Αφηρημένο

Ο μηχανισμός του συνδέτη (TRAIL) αντίσταση που επάγει την απόπτωση παράγοντα νέκρωσης όγκων που σχετίζονται με τα καρκινικά κύτταρα δεν είναι πλήρως κατανοητός. Εδώ, αποδεικνύουμε ότι η Akt μονοπάτι επιβίωσης παίζει σημαντικό ρόλο στην αντίσταση TRAIL σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι η θεραπεία TRAIL ενεργοποιεί το Akt μονοπάτι επιβίωσης και ότι η αναστολή αυτού του μονοπατιού από το LY294002 αναστολέα ΡΙ3Κ ή knockdown του Akt ευαισθητοποιεί ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων σε TRAIL. Από Akt ρυθμίζεται αρνητικά από το ογκοκατασταλτικό ΡΤΕΝ, εξετάσαμε την ευαισθησία TRAIL σε επιθηλιακά κύτταρα ΡΤΕΝ knockdown προστάτη ποντικού και διαπίστωσε ότι το ΡΤΕΝ

– /- κύτταρα είναι πιο ανθεκτικά από

+ /+ κύτταρα ΡΤΕΝ ενώ η ευαισθησία του PTEN

+/- κύτταρα μειώθηκε στο μεταξύ. Περαιτέρω, δείξαμε ότι η υπερέκφραση ενός μεταλλαγμένου ΡΤΕΝ προσδίδει ανθεκτικότητα TRAIL σε ΡΤΕΝ

+ /+ κύτταρα, υποστηρίζοντας ένα ρόλο ΡΤΕΝ στην ευαισθησία TRAIL. Σε ανθεκτικά TRAIL κύτταρα T47D του μαστού, η υπερέκφραση της μεταλλαγμένης ΡΤΕΝ αυξήθηκε περαιτέρω την αντοχή τους σε TRAIL. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η αδρανοποίηση των λειτουργικών ΡΤΕΝ και την επακόλουθη ενεργοποίηση του μονοπατιού Akt αποτρέπει TRAIL απόπτωση, που οδηγεί σε αντίσταση TRAIL. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αντίσταση TRAIL μπορεί να ξεπεραστεί με τη στόχευση PTEN ή το Akt μονοπατιού επιβίωσης στα καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Xu J, Zhou JY, Wei WZ, Wu GS (2010) Η ενεργοποίηση της Akt επιβίωσης μονοπάτι Συμβάλλει στην TRAIL Αντίσταση στα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 5 (4): e10226. doi: 10.1371 /journal.pone.0010226

Επιμέλεια: Dong-Yan Jin, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 22 Φεβρουαρίου 2010? Αποδεκτές: 19 Μάρτη 2010? Δημοσιεύθηκε: 19, Απριλίου, 2010

Copyright: © 2010 Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από επιχορήγηση ΝΙΗ /NCI R01 CA100073 και Υπουργείο άμυνας μαστού Πρόγραμμα Καρκίνου W81XWH-07-1-05-21. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

TRAIL (ή Apo2L) είναι ένα μέλος της υπεροικογένειας παράγοντα νέκρωσης όγκων που επάγει εκλεκτικά απόπτωση σε καρκινικά αλλά όχι τα φυσιολογικά κύτταρα, γεγονός που καθιστά μια ελκυστική παράγων για θεραπεία του καρκίνου. TRAIL επάγει απόπτωση μέσω ενεργοποίησης των υποδοχέων θανάτου του DR4 (TRAIL-R2) και /ή DR5 (KILLER, TRAIL-R1, TRICK2) [1], [2], [3], [4]. Όταν TRAIL δεσμεύεται με DR4 και /ή υποδοχείς DR5, οι υποδοχείς θανάτου γίνονται τριμερισμένες και στη συνέχεια προσλαμβάνουν την πρωτεΐνη προσαρμογέα FADD (Fas-πρωτεΐνη που συνδέεται με τον τομέα του θανάτου) και προκασπάσης 8 ή προκασπάσης 10 για να σχηματίσει το DISC, οδηγώντας σε ενεργοποίηση της κασπάσης 8, [1 ], [2]. Η ενεργοποιημένη κασπάση 8 μπορεί να ενεργοποιήσει άμεσα τα κασπάσες ενέργειας 3, 6 και 7 για να προκαλέσει απόπτωση ή έμμεσα επάγει την απόπτωση μέσω της tBid επαγόμενη κασπάσης 9 μεσολάβηση μιτοχονδριακής απόπτωσης μονοπάτι [2], [4].

Αν και TRAIL είναι ένα ελκυστικός θεραπευτικός παράγων πολλά καρκινικά κύτταρα είναι ανθεκτικά σε αυτόν τον παράγοντα. [2] Οι μηχανισμοί αντίστασης TRAIL δεν είναι πλήρως κατανοητοί, αλλά μπορεί να συμβεί σε πολλαπλά επίπεδα από τους υποδοχείς του να εκτελεστής κασπάσες εντός του μονοπατιού σηματοδότησης [2], [4]. Στο επίπεδο του υποδοχέα, οι μεταλλάξεις σε DR4 και DR5 έχουν βρεθεί σε μερικούς όγκους, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων του μαστού και του πνεύμονα [4]. Αυξημένη έκφραση υποδοχείς δολώματα και μειωμένη έκφραση DR4 /DR5 έχουν συσχετιστεί με αντίσταση TRAIL, αν και άλλες μελέτες έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης των υποδοχέων TRAIL δεν συσχετίζονται με την ευαισθησία TRAIL. Κατά το θάνατο-επαγωγής σύμπλεγμα σηματοδότησης (DISC) επίπεδο, c-FLIP πιστεύεται ότι είναι ένας σημαντικός αναστολέας για TRAIL σηματοδότηση [5], [6]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι τα ευαίσθητα TRAIL μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων (NSCLC) συγκεντρώνουν DISC στην λιπιδίων σχεδίες της πλασματικής μεμβράνης που οδηγεί σε κασπάσης 8 ενεργοποίηση, ενώ συναρμολόγηση DISC μη σχεδία οδηγεί στην πρόσληψη γ-FLIP και RIP και η ενεργοποίηση του προ-επιβίωσης οδούς όπως NF-κΒ και ERK1 /2 σηματοδότηση μονοπατιών [7]. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι η αντι-αποπτωτικά μέλη της οικογένειας Bcl-2, συμπεριλαμβανομένων των Bcl-2 και Mcl-1, συμμετέχουν επίσης στην αντίσταση TRAIL [8], [9]. Η ενεργοποίηση των άλλων οδών επιβίωσης, συμπεριλαμβανομένων των οδών Akt και NF-κΒ οδηγεί στην κυτταρική επιβίωση και χημειοαντίσταση [10]. Σταθερά, έχει δειχθεί ότι η ενεργοποίηση της Akt μονοπάτι συνδέεται στενά με αντοχή φαρμάκου, συμπεριλαμβανομένης της αντοχής TRAIL [11], [12]. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο η Akt μονοπάτι προκαλεί αντίσταση TRAIL δεν είναι πλήρως κατανοητή.

Ο ΡΙ3Κ /Akt μονοπατιού σηματοδότησης είναι ένα πρωτότυπο μονοπάτι επιβίωσης που παίζει κεντρικό ρόλο σε διάφορες κυτταρικές λειτουργίες, περιλαμβανομένων του πολλαπλασιασμού, ανάπτυξης, επιβίωση, και ο μεταβολισμός [13]. Κατά τη διέγερση αυξητικού παράγοντα, ΡΙ3Κ ενεργοποιείται για να φωσφορυλιώσει φωσφατιδυλινοσιτόλη-3, 4-διφωσφορικής (ΡΙΡ2), δημιουργώντας phosphatidylinsitol-3, 4, 5-τριφωσφορική (ΡΙΡ3). ΡΙΡ3 δεσμεύεται με Akt, τότε μετατοπίζεται στη μεμβράνη πλάσματος όπου Akt ενεργοποιείται με διαδοχική φωσφορυλίωση στα κατάλοιπα T308 και S473. Η φωσφορυλίωση στο T308 διαμεσολαβείται από PDK-1 (3′-φωσφοϊνοσιτιδίου-εξαρτώμενη κινάση 1), ενώ η φωσφορυλίωση στο S473 μπορεί να προκληθεί από διάφορους κινάσες συμπεριλαμβανομένων PDK-1 και mTORC2 [13]. Μόλις ενεργοποιηθεί, Akt μπορεί να φωσφορυλιώνει πολλά υποστρώματα να ασκήσει τα καθήκοντά του. Το καλύτερο χαρακτηρισμένο υπόστρωμα του Akt είναι το mTOR κινάσης σερίνης /θρεονίνης (στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά). Akt μπορεί άμεσα φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν την πρωτεΐνη mTOR και έμμεσα την ενεργοποίηση του mTOR με φωσφορυλίωση και την απενεργοποίηση οζώδους σκλήρυνσης 2 (TSC2). Ενεργοποιείται mTOR σχηματίζει ένα σύμπλοκο με Raptor για να ενεργοποιήσετε ριβοσωμικής πρωτεΐνης S6 κινάσες (S6K) και αναστέλλουν 4Ε-BP, με αποτέλεσμα την αύξηση της μετάφρασης πρωτεϊνών [13]. Είναι γνωστό ότι η ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι /mTOR μπορεί να αυξήσει την επιβίωση των κυττάρων και την αντίσταση απόπτωσης που επάγεται από έναν αριθμό παραγόντων [12], [13]. Για παράδειγμα, η υπερέκφραση της Akt αυξάνει την αντίσταση TRAIL [11], [14]. Από την άλλη πλευρά, η ΡΤΕΝ ογκοκατασταλτικό γονίδιο (φωσφατάση και tensin ομόλογο διαγράφονται στο χρωμόσωμα δέκα) μπορεί αποφωσφορυλιώνει ΡΙΡ3 να λειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστής της ΡΙ3Κ /Akt σηματοδότηση /mTOR. ΡΤΕΝ απενεργοποίηση οδηγεί στην ενεργοποίηση του μονοπατιού ΡΙ3Κ /Akt /mTOR σηματοδότησης. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο ο mTOR μονοπάτι ΡΙ3Κ /Akt /προσδίδει αντίσταση TRAIL δεν είναι πλήρως κατανοητή.

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η αυξημένη ενεργοποίηση του μονοπατιού Akt διαδραματίζει ένα σημαντικό ρόλο στην αντίσταση TRAIL. Συγκεκριμένα, δείξαμε ότι TRAIL ενεργοποιεί το μονοπάτι Akt και ότι ο αποκλεισμός της ενεργοποίησης Akt από τον αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 ή knockdown του Akt έκφρασης με siRNA ευαισθητοποιεί ανθεκτικών κυττάρων σε TRAIL. Βρήκαμε επίσης ότι η επανεισαγωγή του άγριου τύπου PTEN σε κύτταρα νοκ-άουτ PTEN ευαισθητοποιεί PTEN

– /- κύτταρα για TRAIL, ενώ η αδρανοποίηση του PTEN στην PTEN

+ /+ και PTEN

+/- κυττάρων οδηγεί σε αντίσταση TRAIL . Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αυξημένη ενεργοποίηση του μονοπατιού Akt μέσω απενεργοποίησης του ΡΤΕΝ παίζει σημαντικό ρόλο στην αντίσταση TRAIL.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

LY294002 αγοράστηκε από την Alexis Biochemicals (San Diego, CA). Ανασυνδυασμένο TRAIL αγοράστηκε από την PeproTech (Rocky Hill, NJ). Πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι φωσφορυλιωμένης Akt (Ser473), φωσφορυλιωμένο mTOR, φωσφορυλιωμένο p70S6K, φωσφορυλιωμένη eIF4E, ΡΤΕΝ, ολική Akt, και πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). αντίσωμα αντι-ακτίνης αγοράστηκε από τη Sigma. Οι αδενοϊοί που εκφράζουν άγριου τύπου και κυρίαρχο αρνητικό ΡΤΕΝ, καθώς οι αδενοϊοί ελέγχου που εκφράζουν γαλακτοσιδάση (Ad-LacZ), παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Dr. Lee Mengjer (University of Louisville).

Οι κυτταρικές σειρές, συνθήκες καλλιέργειας, και θεραπεία

Τα ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού T47D λήφθηκαν από την American Type Culture Collection και διατηρήθηκαν σε DMEM με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του SKOV3 ωοθηκών καλλιεργήθηκαν σε RPMI1640 με 10% FBS, OVCA432 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε MCDB105 /μέσο Μ199 με 10% FBS όπως περιγράφεται [15]. PTEN-νοκ-άουτ του προστάτη του ποντικιού επιθηλιακά κύτταρα (PTEN

– /- και PTEN

+/-) και φυσιολογικά κύτταρα (PTEN

+ /+) ελήφθησαν από Δρ Young Chen (Wake Forest University) και διατηρήθηκε σε ϋΜΕΜ με 10% FBS, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα που αποτελείται από 5% CO

2 και 95% αέρα.

siRNA επιμόλυνση για νοκ ντάουν της Akt

Σήμα Σιωπή siRNA για Akt και το αντίστοιχο siRNA ελέγχου αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν όπως προτείνεται από τον κατασκευαστή με ελαφρές τροποποιήσεις, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. Εν συντομία, κύτταρα T47D απλώθηκαν σε 6 × 10

5 ανά φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα μορφομετατράπηκαν με Akt ή siRNAs ελέγχου που δεν αποτελούν στόχο, χρησιμοποιώντας Oligofectamine (Invitrogen). Μετά από 24 ώρες, τα επιμολυσμένα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επιστρώθηκαν σε 6 × 10

5 ανά φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων. 48 ώρες αργότερα, τα επιμολυσμένα κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με TRAIL (100 ng /ml) για 24 ώρες και στη συνέχεια συλλέγονται για την εκτίμηση της έκφρασης των Akt και διασπασμένη PARP με ανάλυση κηλίδος Western. Για τον προσδιορισμό χημειοευαισθησία, κύτταρα με ή χωρίς την επιμόλυνση τοποθετήθηκαν σε 8.000 ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων και στη συνέχεια κατεργάζεται με TRAIL για 24 ώρες, και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2 , βρωμιούχο (ΜΤΤ) δοκιμασίες 5-διφαινυλτετραζολίνιο.

προσδιορισμοί ΜΤΤ

προσδιορισμοί ΜΤΤ περιγράφηκε προηγουμένως [18].

ανάλυση Western blot

οι διαδικασίες για την παρασκευή των προϊόντων λύσης πρωτείνης ολικού κυττάρου και ανάλυση κηλίδας Western περιγράφηκαν προηγουμένως [18].

λοιμώξεις Adenoviruse

ΡΤΕΝ

+ /+, ΡΤΕΝ

+/- και ΡΤΕΝ

– /- επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη κύτταρα ποντικού και ανθρώπου T47D καρκίνου του μαστού απλώθηκαν σε πιάτα 60 χιλιοστά σε 8 × 10

5, 6 × 10

5, 5 × 10

5 και 8 × 10

5 κύτταρα ανά πιάτο, αντίστοιχα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα πλύθηκαν με κανονικό μέσο και μολύνθηκαν με αδενοϊούς που εκφράζουν άγριου τύπου ΡΤΕΝ, κυρίαρχη αρνητική ΡΤΕΝ, ή LacZ. Κατά τη διάρκεια της μόλυνσης, τα κύτταρα ανακινήθηκαν ήπια κάθε 10 λεπτά για 1 ώρα, και κατόπιν διατηρήθηκε σε μέσο που περιέχει αδενοϊό σε 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. 24 ώρες αργότερα, τα μολυσμένα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε κανονικό μέσο χωρίς αδενοϊούς και στη συνέχεια συνεχώς καλλιεργήθηκαν για άλλες 48 ώρες. Στις 72 ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επιστρώθηκαν σε τρυβλίο 60 mm σε 5 × 10

5 κύτταρα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με TRAIL (100 ng /ml) για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση κηλίδος Western και την δοκιμασία ΜΤΤ, αντίστοιχα.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε χρησιμοποιώντας

t

δοκιμή Student. Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD, και

P

≤0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

Χαρακτηρισμός ευαισθησίας TRAIL σε ένα πάνελ του μαστού και του καρκίνου των ωοθηκών κύτταρο γραμμές

Για να κατανοήσουμε τους μηχανισμούς αντίστασης TRAIL, ερευνήσαμε την πρώτη ευαισθησία TRAIL σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του 14, συμπεριλαμβανομένων 3 του μαστού και 11 κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές δόσεις του TRAIL για 24 ώρες, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Σύκο. 1 δείχνει ότι αυτές οι κυτταρικές γραμμές εμφάνισαν την ευαισθησία απόκλιση TRAIL? MDA-231, DOV13, OV433 και OVCA420 κύτταρα ήταν ευαίσθητα σε TRAIL, ενώ το υπόλοιπο των γραμμών ήταν ανθεκτικά σε TRAIL εκτός MCF-7 κύτταρα που έδειξαν μέτρια αντίσταση. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι πολλές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών και του καρκίνου του μαστού είναι ανθεκτικά σε TRAIL.

καρκινικές κυτταρικές σειρές ανθρώπινου μαστού T47D, MDA231 και MCF7 και κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών DOV13, E52, OV90, OV433, OVCA432, RMG- 1, TOV-21G, TOV-112D, Caov3, OVCA420, και SKOV3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες δόσεις του TRAIL για 24 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με προσδιορισμούς ΜΤΤ. Τα δεδομένα Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκφράζεται ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Η οδός /mTOR Akt ενεργοποιείται σε TRAIL ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές

Δεδομένου ότι πολλές καρκίνο του μαστού και κυτταρικές σειρές των ωοθηκών είναι ανθεκτικά σε TRAIL, είναι σημαντικό να κατανοήσουν την υποκείμενη μηχανισμό αντίστασης TRAIL. Έχει αναφερθεί ότι το TRAIL μπορούν να ενεργοποιήσουν διάφορες οδούς προ-επιβίωσης, συμπεριλαμβανομένου του Akt, NF-κΒ και τα μονοπάτια ERK [19], [20], [21], [22]. Επειδή η ενεργοποίηση αυτών των οδών ρυθμίζει την κυτταρική επιβίωση και χημειοαντίσταση, είναι κατανοητό ότι η ενεργοποίηση αυτών των οδών συμβάλλει στην αντίσταση TRAIL. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, υποβάλλαμε σε αγωγή τέσσερα ανθεκτικές γραμμές T47D, SKOV3, OVCA432 και OV90 με 100 ng /ml TRAIL για διαφορετικές χρονικές περιόδους και εξέτασε την ενεργοποίηση των οδών Akt, NF-κΒ και ERK, καθώς και την έκφραση του Bcl οικογένεια -2 πρωτεΐνες. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2A-D, τα επίπεδα τόσο φωσφορυλιωμένης Akt και πρωτεΐνη mTOR αυξήθηκαν ήδη από 2 ώρες και διήρκεσε μέχρι και 6 ώρες μετά την αγωγή TRAIL, Δείξαμε επίσης ότι μια τέτοια ενεργοποίηση δεν οφείλεται σε αύξηση των συνολικών πρωτεϊνών Akt και mTOR, η οποία παρέμεινε σταθερή (Σχ. 2Α-Δ). Επιπλέον, δείξαμε ότι p70S6K και elF4E, και οι δύο είναι κατάντη στόχοι του mTOR, ενεργοποιούνται (Σχ. 2Α και D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το TRAIL μπορεί να ενεργοποιήσει τον /mTOR μονοπάτι Akt σε ανθεκτικούς TRAIL κυτταρικές σειρές. Είναι σημαντικό, δείξαμε ότι Akt και mTOR δεν ενεργοποιούνται σε ευαίσθητες MCF-7 και κύτταρα OVCA420 TRAIL (Σχ. 2Ε και F). Έτσι, τα αποτελέσματα μας υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση της Akt μονοπατιού /mTOR είναι μια κοινή εκδήλωση των ανθεκτικών TRAIL καρκινικές κυτταρικές γραμμές και ότι αυτή η οδός μπορεί να είναι σημαντικό στην αντίσταση TRAIL. Επιπλέον, βρήκαμε ότι TRAIL μπορούσε να ενεργοποιήσει τις διαδρομές MEK /ERK και ΝΡ-κΒ σε OV90 κύτταρα, αλλά όχι σε άλλες τρεις κυτταρικές γραμμές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, η αναστολή της ERK και μονοπάτια NF-κΒ με αντίστοιχη φαρμακολογική αναστολέων τους δεν επηρέασε την ευαισθησία TRAIL σε OV90 κύτταρα (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση αυτών των δύο οδών δεν μπορεί να είναι σημαντική στην αντίσταση TRAIL σε αυτή την κυτταρική γραμμή.

T47D (Α), SKOV3 (Β), OVCA432 (C), OV90 (D), MCF7 (Ε) και τα κύτταρα OVCA420 (F) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml TRAIL για 0, 2, 4 και 8 ώρες (σε κύτταρα T47D, 6 ώρες θεραπεία συμπεριλήφθηκε), και η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται. Τα επίπεδα της ολικής και φωσφορυλιωμένης Akt (

p-ΑΚΤ

), και φωσφορυλιωμένη mTOR (

p-mTOR

) προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. Σε κύτταρα T47D (Α) και OV90 (Δ), εξετάστηκαν επίσης τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης ρ-p70S6K και φωσφορυλιωμένη elF4E (p-elF4E). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Αξίζει να σημειωθεί ότι υπήρχαν δύο ζώνες για Akt (Akt1 και Akt2) τόσο OVCA432 και OV90 κυττάρων ενώ μόνο μία ζώνη για Akt ανιχνεύθηκε σε κύτταρα T47D και SKOV3.

Η

Αναστολή της ενεργοποίησης Akt ευαισθητοποιεί κύτταρα ανθεκτικά με διαδρομή

από το μονοπάτι Akt ενεργοποιείται σε όλες τις ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, ρωτήσαμε αν η αναστολή της Akt δραστηριότητα θα μπορούσε να αυξήσει την ευαισθησία TRAIL τους σε ανθεκτικά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό, υποβάλλαμε σε αγωγή T47D κυττάρων με το LY294002 αναστολέα ΡΙ3Κ και εξέτασε την επίδραση της αναστολής της Akt σε TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, η θεραπεία TRAIL αυξημένη φωσφορυλίωση της Akt σε κύτταρα T47D, η οποία καταργήθηκε με LY294002, δείχνοντας ότι η ενεργοποίηση Akt εξαρτάται PI3K. Ομοίως, δείξαμε επίσης ότι η ενεργοποίηση της Akt μπλοκάρεται από LY294002 σε OVCA432 κύτταρα (Σχ. 3C). Είναι σημαντικό ότι, η αναστολή της φωσφορυλίωσης Akt με LY294002 αυξηθεί σημαντικά TRAIL-επαγόμενη διάσπαση PARP σε σύγκριση με κύτταρα επεξεργασμένα με TRAIL, ή LY294002 μόνο (Σχ. 3Α και C). Επιπλέον, δείξαμε ότι η συνδυασμένη θεραπεία του TRAIL και LY294002 αναστέλλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε σύγκριση με οποιονδήποτε παράγοντα μεμονωμένα (Σχ. 3Β και Δ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι η ενεργοποίηση της Akt διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην αντίσταση TRAIL σε καρκινικά κύτταρα.

Α και C, επίδραση του αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 στην TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. Ο καρκίνος του μαστού T47D κυττάρων (

A

) και OVCA432 καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών (

C

) αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή προκατεργάστηκαν με 10 μΜ LY294002 (

LY)

για 30 λεπτά, και στη συνέχεια κατεργάζεται με ή χωρίς 100 ng /ml TRAIL για 6 ώρες. Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται, και διασπασμένη PARP και συνολική και φωσφορυλιωμένο Akt προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western.

Β και D

, επίδραση της LY294002 επί TRAIL επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης. T47D (

B

) και OVCA432 κυττάρων (

D

) αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή προκατεργάστηκαν με 10 μΜ LY294002 για 30 λεπτά, και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς 100 ng /ml TRAIL για 24 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με προσδιορισμούς ΜΤΤ και εκφράστηκαν ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Εκπρόσωπος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. **

P

& lt? 0.001, στατιστική σημασία? *,

P

& lt?. 0.01, η στατιστική σημαντικότητα

Η

Νοκ ντάουν της Akt ευαισθητοποιεί τα κύτταρα του καρκίνου του μαστού T47D με TRAIL

Αν και η θεραπεία με τον αναστολέα ΡΙ3Κ LY294002 αυξημένη TRAIL επαγόμενη απόπτωση, τα αποτελέσματα μπορεί να μην αντικατοπτρίζουν πλήρως το αποκλειστικό ρόλο της Akt σε αντίσταση TRAIL επειδή LY294002 μπορεί να αναστέλλουν άλλες κινάσες. Για να ερευνηθεί ο ρόλος της άμεσης ενεργοποίησης Akt σε αντίσταση TRAIL, χρησιμοποιήσαμε siRNA για knockdown Akt έκφραση και στη συνέχεια να καθορίσει το αποτέλεσμα της Akt knockdown την ευαισθησία TRAIL. Εμείς επιμολυσμένα T47D κυττάρων με siRNA έναντι Akt (Akt 1, 2 και 3) ή τον έλεγχο siRNA και απέδειξαν ότι Akt ήταν αποτελεσματικά νοκ ήπιε από Akt siRNA σε κύτταρα με ή χωρίς επεξεργασία TRAIL, σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (Σχ. 4Β ). Είναι σημαντικό, δείξαμε ότι knockdown του Akt ευαισθητοποιημένων επάγεται TRAIL διάσπαση PARP σε σύγκριση με τα ίδια κύτταρα επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (Σχ. 4Β). Περαιτέρω, knockdown του Akt αυξημένη TRAIL επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης, ενώ οι αλλαγές αυτές ήταν ελάχιστες σε κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA μάρτυρα (Σχ. 4Α). Έτσι, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ενώ TRAIL μπορεί να προκαλέσει απόπτωση, ενεργοποιεί επίσης το Akt μονοπάτι επιβίωσης για την εξουδετέρωση TRAIL-επαγώμενη απόπτωση.

A

, επίδραση της Akt knockdown επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Τα T47D κύτταρα εμβολιάστηκαν σε 6 × 10

5 ανά φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα μορφομετατράπηκαν με Akt ή τον έλεγχο siRNAs χρησιμοποιώντας Oligofectamine. Μετά από 2 d, τα κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με TRAIL (100 ng /ml) για 24 ώρες, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με προσδιορισμούς ΜΤΤ. Τα δεδομένα Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκφράζεται ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Εκπρόσωπος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *,

P

& lt? 0,01, στατιστική σημασία.

B

, επίδραση της Akt knockdown σε TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. κύτταρα T47D επιμολύνθηκαν με Akt ή siRNAs ελέγχου και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς TRAIL (100 ng /ml) για 24 ώρες όπως περιγράφεται στο (

A

). Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται για προσδιορισμό ολικής και φωσφορυλιωμένης Akt (

ρ-ΑΚΤ

) και PARP με ανάλυση στυπώματος Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Απώλεια ΡΤΕΝ προσδίδει αντίσταση TRAIL

Είναι γνωστό ότι ΡΤΕΝ είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής του Akt και του εν λόγω αυξημένη δραστικότητα Akt έχει που συνδέονται με την απενεργοποίηση του PTEN σε διάφορες μορφές καρκίνου. Για να κατανοήσουμε τον μηχανισμό ενεργοποίησης μεσολάβηση Akt αντίσταση TRAIL, υποβάλλαμε σε αγωγή ΡΤΕΝ

+ /+, ΡΤΕΝ

+/- και ΡΤΕΝ

– /- ποντικό επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη με TRAIL για 48 ώρες και μετρήθηκαν κυτταρικό πολλαπλασιασμό με προσδιορισμούς ΜΤΤ. Σύκο. 5Α δείχνει ότι το TRAIL επαγόμενη από περίπου 32% αναστολή της ανάπτυξης στην PTEN

+ /+ κύτταρα, ενώ TRAIL δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε PTEN

– /- κύτταρα, ενώ PTEN

+/- κύτταρα έδειξε περίπου 13% αναστολή της ανάπτυξης μετά τη θεραπεία TRAIL. Επιπλέον, δείξαμε ότι Akt ενεργοποιείται στην PTEN

– /- κύτταρα, αλλά όχι σε PTEN

+ /+, ενώ η ελάχιστη ενεργοποίηση PTEN

+/- κύτταρα. Είναι σημαντικό, η θεραπεία TRAIL προκάλεσε σημαντική διάσπαση PARP στην PTEN

+ /+ κύτταρα, μέτρια διάσπαση στην PTEN

+/- κύτταρα και πλήρη απουσία διάσπασης στην PTEN

– /- κύτταρα (Εικ. 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ΡΤΕΝ απαιτείται για TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη ποντικού.

Ποντίκια προστάτη επιθηλιακών κυττάρων με άγριου τύπου ΡΤΕΝ (ΡΤΕΝ

+ /+), ΡΤΕΝ knockout (ΡΤΕΝ

+/-

) και ετερόζυγων (ΡΤΕΝ

– /-

) απλώνονται σε πλάκες 96-φρεατίων και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 100 ng /ml TRAIL για 48 ώρες. Κύτταρα πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε με προσδιορισμούς ΜΤΤ και εκφράστηκαν ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Εκπρόσωπος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *,

P

& lt? 0,01, στατιστική σημασία.

B

, επίδραση της απώλειας ΡΤΕΝ σε TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. ΡΤΕΝ

+ /+, ΡΤΕΝ

+/-, και ΡΤΕΝ

– /- κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 ng /ml TRAIL για 48 ώρες όπως περιγράφεται στο (

A

). Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται για προσδιορισμό ολικής και φωσφορυλιωμένης Akt (

ρ-ΑΚΤ

), ΡΤΕΝ και PARP με ανάλυση κηλίδος Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

C

, αποκαταστάθηκε η έκφραση ΡΤΕΝ ευαισθητοποιεί ΡΤΕΝ

– /- κύτταρα να TRAIL. PTEN

– /- κύτταρα (5 × 10

5) μολύνθηκαν με αδενοϊούς που εκφράζουν άγριου τύπου PTEN (

Ad-PTEN κ.β.

) ή εκφράζουν LacZ (

Ad-lacZ

). Στις 72 ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και επιστρώθηκαν σε τρυβλίο 60 mm σε 5 × 10

5 κύτταρα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα αφέθηκαν χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με TRAIL (100 ng /ml) για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για προσδιορισμούς ΜΤΤ (

Άνω πάνελ

) και ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των επιπέδων της PARP και πρωτεϊνών ΡΤΕΝ (

κατώτερο πάνελ

), αντίστοιχα. δεδομένα Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκφράστηκαν ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Εκπρόσωπος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. **

P

& lt? 0.001, στατιστική σημασία.

D,

αναστολή της λειτουργίας ΡΤΕΝ από ένα κυρίαρχο αρνητικό μορφή PTEN προσδίδει αντοχή TRAIL. ΡΤΕΝ

+ /+ και ΡΤΕΝ

+/- κύτταρα μολύνθηκαν με αδενοϊούς που εκφράζουν μια κυρίαρχη αρνητική μορφή του ΡΤΕΝ για 72 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με TRAIL (100 ng /ml) για 48 ώρες. Τα κύτταρα είτε χρησιμοποιήθηκαν για την αναστολή της ανάπτυξης με προσδιορισμούς ΜΤΤ (

πάνω πάνελ

) ή συγκομίζονται για την ανίχνευση των επιπέδων του PARP, ΡΤΕΝ, και συνολικά και φωσφορυλιωμένο Akt με ανάλυση Western blot (κάτω πίνακας). δεδομένα Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκφράστηκαν ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Εκπρόσωπος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *,

P

& lt? 0,01, στατιστική σημασία. **

P

& lt? 0.001, στατιστική σημαντικότητα

Η

Από PTEN

– /- κύτταρα ανθεκτικά στην TRAIL, ρωτήσαμε αν η αποκατάσταση της έκφρασης ΡΤΕΝ επηρεάζει την ευαισθησία TRAIL. στην PTEN

– /- κύτταρα. ΡΤΕΝ

– /- κύτταρα μολύνθηκαν με αδενοϊούς που εκφράζουν άγριου τύπου ΡΤΕΝ ή LacZ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5C, η έκφραση ΡΤΕΝ αποκαταστάθηκε σε κύτταρα μολυσμένα με αδενοϊούς που εκφράζουν ΡΤΕΝ αλλά όχι σε κύτταρα μολυσμένα με αδενοϊούς που εκφράζουν LacZ. Είναι σημαντικό, ήμασταν σε θέση να αποδείξει ότι η αποκατάσταση της έκφρασης ΡΤΕΝ καθιστά ΡΤΕΝ

– /- (Εικ. 5C) κύτταρα ευαίσθητα στην TRAIL και την ανάπτυξη αναστολή, ενώ τα αποτελέσματα αυτά δεν παρατηρήθηκαν σε κύτταρα που έχουν μολυνθεί με ιούς ελέγχου. Από ΡΤΕΝ

+ /+ κύτταρα είναι ευαίσθητα σε TRAIL, αναρωτηθήκαμε εάν η αναστολή της λειτουργίας ΡΤΕΝ επηρεάζει TRAIL επαγόμενη απόπτωση σε ΡΤΕΝ

+ /+ κύτταρα. Για το σκοπό αυτό, μολύναμε ΡΤΕΝ

+ /+ και ΡΤΕΝ

+/- κυττάρων με αδενοϊούς που εκφράζουν μια κυρίαρχη αρνητική μορφή του ΡΤΕΝ ή LacZ, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία μολυσμένων κυττάρων με TRAIL για 48 ώρες. Σύκο. 5D δείχνει ότι η εισαγωγή της δεσπόζουσας αρνητική μορφή του PTEN αυξήθηκαν p-Akt επίπεδο PTEN

+ /+ κύτταρα. Είναι σημαντικό ότι, η εισαγωγή ενός κυριαρχικό αρνητική μορφή του PTEN καθιστά PTEN

+ /+ και PTEN

+/- κύτταρα πιο ανθεκτικά στην TRAIL (Εικ. 5D). Συνεπής με το ρόλο της Akt στην αναστολή της απόπτωσης, TRAIL διάσπαση που προκαλείται PARP μειώθηκε δραματικά στην ΡΤΕΝ

+ /+ και PTEN

+/- κύτταρα μετά μολύνθηκαν με ιούς που εκφράζουν μια κυρίαρχη αρνητική μορφή του PTEN. Επιπλέον, δείξαμε ότι TRAIL επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης σε ΡΤΕΝ

+ /+ κύτταρα μολυσμένα με έναν αδενοϊό που εκφράζει μια κυρίαρχη αρνητική μορφή του ΡΤΕΝ ήταν περίπου 5%, αλλά περίπου 27% στα ίδια κύτταρα μολυσμένα με αδενοϊούς ελέγχου (Εικ. 5D ). Δείξαμε επίσης ότι σε ΡΤΕΝ

+/- κύτταρα μολυσμένα με κυρίαρχη αρνητική μορφή του ΡΤΕΝ, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ήταν περίπου 102% σε σύγκριση με τα ίδια κύτταρα που έχουν μολυνθεί με ιούς ελέγχου στις οποίες ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ήταν περίπου 81% με την θεραπεία TRAIL (Εικ . 5D, άνω φωτογραφία).

Ο ρόλος της ΡΤΕΝ στην ευαισθησία TRAIL σε κύτταρα T47D καρκίνου του μαστού

Δεδομένου ότι ο καρκίνος του μαστού T47D κυττάρων με ένα άγριου-τύπου ΡΤΕΝ ήταν ανθεκτικά σε TRAIL (Σχ. 1 ), ρωτήσαμε αν διαμόρφωση της λειτουργίας του PTEN θα μπορούσε να επηρεάσει την ευαισθησία TRAIL στα κύτταρα T47D. Για το σκοπό αυτό, μολύναμε T47D κυττάρων με αδενοϊούς που εκφράζουν μια κυρίαρχη αρνητική μορφή του ΡΤΕΝ ή ιούς ελέγχου και στη συνέχεια κατεργάζεται μολυσμένα κύτταρα με TRAIL (100 ng /ml) για 48 ώρες, και το αποτέλεσμα μιας τέτοιας θεραπείας για την ευαισθησία TRAIL προσδιορίστηκε. Σύκο. 6 δείχνει ότι τα κύτταρα μολύνθηκαν με αδενοϊό που εκφράζει μια κυρίαρχη αρνητική μορφή του ΡΤΕΝ εκφράζουν ένα υψηλότερο επίπεδο της ρ-Akt ενώ μια τέτοια αύξηση δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα μολυσμένα με αδενοϊούς που εκφράζουν LacZ, γεγονός που υποδηλώνει ότι η λειτουργία ΡΤΕΝ ανεστάλη από μία κυρίαρχη αρνητική μορφή του ΡΤΕΝ (Εικ. 6Β). Συνεπής με τον ρόλο της Akt στην αναστολή της απόπτωσης, διασπασμένη PARP ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα που εκφράζουν ένα κυρίαρχο αρνητικό μορφή ΡΤΕΝ σε σύγκριση με κύτταρα που εκφράζουν τους ιούς ελέγχου (Εικ. 6Β). Επιπλέον, η υπερέκφραση μιας δεσπόζουσας αρνητική μορφή της ΡΤΕΝ καθιστά κυττάρων T47D πιο ανθεκτικά στην TRAIL σε σύγκριση με τα ίδια κύτταρα που έχουν μολυνθεί με ιούς που εκφράζουν LacZ (Εικ. 6). Ως εκ τούτου, τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι η αυξημένη ενεργοποίηση Akt λόγω της αδρανοποίησης του ΡΤΕΝ μπορούσε προσδίδουν ανθεκτικότητα TRAIL σε καρκινικά κύτταρα.

A

, αποτέλεσμα της αναστολής της λειτουργίας του ΡΤΕΝ επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. κύτταρα T47D (8 × 10

5) μολύνθηκαν με αδενοϊό που εκφράζει μια κυρίαρχη αρνητική μορφή του ΡΤΕΝ ή αδενοϊούς που εκφράζουν LacZ για 72 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με TRAIL (100 ng /ml) για 48 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με προσδιορισμούς ΜΤΤ. Τα δεδομένα Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκφράζεται ως ποσοστό των μη επεξεργασμένων κυττάρων. Εκπρόσωπος των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *,

P

& lt? 0,01, στατιστική σημασία.

B

, αποτέλεσμα της αναστολής της λειτουργίας του ΡΤΕΝ στην απόπτωση. κύτταρα T47D μολυσμένα με αδενοϊούς όπως περιγράφεται στο Α υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TRAIL (100 ng /ml) για 48 ώρες και στη συνέχεια συλλέχθηκαν για την ανάλυση των επιπέδων της PARP, ΡΤΕΝ, συνολική και φωσφορυλιωμένη Akt πρωτεΐνες με ανάλυση Western blot (

κάτω πάνελ

). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι TRAIL ενεργοποιεί το Akt μονοπάτι επιβίωσης σε TRAIL-ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Δείχνουμε επίσης ότι ο υποκείμενος μηχανισμός μπορεί να οφείλεται σε απώλεια της λειτουργικής ΡΤΕΝ επειδή ΡΤΕΝ knockout προστάτη ποντικού επιθηλιακά κύτταρα είναι ανθεκτικά σε TRAIL ενώ τα κύτταρα με ανέπαφη ΡΤΕΝ είναι ευαίσθητα σε TRAIL. Αποκατάσταση της έκφρασης ΡΤΕΝ καθίσταται ΡΤΕΝ

– /- κύτταρα ευαίσθητα στο TRAIL. Περαιτέρω, η αδρανοποίηση του ΡΤΕΝ ενισχύει το επίπεδο αντοχής TRAIL σε κύτταρα T47D. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση της Akt μονοπάτι επιβίωσης διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην αντίσταση TRAIL και ότι η οδός Akt είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για την ενίσχυση της θεραπείας με TRAIL-based.

Η ενεργοποίηση του μονοπατιού Akt έχει ενοχοποιηθεί σε προστατεύει τα κύτταρα από πολλά ερεθίσματα θάνατο, παρέχοντας έτσι κύτταρο επιβίωσης [10], [13]. Προηγούμενες μελέτες πρότειναν ότι η υπερέκφραση της Akt και ανάντη ρυθμιστή της ΡΙ3Κ αυξημένη αντίσταση TRAIL της σε καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών κυττάρων [23], [24]. Ωστόσο, ο υποκείμενος μηχανισμός της ανθεκτικότητας του δεν είναι πλήρως κατανοητή. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι ενώ TRAIL επάγει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα, ενεργοποιεί επίσης αρκετές οδούς επιβίωση, η οποία μπορεί να εξουδετερώσει TRAIL απόπτωση, που οδηγεί σε αντίσταση. Σε πολλά ανθεκτικά TRAIL καρκίνο του μαστού και κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, αλλά δεν είναι ευαίσθητοι κυτταρικές σειρές, η Akt μονοπάτι ενεργοποιήθηκε (Εικ. 2), υποδηλώνοντας ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού Akt μπορεί να είναι ένα κοινό συμβάν σε ανθεκτικά κύτταρα TRAIL. Σύμφωνα με αυτή την έννοια, βρήκαμε ότι η αναστολή της ενεργοποίησης Akt με φαρμακολογικά αναστολέα της LY294002 ή knockdown της έκφρασης του από siRNA ευαισθητοποιεί TRAIL-ανθεκτικών κυττάρων σε TRAIL. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν έντονα ότι η ενεργοποίηση της Akt μονοπάτι επιβίωσης διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην αντίσταση TRAIL σε κύτταρα των ωοθηκών και του καρκίνου του μαστού και υποδηλώνουν ότι η αναστολή αυτής της οδού θα μπορούσε επιβίωσης ξεπεράσει την αντίσταση TRAIL.

Δείξαμε επίσης ότι η αναστολή της PI3K δραστηριότητας μπλοκάρει την ενεργοποίηση της Akt σε ανθεκτικούς TRAIL κυτταρικές σειρές. Από ΡΙ3Κ μπορεί να χρησιμεύσει ως μία ανάντι θετικός ρυθμιστής της Akt, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αυξημένη ενεργοποίηση Akt είναι τουλάχιστον εν μέρει μέσω της αυξημένης ενεργοποίησης δράση ΡΙ3Κ. Στο επόμενο στάδιο, είναι γνωστό ότι Akt ασκεί τις βιολογικές λειτουργίες της με φωσφορυλίωση κατάντη υποστρώματα της, συμπεριλαμβανομένων των mTOR. Η ενεργοποίηση του mTOR μπορεί να αυξήσει την μετάφραση πρωτεΐνης, με αποτέλεσμα την επιβίωση των κυττάρων [13]. Σε συμφωνία με αυτό, βρήκαμε ότι η θεραπεία TRAIL μπορεί να προκαλέσει φωσφορυλίωση mTOR και την επακόλουθη ενεργοποίηση. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι το TRAIL μπορούν να ενεργοποιήσουν μονοπάτι το ΡΙ3Κ /Akt /mTOR να εξουδετερώσει TRAIL επαγόμενη απόπτωση, που οδηγεί σε αντίσταση TRAIL.

Στα καρκινικά κύτταρα, το Akt μονοπάτι επιβίωσης μπορεί να ενεργοποιηθεί από τους διάφορους μηχανισμούς συμπεριλαμβανομένων αδρανοποίηση του ανάντη αρνητικός ρυθμιστής της PTEN. Με αποφωσφορυλίωση και συνομιλεί ΡΙΡ3 να PIP2, PTEN αναστέλλει την ενεργοποίηση Akt και στη συνέχεια ευαισθητοποιεί τα κύτταρα σε θάνατο [10], [13]. Συνεπής με το ρόλο της ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι στην αντίσταση TRAIL, βρήκαμε ότι η απώλεια του ΡΤΕΝ στα επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη ποντικού προσδίδει αντίσταση TRAIL ενώ τα ίδια κύτταρα με ανέπαφη ΡΤΕΝ είναι ευαίσθητα σε TRAIL ενώ ΡΤΕΝ

+/- κύτταρα δείχνουν ενδιάμεσο αντίσταση. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το ΡΤΕΝ παίζει πράγματι έναν σημαντικό ρόλο στην ευαισθησία TRAIL. Επιπλέον, δείξαμε ότι επανεισαγωγή μιας μεταλλαγμένης μορφής του PTEN σε ανθεκτικά TRAIL κύτταρα T47D αυξάνει περαιτέρω την αντίσταση TRAIL. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι σε ανθεκτικούς TRAIL κύτταρα, απώλεια της ΡΤΕΝ συμβάλλει στην TRAIL αντίσταση. Είναι γνωστό ότι η μειωμένη ή απώλεια της έκφρασης ΡΤΕΝ συμβαίνει σε τουλάχιστον το 50% των καρκίνων του μαστού και των ωοθηκών [25]. Είναι πιθανό ότι ανθεκτικές TRAIL καρκίνο του μαστού και των ωοθηκών κύτταρα έχουν μειωμένα επίπεδα του ΡΤΕΝ, οι οποίες χρειάζονται περαιτέρω έρευνα. Περαιτέρω, μία πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η υπερέκφραση του miR-221 & amp? 222 κάτω ρυθμίζει ΡΤΕΝ, οδηγώντας σε αυξημένη ενεργοποίηση του Akt και μετέπειτα αντοχή TRAIL [26]. Επιπροσθέτως, TRAIL κύτταρα ανθεκτικά λευχαιμίας εξέφρασαν ένα υψηλότερο επίπεδο της φωσφορυλιωμένης αδρανής μορφή της ΡΤΕΝ, η οποία οδήγησε σε μια αύξηση στην ενεργοποίηση Akt και αντίσταση TRAIL [27].