Νευροεπιστημών του Πανεπιστημίου της Οτάβα). ELR-CXC ανταγωνιστής των χημειοκινών CXCL8 (3-72) K11R /G31P (G31P) ήταν από τον Δρ John R. Gordon (Πανεπιστήμιο του Saskatchewan, Saskatoon, Καναδάς).

Cell Culture

σισπλατίνη– ευαίσθητος OVCA κύτταρα (Ον2008 και τα A2780S) και των αντίστοιχων ομολόγων τους ανθεκτικά (C13 * και A2780cp, αντίστοιχα), και ρ53 ηυΙΙ κύτταρα SKOV3 καλλιεργήθηκαν όπως έχει ήδη αναφερθεί από το εργαστήριο μας [25] – [31]. Cells, επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα /cm

2, μολύνθηκαν με αδενοϊικούς φορείς έκφρασης ή επιμολυσμένα με siRNA ή κατεργάζεται με προσφάτως παρασκευασθέν SB225002 υπό συνθήκες χωρίς ορό. Ρυθμισμένο μέσο (10 ml) συμπυκνώθηκαν με Amicon Ultra-4 φυγοκεντρικού φίλτρου (Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ) για τελικό όγκο 200 μΐ για μετέπειτα ανάλυση.

RNA Extraction, cDNA Σύνθεση και σε πραγματικό χρόνο ΚΤ- PCR

Ολικό RNA εκχυλίστηκε (RNeasy Mini Kit. Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συμπληρωματικά DNAs δημιουργήθηκαν με τη χρήση ολιγο (dT) αρχικά τεμάχια με MMuLV ανάστροφης μεταγραφάσης (kit Retroscript? Ambion). Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε με τους ακόλουθους εκκινητές: GRO-1: F: TGCAGCTGTGTCTCTCTTTCCTCT και R: AAAGCTTGCCTCAATCCTGCATCC? IL-8: F: AGCCTTCCTGATTTCTGCAGCTCT και R: AATTTCTGTGTTGGCGCAGTGTGG? CXCR2: F: AGAAGTTTCGCCATGGACTCCTCA και R: AGTGGAAGTGTGCCCTGAAGAAGA? F: GGGGAGCCAAAAGGGTCATCATCT και R: GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT για GAPDH. Η αντίδραση ενίσχυσης εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ QuantiTect SYBR Green PCR. Οι συνθήκες θερμικής κυκλοποίησης περιλαμβάνονται ένα αρχικό στάδιο αποδιάταξης (95 °, 15 λεπτά) και ακολουθείται από PCR (95 ° C για 15 λεπτά, 50 κύκλοι στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, 56 ° για 20 δευτερόλεπτα, και 72 ° για 30 sec). Τα προϊόντα PCR στη συνέχεια τήκεται στους 60 ° για 30 δευτερόλεπτα και mRNA αφθονία του IL-8, GRO-1 και CXCR2 εκφράστηκαν ως αναλογία προς τις τιμές GAPDH. Κάθε τιμή συγκρίθηκε με εκείνη των Ον2008.

αδενοϊό Λοίμωξη, παρεμβολή RNA και SB225002 Θεραπεία

κύτταρα SKOV3 μολύνθηκαν με αδενοϊικό ρ53 άγριου τύπου ή ελέγχου LacZ (ΜΟΙ = 10) [25] . Εικοσιτέσσερις ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με SB225002 (750 ηΜ, 24 ώρες ή 48 ώρες). Ον2008 και C13 * κύτταρα επιμολύνθηκαν με p53 siRNA (100 nmol /L? 36 h). Ή αλληλουχία σκαρφάλωμα (έλεγχος) [26] και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SB225002

Ανάλυση Western

κηλίδωση Western διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [25], [26]. Οι μεμβράνες επωάστηκαν για μια νύχτα στους 4 ° C σε πρωτογενή αντισώματα (αντι-p53 1: 10.000? Αντι-φωσφο-ρ53 (S15) 1:1,000? Αντι-Chk1 1: 1000? Αντι-φωσφο Chk1 (S345) 1:1,000? αντι-φωσφο-Chk1 (S317) 1:1,000? αντι-κασπάσης 3 1: 1000? αντι-PARP, 1:1,000? αντι-φωσφο-ιστόνης 3 (S10? 1:1,000), αντι-GAPDH, 1:20,000) , που ακολουθείται από επώαση (RT, 1 ώρα) με ραφανιδική υπεροξειδάση συζευγμένο αντι-κουνελιού ή δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού (1:5,000). Υπεροξειδάσης δραστηριότητα οπτικοποιήθηκε με ECL κιτ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Αποτελέσματα σαρώθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Scion λογισμικό Image (Scion, Inc., Frederick, MD).

ιωδιούχου προπιδίου χρώσης και κυτταρομετρία ροής

Πλωτή και προσκολλημένη κυττάρων συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη διανυκτέρευση. Είχαν επεξεργασμένο με RNase Α και επωάστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (50 μg /ml? ΡΙ) και αναλύθηκαν σε Beckman Coulter FC500. Για την ταυτοποίηση των μιτωτικών κυττάρων, τα κύτταρα επωάστηκαν (2 ώρες, RT) με αντι-φωσφο-ιστόνης Η3 (Alexa 488, 1:10, Cell Signaling) και πλύθηκε με PBS πριν τη χρώση ΡΙ. Για την ανίχνευση της έκφρασης της έκφρασης CXCR2 επί OVCAs, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν σε PBS, στη συνέχεια χρωματίζονται αμέσως με μία πρότυπη δοκιμασία ανοσοφθορισμού με φυκοερυθρίνη (ΡΕ) αντι-ανθρώπινου CXCR2 mAb ή ΡΕ-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο αντίσωμα ισοτύπου (BD Pharmingen). Το ποσοστό του CXCR2-θετικών κυττάρων προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής.

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά, μετά αποκλείστηκαν με 2% BSA που ακολουθείται από επώαση (όλη τη νύκτα, 4 °) με FITC συζευγμένο ποντικού αντι-βήτα-τουμπουλίνης (1:50) ή ΡΙΤΟ-συζευγμένο IgG ισοτύπου (αρνητικός έλεγχος). Μετά την πλύση, η Hoechst πυρηνική χρώση (33258) προστέθηκε στα κύτταρα, τα οποία ήταν τοποθετημένα με Vectashied (Vector, Burlingame, CA, USA). εικόνες florescence συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Leitz DMRX και αναλύονται με το Adobe Photoshop 7.01 (Adobe, Οτάβα, Καναδάς).

χρωμοσωμάτων Διαδώστε Δοκιμασία

spreads των χρωμοσωμάτων παρασκευάστηκαν με χρήση τυπικού πρωτοκόλλου [32] ? DNA χρωματίστηκε με 0,1% πράσινο SYTOX, και οι εικόνες ελήφθησαν με ένα μικροσκόπιο Leitz DMRX.

Αξιολόγηση της απόπτωσης

Attached και επιπλέοντα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης (4%) που περιέχει Hoechst 33258 χρωστική (3,75 ng /ml, 24 ώρες). Το ποσοστό της απόπτωσης προσδιορίσθηκε με πυρηνική μορφολογία. Τουλάχιστον 400 κύτταρα μετρήθηκαν σε κάθε ομάδα με τον πάγκο «τύφλωσε» για να δοκιμάσετε την ταυτότητα για να αποφευχθεί η πειραματική προκατάληψη [25], [26].

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με αμφίδρομη ΑΝΟνΑ και Bonferroni posttest χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί στατιστική διαφορά μεταξύ των πειραματικών ομάδων (λογισμικό PRISM έκδοση 5.0, GraphPad, San Diego, CA). Η στατιστική σημαντικότητα συναχθεί σε P & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Έκφραση των CXCR2 και συνδετήρων IL-8 και ΟΡΟ-1 σε CDDP-ευαίσθητο και ανθεκτικών OVCA κύτταρα

Εξετάσαμε πρώτα mRNA και η πρωτεΐνη περιεχόμενο του CXCR2 και συνδετήρων του IL-8 και ΟΡΟ-1 σε δύο ζεύγη CDDP ευαίσθητου και ανθεκτικών OVCA κυτταρικές σειρές. Η κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι CXCR2 ήταν θετική σε 9,08%, 5,87%, 6,66% και 7,63% των Ον2008, C13 *, τα A2780S και A2780cp κύτταρα, αντίστοιχα, και δεν έδειξαν σημαντικά διαφορά μεταξύ των κυτταρικών σειρών. Ομοίως, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο CXCR2 mRNA αφθονία (Εικ. 1Α). Αντίθετα, η IL-8 που εκφράζεται κυρίως σε κυτταρικές σειρές Ον2008 και C13 *, ενώ GRO-1 ήταν κυρίως στην τα A2780S και A2780cp κύτταρα τόσο σε επίπεδο mRNA και πρωτεΐνης. IL-8 έκκριση ήταν 5 φορές υψηλότερη σε C13 * ό, τι στην Ον2008, ενώ η έκκριση GRO-1 ήταν 5 φορές υψηλότερη σε σχέση με τα A2780S A2780cp κύτταρα (Εικόνα 1Β, 1C).

Α:. CXCR2 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης σε νόσο ευαίσθητη OVCA κυττάρων (OV2008 & amp? τα A2780S) και ανθεκτικά ομόλογό τους (C13 * & amp? A2780cp, αντίστοιχα) προσδιορίστηκε με qPCR (αριστερά) και κυτταρομετρία ροής (δεξιά, η πιο σκοτεινή γραμμή αντιπροσωπεύει τον έλεγχο ισοτόπου, το ελαφρύτερο γραμμή αντιπροσωπεύει τα κύτταρα CXCR2-χρώση). B & amp? C: mRNA αφθονία και πρωτεΐνη έκκριση της IL-8 (Β) και GRO-1 (C) [κηλίδας Western (άνω) και qPCR (κατώτερο)]. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσοι ± SEM τριών πειραμάτων. Αντιπροσωπευτικά φωτογραφίες του FCM και κηλίδας Western φαίνεται.

Η

SB225002 επαγόμενη απόπτωση και Μίτωση και στις δύο CDDP-ευαίσθητο και ανθεκτικών OVCA κύτταρα

Για να προσδιορίσετε αν το CXCR2 ανταγωνιστής SB225002 θα προκαλέσει κυτταρική θάνατο σε σισπλατίνη ευαίσθητα και ανθεκτικών OVCA κύτταρα, αξιολογήσαμε την απόπτωση μορφολογικά σε Ον2008 κυττάρων /C13 * (τόσο ρ53-άγριου τύπου) και τα A2780S /A2780cp (ρ53-αγρίου τύπου και μεταλλαγμένο ρ53, αντίστοιχα) μετά SB225002 ή CDDP θεραπεία για 24 h. Όπως ήταν αναμενόμενο, CDDP επαγόμενη απόπτωση (εμφανές από κυτταροπλασματική συρρίκνωση, συμπύκνωση χρωματίνης και πυρηνική κατάτμηση) σε χημειο-ευαίσθητα κύτταρα (Ον2008 και τα A2780S), αλλά όχι στα ανθεκτικά κύτταρα (C13 * και A2780cp). Σε αντίθεση, SB225002 επαγόμενη απόπτωση σε όλες τις κυτταρικές σειρές σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 2Α), μία παρατήρηση που υποστηρίζεται από κασπάσης 3 ενεργοποίηση και διάσπαση PARP (Εικ. 2Β). Είναι ενδιαφέρον ότι, «λουλούδι-σαν« κύτταρα με μεγαλύτερες και συμπυκνωθέν χρωμοσώματα ήταν εμφανής κατά την έκθεση σε SB225002 (≥500 ηΜ? Εικ. 2C)., Η οποία συνδέεται με αυξημένη συσσώρευση κυττάρων στο G2 /M και υπο-G1 φάσεις (Σχ 2D – ανώτερος). Το μεγαλύτερο μέρος του πληθυσμού φάσης αυξήθηκε G2 /M ήταν φωσφο-ιστόνης Η3-θετικών κυττάρων (σχ. 2D-χαμηλή), γεγονός που υποδηλώνει ότι SB225002 αυξάνει τον αριθμό των μιτωτικών κυττάρων, πιθανώς με είτε προωθώντας την πρόωρη έναρξη της μίτωσης ή την καθυστέρηση εξόδου μίτωση.

Α: CDDP (0-10 μΜ, 24 ώρες) που προκαλείται απόπτωση σε χημειο-ευαίσθητο OV2008 και τα A2780S αλλά δεν ανθεκτικά ομολόγους τους C13 * και A2780cp, ενώ SB225002 (0-1000 ηΜ, 24 ώρες) που προκαλείται απόπτωση σε όλες τις κυτταρικές γραμμές. Οι OVCAs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετική συγκέντρωση του SB225002 ή του CDDP για 24 ώρες. Η συνημμένη (βιώσιμα) και επιπλέοντα κύτταρα (αποπτωτικών) συνενώθηκαν, πλύθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης (4%) που περιέχει χρωστική Hoechst 33258 (3,75 ng /ml, 24 ώρες). Το ποσοστό της απόπτωσης προσδιορίσθηκε με βάση την πυρηνική μορφολογία. Τουλάχιστον 400 κύτταρα μετρήθηκαν σε κάθε ομάδα και από τον πάγκο «τύφλωσε» για να δοκιμάσετε την ταυτότητα για να αποφευχθεί η πειραματική προκατάληψη. Β: SB225002 επαγόμενη κασπάσης 3 ενεργοποίηση και διάσπαση PARP (στύπωμα Western) σε όλες τις OVCA κύτταρα εξετάζονται. C: SB225002 επάγεται μορφολογικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης σε Ον2008, που συνοδεύτηκε από την μίτωση κύτταρα που μοιάζουν. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της κατανομής του κυτταρικού κύκλου των Ον2008 μετά τη θεραπεία SB225002 σε διάφορες συγκεντρώσεις (0, 250, 500, 750 και 1000 ηΜ) για 24 ώρες: D. Κύτταρα σε φάση Μ ταυτοποιήθηκαν με αντι-φωσφο-ιστόνης Η3 (Ρ-Η3), όπως φαίνεται στα διαγράμματα στιγμών (κατώτερο). Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές τουλάχιστον τριών πειραμάτων.

Η

SB225002 επαγόμενη απόπτωση σε αγρίου τύπου-Ρ53 OVCA κυττάρων μέσω p53

Ενεργοποίηση

Ρ53 είναι απαραίτητη για την επαγωγή της απόπτωσης σε κύτταρα OVCA, και είναι ένας καθοριστικός παράγοντας της ευαισθησίας CDDP [25]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3Α, SB225002 (≥500 ηΜ) σημαντικά up-ρυθμιζόμενη σύνολο ρ53 και φωσφο-ρ53 (Ser15) σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν. Σίγαση ρ53 με siRNA κάτω ρυθμισμένα SB225002 επαγόμενη απόπτωση σε δύο κύτταρα Ον2008 και C13 * (Εικ. 3Β), γεγονός που υποδηλώνει ότι SB225002 προκαλεί απόπτωση μέσω ενεργοποίησης ρ53. Σε αντίθεση, ο αριθμός των φωσφο-ιστόνης Η3-θετικών κυττάρων δεν επηρεάστηκε από ρ53 siRNA (Σχ. 3C), υποδηλώνοντας το ρόλο της ρ53 στην SB225002 επαγόμενη απόπτωση δεν εξαρτάται από συσσώρευση μιτωτικό κύτταρο.

Α: SB225002 (0-1000 ηΜ, 24 ώρες) αυξημένο επίπεδο φωσφο-ρ53 (S15) σύνολο- και Ον2008, C13 *, τα A2780S κύτταρα και αυξημένη φωσφο-ρ53 σε A2780cp κύτταρα. SB225002 αύξησε την αναλογία φωσφο-ρ53 /συνολικός-p53 σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Western blot). Β: Σίγαση p53 [p53 siRNA (100 nM, 36 ώρες, ή αγωνίζομαι siRNA (έλεγχος)] μειώθηκε SB225002 (750 nm, 24 ώρες) προκληθείσα απόπτωση αλλά όχι μίτωσης σε Ον2008 και C13 * κύτταρα C:. Σίγαση p53 δεν είχε καμία επίδραση σχετικά με τον αριθμό των κυττάρων της εισόδου στη μίτωση στα κύτταρα Ον2008 και C13 * αντιμετωπίζονται με SD225002 στα 750 nm. κυττάρων στη μίτωση εντοπίστηκαν από FCM, χρησιμοποιώντας αντι-φωσφο-ιστόνης Η3 (P-Η3).

η

SB225005 Induced συσσώρευση προ-ώριμα μίτωση και Μεταγενέστερες απόπτωση σε ρ53 άγριου τύπου και ελλιπή OVCA κύτταρα

από SB225002 που προκαλείται από τη συσσώρευση της μίτωσης τόσο p53-άγριου τύπου και ανεπάρκεια OVCA κύτταρα, είμαστε αποφασισμένοι περαιτέρω αν η SB225002 επαγόμενη συσσώρευση μιτωτικά κύτταρο συνέβαλε στην απόπτωση. θεραπεία SB225002 προκάλεσε εξαρτώμενη από το χρόνο αύξηση του ποσοστού των μιτωτικών κυττάρων (φωσφο-ιστόνης Η3 θετικά), η οποία ξεκίνησε στις 6 ώρες, αυξάνοντας και διαρκεί για 24 ώρες, στη συνέχεια μειώνεται τα επόμενα έτη. SB225002 προκάλεσε μια καθυστερημένη αύξηση του πληθυσμού των κυττάρων σε υπο-G1 φάση (απόπτωση), που αρχίζει στις 12 ώρες και κορυφώθηκε στις 48 ώρες. Η χρονο-εξαρτώμενη απώλεια μιτωτικά κύτταρα μετά από έκθεση 24 ώρες SB225002 συσχετίστηκε με σημαντική αύξηση των αποπτωτικών κυττάρων, υποδεικνύοντας ότι SB225002 προκαλείται κύτταρα Ον2008 να συλλάβουν στη μίτωση πριν προχωρήσει στην απόπτωση (Σχ. 4Α).

Α: Χρόνος εξαρτώμενη επαγωγή της μίτωσης (μαύροι κύκλοι) και εν συνεχεία την απόπτωση (γεμάτα τετράγωνα) σε Ον2008 κυττάρων με SB225002. Β: 24 ώρες μετά τη θεραπεία SB225002, μιτωτικών ατράκτων έγιναν ορατά με Alexa Fluor® συζευγμένο σε αντι-α-τουμπουλίνης (πράσινο) και αντίθετα με Hoechst (μπλε). Στα κύτταρα ελέγχου, η κανονική διπολική άτρακτος ήταν καλά οργανωμένη με υψηλά συμπυκνωμένη χρωμοσώματα ευθυγραμμίζονται κατά μήκος των ισημερινού πλάκες κατά την διάρκεια χρωματίδες μετα-φάσης και αδελφή διαχωρίζονται κατά την έναρξη της ανάφασης (Β-1). κύτταρα SB225002 επεξεργασμένα εμφανίζεται μιτωτική εκτροπές. Οι συχνότητες των υστερούν χρωμοσωμικό υλικό, πολυπολική μιτωτικών ατράκτων και πολλαπλές πυρήνες όλα αυξημένα σε κύτταρα SB225002 επεξεργασμένα (Β-2, Β-3). C:. Χρωμοσωμάτων εξαπλώνεται δείχνει SB225002 που προκαλείται ανευπλοειδισμών /πολυπλοειδίας

Η

Η μορφολογία των κυττάρων που υφίστανται SB225002 που προκαλείται από μίτωση επιβεβαιώθηκε περαιτέρω για την άτρακτο σχηματισμό, συμπύκνωση της χρωματίνης, και β-τουμπουλίνης και διαχωρισμό του DNA. Στα κύτταρα ελέγχου, η κανονική διπολική άτρακτος ήταν καλά οργανωμένη σε ένα οβάλ σχήμα, ιδιαίτερα συμπυκνωμένο χρωμοσώματα ευθυγραμμίζονται κατά μήκος των ισημερινού πλάκες κατά την διάρκεια χρωματίδες μετα-φάσης και αδελφή διαχωρίζονται κατά την έναρξη της ανάφασης. SB225002 αύξησε το σχηματισμό των συγκεκριμένων τύπων πολυπολικού άξονες, όπως και στην pseudobipolar, τριπολικό και πολυπολικό κύτταρα. είτε δεν υπήρχε η συμπύκνωση των χρωμοσωμάτων κατά την πρόφαση, ή οι συνοπτικές χρωμοσώματα απέτυχε να ευθυγραμμίσει σωστά κατά μήκος των ισημερινή πλάκες κατά τη διάρκεια μετάφαση αλλά, αντίθετα, να εξαπλωθεί σε όλη κυττάρων. Κυττάρων που εισέρχονται ανάφαση έδειξε εμφανή υστέρηση χρωμόσωμα, ενδεικτικό της μη φυσιολογικής διαχωρισμού χρωμοσωμάτων σε SB-225002-συνελήφθη μιτωτικά κύτταρα. SB225002 επάγεται επίσης την εμφάνιση πολλαπλών πυρήνων, η οποία ήταν περισσότερο συχνή με μεγαλύτερη έκθεση (Εικ. 4Β). Παρεκκλίνουσα μίτωση συνδέθηκε με ανευπλοειδία πολυπλοειδίας κύτταρα /, όπως επαληθεύεται με δοκιμή εξάπλωσης χρωμοσωμάτων (Εικ. 4C). Συλλογικά, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι SB225002 προκάλεσε ανώμαλη μιτωτικών ατράκτων, αλλοιωμένη χρωμόσωμα διαχωρισμού σε συλληφθεί μιτωτικά κύτταρα, και είχε ως αποτέλεσμα ανώμαλη κυτταρική διαίρεση και το σχηματισμό των πολλαπλών πυρήνων, τα οποία όλα ήταν ενδεικτικά της πρόωρης μίτωση, ένα γεγονός οδήγησε τελικά στην μιτωτική καταστροφή.

SB225002 που προκαλείται Μιτωτικά Καταστροφή είναι μέσω Chk1 κάτω ρύθμιση και Cdk1 ενεργοποίηση

αποτελέσματα βλάβη στο DNA ενεργοποίηση Chk1, η οποία οδηγεί σε υποβάθμιση CDC25, μειωμένη Cdk1 δραστηριότητα και G2 σύλληψης [10]. Έχουμε αποδείξει ότι OVCA κύτταρα κατεργασμένα με SB225002 αποχώρησε G2 φάση και Μ φάση εισήλθε, και υποβλήθηκε σε πρόωρη μίτωση, υποδηλώνοντας G2 /M σημείο ελέγχου φάση απορρύθμιση. Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε αν Chk1 απενεργοποίηση και ενεργοποίηση Cdk1 συμμετείχε στη δράση SB225002. SB225002 μειωμένη συνολική και φωσφο-Chk1 (S345) επίπεδα σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικ. 5Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι η προώθηση της πρόωρης έναρξης μίτωσης με SB225002 συνδέεται με την αναστολή Chk1 και πρόωρη ενεργοποίηση Cdk1. Η έννοια αυτή υποστηρίζεται από την παρατήρηση ότι η προκατεργασία με τον αναστολέα roscovotine Cdk1 εμποδίζεται η συσσώρευση μιτωτικό κύτταρο SB225002 επαγόμενη απόπτωση και (Εικ. 5Β). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η SB225002 είναι σε θέση να προωθήσει την απόπτωση μέσω της μιτωτικής καταστροφής πιθανότατα μέσω ενεργοποίησης Cdk1

Α:. SB225002 (0-1000 ηΜ, 24 ώρες) μειώθηκαν συνολική και φωσφο-Chk1 (S317 και S345 ) επίπεδα σε κύτταρα Ον2008. Β: Προεπεξεργασία των κυττάρων Ον2008 με roscovotine (12 ώρες) εξασθενημένα SB225002 (750 ηΜ, 24 ώρες) προκληθείσα συσσώρευση Μ φάση και μειωμένη επακόλουθη απόπτωση. * P & lt?. 0.05 (σε σύγκριση με μόνη SB225002)

Η

Η ανασύσταση της άγριου τύπου Ρ53 σε Ρ53-null OVCA κυττάρων μείωσε SB225002 που προκαλείται από καταστροφή Μιτωτικά

Για να προσδιορίσετε αν p53 εμπλέκεται στην SB225002 που προκαλείται από μιτωτική καταστροφή, η p53-μηδενική κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών SKOV3 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με SB225002. SB225002 διήγειρε συσσώρευση εξαρτάται από τη συγκέντρωση μιτωτική κυττάρου και απόπτωση σε κύτταρα SKOV3 (Εικ 6Α & amp?. 6Β). Η αύξηση στην απόπτωση ήταν εξαρτώμενη από το χρόνο και σχετίζεται χρονικά με SB225002 επαγόμενη μίτωση (Σχ. 6 C), προτείνοντας ότι η ρ53 δεν είναι αναγκαία για SB225002 επαγόμενη μιτωτική καταστροφή. Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η δράση της ρ53 επί SB225002 επαγόμενη μιτωτική καταστροφή, εξετάσαμε εάν η ανασύσταση του άγριου τύπου ρ53 στα ρ53-ελλειπή κύτταρα θα μπορούσε να αλλάξει SB225002 επαγόμενη συσσώρευση μιτωτική και την απόπτωση. κύτταρα SKOV3 μολύνθηκαν με αδενοϊικό ρ53 άγριου τύπου (που επιβεβαιώνεται με κηλίδα Western? Εικ. 6D). Όπως ήταν αναμενόμενο, η έκθεση των SB225002 και μόνο που προκαλείται κυρίως τη μίτωση στις 24 ώρες, και σημειώνονται απόπτωση στις 48 ώρες. Ανασύσταση του άγριου-τύπου ρ53 παρεμποδίζεται σημαντικά SB225002 επαγόμενη μίτωση στις 24 ώρες, και εξασθένησε την επακόλουθη απόπτωση που επάγεται από SB225002 στις 48 ώρες (Σχ. 6D, 6Ε). Η απόπτωση επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με διάσπαση PARP στις 24 ώρες με κηλίδα Western (Εικ. 6D). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ρ53 εξασθενεί SB225002 επαγόμενη αργά απόπτωση μέσω καταστολής της πρόωρης συσσώρευση των κυττάρων σε μίτωση. Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η p53 παίζει απέναντι ρόλο στην SB225002-επαγόμενη απόπτωση των κυττάρων OVCA, προκαλώντας κλασικό απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης p53 και την πρόληψη της απόπτωσης μέσω μιτωτικής καταστροφής

Α:. SB225002 (0-1000 ηΜ, 24 ώρες) επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα SKOV3 (άνω). Β: SB225002 αυξήθηκε κύτταρα SKOV3 σε υπο-G1 φάσης (αποπτωτικών κυττάρων) και μίτωση (φωσφο-ιστόνης Η3-θετικό? Dot οικόπεδα). C: χρονική πορεία της SB225002 επαγόμενης η μίτωση (γεμάτοι κύκλοι) και αποπτωτικά (γεμάτα τετράγωνα) [κυτταρομετρία ροής]. D & amp? Ε: Adenviral μόλυνση άγριου-τύπου ρ53 (ΜΟΙ = 10? Αδενοϊικοί LacZ να εξισώσει σύνολο ΜΟΙ σε κάθε πειραματική ομάδα) του SKOV3 εξασθενημένο SB225002 (750 nm? DMSO ως έλεγχος) προκληθείσα μίτωση και την επακόλουθη απόπτωση. περιεχόμενο ρ53 και διάσπαση PARP αξιολογήθηκαν στις 24 ώρες (Western blot). πρόοδο του κύκλου των κυττάρων εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Οι τιμές είναι μέση τιμή ± SEM. * P ≤ 0,05 (σε σύγκριση με το DMSO-ελέγχου).

# p ≤ 0,05 (σε σύγκριση με τα κύτταρα SB225002-θεραπεία).

Η

SB225002 απόπτωση και καταστροφική Μίτωση δεν ήταν μέσα Μπλόκο CXCR2 σηματοδότησης υποδοχέων

Από SB225002 είναι μια ειδική μη-πεπτίδιο ανταγωνιστή για CXCR2, μπορούμε τότε διερευνηθεί κατά πόσον η δράση του SB225002 προκαλείται μέσω CXCR2. Πρώτον, προ-επεξεργασμένα κύτταρα Ον2008 και C13 * με διαφορετικές συγκεντρώσεις IL-8 για 2 ώρες πριν την καλλιέργεια τους με SB225002 (750 ηΜ) για επιπλέον 24 ώρες. Απροσδόκητα, η προκατεργασία με IL-8 ή ΟΚΟ-1 απέτυχε να αναστείλει την επαγόμενη SB225002 μίτωση ή απόπτωση (Σχ. S1A), υποδεικνύοντας ότι SB225002 επαγόμενη μίτωση και την απόπτωση δεν μπορεί να διαμεσολαβείται μέσω CXCR2. Επιπλέον, η προκατεργασία των κυττάρων με CXCR2 αντισώματος εξουδετέρωσης και ένα άλλο ανταγωνιστή του CXCR1 /CXCR2-G31P [33] δεν είχε επίδραση επί της βασικής ή SB225002 απόπτωση και μίτωσης σε Ον2008 και C13 * (Εικ. S1B και S1c). Επιπλέον, ένα άλλο ειδικό αναστολέα του CXCR2, SB265610 δεν είχε καμία επίδραση επί της βασικής και SB225002 επαγόμενη απόπτωση και μιτωτική σύλληψη (Εικ S2A & amp?. Β & amp? C) και ενεργοποίηση ρ53 και αναστολή Chk1 σε Ον2008 (Εικ S2D.). Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν την ιδέα ότι SB225002 επάγει την απόπτωση και μιτωτική καταστροφή στην OVCA κύτταρα ανεξάρτητα του CXCR2.

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, έχουμε αποδείξει ότι SB225002, ένα μη-πεπτίδιο ανταγωνιστής CXCR2, είναι αποτελεσματική στην επαγωγή της απόπτωσης σε σημείο ελέγχου interphases και μίτωσης σε αμφότερες CDDP ευαίσθητα και ανθεκτικών OVCA κυτταρικές γραμμές με διαφορετικό καθεστώς ρ53. Κατεργασία των καρκινικών κυττάρων με SB225002 οδήγησε σε ρ53-μεσολαβούμενη απόπτωση κλασική αλλά επίσης προκάλεσε μιτωτική καταστροφή σε άγριου τύπου ρ53 και ανεπάρκεια OVCA κύτταρα. SB225002 που προκαλείται μιτωτική καταστροφή με την προώθηση της ανώμαλης μιτωτικής ατράκτου, αλλάζοντας χρωμόσωμα διαχωρισμό στην συνελήφθησαν μιτωτικά κύτταρα, και προκάλεσε ανώμαλη κυτταρική διαίρεση και το σχηματισμό των πολλαπλών πυρήνων. Οι αλλαγές αυτές καταργούνται από roscovotine, υποδηλώνοντας ότι η κυκλίνη B /CDK1 είχε ενεργοποιηθεί μέσω ρύθμισης προς τα κάτω του σημείου ελέγχου Chk1 κινάσης. Τα αποτελέσματα του SB225002 δεν διαμορφώνονται από προθεραπεία με συνδετήρες CXCR2 ή εξουδετερωτικού αντισώματος της, ούτε μιμείται από άλλα CXCR2 ανταγωνιστή SB265610 ή G31P. Η μελέτη μας παρέχει την πρώτη απόδειξη ότι SB225002 κυτταρικό θάνατο που επάγεται όχι μόνο μέσω των συμβατικών απόπτωσης, αλλά και μιτωτική καταστροφή μέσω ενός CXCR2-ανεξάρτητο τρόπο.

Η μελέτη μας έδειξε ότι τόσο άγριου τύπου ρ53 και ανεπάρκεια OVCA κύτταρα αποκρίνονται σε SB225002 στην επαγωγή της απόπτωσης, αν και μέσω διαφορετικών μηχανισμών. P53 μπορεί είτε να προκαλέσει την απόπτωση μέσω της ενεργοποίησης του εγγενούς (μιτοχονδριακού) και εξωγενών (θάνατος-υποδοχέας) αποπτωτικής παθολογικής οδού μέσω γενωμικού [33], [34] και μη-γονιδιωματικό [27], [28] μηχανισμούς.