Αφηρημένο

Στόχος

IL-17Α παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές φλεγμονώδεις ασθένειες και καρκίνους. Επιδιώξαμε να εξετάσουμε την επίδραση της IL-17Α σχετικά με την εισβολή του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων και τη μελέτη των σχετικών μηχανισμών της.

Μέθοδοι

επούλωση τραυμάτων και matrigel Transwell δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν για να εξεταστεί η επίδραση της IL -17A επί του τραχήλου της μήτρας μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή από ένα πάνελ του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Τα επίπεδα των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (MMPs) και αναστολέας μεταλλοπρωτεϊνασών ιστού (ΤΙΜΡ) διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Η δραστικότητα των ρ38 και (NF-κΒ) οδού σήμα πυρηνικού παράγοντα-kappa Β ανιχνεύθηκε επίσης.

Αποτελέσματα

Εδώ, δείξαμε ότι η IL-17Α θα μπορούσε να προωθήσει την μετανάστευση και την εισβολή του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Περαιτέρω μοριακή ανάλυση έδειξε ότι η IL-17Α θα μπορούσαν να ρυθμίζουν τις εκφράσεις και τις δραστηριότητες των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9, και ρυθμίζουν προς τα κάτω τις εκφράσεις του ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2. Επιπλέον, η IL-17Α ενεργοποιεί επίσης σηματοδοτικό μονοπάτι ρ38 και ρ50 αυξήθηκε και ρ65 πυρηνική έκφραση. Επιπλέον, η θεραπεία του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων με τις φαρμακολογικές /αναστολείς σηματοδοτικό μονοπάτι ρ38 ΝΡ-κΒ, SB203580 και PDTC, ισχυρά αποκατέστησε τους ρόλους της εισβολής και αυξορρύθμιση των MMPs που επάγεται από την IL-17Α.

Συμπέρασμα

IL-17Α θα μπορούσε να προωθήσει την μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας μέσω έκφρασης ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 up-ρύθμιση, και προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 μέσω p38 /σηματοδοτικό μονοπάτι ΝΡ-κΒ. IL-17Α μπορεί να είναι ένας πιθανός στόχος για να βελτιώσει την πρόγνωση για τους ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Feng Μ, Wang Υ, Chen Κ, Bian Ζ, Jinfang Wu, Gao Q (2014) IL-17Α Προωθεί η μετανάστευση και εισβολής κύτταρα καρκίνου του τραχήλου από συντονισμένη ενεργοποίηση MMPs Έκφραση μέσω του p38 /NF-κΒ Σήμα διάβαση. PLoS ONE 9 (9): e108502. doi: 10.1371 /journal.pone.0108502

Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Ιαπωνία

Ελήφθη: 23 Ιούλ, 2014? Αποδεκτές: 31 του Αυγούστου 2014? Δημοσιεύθηκε: 24 Σεπτεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Feng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίζεται από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 81070536) και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Shaanxi (Νο 2014JM4143). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του τραχήλου είναι η δεύτερη πιο κοινή αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο στις γυναίκες παγκοσμίως [1] και είναι ένα από τα γνωστά μόνο καρκίνους που προκαλούνται από έναν ιό που μπορεί να μεταδοθεί σεξουαλικά. Πρόσφατες έρευνες διαπιστώνουν ότι τα κύτταρα του ανοσοποιητικού και εκκρίνεται κυτοκίνες τους δεν μπορεί να συμβάλει μόνο στην εξάλειψη των καρκινικών κυττάρων, αλλά και να παρέχει ένα κατάλληλο μικροπεριβάλλον για την ανάπτυξη των όγκων, καθώς και την προώθηση της εξέλιξης του όγκου [2], κατά τη διάρκεια της οποίας το τοπικό μικροπεριβάλλον του όγκου και η κατάσταση λειτουργίας ανοσοκυττάρων παίζουν σημαντικούς ρόλους [3].

η ιντερλευκίνη 17Α (IL-17Α) είναι μία προ-φλεγμονώδης κυτοκίνη, και έχει βρεθεί να συμβάλει πολλές χρόνιες ασθένειες. Πρόσφατα, η IL-17Α έχει επίσης συχνά βρίσκονται σε πολλούς καρκίνους, όπως ο καρκίνος των ωοθηκών [4], του καρκίνου του μαστού [5], γαστρικό καρκίνο [6], και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [3]. Ο ρόλος της IL-17Α στην ανάπτυξη και την εξέλιξη αυτών των καρκίνων παραμένει αμφιλεγόμενη. Χρησιμοποιώντας ζωικό μοντέλο, ορισμένες μελέτες διαπιστώνουν ότι η IL-17Α παρεμπόδισε την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση μέσω ΙΡΝ-γ παραγωγή ΝΚ και Τ κύτταρα [6], [7]. Άλλες μελέτες δείχνουν ότι η IL-17Α προωθείται ανάπτυξη και μετάσταση όγκου [8], [9]. Το αποτέλεσμα μπορεί να συσχετισθεί με την επαγωγή της προώθησης στο μικροπεριβάλλον του όγκου στη θέση του όγκου [10].

μετάσταση όγκου είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας που σχετίζεται με τον καρκίνο [11]. Τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να υποβαθμίσει την ECM και να εισβάλουν στα λεμφικά και αγγειακά συστήματα για τη διάδοση σε μακρινές περιοχές [12]. Σε αυτή τη διαδικασία, πρωτεάσες όπως μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (MMPs), παίζουν σημαντικό ρόλο [12]. Παραγωγή και ενεργοποίηση των MMPs εξαρτάται από διάφορες κυτοκίνες, περιλαμβανομένου του ΤΝΡ-α και IL-1 που εκκρίνεται από κύτταρα όγκου [13], [14], ινοβλάστες [15], [16] και μακροφάγα [16]. Προηγούμενες μελέτες βρέθηκε ότι η IL-17Α θα μπορούσε να ρυθμίσει MMPs, IL-1 και TNF σε περιοδοντίτιδα [17], και βρήκε ότι τα αποτελέσματα ανεπάρκεια IL-17 υποδοχέα σε διαταραγμένη έκφραση της IL-1 και ΜΜΡ3 /ΜΜΡ9 /ΜΜΡ13 στη ρευματοειδή αρθρίτιδα [18] , υποδεικνύοντας ότι η IL-17Α παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των MMPs. ΜΑΡΚ μονοπάτι σήματος και NF-κΒ παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της παραγωγής και της δραστηριότητας των ΜΜΡ [10], [19]. Και πολλές επιδράσεις της IL-17Α συσχετίζεται με σηματοδοτικό μονοπάτι ΜΑΡΚ και NF-κΒ [10], [20], [21].

Στη μελέτη μας, βρήκαμε ότι η IL-17Α θα μπορούσε να αυξήσει κύτταρο κινητικότητα και εισβολή από το up-ρύθμιση του ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 μέσω ενεργοποίησης της p38-NF-κΒ οδό σήματος.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

η έρευνα αυτή είχε εγκριθεί από την Ηθική Επιτροπή της δεύτερης Ενταγμένο Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Xi’an Jiaotong Πανεπιστήμιο. Όλα καρκίνο του τραχήλου της μήτρας συμμετέχοντες ασθενή με ιστολογική εξέταση που προβλέπεται γραπτή συγκατάθεση τους να συμμετάσχουν σε αυτή τη μελέτη.

τραχήλου της μήτρας δείγματα καρκίνου

τραχήλου της μήτρας δείγματα καρκίνου για mRNA ελήφθησαν από 50 ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας στο τμήμα της Μαιευτική και Γυναικολογία, Δεύτερη Συνδεδεμένες Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή, Xi’an Jiaotong Πανεπιστήμιο. Όλοι οι ασθενείς είχαν συναινέσει στην συλλογή του ιστού κατά το χρόνο της χειρουργικής επέμβασης. Και όλα τα δείγματα διαγνώστηκαν ως τραχηλικού πλακώδους καρκίνου του από το τμήμα της παθολογίας. Μεταξύ αυτών, 11 ήταν από καρκίνο του τραχήλου της βιοψίας και δεν συμπεριλήφθηκαν στην στατιστική ανάλυση του βάθους εισβολής και του λεμφικού μετάσταση. Κανένας από τους ασθενείς είχαν υποβληθεί σε χημειοθεραπεία, ανοσοθεραπεία ή η ακτινοθεραπεία πριν από τη συλλογή του δείγματος. Κλινικό στάδιο και ιστολογική ταξινομήσεις με βάση τη Διεθνή Ομοσπονδία Γυναικολογίας και Μαιευτικής (FIGO) σύστημα ταξινόμησης. Δείγματα ιστών χωρίστηκαν σε δύο τμήματα: το ένα μέρος καταψύχθηκε σε -80 ° C για την απομόνωση του RNA και το αριστερό χρησιμοποιήθηκε για παθολογικές διάγνωση

Οι κυτταρικές σειρές και πειραματική αντιδραστήρια

Ο HeLa, C33A. κυτταρικές σειρές, και Caski ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και διατηρήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό στους 37 ° C, 5% CO

2. Αντι-ΜΜΡ2, ΜΜΡ9, ΤΙΜΡ-1, ΤΙΜΡ-2, β-ακτίνη, ρ38 και ρ-ρ38 ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Anti-NF-κΒ-p50, p65 αντισώματα /Rel Α και ιστόνης Η1 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ) και όλα τα άλλα χημικά ελήφθησαν από την Sigma (St Louis, ΜΟ), εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Η κυτταρική μετανάστευση και δοκιμασία εισβολής

η μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή ικανότητες ελέγχθηκαν με την επούλωση των τραυμάτων και την εισβολή δοκιμασίες. Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία επούλωση του τραύματος. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων μέχρι συρροή ρυθμός φτάσει 70-80% και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς IL-17Α (50 ng /mL). Η κυτταρική στιβάδα τραυματίστηκε χρησιμοποιώντας ένα αποστειρωμένο άκρο και η εξάπλωση του κλεισίματος τραύματος παρατηρήθηκε και φωτογραφήθηκε. δοκιμασία Εισβολή διεξήχθη με 24 φρεατίων Biocoat Matrigel εισβολής Chambers (Becton Dicknson, Bedford, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από καλλιέργεια σε μέσο με ή χωρίς IL-17Α (50 ng /mL), κύτταρα σπάρθηκαν πάνω σε εσωτερική καλά και ο αριθμός των κυττάρων που εισέβαλαν μέσα από την Matrigel μετρήθηκε.

απομόνωση RNA και ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR

Ολικό RNA εξήχθη από καλλιεργημένα κύτταρα με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen), και τα επίπεδα έκφρασης του mRNA μετρήθηκαν με qRT-PCR χρησιμοποιώντας ένα iQ5 πολύχρωμα πραγματικού χρόνου σύστημα ανίχνευσης PCR (Bio-Rad) με SYBR πρόμιγμα EX. Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με τη PrimeScript RT Kit αντιδραστηρίου (Perfect Real Time? TaKaRa) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Για ανάλυση του mRNA, τα επίπεδα GAPDH mRNA χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικός έλεγχος κανονικοποίηση. Fold αλλαγές υπολογίστηκαν και κανονικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο CT. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως εξής: GAPDH (GCACCGTCAAGGCTGAGAAC και TGGTGAAGACGCCAGTGGA)? MMP1 (ACTCTGGAGTAATGTCACACCT και GTTGGTCCACCTTTCATCTTCA)? ΜΜΡ2 (CCGTCGCCCATCATCAAGTT και CTGTCTGGGGCAGTCCAAAG)? ΜΜΡ3 (AGTCTTCCAATCCTACTGTTGCT και TCCCCGTCACCTCCAATCC)? ΜΜΡ9 (GGGACGCAGACATCGTCATC και TCGTCATCGTCGAAATGGGC)? MMP10 (CCCACTCTACAACTCATTCACAG και TCAGATCCCGAAGGAACAGAT)? ΜΜΡ13 (TGCCAGTGCCCTTAAATTCCA και CAACAGGGTCTCAAACCCCA)? IL-17Α (CAATCCCACGAAATCCAGGATG και GTGGAGATTCCAAGGTGAGG).

Ζυμογράφημα

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-17Α σε 37 ° C για 24 ώρες, και τα δείγματα των ρυθμισμένων μέσων συλλέχθηκαν. Κατάλληλοι όγκοι των άβραστος δείγματα διαχωρίστηκαν με 0,1% ζελατίνη-8% SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση. Μετά την ηλεκτροφόρηση, οι πηκτές πλύθηκαν δύο φορές σε 2.5% Triton Χ-100 σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης (10 mM CaCl2, 40 mM Tris-HCl και 0,01% NaN3, ρΗ 8,0) στους 37 ° C για 12 h. Coomassie brilliant blue κηλίδα πηκτώματος R-250 χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για τη χρώση του πηκτώματος. Οι εντάσεις των ζωνών στα πηκτώματα υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ανάλυσης εικόνας (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA).

Ποσοτικοποίηση της ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 πρωτεΐνες

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /ml σε τρυβλία 6 φρεατίων μια ημέρα πριν από το πείραμα. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 1% FBS και γονικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με 1% FBS με ή χωρίς IL-17Α (50 ng /mL). Μετά από 48 ώρες επώασης, τα κυτταρικά υπερκείμενα συλλέχθηκαν, και στη συνέχεια οι συγκεντρώσεις ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 είχαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας τα κιτ ELISA (Σαγκάη Westang Bio-Tech Co, Ltd, Shanghai, Κίνα).

ανάλυση Western κηλίδωση

1 × 10

6 του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα αιωρήθηκαν σε 250 μΙ ρυθμιστικού λύσης (40 mmol /l Tris-HCI, 1 mmol /l EDTA, 150 mmol /l ΚΟΙ, 100 mmol /l NaVo3, 1 % Triton Χ-100, 1 mmol /l PMSF, ρΗ 7.5). Οι πυρηνικές κυτταρολύματα συλλέχτηκαν με NucBuster Protein extration Kit (Novagen, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι πρωτεΐνες (50 μg) διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση SDS-πολυακρυλαμιδίου 10% και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF. Οι μεμβράνες στη συνέχεια αποκλείστηκε σε μη λιπαρό γάλα (5% σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με Tween-20, TBST) ρυθμιστικό διάλυμα στους 37 ° C για 1 ώρα για τον αποκλεισμό της μη ειδικής σύνδεσης και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα με αντισώματα έναντι ρ38, ρ -p38, ΜΜΡ2, ΜΜΡ9, ΤΙΜΡ-1, ΤΙΜΡ-2, NF-κΒ-ρ50, ρ65 /ΚεΙΑ, ιστόνη Η1 ή β-ακτίνης σε TBST που περιείχε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε 4 ° C. Στη συνέχεια, δεύτερη αντισώματα επωάστηκαν. Οι ζώνες ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια kit (Amersham, ECL Plus, Freiburg, Germany) και εκτέθηκαν με αυτοραδιογραφία. Η ανάλυση πυκνομετρίας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού J εικόνας (GE Healthcare, Buckinghamshire, Ηνωμένο Βασίλειο).

Η στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας SPSS 13.0 (SPSS Inc., IL). Η στατιστική σημαντικότητα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας t-test του φοιτητή.

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Η έκφραση της IL-17Α συνδέεται θετικά με μετάσταση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας

IL-17Α έκφραση mRNA μετρήθηκε σε 50 τραχήλου καρκινικούς ιστούς με πραγματικού χρόνου PCR. μελέτη σύνδεσης εφαρμόστηκε περαιτέρω να διερευνηθεί η κλινική σημασία της έκφρασης της IL-17Α σε 50 κολπικών δειγμάτων καρκίνου. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι η έκφραση της IL-17Α δεν συσχετίστηκε με τους ασθενείς «ηλικία, το στάδιο της νόσου, και το μέγεθος του όγκου, ενώ η έκφραση της IL-17Α συσχετίστηκε σημαντικά σε ασθενείς« βάθος εισβολή και του λεμφικού κατάσταση μετάσταση (

P

& lt? 0.01, φοιτητές t-test, πίνακας 1). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η IL-17Α θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα σημαντικό ρόλο στην μετάσταση καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.

Η

IL-17Α αυξημένη κινητικότητα του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων

επούλωση τραυμάτων και matrigel εισβολή δοκιμασίες διεξήχθησαν σε δοκιμαστεί περαιτέρω το ρόλο της IL-17Α επί του τραχήλου της μήτρας κυτταρική κινητικότητα. Τα αποτελέσματα της θεραπεία του τραύματος δείχνουν ότι μεταναστεύσεις των HeLa, C33A και τα κύτταρα Caski ενισχύθηκαν από την IL-17Α (σχ. 1Α και Β). Επιπλέον, transwell δοκιμασία έδειξε ότι η θεραπεία με IL-17Α προάγει κυτταρική εισβολή μέσω του Matrigel (σχ. 1 C και D).

(Α, Β) Σε σύγκριση με κύτταρα ομάδα ελέγχου, η IL-17Α θεραπεία καρκίνου του τραχήλου κύτταρα ( HeLa, C33 Α, και Caski) έδειξαν υψηλότερη κινητικότητα σε μία δοκιμασία επούλωση της πληγής. (Γ) Με επεμβατική δοκιμασία κυττάρων, η επίδραση της IL-17Α στην κυτταρική εισβολή ανιχνεύθηκε (μεγέθυνση 100 Χ). (D) Συνολικός αριθμός επεμβατική κυττάρων σε κάθε θάλαμο συνοψίστηκε. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσο ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. *

σ

& lt? 0,05 και **

σ

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου αντίστοιχα

Η

IL-17Α επάνω ρυθμισμένη ΜΜΡ2 και την έκφραση ΜΜΡ9 και ρυθμισμένα προς τα κάτω ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 έκφραση σε καρκινικά κύτταρα του τραχήλου της μήτρας

Ως υπερέκφραση των MMPs παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετάσταση του καρκίνου [22], ο ρόλος της IL-17Α επί της έκφρασης ΜΜΡ σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές γραμμές (C33A και Caski) ερευνήθηκε. Εκφράσεις της ΜΜΡ1, ΜΜΡ2, ΜΜΡ3, ΜΜΡ9, MMP10 και ΜΜΡ13 εντοπίστηκαν με πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση μεταξύ επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων κυττάρων IL-17Α. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, η IL-17Α αύξησε την έκφραση τόσο ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9, υποδεικνύοντας ότι η κινητικότητα προώθηση του ρόλου της IL-17Α μπορεί να εμπλέκεται με εξωκυτταρικό πλέγμα (ECM) αναδιαμόρφωση.

έκφραση (Α) MMPs εντοπίστηκε με πραγματικού -Time PCR ανάλυση στην αυχενική καρκινικά κύτταρα σε επεξεργασία με και χωρίς IL-17Α. (Β) Μετά από επεξεργασία με IL-17Α για 24 ώρες, η έκφραση του ΜΜΡ2, ΜΜΡ9, ΤΙΜΡ-1, και ΤΙΜΡ-2 ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδος Western σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα. (C) ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων πρωτεΐνης ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, ΤΙΜΡ-1, και ΤΙΜΡ-2. ΜΜΡ2 (D) και ΜΜΡ9 (Ε) συγκεντρώσεις σε υπερκείμενα μορφή κύτταρα κατεργασμένα με ή χωρίς IL-17Α αναλύθηκαν με ELISA. (F) Τα αποτελέσματα της IL-17Α σχετικά με τις δραστηριότητες της ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 αναλύθηκαν με τη δοκιμασία zymography. (G) Ποσοτικοποίηση των δραστηριοτήτων των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσο ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. *

σ

& lt? 0,05 και **

σ

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου αντίστοιχα

Η

ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 παίζουν σημαντικό ρόλο για την μετάσταση του καρκίνου [12 ], και IL-17Α μπορεί να επηρεάσει την έκφραση του ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 [10]. TIMPs, τα ενδογενή φυσικούς αναστολείς των MMPs, μπορεί να ρυθμίσει τη δραστικότητα και την έκφραση των MMPs [23]. Μετά από επεξεργασία με IL-17Α, η έκφραση των πρωτεϊνών ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 σε καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές γραμμές (C33A και Caski) αυξήθηκε, εν τω μεταξύ η έκφραση του ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 πρωτεϊνών μειώθηκε (Σχ. 2Β και C).

IL-17Α αύξησε την έκκριση και τη δραστηριότητα των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9

MMPs έχει τον ρόλο της υποβάθμισης της ECM, και εμπλέκονται έντονα σε εισβολή και τη μετάσταση κυττάρων κακοήθους όγκου [22]. Υπό το πρίσμα αυτό, η έκφραση της ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 σε υπερκείμενα κυττάρου αναλύθηκε με ELISA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2D και Ε, τα κύτταρα C33A εκκρίνεται 425,55 ± 49,35 pg /ml /10

5 κύτταρα του ΜΜΡ2 και 75.01 ± 9.80 pg /ml /10

5 κύτταρα της ΜΜΡ9. θεραπεία IL-17Α αύξησε σημαντικά τα επίπεδα ΜΜΡ2 σε 773,12 ± 60,12 pg /ml /10

5 κύτταρα (

P

& lt? 0,05) και τα επίπεδα MMP9 σε 148,89 ± 11,18 pg /ml /10

5 κύτταρα (

P

& lt? 0,05). Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε κύτταρα Caski. Σαφώς, η θεραπεία με IL-17Α προωθείται αξιοσημείωτα την έκφραση τόσο της ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9.

Επιπλέον, η δραστηριότητα των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 που εκκρίνονται από τα κύτταρα καρκίνου του τραχήλου εξετάσθηκε με ανίχνευση ζυμογραφία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η IL-17Α θα μπορούσε να αυξήσει σημαντικά την δραστικότητα αποδόμησης της ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 σε C33A και κυτταρικές γραμμές Caski (Σχ. 2F και G).

IL-17Α ρυθμίζεται ΜΜΡ έκφραση και εισβολή του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων μέσω ενεργοποίηση ρ38 /NF-κΒ σηματοδοτικό μονοπάτι

το σηματοδοτικό μονοπάτι ρ38 παίζει σημαντικό ρόλο στην εισβολή του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων. Μετά την επεξεργασία με IL-17Α, το επίπεδο φωσφορυλίωσης της ρ38 αυξήθηκε (Σχ. 3Α-Β, Ε-Ρ). Ωστόσο, η έκφραση του συνολικού ρ38 δεν επηρεάστηκε. Όπως μονοπάτι σηματοδότησης ΝΡ-κΒ αναφέρθηκε ότι είναι ένα προς τα κάτω στόχος της σηματοδότησης ρ38, και ήταν σε θέση να ρυθμίζουν προς τα πάνω έκφραση andMMP9 ΜΜΡ2, ΝΡ-κΒ /ρ50 και ρ65 /έκφραση ΚεΙΑ επίσης ανιχνεύθηκαν. Παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία με IL-17Α αύξησε σημαντικά την πυρηνική έκφραση τόσο της ΝΡ-κΒ /ρ50 και ρ65 /ΚεΙΑ (Σχ. 3 C-D, G-Η). Για να οριστεί περαιτέρω το σημείο στο ρ38 /NF-κΒ σηματοδοτικό μονοπάτι στο οποίο η IL-17Α ρυθμίζει την εισβολή του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων, μπορούμε κατεργασία του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα με SB203580 (αναστολέας ρ38) και PDTC (αναστολέας του ΝΡ-κΒ), και ανέλυσε την επεμβατική ικανότητα. Τόσο SB203580 και PDTC μπορεί να αντιστρέψει την εισβολή αυξήθηκε από την IL-17Α (Σχ. 4Α-Β, Ε-Ρ). Επιπλέον, η ανάλυση στυπώματος western αποκάλυψε ότι η προεπεξεργασία των SB203580 και PDTC κατήργησε την προς τα πάνω ρύθμιση των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 που προκαλείται από IL-17Α (σχ. 4C-D, G-H), επιδεικνύοντας περαιτέρω ότι η IL-17Α ρυθμισμένη έκφραση ΜΜΡ και εισβολή του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων μέσω ενεργοποίησης p38 /NF-κΒ οδού σήματος.

η έκφραση της ρ38 και ρ-ρ38 ανιχνεύθηκαν με ανάλυση στυπώματος Western σε C33A (Α) και τα κύτταρα Caski (Ε) υποβάλλεται σε επεξεργασία με ή χωρίς IL -17A για 24 ώρες. Ποσοτικοποίηση των επιπέδων πρωτεΐνης ρ38 και ρ-ρ38 σε C33A (Β) και Caski (F). Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσο ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. * P & lt? 0,05 και ** p & lt? 0,01 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, αντίστοιχα. Η ανάλυση στυπώματος Western για την ανίχνευση πυρηνικών ρ50 και ρ65 έκφραση σε C33A (C) και τα κύτταρα Caski (G) υποβάλλεται σε επεξεργασία με IL-17Α (50 ng /mL) σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Ποσοτικοποίηση των επιπέδων πυρηνικής πρωτεΐνης ρ50 και ρ65 σε C33A (D) και τα κύτταρα Caski (H). Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσο ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. *

σ

& lt? 0,05 και **

σ

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου αντίστοιχα

Η

C33A (Α) και τα κύτταρα Caski (Ε) ήταν προεπεξεργασία με SB (20 μΜ) και PDTC επί 30 λεπτά, στη συνέχεια επωάζονται παρουσία ή απουσία IL-17Α (50 ng /mL) για 24 ώρες. Οι επεμβατικές ικανότητες των κυττάρων διεξήχθησαν με τη δοκιμασία εισβολή θαλάμου Boyden. Το ποσοστό των επεκτατικών ρυθμού C33A (Β) και κύτταρα Caski (F) εκφράστηκε ως ποσοστό του ελέγχου. C33A (C, D) και Caski (G, H) κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε Western Blot για την ανάλυση των επιπέδων πρωτεΐνης του ΜΜΡ2, ΜΜΡ 9. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσο ± SD από τρία ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. *

σ

& lt? 0,05 και **

σ

& lt?. 0.01 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου αντίστοιχα

Η

Συζήτηση

Σημαντικά στοιχεία δείχνουν ότι ορισμένους ασθενείς με καρκίνο παρουσιάζουν μια γενικευμένη κατάσταση ανοσοκατασταλτικά, αλλά η φλεγμονώδης αντίδραση στο σημείο του όγκου μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη και την εξέλιξη [24] όγκου [25]. Επίμονη μόλυνση με ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) είναι ένα απαραίτητο αιτία του καρκίνου του τραχήλου [26]. HPV λοιμώξεις είναι συχνές, και καρκίνο του τραχήλου μπορεί να θεωρηθεί ως μια σπάνια επιπλοκή αυτής της κοινής λοίμωξης [27]. IL-17Α είναι ένας σημαντικός φλεγμονώδης κυτοκίνη στην ανάπτυξη πολλών φλεγμονωδών παθήσεων και είναι επίσης συχνά ανιχνεύεται σε μικροπεριβάλλον του όγκου [8], [28], [29]. Αλλά μέχρι τώρα, λίγα είναι γνωστά για την επίδραση της IL-17Α επί του τραχήλου της μήτρας εξέλιξης του καρκίνου. Souza και οι συνεργάτες του μελέτησαν τη συσχέτιση της συγκέντρωσης της IL-17 στον ορό από ασθενείς και διαφορετικές ποιότητες του πλακώδους ενδοεπιθηλιακής βλαβών και επεμβατική τραχηλικού καρκινώματος [30], για να μην αναφέρουμε το προ-μεταστατικό και επεμβατική επίδραση της IL-17Α για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, καθώς και μηχανισμό υποτακτικός του. Εδώ, αποκάλυψε ότι η IL-17Α προώθησε σημαντικά την επεμβατική και μεταστατική ικανότητα του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα με τη ρύθμιση ισορροπίας MMP /TIMP μέσω ενεργοποίησης του /NF-κΒ σηματοδοτικό μονοπάτι της p38.

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι IL-17Α θα μπορούσε να ενισχύσει τη μετανάστευση και την εισβολή των ικανοτήτων του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Προηγούμενες έρευνες έδειξαν ότι η IL-17Α θα μπορούσε να προωθήσει τη μετανάστευση και εισβολή ικανότητες του ανθρώπινου καρκίνου του μαστού και το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα κυττάρων [8], [10]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η IL-17Α συσχετίζεται στενά με την εισβολή του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων. Προκειμένου να αποσαφηνιστούν οι σχετικοί μηχανισμοί, ερευνήσαμε εάν η προώθηση επίδραση της IL-17Α στην κυτταρική εισβολή είναι μέσω της ρύθμισης της έκφρασης των MMPs και TIMPs.

Κατά τη διαδικασία της μετάστασης, τα καρκινικά κύτταρα πρέπει να υποβαθμίσει την ECM και εισβάλλουν στο αίμα ή λεμφαγγεία, και να φτάσει σε άλλους ιστούς και όργανα, στη συνέχεια, τη δημιουργία νέων όγκων. ΜΜΡ και ΤΙΜΡ παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξευτελιστική ECM [31]. ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 έχουν συχνά ανιχνευθεί ότι υπερ-εκφράζεται σε συμπαγείς όγκους και που συνδέονται με εισβολή και μετάσταση όγκου [22], [32]. Έτσι ερευνήσαμε την επίδραση της IL-17Α σχετικά με την έκφραση των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η IL-17Α μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9. TIMPs δρουν μέσω του σχηματισμού ενός σφιχτό και μη ομοιοπολικό σύμπλοκο με συγγενή ένζυμα τους και είναι σε θέση να επηρεάσουν τις βιολογικές δραστηριότητες των MMPs [33], [34]. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε IL-17Α θα μπορούσε κάτω regualte την έκφραση του ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η δράση προαγωγής της IL-17Α συσχετίζεται με τις MMPs και των αναστολέων τους.

Το σηματοδοτικό μονοπάτι ρ38 παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης και της δραστηριότητας των ΜΜΡ και ΤΙΜΡ [35], [ ,,,0],36]. Δραστηριότητα της οδού σήματος p38 μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 [10]. Προηγούμενη μελέτη διαπίστωσε ότι η IL-17Α μπορεί να ενεργοποιήσει σηματοδοτικό μονοπάτι της p38 [37], [38]. Για να διευκρινιστεί περαιτέρω πιθανός μηχανισμός (ες) της IL-17Α στην προώθηση του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων εισβολής, έχουμε ερευνήσει την επίδραση της IL-17Α για την φωσφορυλίωση της ρ38. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η IL-17Α θα μπορούσαν να ρυθμίζουν το επίπεδο φωσφορυλίωσης της ρ38. Τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι η θεραπεία αναστολέα της ρ38 μειωμένη κυτταρική εισβολή σημαντικά, συνοδεύονται από αυξημένη ΜΜΡ2 και η έκφραση πρωτεΐνης ΜΜΡ9, και μειωμένη ΤΙΜΡ-1 και την έκφραση της πρωτεΐνης ΤΙΜΡ-2, υποδηλώνοντας ότι η προς τα πάνω ρύθμιση ρόλος της IL-17A σε ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 έκφραση μπορεί να είναι μέσω της ενεργοποίησης της οδού σήματος ρ38. NF-κΒ έχει βρεθεί ότι είναι ένας βασικός παράγοντας μεταγραφής στη ρύθμιση της ΜΜΡ2 και έκφραση ΜΜΡ9 [10], [39] και η IL-17Α έχει αναφερθεί ότι είναι σε θέση να ενεργοποιούν το ΝΡ-κΒ σήμα οδού [40], [41 ], είμαστε δίπλα μελέτησε κατά πόσο η IL-17Α θα μπορούσε να ενεργοποιήσει NF-κΒ οδό σήματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η IL-17Α θα μπορούσε να ενεργοποιήσει ΝΡ-κΒ, υποδηλώνοντας ότι η προς τα πάνω ρύθμιση ρόλος της IL-17A σε ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 έκφραση θα μπορούσε να είναι μέσω της ενεργοποίησης της οδού σήματος ΝΡ-κΒ.

Εν κατακλείδι, η επίδραση της IL-17A για καρκίνο του τραχήλου κυτταρική εισβολή και μετάσταση μπορεί να οδηγήσει στον εντοπισμό νέων διαγνωστικών δεικτών και θεραπευτικών στόχων.

Ευχαριστίες

το έργο υποστηρίζεται από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (No.81070536) και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Shaanxi (No.2014JM4143).