Αφηρημένο

Τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν αξιοσημείωτες αλλαγές στον κυτταρικό μεταβολισμό, ιδιαίτερα σε θρεπτικά συστατικά προτίμησή του υποστρώματος τους. Εχουμε επινοήσει διάφορες πειραματικές μεθόδους που αναλύουν γρήγορα την μεταβολική ροή υπόστρωμα σε καρκινικά κύτταρα: γλυκόλυση και την οξείδωση των μεγάλων υποστρωμάτων καυσίμου γλυκόζη, γλουταμίνη, και λιπαρά οξέα. Χρησιμοποιώντας τον αναλυτή XF Εξωκυττάρια Flux, αυτές οι μέθοδοι μέτρο, σε πραγματικό χρόνο, ο ρυθμός κατανάλωσης οξυγόνου (OCR) και εξωκυτταρικό ρυθμό οξίνισης (ECAR) των ζωντανών κυττάρων σε μικροπλάκα καθώς ανταποκρίνονται σε υποστρώματα και μεταβολικών παραγόντων όχλησης. Σε πειράματα απόδειξη της αρχής, αναλύσαμε ροής υποστρώματος και μιτοχονδριακή βιοενεργητικές δύο ανθρώπινων κυτταρικών σειρών γλοιοβλαστώματος, SF188s και SF188f, τα οποία προήλθαν από την ίδια γονική κυτταρική γραμμή, αλλά πολλαπλασιάζονται σε αργό και γρήγορους ρυθμούς, αντίστοιχα. Αυτές οι αναλύσεις οδήγησαν σε τρεις ενδιαφέρουσες παρατηρήσεις: 1) δύο κυτταρικές σειρές αναπνεομένων αποτελεσματικά με ουσιαστικές αναπνοή ενδογενές υπόστρωμα? 2) κύτταρα SF188f υπέστη σημαντική μετατόπιση από γλυκολυτικά σε οξειδωτικό μεταβολισμό, μαζί με ένα υψηλό ποσοστό οξείδωσης γλουταμίνης σε σχέση με κύτταρα SF188s? και 3) η μιτοχονδριακή πρωτονίων διαρροή που συνδέονται με την αναπνοή των κυττάρων SF188f αυξήθηκε σημαντικά σε σύγκριση με τα κύτταρα SF188s. Είναι εύλογο ότι η διαρροή πρωτονίων των κυττάρων SF188f μπορεί να διαδραματίσει έναν ρόλο, επιτρέποντας τη συνεχή γλουταμίνη χρησιμοποιείται ως καύσιμο anaplerotic TCA ροή κύκλου με μερική αποσύνδεση του κύκλου TCA από την οξειδωτική φωσφορυλίωση. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά γρήγορη, ευαίσθητη και υψηλής απόδοσης ροής υπόστρωμα μεθόδους ανάλυσης εισαγάγει εξαιρετικά πολύτιμο προσεγγίσεις για την ανάπτυξη μιας καλύτερης κατανόησης των γενετικών και επιγενετικών μονοπάτια που ρυθμίζουν τον κυτταρικό μεταβολισμό, και την ανάπτυξη θεραπειών που στοχεύουν το μεταβολισμό του καρκίνου.

Παράθεση: Pike Winer LS, Wu Μ (2014) ταχεία Ανάλυση γλυκολυτικών και οξειδωτική υποστρώματος Flux των καρκινικών κυττάρων σε μικροπλάκα. PLoS ONE 9 (10): e109916. doi: 10.1371 /journal.pone.0109916

Συντάκτης: Robert W. Sobol, Πανεπιστήμιο του Pittsburgh, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 Αυγ 2013? Δεκτές: 1 του Σεπτεμβρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 31 Οκτωβρίου, 2014

Copyright: © 2014 Pike Winer, Wu. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο διεξήχθη σε και χρηματοδοτήθηκε από Seahorse Bioscience. LSPW είναι υπάλληλος και MW ήταν υπάλληλος κατά το χρόνο της εργασίας στην εταιρεία. Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Lisa S. Pike Winer είναι ένας Εργαζόμενος στο Seahorse Bioscience, Βόρεια Billerica, ΜΑ, ΗΠΑ. Ελάχιστη Γου ήταν υπάλληλος σε Seahorse Bioscience κατά το χρόνο της εργασίας αυτής, Βόρεια Billerica, ΜΑ, USA. Ωστόσο, αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Τα καρκινικά κύτταρα επαναπρογραμματίσει σημαντικά το μεταβολισμό τους να οδηγούν την ανάπτυξη του όγκου και της επιβίωσης. Otto Warburg παρατήρησε πρώτα ότι κάτω από αερόβιες συνθήκες, οι όγκοι είχαν υψηλά ποσοστά γλυκόλυση σε σύγκριση με τον περιβάλλοντα ιστό, ένα φαινόμενο γνωστό ως αποτέλεσμα Warburg, ή αερόβια γλυκόλυση [1]. Έχει διατυπωθεί η άποψη ότι αυξημένη γλυκόλυση και διαταραγμένη αναπνοή μιτοχόνδρια είναι η κύρια αιτία του καρκίνου [2]. Πιο πρόσφατα, ένας μεγάλος όγκος στοιχείων υποδεικνύει ότι τα καρκινικά κύτταρα υφίστανται μεταβολική επαναπρογραμματισμό, οδηγώντας σε εκτεταμένη χρήση και εξάρτηση από γλυκόζη ή γλουταμίνη για την ανάπτυξη και την επιβίωσή τους [3] – [9]. Αυτή η μεταβολική επαναπρογραμματισμό έχει αποδειχθεί ότι είναι το αποτέλεσμα της ενεργοποίησης ογκογονιδίων και /ή απώλεια των λειτουργιών ογκοκατασταλτικών, καθώς και σε απόκριση σε περιβαλλοντικές νύξεις, όλες από τις οποίες ρυθμίζουν την πρόσληψη των θρεπτικών συστατικών του υποστρώματος και του μεταβολισμού [10] – [14]. Ανάλογα με τους συνδυασμούς αυτών των παραγόντων και μια δεδομένη κυτταρική έννοια, τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να εκδηλωθεί μια σειρά από μεταβολικές φαινοτύπων [15], η οποία μπορεί να επηρεάσει είτε την επιλογή της θεραπείας ή την ανταπόκριση στη θεραπεία.

Λόγω των πολυάριθμων τύπων γενετικώς και μεταβολικά ποικίλες καρκινικά κύτταρα, μια ταχεία, κατατοπιστική, σχετικά εύκολο να εκτελέσει και ανάλυση υψηλότερης απόδοσης ροή υπόστρωμα μπορεί να διευκολύνει την καλύτερη κατανόηση των γενετικών και επιγενετικών μονοπάτια που ρυθμίζουν το μεταβολισμό των κυττάρων του καρκίνου, να καθοριστεί αν υπάρχει ένας πεπερασμένος αριθμός των μεταβολικών φαινοτύπων . μεταξύ όλων των τύπων καρκινικών κυττάρων, ανεξάρτητα από προέλευση του ιστού, και την ανακάλυψη παραγόντων που στοχεύουν σε συγκεκριμένα μεταβολικών οδών για τη θεραπεία του καρκίνου

κύτταρα παράγουν ΑΤΡ μέσω δύο μεγάλων οδών που παράγουν ενέργεια: φωσφορυλίωσης γλυκόλυση και οξειδωτική. Η γλυκολυτική οδό μετατρέπει τη γλυκόζη σε πυροσταφυλικό. Μία μοίρα του πυροσταφυλικού είναι η μείωση στη γαλακτικό στο κυτοσόλιο σε μία βιοχημική αντίδραση οξυγόνο ανεξάρτητος με αποτέλεσμα η παραγωγή ΑΤΡ και καθαρή παραγωγή πρωτονίων. Τα πρωτόνια αντλούνται έξω από το κύτταρο με διάφορους μηχανισμούς για τη διατήρηση του ενδοκυτταρικού ρΗ [16] και την εκροή των πρωτονίων στον εξωκυτταρικό χώρο ή το μέσο που περιβάλλει τα κύτταρα προκαλεί εξωκυτταρική οξίνιση [17] – [21]. Το κύριο θρεπτικό συστατικό υποστρωμάτων γλυκόζη, γλουταμίνη, και τα λιπαρά οξέα μπορούν να οξειδωθούν εντελώς σε σε CO

2 και Η

2O μέσω του κύκλου τρικαρβοξυλικού οξέος (κύκλος TCA) το οποίο απαιτεί την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων (ETC) στα μιτοχόνδρια χρησιμοποιώντας οξυγόνο ως τερματικό δέκτης ηλεκτρονίων, και ο οποίος συνδέεται με ΑΤΡ παραγωγή με οξειδωτική φωσφορυλίωση. Το CO

2 που παράγεται μπορεί να μετατραπεί σε όξινο ανθρακικό άλας και τα πρωτόνια, όπως καταλύεται από καρβολικό ανυδράσης [16], μια άλλη πηγή πρωτονίων προκαλεί μέσου οξίνισης. Σε πολλά μη-μετασχηματισμένα διαφοροποιημένα κύτταρα όπως νευρώνες, οξειδωτική φωσφορυλίωση παράγει το μεγαλύτερο μέρος της κυτταρικής ΑΤΡ. Σε αντίθεση, τα καρκινικά κύτταρα εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό γλυκόλυση εκτός από οξειδωτική φωσφορυλίωση για την ΑΤΡ παραγωγή τους [22]. Καθώς και τροφοδοτώντας ΑΤΡ παραγωγή, η γλυκόζη και γλουταμίνη είναι απαραίτητα πηγές άνθρακα που παρέχουν αναβολικές προδρόμους, μερικές από τις οποίες (π.χ., κιτρικό και οξαλοξικό) παράγονται μέσω ενός κόλουρου κύκλου TCA για τη βιοσύνθεση των λιπιδίων, νουκλεϊκά οξέα και αμινοξέα.

Από τα ζωντανά κύτταρα δεν αποθηκεύουν ΑΤΡ, που παράγει συνεχώς και σε πρώτη ζήτηση, και ως εκ τούτου καταναλώνουν συνεχώς οξυγόνο και τα καύσιμα υποστρώματα. Ετσι, η ζήτηση για ΑΤΡ στα κύτταρα (δηλ διαθεσιμότητα ADP) ελέγχει τον ρυθμό κατανάλωσης οξυγόνου. Τα ηλεκτρόνια (ενέργεια) που είναι αποθηκευμένα σε θρεπτικά υποστρώματα εξάγεται μέσω των μιτοχονδριακών αντιδράσεις του κύκλου TCA και μεταφέρονται από τη μειωμένη φορείς ηλεκτρονίων NADH και FADH

2 του Κ.Λ.Π. Καθώς τα ηλεκτρόνια ρέουν κάτω από το ETC, η ενέργεια που απελευθερώνεται χρησιμοποιείται για την άντληση πρωτονίων από τη μήτρα μέσα στο intramembrane χώρο, σχηματίζοντας μια διαμεμβρανική ηλεκτροχημική κλίση πρωτονίων κατά μήκος της μιτοχονδριακής εσωτερικής μεμβράνης. Στο τέλος του ETC, τα ηλεκτρόνια μεταφέρονται σε μοριακό οξυγόνο, μειώνοντας το σε νερό μέσω του τερματικού οξειδάσης κυτοχρώματος C. Όπως πρωτόνια επιστρέψει στην μιτοχονδριακή μήτρα μέσω του συμπλόκου συνθάσης ΑΤΡ, η ενέργεια που αποθηκεύεται στο βαθμίδωση πρωτονίων στη συνέχεια οδηγεί την φωσφορυλίωση της ADP σε ΑΤΡ αναπνοή σύζευξης (μεταφορά ηλεκτρονίων) με την παραγωγή ΑΤΡ. φωσφορυλίωση Οξειδωτική, ωστόσο, είναι ελλιπώς συζευγμένο με την αναπνοή. Τα πρωτόνια μπορούν επίσης να επανέλθουν στην μήτρα μέσω διαύλων πρωτονίων όπως πρωτεΐνες αποσύζευξης (UCP), τα οποία βρίσκονται επί της εσωτερικής μεμβράνης, παρακάμπτοντας συνθάσης ΑΤΡ και διαχέουν την ενέργεια κλίση χωρίς παραγωγή ΑΤΡ σε μια διαδικασία γνωστή ως διαρροή πρωτονίων. Μερικώς μειωμένη είδη οξυγόνου (ROS), όπως το ανιόν υπεροξειδίου μπορεί να παραχθεί σε διαφορετικές θέσεις στο ETC ανάλογα με τις συνθήκες [23]? η διαρροή πρωτονίων έχει θεωρηθεί ένα σημαντικό κυτταρικό μηχανισμό για την προστασία των κυττάρων από τις οξειδωτικές βλάβες με τη μείωση των ROS παράγονται από την ETC [24].

Επειδή η σύνδεση μεταξύ της κατανάλωσης οξυγόνου και εξωκυττάριο οξίνιση με θρεπτικό υπόστρωμα του μεταβολισμού, αύξηση της κατανάλωσης οξυγόνου είναι ένα μέτρο της οξείδωσης του υποστρώματος όταν το υπόστρωμα προστίθεται στα κύτταρα. Ομοίως, η αύξηση του ποσοστού των εξωκυτταρικών οξίνισης με την προσθήκη της γλυκόζης είναι ένα μέτρο της γλυκολυτικής ροής.

Διάφορα παραδοσιακά πειραματικές μεθόδους που αναλύουν το μεταβολισμό του υποστρώματος έχουν συμβάλει στην τρέχουσα κατανόηση του κυτταρικού μεταβολισμού. Αυτές περιλαμβάνουν τη μέτρηση της συσσώρευσης ραδιοεπισημασμένων τελικών προϊόντων, όπως H

2O και CO

2 μεταβολίζονται από υποστρώματα όπως

3Η επισημασμένη γλυκόζη και

14C σεσημασμένη λιπαρά οξέα. Άλλοι που χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως (και αναπτυχθεί πιο πρόσφατα) μεθόδους για τον ποσοτικό προσδιορισμό των μεταβολιτών είναι σταθερά ιχνηθέτες ισότοπο σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας και ανάλυσης NMR, οι οποίες έχουν δώσει λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με το μεταβολισμό του υποστρώματος. Οι τεχνικές αυτές, ωστόσο, μπορεί ωστόσο να είναι είτε εντάσεως εργασίας και δυσκίνητη, και /ή σχετικά απρόσιτη για πολλά εργαστήρια.

Αυτή η μελέτη είχε δύο βασικούς στόχους. Το πρώτο ήταν να εφαρμόζουν τις αρχές που περιγράφονται παραπάνω για να καθορίσει μια σειρά από γρήγορες και εύκολες μεθόδους για να αναλύσει γλυκολυτική ροή και οξειδωτική ροή υπόστρωμα των καρκινικών κυττάρων. Αυτό επιτεύχθηκε με τη μέτρηση της κυτταρικής ρυθμό κατανάλωσης οξυγόνου και εξωκυτταρική οξίνιση με τη χρήση του αναλυτή XF Εξωκυτταρική Flux [22]. Το δεύτερο ήταν να εκτελέσει απόδειξη της αρχής πειράματα μέσω της εφαρμογής των εν λόγω υπόστρωμα ροή μεθόδους, μαζί με την ανάλυση του μιτοχονδριακού βιοενεργειακό σε ανθρώπινα κύτταρα γλοιοβλαστώματος SF188s και SF188f να ανακρίνουν μεταβολικών δικτύων τους.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

κυανιούχο Καρβονυλ 4- (τριφθορομεθοξυ) φαινυλυδραζόνης (FCCP), myxothiazol, αντιμυκίνη Α, ροτενόνη, 2-δεοξυγλυκόζη, οξαμικό, aminooxyacetate, γλυκόζη, πυροσταφυλικό νάτριο και παλμιτικό νάτριο ελήφθησαν από την Sigma (St. Louis , ΜΟ, USA). L-γλουταμίνη ελήφθη από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Ολιγομυκίνη ελήφθη από EMD (San Diego, CA, USA). Αλβουμίνη βόειου ορού κλάσμα V (λιπαρό οξύ υπερ-free) ελήφθη από τη Roche Diagnostics (Indianapolis, ΙΝ, USA). Όλες οι ενώσεις και το μέσο παρασκευάστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών, εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά.

Κυτταρικές γραμμές και κυτταροκαλλιέργεια

κύτταρα SF188 Ανθρώπινα γλοιοβλαστώματος ελήφθησαν από το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια στο Σαν Φρανσίσκο Brain Tissue Bank . Αυτά τα κύτταρα είχαν αρχικά διατηρηθεί, όπως συνιστάται από τον εντολέα, σε ένα μέσο ΜΕΜ που περιέχει 5,5 mM γλυκόζη και 2 mM L-γλουταμίνη. Είχαν προσαρμοσμένη κλιμακωτή σε μέσο ϋΜΕΜ που περιέχει 25 mM γλυκόζη και 6 mM L-γλουταμίνη ως πρότυπο σύστημα για τη μελέτη του μεταβολισμού γλουταμίνης, όπως αναφέρεται [6]. Ως έλεγχος, τα γονικά κύτταρα επίσης προσαρμοσμένη παράλληλα με μέσο DMEM που περιείχε 5,5 mM γλυκόζη και 2 mM L-γλουταμίνη. Ο πρώην απέκτησε μια πολύ πιο γρήγορο ρυθμό ανάπτυξης μετά από 4 εβδομάδες καλλιέργειας στο μέσο και ονομάστηκε SF188f (γρήγορα). Ο τελευταίος, ωστόσο, διατηρείται παρόμοια ποσοστά αύξησης όπως αυτές γονικά κύτταρα διατηρούνται σε ΜΕΜ, και ονομάστηκαν SF188s (αργή). Για να διατηρηθεί η διακριτή φαινότυπο ανάπτυξης τους, SF188s και SF188f κύτταρα ήταν πάντα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 5.5 mM γλυκόζη και 2 mM L-γλουταμίνη και 25 mM γλυκόζη και 6 mM L-γλουταμίνη, αντίστοιχα στους 37 ° C σε επωαστή Forma με 10% CO

2 και 100% υγρασία στους -80% συρροή σε 175 cm

2 φιάλες Τ (Corning). Ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη PC-3 και τον καρκίνο του τραχήλου HeLa κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), και διατηρήθηκαν σε RMPI1640. Όλα τα μέσα κυτταρικής καλλιέργειας συμπληρώθηκαν με 10% λευκωματίνη εμβρύου βοός (FBS, Hyclone, Logan, UT, USA).

μέσο δοκιμασίας XF

Ένα μέσο βάσης χρησιμοποιήθηκε για τις δοκιμασίες που περιγράφονται σ ‘αυτό μελέτη άμεσα ή να συμπληρώνονται με υποστρώματα και συμπαράγοντες, όπως ορίζεται σε κάθε μία από τις ειδικές δοκιμασίες (βλέπε παρακάτω) και για κάθε πείραμα. Το μέσο δοκιμασίας βάση παρασκευάστηκε ως ακολούθως. σκόνη κατά Dulbecco Modified Eagle Medium του (ϋΜΕΜ) (Sigma, αριθμός καταλόγου D5030) ήταν το αρχικό υλικό. Δεν περιέχει γλυκόζη, L-γλουταμίνη, πυροσταφυλικό νάτριο, όξινο ανθρακικό νάτριο, ή ερυθρό φαινόλης, και έχει χαμηλή φωσφορικού (βλέπε Υλικά S1 στο File S1for λεπτομέρειες για την προετοιμασία). Επιπλέον, ένα τροποποιημένο Krebs-Henseleit- ρυθμιστικό διττανθρακικό (ΚΗΒ) το οποίο δεν περιέχει διττανθρακικό και κάτω φωσφορικού μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν (Υλικά S2 κατά αρχείου S1) ως ένα εναλλακτικό μέσο προσδιορισμού για την οξείδωση των λιπαρών οξέων. Η χρήση του ρυθμιστικού αμινοξέος-free, σε αντίθεση με το μέσο βάσης για άλλες δοκιμασίες είναι δυνατή, αλλά, μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικές πειραματικές αποτελέσματα τα οποία μπορεί να απαιτούν διαφορετικές ερμηνείες των δεδομένων. Όλες οι δοκιμασίες που περιγράφονται εδώ εκτελέστηκαν αποκλειστικά στο μέσο βάσης με ενδεικνυόμενη συμπλήρωση, με την εξαίρεση της οξείδωσης λιπαρών οξέων τα οποία διεξήχθη σε τόσο μέσο βάσης και ΚΗΒ, δίδοντας παρόμοια αποτελέσματα.

Παρασκευή παλμιτική-BSA προϊόν σύζευξης

παλμιτικό νάτριο διαλύθηκε με θέρμανση αυτό στους 68 ° C σε διάλυμα χλωριούχου νατρίου 150 mM. Στη συνέχεια δεσμεύεται με BSA σε διάλυμα σε γραμμομοριακή αναλογία 6:01. Το πλήρες πρωτόκολλο περιγράφεται στο Υλικό S3 στο S1 αρχείου.

Μέτρηση του ρυθμού κατανάλωσης οξυγόνου και εξωκυττάριο ποσοστά οξίνισης

OCR και ECAR μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του αναλυτή XF24 ή XF96 Εξωκυττάρια Flux (Seahorse Bioscience , North Billerica, ΜΑ) όπως περιγράφεται [22]. Εν συντομία, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε XF24 (V7) ή πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας XF96 (V3) πολυστυρενίου (ιππόκαμπος Bioscience, North Billerica). κύτταρα SF188s σπάρθηκαν σε 30.000 /φρεάτιο (πλάκα XF24) ή 20.000 /φρεάτιο (πλάκα XF96) και κύτταρα SF188f στα 20.000 /φρεάτιο (πλάκα XF24) ή 15.000 /φρεάτιο (πλάκα XF96), αντίστοιχα. κύτταρα PC-3 και HeLa απλώθηκαν σε 25000 και 30000 κύτταρα ανά φρεάτιο, αντίστοιχα, σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας XF24. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 έως 28 ώρες σε υγροποιημένο επωαστή 37 ° C με 10% CO

2 (μέτρια DMEM) ή 5% CO

2 (RMPI1640 και ΜΕΜ μέσο), αντίστοιχα. Επειδή οι δύο κυτταρικές γραμμές πολλαπλασιάζονται με διαφορετικούς ρυθμούς κατά την περίοδο επώασης 24-28 ώρες, SF188s και SF188f κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θρυψίνη και στη συνέχεια μετρήθηκαν για να προσδιοριστεί ο αριθμός των κυττάρων σε κάθε φρεάτιο μετά από μία δοκιμασία. Αυτές οι μετρήσεις κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν για την κανονικοποίηση είτε OCR ή ECAR. βιωσιμότητες τους, όπως προσδιορίζεται μετά τις δοκιμασίες, ήταν σχεδόν δυσδιάκριτες ανεξάρτητα από την παρουσία ή απουσία εξωγενούς υποστρώματα ή αναστολείς του μεταβολισμού στο μέσο δοκιμής. Πριν από την εκτέλεση μιας δοκιμασίας, το μέσο ανάπτυξης στα φρεάτια μιας πλάκας κυτταρικής XF ανταλλάχθηκε με το κατάλληλο μέσο προσδιορισμού για την επίτευξη τουλάχιστον 1:1000 αραίωση του μέσου ανάπτυξης. 600 μL (XF24) ή 150 μL (XF96) του μέσου προσδιορισμού προστέθηκε σε κύτταρα για μία δοκιμασία XF. Ενώ διαβαθμίστηκαν φυσίγγια αισθητήρα, οι πλάκες των κυττάρων επωάστηκαν σε 37 ° C /μη-CO

2 εκκολαπτήριο για 60 λεπτά πριν από την έναρξη μιας δοκιμασίας. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν στους 37 ° C. Κάθε κύκλος μέτρησης αποτελείτο από ένα χρόνο ανάμιξης από 3 λεπτά και μια περίοδο απόκτησης δεδομένων 3 λεπτά (13 σημεία δεδομένων) για την XF24, και 2 λεπτά και 4 min για το XF96. OCR και ECAR σημεία δεδομένων αναφέρονται στις μέσες τιμές κατά τη διάρκεια των κύκλων της μέτρησης. Όλες οι ενώσεις που παρασκευάζονται σε κατάλληλες συγκεντρώσεις σε επιθυμητό μέσο προσδιορισμού και ρυθμίστηκαν σε ρΗ 7,4. Ένας όγκος 75 μL για XF24 (25 μL για XF96) της ένωσης προστέθηκαν σε κάθε θυρίδα έγχυσης. Σε ένα τυπικό πείραμα, 3 βασικές μετρήσεις ελήφθησαν πριν από την προσθήκη οποιασδήποτε ένωσης, και 3 μετρήσεις αντίδρασης ελήφθησαν μετά την προσθήκη του κάθε ένωση. OCR και ECAR αναφέρθηκαν ως απόλυτες τιμές (pmoles /min για OCR και mpH /min για ECAR) ή κανονικοποιημένη έναντι αριθμού των κυττάρων, ή να εκφράζονται ως ποσοστό της κατανάλωσης βασικής γραμμής οξυγόνου. Σε αυτή τη μελέτη, βασική OCR ή ECAR (ένας τεχνικός όρος) αναφέρεται στις τιμές που ξεκινούν πριν από την προσθήκη ενός παράγοντα, ο οποίος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για συγκρίσεις με τις εν λόγω τιμές μετά την προσθήκη. Σε αντίθεση, η βασική OCR ή ECAR (ένα βιολογικό όρος) αναφέρεται σε OCR ή ECAR που συμβαίνουν σε κύτταρα σε κατάσταση ηρεμίας για να διατηρηθεί βασική λειτουργία κυττάρου. Εκτός εάν ορίζεται διαφορετικά, η τρίτη μέτρηση της βασικής γραμμής ή μετά την προσθήκη κάθε υπόστρωμα ή ένωση που χρησιμοποιείται για να δημιουργήσει την απόλυτη OCR ή ECAR τιμές. Επίσης, το ποσοστό των τιμών βασικής γραμμής OCR υπολογίστηκε ως OCR στην τρίτη μέτρηση μετά από μια ένεση παράγοντα διαιρείται με το OCR αμέσως πριν από την ένεση. Κάθε στοιχείο προσδιορίστηκε ελάχιστα εις τριπλούν.

XF υποστρώματος Flux συνθήκες δοκιμασίας

γλυκολυτική ροή και γλυκολυτικό ικανότητα.

Το μέσο προσδιορισμού αποτελείται από το μέσο βάσης συμπληρώνεται με 2 mM L -γλουταμίνη. Γλουταμίνη απαιτείται για την επίτευξη του μέγιστου ρυθμού γλυκόλυση για ορισμένα, αλλά όχι όλες τις κυτταρικές σειρές. Το ίδιο μέσο χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορισθεί γλυκολυτικά ικανότητα. Η συγκέντρωση της γλυκόζης προστίθεται για να αρχίσει γλυκόλυση και τη μέτρηση γλυκολυτικό ικανότητα ήταν 10 mM, μεγαλύτερη από το σημείο κορεσμού υπό δύο προϋποθέσεις.

Γλυκόζη οξείδωση.

Το μέσο προσδιορισμού ήταν το βασικό μέσο χωρίς εξωγενή συμπλήρωση του υποστρώματος καυσίμου. Η συγκέντρωση της γλυκόζης προστίθεται για να αρχίσει η οξείδωση της γλυκόζης ήταν 10 mM, η οποία καθορίστηκε σε προκαταρκτικά πειράματα για να είναι πάνω από τον κορεσμό.

οξείδωση γλουταμίνη.

Το μέσο προσδιορισμού ήταν το βασικό μέσο χωρίς εξωγενή καυσίμων υπόστρωμα. Η συγκέντρωση της γλουταμίνης προστίθεται στα κύτταρα για την κίνηση οξείδωση γλουταμίνη 4 mM, η οποία ήταν επίσης προκαθορισμένο να είναι πάνω από τον κορεσμό.

οξείδωση των λιπαρών οξέων.

Το μέσο δοκιμασίας ήταν το μέσο βάσης (ή ΚΗΒ) συμπληρωμένο με 5,5 mM γλυκόζη και 50 μΜ καρνιτίνης (που απαιτείται για τη μεταφορά λιπαρών οξέων μακράς αλυσίδας στα μιτοχόνδρια). Τα λιπαρά οξέα περιλαμβάνουν παλμιτικό δοκιμαστεί μακράς αλύσου λιπαρό οξύ, οκτανοϊκός λιπαρού οξέος μέσης αλύσου, και βουτυρικό λιπαρό οξύ βραχείας αλύσου. Μπορούν τιτλοποιήθηκαν για τις συγκεντρώσεις τόνωση μέγιστη απόκριση OCR. Η συγκέντρωση εργασίας παλμιτικό συζευγμένο με BSA ήταν 150 μΜ, και οκτανικού 1 mM, η οποία ήταν επίσης πάνω από τον κορεσμό.

Είναι ζωτικής σημασίας ότι οι ανωτέρω συνθήκες προσδιορισμού τηρούνται αυστηρά. Οποιαδήποτε μεταβολή στη σύνθεση μέσο προσδιορισμού μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικές ερμηνείες και ιδέες σε κυτταρικές μεταβολικές δικτύου. Συγκεντρώσεις κορεσμού υποστρώματος και οι βέλτιστες συγκεντρώσεις ένωσης καθορίστηκαν πραγματοποιώντας πειράματα τιτλοδότησης όπως περιγράφεται στο Υλικά και S4 S5 στο S1 αρχείου. Η επίδραση της συνθήκες δοκιμασίας για την ερμηνεία των πειραματικών αποτελεσμάτων θα περιγραφεί αλλού.

Οι αριθμοί κυττάρων

SF188s και SF188f κύτταρα αποκολλήθηκαν με θρυψίνη-ΕϋΤΑ και συλλέχθηκαν αμέσως μετά από μια δοκιμασία XF. Ο αριθμός των κυττάρων σε κάθε φρεάτιο προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο ViCell trypan blue μετρητή (Beckman-Coulter, Fullerton, CA), και χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει OCR και ECAR όπως υποδεικνύεται στις λεζάντες σχήμα.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση, με τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις για κάθε σημείο δεδομένων. Εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά, μια αντιστοιχισμένη Φοιτητών

t

δοκιμή πραγματοποιήθηκε για κάθε πειραματική ομάδα να αξιολογήσει τη στατιστική σημαντικότητα έναντι των αντίστοιχων ελέγχων.

Αποτελέσματα

γλυκόλυση και γλυκολυτικό ικανότητα

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι λογαριασμών γλυκόλυση για περίπου 80% των συνολικών ECAR σε έναν αριθμό καρκινικών κυττάρων, όπως προσδιορίζεται με δύο μεθόδους: α) την αφαίρεση της γλυκόζης από το μέσο προσδιορισμού και β) την προσθήκη γλυκολυτική οδό αναστολείς όπως εξοκινάση αναστολέα 2- ΓΔ και γαλακτικής αφυδρογονάσης (LDH) αναστολέα οξαμικός [22]. Το υπόλοιπο 20% του ECAR μπορεί να αποδοθεί σε άλλες μεταβολικές διεργασίες, όπως η CO κύκλο TCA

2 εξέλιξης. Για να μετρηθεί γλυκόλυση χρησιμοποιώντας ECAR με μεγαλύτερη ακρίβεια και εύκολα, πήραμε την ακόλουθη προσέγγιση. Γλυκόζη προστίθεται σε κύτταρα που επωάζονται σε μέσο χωρίς γλυκόζη, αλλά συμπληρωμένο με γλουταμίνη (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Η αύξηση ECAR μετά την προσθήκη της γλυκόζης καθορίζει το ποσοστό γλυκόλυση. Μια επακόλουθη προσθήκη ενός αναστολέα γλυκόλυσης εξαλείφει την αύξηση ECAR γλυκόζης που προκαλείται. Κάθε οξίνιση λόγω άλλων μεταβολικών διεργασιών όπως η

2 απελευθέρωσης (από οποιαδήποτε υπόστρωμα αλλά γλυκόζη) CO κύκλος TCA ανιχνεύεται ως ECAR πριν από την προσθήκη γλυκόζης. Η απόκριση στη γλυκόζη OCR, παρακολουθούνται ταυτόχρονα με ECAR, χρησιμεύει ως δείκτης του κατά πόσον η γλυκόζη είναι επίσης καταβολίζεται μέσω μιτοχονδριακή αναπνοή (Σχήμα 1Α).

A. Σχηματική απεικόνιση της γλυκολυτικής οδού. NADH που παράγονται στην κυτοσόλη, όπως η γλυκόζη μετατρέπεται σε πυροσταφυλικό και αναγεννάται από LDH στο κυτταρόπλασμα. B. Κινητική ECAR απόκριση των κυττάρων SF188s σε γλυκόζη (10 mM) και 2-DG (100 mM) ή οξαμικό (100 mM), αντίστοιχα. κύτταρα SF188s απλώθηκαν σε 30000 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία κυτταρικής καλλιέργειας XF24 V7 24-28 ώρες πριν από την δοκιμασίες. Το μέσο δοκιμασίας ήταν υπόστρωμα μέσο ελεύθερο βάσης (όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι) συμπληρωμένο με 2 mM γλουταμίνη. Η αξία ECAR δεν ομαλοποιήθηκε. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τουλάχιστον τρία εμφανίζεται εδώ. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει μέση ± SD, η = 4. C. απόκριση ECAR κυττάρων HeLa σε γλυκόζη (10 mM), 2-DG (100 mM) και αντιμυκίνη (1 μΜ). Εισάγετε: την απόκριση OCR στα ίδια πειράματα που δείχνουν την επίδραση Crabtree και ότι η γλυκόζη δεν αυξήθηκε OCR. κύτταρα HeLa απλώθηκαν σε 30000 /φρεάτιο σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας XF24 24-28 ώρες πριν από την δοκιμασίες. ECAR ή OCR τιμές δεν εξομαλύνθηκαν. Το μέσο δοκιμασίας ήταν υπόστρωμα μέσο ελεύθερο βάσης (όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι) συμπληρωμένο με 2 mM γλουταμίνη. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τουλάχιστον τρία εμφανίζεται εδώ. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει μέση τιμή ± SD, η = 5.

Η

Πραγματοποιήσαμε το πείραμα χρησιμοποιώντας SF188s και κύτταρα HeLa. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, εκτός από τη γλυκόζη σε κύτταρα SF188s προκάλεσε μια στιγμιαία αύξηση ECAR, 38 ± 4 mpH /min (ECAR μέτρησης 6 λιγότερο από μέτρησης 3), η οποία στη συνέχεια καταργήθηκε με την προσθήκη αναστολέων γλυκόλυση, είτε 2-DG ή οξαμικό. Αυτού του πειράματος έδειξαν ότι η εξωγενώς προστιθέμενη γλυκόζη κατανεμημένα σε γαλακτικό (γιατί αναστολή LDH από Οξαμικός μειώνει ECAR παρόμοια με 2-DG), προκαλώντας αύξηση ECAR και ως εκ τούτου την επικύρωση πειραματικό σχεδιασμό μας. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε κύτταρα HeLa (Σχ 1Γ.), Τα οποία ήταν σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη μας [22], καθώς και με μια σειρά από πρόσφατες εκθέσεις που δείχνουν ότι η απόκριση ECAR παράλληλη με εκείνη της παραγωγής γαλακτικού οξέος [25] – [27]. Πριν από την προσθήκη της γλυκόζης στα κύτταρα καθώς επίσης και μετά την προσθήκη 2-DG ή οξαμικό, παρατηρήσαμε ξανά μια μικρή ECAR, 6 ± 1 mpH /min και 10 ± 2 mpH /min (σε μέτρηση 3), αντίστοιχα σε SF188s και Τα κύτταρα HeLa (Εικόνα 1Β και Γ). Αναφερόμαστε σε αυτό το μικρό αλλά μετρήσιμη ECAR ως μη γλυκόλυσης οξίνιση. Η απάντηση OCR έδειξαν ότι η έγχυση γλυκόζης, όχι μόνο απέτυχε να προκαλέσει μια αύξηση, αλλά στην πραγματικότητα προκάλεσε μία μικρή μείωση στην OCR (σχήμα 1Γ), η οποία είναι παρόμοια με την επίδραση Crabtree, παρατηρήθηκε για πρώτη φορά σε καρκινικά κύτταρα από Crabtree το 1920 [ ,,,0],28].

Οι δύο πιο σημαντικές πηγές πρωτονίων που μπορεί να συμβάλει στην μη γλυκολυτικό οξίνιση είναι ο κύκλος TCA και την κατανομή των ενδοκυττάριων γλυκογόνου, δηλαδή, γλυκογονόλυση [20]. Για να προσδιοριστεί η συμβολή της εξέλιξης

2 CO κύκλο TCA, χρησιμοποιήσαμε έναν αναστολέα III συγκρότημα αντιμυκίνη να σταματήσει τη ροή ηλεκτρονίων και έτσι η ροή του κύκλου TCA σε κύτταρα HeLa. Γλυκόζη προστέθηκε πρώτα να ξεκινήσει γλυκόλυση, που ακολουθείται από 2-ΓΔ να την καταργήσει, αφήνοντας πίσω μη γλυκόλυσης ECAR. Η τελική προσθήκη αντιμυκίνη σταματήσει τον κύκλο TCA από την παραγωγή CO

2. Αν και ένα υπόλειμμα παρέμεινε, 4 ± 1,4 mpH /min, αντιμυκίνη εξαλειφθεί περίπου το ήμισυ του μη γλυκολυτικό ECAR (Σχήμα 1C), επιβεβαιώνοντας την συμβολή του CO κύκλου TCA

2 προερχόμενο πρωτόνιο σε μη γλυκολυτικά οξίνιση. Δοκιμάσαμε το αν το ECAR αντιμυκίνη-ανθεκτικά οφειλόταν σε γλυκογονόλυσης χρησιμοποιώντας CP91149, έναν αναστολέα της φωσφορυλάσης του γλυκογόνου (το πρώτο ένζυμο διάσπασης γλυκογόνου), αλλά δεν παρατηρήσαμε κάποια σημαντική επίδραση του CP91149 σε μη γλυκολυτικά οξίνιση (τα δεδομένα δεν φαίνονται) , οδηγώντας μας στο συμπέρασμα ότι η υπολειμματική μη γλυκόλυσης ECAR έπρεπε να εξηγείται από άλλες μεταβολικές διεργασίες, όπως είναι οι αντιδράσεις αποκαρβοξυλίωση καταλύεται από γλυκόζης-6 αφυδρογονάσης φωσφορικού άλατος και /ή αφυδρογονάση πυροσταφυλικού. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν και πάλι ότι οι λογαριασμοί γλυκόλυση για την πλειοψηφία των ECAR παρατηρείται σε καρκινικά κύτταρα, και διαπίστωσε ότι TCA που προέρχονται CO

2 αποτελεί πρωταρχικό συμβολή των μη γλυκόλυσης οξίνιση.

γλυκολυτικής ροής προσδιορίζεται

in vitro

στα επίπεδα του ατμοσφαιρικού οξυγόνου αντανακλά το βασικό ρυθμό γλυκόλυση. Όταν τα κύτταρα βιώνουν απώλεια μιτοχονδριακής παραγωγής ΑΤΡ οφείλεται στην αναστολή της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης, είτε σε χαμηλή τάση οξυγόνου ή με ολιγομυκίνη, αυτοί αυξάνουν γλυκολυτικής ροής τους και να κάνουν περισσότερο ΑΤΡ από γλυκολυτική οδούς για τη διατήρηση της ομοιόστασης κυτταρική ΑΤΡ [22]. Αναφερόμαστε σε αυτό το αυξημένο γλυκολυτικής ροής σε απόκριση σε ανεπάρκεια σε μιτοχονδριακή παραγωγή ΑΤΡ ως γλυκολυτικά ικανότητα. Πειραματικά, ορίζουμε γλυκολυτικό ικανότητα ως γλυκόζη που προκαλείται ECAR από μιτοχονδριακό ΑΤΡ ολιγομυκίνη αναστολέας συνθάσης.

Για τον προσδιορισμό τόσο γλυκολυτική ροή και γλυκολυτικό ικανότητα του ίδιου πληθυσμού κυττάρων σε ένα πείραμα, μετρήθηκε ECAR ενώ διαδοχικά ενέσιμη γλυκόζη, ολιγομυκίνης, και 2-DG. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, προσθέτοντας γλυκόζη στα κύτταρα HeLa, όπως αναμενόταν, το έναυσμα για μια γλυκολυτικής ροής 19 ± 0,9 mpH /min (EACR σε μέτρηση 6 μείον ότι στο μέτρηση 3) σε κύτταρα HeLa. Η μετέπειτα προσθήκη ολιγομυκίνη προκάλεσε περαιτέρω αύξηση στην ECAR σε 44 ± 3,8 mpH /min (ECAR σε μέτρηση 9 μείον ότι στο μέτρηση 3), υποδεικνύοντας μια υπερυψωμένη ροής γλυκόζης προς γαλακτικό και αποκαλύπτοντας το γλυκολυτικό ικανότητα των κυττάρων HeLa. Η τελική προσθήκη του αναστολέα γλυκόλυσης 2-DG κατήργησε τη συνολική γλυκόλυσης (Σχήμα 2Α). Η υπολογιζόμενη γλυκολυτικής ροής και γλυκολυτικής χωρητικότητα από το πείραμα γλυκόλυση δείχνονται στο Σχήμα 2Β.

A. Κινητική αντίδραση ECAR κυττάρων HeLa σε γλυκόζη (10 mM), ολιγομυκίνης (2 μΜ), και 2-DG (100 mM). Εισαγωγή δείχνει απόκριση OCR σε απόκριση της γλυκόζης και ολιγομυκίνη. κύτταρα HeLa απλώθηκαν σε 30000 /φρεάτιο σε πλάκες κυτταρικής καλλιέργειας XF24 V7 24-28 ώρες πριν από την δοκιμασίες. Το μέσο δοκιμασίας ήταν το υπόστρωμα μέσο άνευ βάσεως συμπληρωμένο με 2 mM γλουταμίνη. ECAR ή OCR τιμές δεν εξομαλύνθηκαν. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από σε 5 παρουσιάζεται εδώ. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει μέση ± SD, η = 4. B. Υπολογίστηκε γλυκολυτικής ροής, γλυκολυτικά ικανότητα. Γλυκολυτικής ροής είναι η διαφορά μεταξύ των ECARs μέτρησης 6 και μέτρηση 3. Ομοίως, γλυκολυτικά ικανότητα περιγράφει τη διαφορά μεταξύ του ECAR μέτρησης 9 και ότι μέτρησης 3. * ρ & lt?. 0.05

Η

Δύο πειραματικές προϋποθέσεις πρέπει να πληρούνται στο παραπάνω πείραμα. Πρώτον, η συγκέντρωση θα πρέπει ολιγομυκίνης μέγιστο αναστέλλουν αναπνοή. Αυτό επιτεύχθηκε με την επιλογή της συγκέντρωσης ολιγομυκίνη που είχε ως αποτέλεσμα μέγιστη αναστολή OCR σε ένα πείραμα τιτλοδότησης. Για παράδειγμα, 0,5 μΜ ολιγομυκίνη βρέθηκε να είναι επαρκής για την επίτευξη της μέγιστης αναστολής του OCR σε κύτταρα HeLa (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Δεύτερον, είναι κρίσιμο να εξασφαλισθεί ότι η παροχή εξωγενούς γλυκόζης κορεσμό, επιτρέποντας στο γλυκολυτικό μηχανήματα να είναι ο περιοριστικός παράγοντας. Η συγκέντρωση κορεσμού της γλυκόζης για την επίτευξη μέγιστης απόκρισης ECAR προσδιορίστηκε σε ένα πείραμα τιτλοδότησης συγκέντρωση γλυκόζης, στην οποία αυξανόμενες συγκεντρώσεις γλυκόζης προστέθηκαν στα κύτταρα, που ακολουθείται από την προσθήκη του ελέγχου ή ολιγομυκίνη σε συγκέντρωση που αναστέλλει μέγιστα αναπνοή. Σε κύτταρα HeLa, για παράδειγμα, βρήκαμε ότι ECAR αυξήθηκε συνεχώς μέχρι η συγκέντρωση της γλυκόζης που επιτεύχθηκε 5 mM, μετά την οποία δεν υπήρξε περαιτέρω αύξηση ECAR (Σχήμα S1). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με μια δωδεκάδα μετασχηματισμένο και μη μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Εμείς επιλέξαμε ένα υψηλότερο-από-συγκέντρωση κορεσμού 10 mM ως το πρότυπο συγκέντρωσης για να καθοριστεί τόσο γλυκολυτική ροή και γλυκολυτικό ικανότητα.

γλυκόζη οξείδωση

γλυκόζης που προέρχεται από πυροσταφυλικό μπορούν επίσης να εισάγετε τα μιτοχόνδρια, όπου μετατρέπεται σε ακετυλο CoA από πυροσταφυλική αφυδρογονάση και εισέρχεται στον κύκλο TCA μέσω κιτρική συνθάση (ή ως οξαλοξικό μέσω πυροσταφυλικής καρβοξυλάσης [29]. Η ρίζα ακετυλίου τελικά οξειδώνεται προς CO

2 και Η

2O (Σχήμα 3Α) . Η διαδικασία της κατανάλωσης οξυγόνου από την οξείδωση της γλυκόζης πρώτα σε πυροσταφυλικό και στη συνέχεια σε CO

2 και H

2O αναφέρεται εδώ ως οξείδωση της γλυκόζης.

Ένα. Σχηματική απεικόνιση της βιοχημικής οδού, για την οξείδωση της γλυκόζης . Η NADH παράγεται στο κυτταρόπλασμα, όπως η γλυκόζη μετατρέπεται σε πυροσταφυλικό εισάγεται στα μιτοχόνδρια μέσω της σαΐτας μηλικού-ασπαρτικού και αναγεννήθηκε δια της ETC για να διατηρηθεί συνεχής οξείδωση της γλυκόζης. απόκριση Β Kinetic OCR από PC-3 κύτταρα σε γλυκόζη (10 mM )? απόκριση C. OCR σε γλυκόζη (10 mM), ολιγομυκίνης (1 μΜ) και FCCP (0,3 μΜ). κύτταρα PC-3 καλλιεργήθηκαν σε 25,000 /φρεάτιο σε πλάκες καλλιέργειας XF24 V7. Το μέσο δοκιμασίας ήταν το υπόστρωμα μέσο χωρίς βάση. Οι τιμές OCR δεν ομαλοποιήθηκαν. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τρία παρουσιάζεται εδώ. Κάθε σημείο δεδομένων αντιπροσωπεύει μέση ± SD, η = 4.

Η

Πειραματικά, χρησιμοποιήσαμε το OCR που προκαλείται από γλυκόζη για να μετρηθεί οξείδωση της γλυκόζης. Για να καθοριστεί η δοκιμασία οξείδωση της γλυκόζης, εμείς επιλέξαμε PC-3 κύτταρα που οξειδώνουν ενεργά γλυκόζη. Για τον προσδιορισμό της οξείδωσης της γλυκόζης, 10 mM γλυκόζη προστέθηκε στα κύτταρα σε μέσο δοκιμασίας που δεν περιέχει γλυκόζη ή γλουταμίνη (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, η προσθήκη της γλυκόζης σε κύτταρα PC-3 προκάλεσε την άμεση αύξηση της OCR, 45 ± 11 pmol /min (OCR σε μέτρηση 6 μείον ότι στο μέτρηση 3), υποδεικνύοντας ροή γλυκόζης στον κύκλο TCA, και τελικά , η ETC για την πλήρη οξείδωση. Αυτό το πειραματικό σχέδιο παρέχεται μία ποσοτική μέτρηση της οξείδωσης της γλυκόζης στο πλαίσιο της παρούσας πειραματική συνθήκη. Σε ένα σχέδιο παραλλαγή, PC-3 κύτταρα εκτέθηκαν σε γλυκόζη, ολιγομυκίνης, και FCCP διαδοχικά, με 3 μετρήσεις πριν από κάθε ενώσεως προσθήκης και μετά από κάθε προσθήκη ένωσης. FCCP αποσυνδέει αναπνοή από οξειδωτική φωσφορυλίωση, επιτρέποντας την οξείδωση οποιουδήποτε οξειδώσιμο υπόστρωμα που υπάρχει στο μέσο της δοκιμασίας να συμβεί. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, FCCP διεγείρεται μια ακίδα σε OCR μετά την προσθήκη γλυκόζης, αλλά όχι ο έλεγχος, επιβεβαιώνοντας περαιτέρω ότι οι βιοχημικές οδοί για την οξείδωση της γλυκόζης ήταν ενεργά σε κύτταρα PC-3. Η απόκριση OCR να FCCP επιβεβαιώνει και παρέχει μια ημι-ποσοτική αξιολόγηση της ικανότητας των κυττάρων να οξειδώνουν γλυκόζη. Σε αυτό το πειραματικό σχεδιασμό, τα κύτταρα προ-επωάστηκαν σε υπόστρωμα μέσο ελεύθερο βάση για 60 λεπτά πριν από την μία δοκιμασία, οπότε υπάρχει μια πιθανότητα ότι μπορεί να έχουν τονισθεί και να μεταβληθεί απόκρισή τους σε γλυκόζη προσθήκης.