Αφηρημένο

πιλοτική μελέτη μας χρησιμοποιώντας συστοιχίες miRNA διαπίστωσε ότι miRNA-29c (miR-29γ) εκφράζεται διαφορικά σε ζεύγη καρκίνο του πνεύμονα 95C χαμηλή μεταστατική κυτταρική γραμμή σε σύγκριση με το high-μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρική σειρά 95δ. ανάλυση Βιοπληροφορική δείχνει ότι ιντεγκρίνης β1 και μεταλλοπρωτεϊνάση 2 (ΜΜΡ2) θα μπορούσε να είναι σημαντικό γονιδίων στόχων του miR-29c. Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι miR-29c καταστέλλει τον καρκίνο του πνεύμονα προσκόλληση κυττάρου προς εξωκυτταρική μήτρα (ECM) και τη μετάσταση με στόχευση ιντεγρίνης β1 και ΜΜΡ2. Οι μελέτες κέρδος-of-λειτουργία που έθεσε έκφραση miR-29c σε 95d κύτταρα χρησιμοποιώντας μιμείται του έδειξε μειώσεις στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, προσκόλληση προς ECM, εισβολή και τη μετανάστευση. Σε αντιθέσεις, απώλεια-του-λειτουργία μελέτες που μειώνεται miR-29c με τη χρήση αναστολέα της σε 95C κύτταρα προωθούνται πολλαπλασιασμό, την προσκόλληση στην ECM, την εισβολή και τη μετανάστευση. Επιπλέον, η δοκιμασία ρεπόρτερ διπλής λουσιφεράσης έδειξαν ότι miR-29c ανέστειλε την έκφραση του γονιδίου λουσιφεράσης που περιέχει τα 3′-UTRs ιντεγκρίνης β1 και ΜΜΡ2 mRNA. Κηλίδωση Western έδειξε ότι miR-29c ρυθμίζεται προς τα κάτω την έκφραση της ιντεγρίνης β1 και ΜΜΡ2 στο επίπεδο πρωτεΐνης. Ανάλυση ζυμογραφία ζελατίνης επιβεβαίωσε επίσης ότι το miR-29c μειωμένη δραστηριότητα του ενζύμου ΜΜΡ2. Γυμνά ποντίκια με μοντέλα ξενομοσχεύματος καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα επιβεβαίωσε ότι miR-29c ανέστειλε πνεύμονα μετάσταση καρκίνου σε βιολογικό περιβάλλον, συμπεριλαμβανομένων των οστών και της μετάστασης ήπατος. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι miR-29c χρησιμεύει ως καταστολέας μετάσταση όγκου, η οποία καταστέλλει την κυτταρική προσκόλληση καρκίνου του πνεύμονα σε ECM και τη μετάσταση με απευθείας αναστολή β1 ιντεγκρίνης και έκφραση ΜΜΡ2 και με περαιτέρω μείωση ενζυμικής δραστηριότητας ΜΜΡ2. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-29c μπορεί να είναι μια νέα θεραπευτική υποψήφιο στόχο να επιβραδύνει τη μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα

Παράθεση:. Wang Η, Zhu Υ, Zhao Μ, Wu C, Zhang P, Tang L, et al. (2013) miRNA-29c Καταστέλλει καρκίνος του πνεύμονα Πρόσφυση στο εξωκυττάριο χώρο και μετάσταση από Στόχευση ιντεγκρίνης β1 και Matrix Metalloproteinase2 (ΜΜΡ2). PLoS ONE 8 (8): e70192. doi: 10.1371 /journal.pone.0070192

Επιμέλεια: Edward F. άροτρο, Lerner Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8η Απριλίου 2013? Αποδεκτές: 17 του Ιουνίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 6 Αυγ, 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30800631, Αρ 30872553 και Νο 81272433) και επιχορήγηση από την Επιτροπή Σαγκάη Επιστήμης και Τεχνολογίας (Νο 09411964800). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Σήμερα, ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ένας από τους πιο κοινούς καρκίνους. Περισσότερο από το 90% των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα πεθαίνουν από μετάσταση και όχι από πρωτογενείς όγκους τους, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μετάσταση είναι ένας βασικός προγνωστικός παράγοντας [1], [2]. Η πρόοδος του όγκου και η μετάσταση είναι μία πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει πολλά διαφορετικά βιολογικά παίκτες. Μία από τις κρίσιμες ρυθμιστικές αρχές που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία είναι ένα microRNA (miRNA) [3].

Ζευγάρι miRNAs είναι σύντομες, μονόκλωνο, ενδογενείς και μη-κωδικοποίησης RNAs που αποτελείται από περίπου 22 νουκλεοτίδια, τα οποία ρυθμίζουν γονίδια στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο κατά τη διαδικασία της μετάφρασης. Μπορούν να στοχεύουν το 3′-UTR (μη μεταφραζόμενες περιοχές) του mRNA, το οποίο λειτουργικά οδηγεί σε μεταγραφική αναστολή ή απορρύθμιση του στόχου mRNA [4]. miRNAs έχουν σημαντική επιρροή στις διάφορες βιολογικές διαδικασίες, όπως η διαφοροποίηση των κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, αντοχή στο στρες, το μεταβολισμό των λιπών, και την ανάπτυξη. Ως εκ τούτου, παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο σε διάφορες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [3]. Επιπλέον, έρευνες δείχνουν ότι ορισμένες miRNAs μπορούν να λειτουργήσουν ως ογκογονίδια ή καταστολείς των όγκων. MiRNAs διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση και την εξέλιξη του όγκου, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού και της μετάστασης [3], [5] – [8]. Για παράδειγμα, miR-10β προωθεί μετάσταση όγκου του μαστού, ενώ miR-335 και miR-126 καταστείλει την μετάσταση [9], [10]. Ως εκ τούτου, η επόμενη γενιά των θεραπευτικών στόχων για κακοήθεις όγκοι μπορεί να είναι miRNAs [11].

Η οικογένεια miR-29 είναι μια συντηρημένη οικογένεια miRNAs συμπεριλαμβανομένων των miR-29a, miR-29b, miR-29c, και miR -29d. Πρόσφατα, τα επίπεδα έκφρασης των πολλών μελών miR-29 οικογένεια βρέθηκαν να μειώνονται σε μία ποικιλία καρκίνων. Για παράδειγμα, Sengupta και οι συνεργάτες του έχουν δείξει ότι το miR-29c ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ρινοφαρυγγικά καρκινώματα [12], ενώ οι Fabbri και οι συνεργάτες του ανακάλυψαν ότι η οικογένεια miR-29, συμπεριλαμβανομένων των miR-29c, στοχεύει Dnmt3a και DNMT3B στον πνεύμονα καρκινικούς ιστούς και τα κύτταρα [13].

στην παρούσα μελέτη, νωρίτερα πιλοτική μελέτη μας βρήκε μια σχεδόν τετραπλάσια διαφορική έκφραση του miR-29c μεταξύ καρκινικές κυτταρικές σειρές υψηλής (95d) και χαμηλής μεταστατικό (95C) (Λεπτομέρειες στην Πίνακας S1). Αρκετές μελέτες έχουν επωφεληθεί από αυτή τη διαφορά μεταξύ των δίδυμων κυτταρικές σειρές σε σχέση με την εισβολή και τη μετάσταση [14], [15]. Ωστόσο, ο ρόλος του miR-29c στον καρκίνο του πνεύμονα δεν έχει ακόμη διερευνηθεί διεξοδικά και πλέον της συνολικής βιολογικής λειτουργίας του παραμένει άγνωστη. Εδώ, μπορούμε να αποδεικνύουν ότι το miR-29c λειτουργεί ως καταστολέας μετάσταση που αναστέλλει την προσκόλληση των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα στην ECM και τη μετανάστευση

in vitro

, και καταστέλλει καρκινικό κύτταρο μακρινή μετάσταση

in vivo

. Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι το miR-29c μπορεί να ρυθμίζουν προς τα κάτω απ ‘ευθείας ιντεγκρίνης β1 και έκφραση ΜΜΡ2 με στόχο το 3’ -untranslation ακολουθία, αναστέλλει τα επίπεδα της πρωτεΐνης της ιντεγκρίνης β1 και ΜΜΡ2, και τη μείωση της δραστηριότητας του ενζύμου ΜΜΡ2. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-29c μπορεί να είναι μια νέα θεραπευτική υποψήφιο στόχο ή στρατηγική που επιδιώκουν να ελέγχουν τη μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική

Όλα τα πειράματα σε ζώα ήταν πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση θηλυκών γυμνών ποντικών (6-7 εβδομάδων). Τα ποντίκια αγοράστηκαν από το Εργαστήριο SLAC Ζώων Ε.Π.Ε., Ο.Ε. (Σαγκάη, Κίνα) και φροντίζονται σύμφωνα με τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου. Όλα τα ζωικά πειραματικό πρωτόκολλο εγκρίθηκε από Θεσμικών Φροντίδα Ζώων και Χρήση Επιτροπής του Πανεπιστημίου Tongji (IACUC Νο 1201).

Οι κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια

Η συνδυαστεί με χαμηλό μεταστατικό 95C και υψηλής μεταστατικό κυτταρικές γραμμές 95d υποκλωνοποιήθηκαν από ένα χαμηλό διαφοροποιημένο ανθρώπινο μεγάλο πνεύμονα καρκινώματος κυτταρική γραμμή PLA-801. Τα κύτταρα και επικυρώνονται και δημοσιεύονται από διάφορες ερευνητικές ομάδες [14], [15]. Τα κύτταρα ευγενώς από τον καθηγητή Ying-Lin Lu, Τμήμα Παθοβιολογία, Ινστιτούτο Βασικών Ιατρικών Επιστημών, Ακαδημία Στρατιωτική Ιατρικών Επιστημών, Πεκίνο, Κίνα στο 5,2009 Δεκέμβριο Όπως περιγράφεται Ο 95C και 95d τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, USA) με 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 100 μg /mL στρεπτομυκίνη και 10% ορό μόσχου, και αναπτύχθηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για τις λειτουργικές μελέτες εντός 6 μηνών μετά αποψύχθηκαν από την δεξαμενή υγρού αζώτου.

Τα microRNAs σειρά και ανάλυση qRT-PCR

Μετά την εκτέλεση μια απλή δοκιμασία μετανάστευσης στην οθόνη υψηλής και χαμηλής μεταστατικά κύτταρα , πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία transwell ως δείκτης της Matrigel εισβολής

in vivo

χρησιμοποιώντας μη επεμβατική 95C κυττάρων στον άνω θάλαμο του μη επικαλυμμένο transwell ένθετο (24-φρεατίων ένθετο? μέγεθος πόρου 8 μm? Corning, USA) και 95d κύτταρα στο πυθμένα χρησιμοποιώντας μία Matrigel (50 μg /ml) επικαλυμμένο transwell προστεθεί για να ενισχύσει τη διαφορική έκφραση του miRNAs. Στη συνέχεια miRNAs διαφορική έκφραση μεταξύ 95C και 95d μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μια σειρά miR human_01_H10.1_080277 miRNA (LC Επιστημών Χιούστον, ΗΠΑ). Όλα τα δεδομένα που κατατέθηκε στο γονιδιακής έκφρασης Omnibus (GEO). Ο αριθμός ένταξη είναι GSE47788. Οι μετρηθείσες miRNAs με στατιστική διαφορά (

ρ

& lt? 0,01). Θεωρήθηκαν ότι είναι σημαντικά εκφράζονται διαφορικά

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) διεξήχθη για να μετρηθούν τα επίπεδα έκφρασης των 95C και 95d κύτταρα. Ολικό RNA από άγριου τύπου 95C και 95d απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το συνολικό RNA (50 ng) μεταγράφηκε αντίστροφα με miR-29c στελέχους-βρόχου RT εκκινητές ή U6 RT εκκινητές (Shanghai Επέκταση Nature Biotech Co., Ltd) με τη χρήση ενός κιτ RevertAid ™ First Strand cDNA Synthesis (Fermentas, USA) σύμφωνα με με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για το σχηματισμό cDNA. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ SYBR® Προμίγματα Ex Taq ™ (Takara, Ιαπωνία) με miR-29c ή U6 εκκινητών PCR (Shanghai Επέκταση Nature Biotech Co., Ltd). Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ABI7500 PCR Πραγματικού χρόνου System (Applied Biosystems). Όλα τα δεδομένα για κάθε δείγμα συλλέχθηκαν εις τριπλούν και αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας 2

-ΔΔCt σχετική ποσοτική ανάλυση.

Gain-of-λειτουργίας και απώλεια-του-λειτουργία για την miR-29c

Η αποκτήσουν-of-λειτουργία ανιχνεύσεως με μιμείται miR-29c και τη δοκιμασία απώλειας λειτουργίας με αναστολέα miR-29c

in vitro

πραγματοποιήθηκαν με επιμόλυνση κυττάρων χρησιμοποιώντας τη μέθοδο που αναφέρεται παρακάτω. αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων του μιμείται miR-29c, αναστολέα και αρνητικός έλεγχος τους είναι:

μιμείται miR-29γ (29γ):

Sense: 5′-UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3 ‘,

Αντι-νόημα: 5′-UAACCGAUUUCAAAUGGUGCUA-3 ‘?

μιμείται miR-29c αρνητικός έλεγχος (MiNC):

Sense: 5′-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3′,

Αντι-νόημα: 5′-UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA-3 ‘?

αναστολέας miR-29c (29ci): 5′-UAACCGAUUUCAAAUGGUGCUA-3′

miR-29c αναστολέα αρνητικός έλεγχος (IhNC): 5′-UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA-3 ‘.

Όλα αυτά τα ολιγονουκλεοτίδια chemosynthesized από Επέκταση Nature Biotech, Σαγκάη.

επιμόλυνση κυττάρων

Τα 95C ή 95δ κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε περίπου 80 % συρροή σε πλάκες 6-φρεατίων και μορφομετατράπηκαν με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 6-φρεατίων μορφομετατράπηκαν με 100 ηΜ μιμείται ή 200 ηΜ αναστολέα. 24-48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για περαιτέρω πειράματα, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, την προσκόλληση, μετανάστευση, και εισβολή.

προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων

Ο πολλαπλασιασμός των επιμολυσμένων κυττάρων εκτιμήθηκαν με ΜΤΤ χημική δοκιμή. Περίπου 2 χ 103 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 96-φρεατίων με 100 μΙ μέσου σε κάθε φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες, 48 ώρες 72 ώρες και 96 ώρες, 20 μΐ ΜΤΤ (5 mg /ml) προστέθηκε σε 96-φρεατίων και επωάστηκαν για 4 ώρες πριν από την ανάγνωση στα 530 nm σε μια συσκευή ανάγνωσης πλάκας. Όλα τα ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Η κυτταρική συγκόλληση σε εξωκυτταρική μήτρα (ECM) δοκιμασίες

Η επιμολυσμένα προσκόλληση κυττάρου προς Matrigel αξιολογήθηκαν με ΜΤΤ δοκιμασία και καταμέτρηση. Στην δοκιμασία ΜΤΤ, οι πλάκες 96 φρεατίων προ-επικαλύπτονται με 40 μΐ 50 μg /ml Matrigel (BD Biosciences, Η.Π.Α.) και έπειτα 1 Χ 104 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο σε μία πλάκα 96-φρεατίων με 100 μΐ μέσου και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες. Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε τη δοκιμασία ΜΤΤ που περιγράφηκε προηγουμένως μετά τρεις φορές το πλύσιμο μακριά τα μη προσκολλημένα κύτταρα με PBS. Στην δοκιμασία καταμέτρησης, το 95d και 95C κύτταρα επιμολύνθηκαν με φακοϊό από NC-CMV-GFP-LV (Shanghai Genechem) ώστε να εκφράζουν σταθερά το γονίδιο GFP. Τα κύτταρα 95d-GFP και 95C-GFP επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ μιμείται ή 200 ηΜ αναστολέα, αντίστοιχα, σε επεξεργασία με θρυψίνη, πλύθηκαν δύο φορές σε 1 χ PBS, και στη συνέχεια 1 × 104 κύτταρα with100 μΙ μέσου τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο σε 96 φρεατίων πλάκα προ-επικαλύπτονται με 40 μΐ 50 μg /ml Matrigel και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 min.The μη προσκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές με PBS, και ο αριθμός των κυττάρων που προσκολλώνται Matrigel να μετρήθηκαν υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus Corp. Tokyo, Japan) στα 100 × μεγέθυνση από 3 τυχαία επιλεγμένα πεδία πράσινο σε κάθε φρεάτιο. Τα ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν σε τρεις φορές.

μετανάστευση των κυττάρων και δοκιμασίες εισβολή

Το δυναμικό για τη μετανάστευση και την εισβολή των επιμολυσμένων κυττάρων αξιολογήθηκαν με δοκιμασία transwell. Στον προσδιορισμό της μετανάστευσης, 2,5 χ 104 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 200 μΙ μέσου με 1% ορό μόσχου στον ανώτερο θάλαμο ενός μη επικαλυμμένο ένθετο transwell. Στο κάτω θάλαμο, 600 μΐ μέσο με 10% ορό μόσχου χρησιμοποιήθηκε ως χημειο-προσέλκυσης για την ενθάρρυνση της κυτταρικής μετανάστευσης. Στην δοκιμασία εισβολή, ο άνω θάλαμος των ενθέτων transwell επικαλύφθηκαν με 50 μΙ 2.0 mg /ml Matrigel, και 5 χ 104 κύτταρα τοποθετήθηκαν στον άνω θάλαμο του Matrigel επικαλυμμένων ένθετο transwell. Κύτταρα και των δύο δοκιμασιών επωάστηκαν για 24 ώρες και τα κύτταρα που δεν μεταναστεύουν ή να εισβάλει απομακρύνθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μάκτρο βάμβακος. Όλα τα κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας κρυσταλλικό ιώδες χρώση και μετρήθηκαν υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο. Έχουμε επιλέξει τέσσερις τυχαία απόψεις να μετρήσει τα κύτταρα και τα ανεξάρτητα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Προσδιορισμός του miR-29c ακολουθίες στόχευσης από υπολογιστική πρόβλεψη

Υπολογιστική πρόβλεψη έχει ήδη αποδειχθεί ότι είναι ένας αποτελεσματικός και αποτελεσματική μέθοδος για την πρόβλεψη των στόχων miRNA του. Χρησιμοποιήσαμε TargetScan, PicTar και Μιράντα να προβλέψει το miR-29γ ακολουθίες στόχευσης. Στόχους που είχαν προβλεφθεί από τις τρεις βάσεις δεδομένων και είχαν σχέση με την εισβολή και μετάσταση όγκου θεωρήθηκαν σχετικές με την έρευνά μας.

δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης για τον προσδιορισμό των επιδράσεων των αλληλουχιών στόχου της περιοχής 3′-UTR της ιντεγρίνης β1 και ΜΜΡ2

το θραύσμα 3′-UTR των β1 ιντεγκρίνης και τα γονίδια ΜΜΡ2, συμπεριλαμβανομένης της θέσης δέσμευσης miR-29c, ενισχύθηκε με PCR από 95d κύτταρο γονιδιωματικό DNA χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές. PCR εκκινητές για β1 ιντεγκρίνης ήταν:

Intβ1-

Sal

I-UTR1, 5′-TGGAGCTCTAACTGCCCGTGCAAATCCCACAAC-3 ‘(προς τα εμπρός),

Intβ1-

ΜΙυ

I-UTR2, 5′-TGACGCGTAACTTCAGTAAATAGCACTGTA-3 ‘(αντίστροφο)

εκκινητών PCR για ΜΜΡ2 ήταν:.

MMP2-

ΜΙυ

Ι-UTR1, 5′ -TGACGCGTAACTGCCTTCGATACACCGGGCCTG-3 ‘(προς τα εμπρός), MMP2-

Hind

ΙΙΙ-UTR2, 5′-TGAAGCTTGCACATAGAAAGCACTCTATTAATTC-3′ (αντίστροφο).

Η β1 ιντεγκρίνης και γονιδιακή μετάλλαξη ΜΜΡ2 3′-UTR τεμάχιο που περιέχει τη θέση δεσμεύσεως miR-29c ενισχύθηκε από το θραύσμα 3′-UTR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές για ιντεγκρίνης β1 με Intβ1-

Sal

I-UTR1 + Intβ1-

ΜΙυ

Ι

mut

-UTR3 (5′-TGACGCGTGAAGAGGTGACAGAAACTAAGT GACATTAAAC-3 ‘) και για ΜΜΡ2 από MMP2-

ΜΙυ

I-UTR1 + MMP2-

Hind

III

-mut -.

UTR (5′-TGAAGCTTGAAGAGCCTGAAGTGTGGCAGCGTCTGGGC-3 ‘) (οι υπογραμμισμένες βάσεις δείχνουν τη θέση μετάλλαξης)

το ενισχυμένο θραύσμα κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα pMIR-REPORT λουσιφεράσης (Ambion, USA) κατά τη em

Sal

I +

ΜΙυ

I

και ΜΙυ

I +

Hind ιστοσελίδα

III για ιντεγκρίνης β1 και ΜΜΡ2, αντίστοιχα.

Η 95C ή 95d κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων που περιέχει 200 ​​ng λουσιφεράση πυγολαμπίδας φορέα, 40 ng

Renilla

λουσιφεράσης φορέα ρΡΙ_-ΤΚ (Promega, USA) και 100 ηΜ μιμείται ή 200 ηΜ αναστολέα. Λουσιφεράση πυγολαμπίδας ενήργησε ως γονίδιο αναφοράς και

Renilla

λουσιφεράσης ως κανονικοποιημένη ελέγχου. Τα επιμολυσμένα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες. Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Assay System Reporter (Promega, USA).

κηλίδωση Western

Για την απομόνωση των συνολικών πρωτεϊνών, θεραπεία και κύτταρα μάρτυρες εκπλύθηκαν με 1 χ PBS, λύθηκαν με ρυθμιστικό RIPA (50 m mol /L Tris-base, 150 m mol /L NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton Χ-100, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 1 m mol /L ορθοβαναδικό νάτριο, 10 m mol /L νάτριο φθορίδιο, 1% κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης) για 15-20 λεπτά επί πάγου. Μετά από φυγοκέντρηση στις 12000 rpm για 15 λεπτά, συλλέχθηκαν τα υπερκείμενα. και η συγκέντρωση πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε με την δοκιμασία BCA πρωτεΐνης. 20-30 μg ολικών πρωτεϊνών διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης SDS-PAGE, θερμάνθηκαν στους 100 ° C για 5 λεπτά, διαχωρίστηκαν σε 10% πηκτή πολυακρυλαμιδίου, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Amersham Biosciences). Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε γάλα 5% άπαχο σε ρυθμιστικό TBST (Τρις Ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα που περιέχει 0.1% Tween-20) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια επωάζονται όλη τη νύκτα στους 4 ° C με την κατάλληλα αραιωμένου πρώτα αντισώματα για μονοκλωνικά κουνελιού αντι -ανθρώπινη β1 ιντεγκρίνης και ΜΜΡ2 (αραιωμένο 1:1000? Cell Signaling Technology). Μετά από εκτεταμένη πλύση με ρυθμιστικό διάλυμα TBST, τα στυπώματα στη συνέχεια επωάστηκαν με συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από εκτεταμένη πλύση με ρυθμιστικό διάλυμα TBST, πρωτεΐνες-στόχοι ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια αντιδραστήρια ECL.

ζελατίνης ζυμογραφία της δραστικότητας του ενζύμου ΜΜΡ2

Το πείραμα αυτό επιδιώκεται για την ανίχνευση ειδικών ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 δραστικότητα του ενζύμου. Τα μέσα χωρίς ορό που συλλέγεται από την επιμολυσμένα 95C και 95d κυττάρων μετά από 24 ώρες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας ζελατίνη ζυμογραφία (Applygen, Κίνα). δραστικότητα ΜΜΡ μετρήθηκε με SDS-PAGE υπό μη αναγωγικές συνθήκες. Η γέλη περιείχε 1% ζελατίνη και 30% ακρυλαμίδιο. Η ηλεκτροφόρηση διεξήχθη στους 4 ° C. Μετά από πλύση με το ρυθμιστικό διάλυμα Α (που περιέχει 2% Triton Χ-100) από το κιτ, το πήκτωμα επωάζεται σε 37 ° C με το ρυθμιστικό διάλυμα Β (που περιέχει το απαραίτητο μεταλλικό ιόν: 5 mmol /CaCl

2, 1 mmol /L ΖηΟ

2). δραστικότητα ΜΜΡ οπτικοποιήθηκε με χρώση με Coommasie Blue R-250.

In vivo δοκιμασίες μετάστασης σε γυμνό μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντίκια

Ο 95d και 95C κύτταρα επιμολύνθηκαν με φακοϊό του U6-RNAi- (Ubi ) -luc-LV (Σαγκάη Genechem) ώστε να εκφράζουν σταθερά την λουσιφεράση πυγολαμπίδας σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Οι 95d-Luc και 95C-Luc κύτταρα επιμολύνθηκαν με 100 ηΜ μιμείται ή 200 ηΜ αναστολέα, αντίστοιχα, σε επεξεργασία με θρυψίνη, πλύθηκαν δύο φορές σε 1 χ PBS, και επαναιωρήθηκαν σε μια συγκέντρωση 1-5 × 10

6 κύτταρα /ml σε κρύο 1 × PBS. Θηλυκά γυμνά ποντίκια (ηλικίας 6-7 εβδομάδων) αναισθητοποιήθηκαν με ενδοπεριτοναϊκή ένεση κεταμίνης (90-110 mg /kg) και ξυλαζίνης (10 mg /kg) πριν από τις ενέσεις ενδοκαρδιακά και τοποθετήθηκαν σε ύπτια θέση. Με μια βελόνα διαμετρήματος 25, 2-3 × 10

5 κύτταρα εγχύθηκαν εντός της αριστερής κοιλίας (όγκος 0,1 ml) μετά την απεικόνιση της αρτηριακής ροής του αίματος μέσα στη σύριγγα. Μετά την ένεση, τα ποντίκια τοποθετήθηκαν σε κλουβιά θέρμανση να συνέλθουν από την αναισθησία. Τα ζώα των κυττάρων-ένεση στεγάστηκαν κάτω από άσηπτες συνθήκες σε Experimental Animal Facility του Πανεπιστημίου Tongji (Σαγκάη, PR China).

Για το

in vivo

δοκιμασία μετάσταση, μετάσταση του καρκίνου του πνεύμονα παρακολουθείται η ζώντα ζώα με bioluminescent απεικόνισης (BLI) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα LB 983 in-vivo απεικόνισης (Berthold) ξεκινώντας 3-4 εβδομάδες μετά την εμφύτευση. Δεκαπέντε λεπτά πριν από

in vivo

BLI, τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν με 1-3% ισοφλουράνιο και εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς με D-λουσιφερίνης (150 mg /kg σε 1 × PBS). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 5 ή 6 ποντικοί ανά ομάδα και επαναλήφθηκε τρεις φορές. Η ανάπτυξη των μεταστάσεων στα οστά παρακολουθήθηκε με ραδιογραφία ακτίνων-Χ για 6-8 εβδομάδες μετά την ένεση. Οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν, τοποθετήθηκαν σε ένα διαφανές σκάφους σε πρηνή και πλευρικές θέσεις, εκτίθενται σε ακτίνες Χ σε 30 kV και 0,5 mA για 10 s σε μία ακτινογραφία Σύστημα Fixitron MX-20 στο Ινστιτούτο Τραυματολογίας & amp? Ορθοπεδική, Σαγκάη Ακαδημία Παραδοσιακής Κινέζικης Ιατρικής.

Η στατιστική ανάλυση

Ποσοτικές τιμές παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM. Η Φοιτητών

t

και χ

2 δοκιμές έγιναν για να συγκρίνουν τα αντίστοιχα στοιχεία. Οι διαφορές με το

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

miR-29c ρυθμίζεται προς τα κάτω σε high-μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων

σε αυτή τη μελέτη, επελέγησαν ο 95C και 95d κυτταρικές σειρές, επειδή προέρχονται από το ίδιο άτομο και υπάρχει μια δραματική διαφορά σε μεταστατικό συμπεριφορά τους. Για τον προσδιορισμό της διαφορικής έκφρασης των miRNAs μεταξύ 95C και 95d κύτταρα. Πρώτον, μια πρωτεύουσα διαλογή διεξήχθη χρησιμοποιώντας μία απλή δοκιμασία εισβολής transwell Matrigel πριν συστοιχία miRNA. Βρήκαμε μια σημαντική διαφορική έκφραση των miRNAs μεταξύ 95C και 95d κύτταρα χρησιμοποιώντας ποικιλία miRNA (Λεπτομέρειες στον πίνακα S1). Για να μελετηθεί ο πιθανός ρόλος των miRNAs που αναστέλλουν μετάσταση στους πνεύμονες των καρκινικών κυττάρων και εν δυνάμει υποψήφιες στόχευση γονιδίων, εστιάσαμε στην miR-29c, διότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κύτταρα υψηλού μεταστατικού 95d και πάνω ρυθμισμένα σε 95C κύτταρα χαμηλής μεταστατικής. Το εύρημα αυτό μπορεί να συνεπάγεται τη λειτουργία miR-29c ως καταστολέας μετάσταση των όγκων. Τα δεδομένα από qRT-PCR επιβεβαίωσε περαιτέρω τα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης του miR-29c μεταξύ 95C και 95d κύτταρα. Το αποτέλεσμα αυτό είναι συνεπές με τα αποτελέσματα σειρά miRNA. (MiR-29γ έδειξε 3,8 φορές φορές υψηλότερη σε 95C από 95d από το Σχήμα 1Α).

(Α) qRT-PCR του miR-29c στην 95d και κυτταρικές 95C γραμμές. Αλλαγή υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας 2

-ΔΔCt σχετική ποσοτική ανάλυση? **

σ

& lt? 0,01 (Μαθητή

t

-τεστ). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές (η = 3). (Β) miR-29c αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε κύτταρα 95d με δοκιμασία ΜΤΤ. **

σ

& lt? 0,01 (Μαθητή

t-test

, n = 3). (Γ) αναστολέα miR-29c αυξήθηκε κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε 95C κύτταρα με ανάλυση ΜΤΤ. **

σ

& lt?. 0.01 (

t-test

, n = 3 Student)

Η

miR-29c καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα 95δ

Για να προσδιορίσετε αν το miR-29c καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα, μιμείται miR-29c (miR-29γ) και μιμείται αρνητικού ελέγχου (MiNC) μετήχθησαν σε 95δ κύτταρα, ενώ αναστολέας miR-29c (29ci) και αναστολέα αρνητικού ελέγχου ( IhNC) διαμολύνθηκαν σε 95C κύτταρα. προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθηκαν για να μετρηθεί πολλαπλασιασμός κυττάρου. Τα αποτελέσματα (Σχήμα 1 Β) υποδεικνύουν ότι miR-29c έχει ανασταλτική δράση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 95d. Δεν υπήρχε διαφορά στις 24 ώρες στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων 95d μεταξύ του miR-29c και ομάδες MiNC (

σ

& gt? 0,05). Ωστόσο, υπήρχε μια σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων μετά από 48 ώρες, 72 ώρες και 96 ώρες επώασης (

ρ

& lt? 0,01). Οι ανασταλτικές αποδόσεις ήταν 37,5%, 54,4% και 40,3% (Σχήμα. 1 Β), αντίστοιχα. Ως εκ τούτου, η αναστολή του miR-29γ του πολλαπλασιασμού των κυττάρων 95d είναι μια εξαρτώμενη από το χρόνο της διαδικασίας.

Σε 95C κύτταρα επιμολυσμένα με αναστολέα miR-29c (miR-29ci), ο πολλαπλασιασμός αυξήθηκε σε έναν χρόνο εξαρτώμενο τρόπο. Τα ποσοστά πολλαπλασιασμού μεταξύ των ομάδων miR-29ci και IhNC δεν ποικίλλει (

σ

& gt? 0,05) στο σημείο 24 ώρες επώασης. Ωστόσο, υπήρξε μια στατιστικά σημαντική μεταξύ των δύο ομάδων μετά από 48 ώρες, 72 ώρες και 96 ώρες επώασης με ρυθμούς πολλαπλασιασμού του 15,2%, 13,7% και 10,4% (Σχήμα 1 C,

ρ

& lt? 0,01), αντίστοιχα. Ως εκ τούτου, miR-29c προωθείται πολλαπλασιασμό των κυττάρων 95C σε ένα χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο.

miR-29c αναστέλλει την προσκόλληση των κυττάρων σε ECM in vitro

Προσκόλληση σε ECM είναι ένα βασικό βήμα, όταν τα καρκινικά κύτταρα οι ίδιοι φυτέψει σε απομακρυσμένες περιοχές κατά τη διάρκεια της μετάστασης. Matrigel που περιέχει τα συστατικά της βασικής μεμβράνης μπορεί να προσομοιώσει την κυτταρική προσκόλληση

in vitro.

Πήραμε πλεονέκτημα αυτής της ιδιοκτησίας και εκτελείται μια δοκιμασία προσκόλλησης. Σε 95d κύτταρα επιμολυσμένα με μιμείται miR-29c (MIR-29c) και μιμείται αρνητικό μάρτυρα (MiNC), ο αριθμός των κυττάρων που προσκολλώνται στο Matrigel μειώθηκε σημαντικά (

ρ

& lt? 0,01, Σχήμα 2 Α-Γ ) μετά miR-29c επιμόλυνση σε σύγκριση με εκείνα επιμολυσμένα με MiNC. Ωστόσο, σε 95C κύτταρα επιμολυσμένα με αναστολέα miR-29c (29ci) και αναστολέα αρνητικό μάρτυρα (IhNC), αναστολέα miR-29c έχει αυξηθεί σημαντικά προσκόλληση 95C να matrigel όταν τα κύτταρα επιμολυσμένα με αναστολέα miR-29c σε σύγκριση με εκείνους που μορφομετατρέπονται με IhNC (

ρ

& lt? 0,01, Σχήμα 2 D-F). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι mir-29c μπορεί να μειώσει τον αριθμό των κυττάρων προσκόλλησης σε υψηλής μετάσταση 95d κύτταρα, ενώ η αναστολή της mir-29c μπορεί αυξημένη προσκόλληση κυττάρων σε χαμηλού μεταστατικού 95C κύτταρα (Σχήμα 2).

( Α) 95d κύτταρα επιμολυσμένα με μιμείται miR-29c προσκόλληση σε Matrigel μετρήθηκε με απαρίθμηση όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Εκπρόσωπος τομείς της 95d 29c και 95d MiNC (μεγέθυνση χ 100). (Β) Αριθμός Μέσος όρος προσκόλληση κυττάρου ανά τυχαία τομέα. **

P

& lt? 0,01 (Μαθητή

t-test

, n = 3). (C) miR-29c αναστέλλει 95δ κυτταρική προσκόλληση (ΜΤΤ δοκιμασία). **

σ

& lt? 0,01 (Μαθητή

t-test

, n = 3). (Δ) Εκπρόσωπος πεδία από 95d 29ci και 95C IhNC καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων (μεγέθυνση χ 100). (Ε) Αριθμός Μέσος όρος προσκόλληση κυττάρου ανά τυχαία τομέα. **

P

& lt? 0,01 (Μαθητή

t-test

, n = 3). (F) Καταστολή του miR-29c αυξημένη κυτταρική προσκόλληση σε 95C κύτταρα (ΜΤΤ δοκιμασία). **

σ

& lt?. 0.01 (Μαθητή

t-test

, n = 3)

Η

miR-29c αναστέλλει τον κυτταρικό εισβολή και τη μετανάστευση in vitro

δοκιμασίας Transwell χρησιμοποιείται ευρέως για τη μέτρηση της κυτταρικής συμπεριφοράς κατά τη μετανάστευση και την εισβολή, βασικά βήματα στη μετάσταση του όγκου. Θέτουμε μια μεμβράνη Matrigel ή το ίδιο το transwell με χημειο-προσέλκυσης για την προσομοίωση των κυττάρων εισβολής και της συμπεριφοράς της μετανάστευσης

in vitro

. Σε 95d κύτταρα μετά από miR-29c και MiNC επιμόλυνση, μια ορατή σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε με λιγότερες miR 29c-επιμολυσμένα κύτταρα μετρήθηκαν από MiNC επιμολυσμένα κύτταρα (αριθμοί κυττάρων μειώνονται 104,2% το δοκιμασία μετανάστευσης και 136% στη δοκιμασία εισβολής,

ρ

& lt? 0,01). Το εύρημα αυτό μπορεί να υποδεικνύει ότι η ρύθμιση προς τα πάνω του miR-29c αναστέλλει τον κυτταρικό εισβολή και τη μετανάστευση (Σχήμα 3Α και Β). Σε αντίθεση, η επιμόλυνση των 95C κύτταρα με αναστολέα miR-29c και IhNC παρουσίασαν αντίθετο αποτέλεσμα? περισσότερα miR-29c αναστολέα επιμολυσμένα κύτταρα διέρχεται διαμέσου του Matrigel και της μεμβράνης transwell (αριθμοί κυττάρων αυξήθηκαν περίπου 79,7% κατά την δοκιμασία μετανάστευσης και 97,4% στην δοκιμασία εισβολής,

ρ

& lt? 0,01) σε σύγκριση με τα κύτταρα 95C transefected με IhNC (Σχήμα 3 Γ και Δ). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το miR-29c επηρεάζεται κυττάρων εισβολή και τη συμπεριφορά της μετανάστευσης

in vitro

.

(Α) Σε μια δοκιμασία εισβολής Matrigel, μιμείται miR-29c επιμολυσμένα 95δ κύτταρα vs MiNC επιμολυσμένα κύτταρα σε ένα 200 × φως πεδίο εφαρμογής μετά από χρώση με κρυσταλλικό ιώδες. (Β) Matrigel εισβολής και transwell μετανάστευση: 95d κύτταρα μετρήθηκαν σε ένα ελαφρύ πεδίο εφαρμογής σε τέσσερις τυχαία προβολές. **

σ

& lt? 0,01 (Μαθητή

t-test

, n = 4). (Γ) Σε μια δοκιμασία εισβολής Matrigel, αναστολέας miR-29c επιμολυσμένα κύτταρα 95C vs IhNC επιμολυσμένα κύτταρα σε ένα ελαφρύ έκταση 200 × μετά από χρώση κρυσταλλικού ιώδους. (D) Matrigel εισβολής και μετανάστευση transwell: κύτταρα 95C μετρήθηκαν σε ένα ελαφρύ πεδίο εφαρμογής σε τέσσερις τυχαία προβολές. **

σ

& lt? 0,01 (Μαθητή

t-test

, n = 4)

Η

miR-29c στοχεύει άμεσα 3′-UTR της ιντεγκρίνης. β1 και γονίδιο ΜΜΡ2

Για να διερευνήσουν περαιτέρω τους μηχανισμούς με τους οποίους miR-29c καταστέλλει τον καρκίνο του πνεύμονα εισβολή κυττάρων και τη μετάσταση, αναλύσαμε πιθανό τα γονίδια που σχετίζονται με μετάσταση στα κατάντη του όγκου. Υπολογιστική πρόβλεψη χρησιμοποιήθηκε για να μάθετε το πιο πιθανό γονίδιο στόχο. Πήραμε πλεονέκτημα των βάσεων δεδομένων TargetScan, PicTar και Miranda των προβλεπόμενων στόχων microRNA για να αναλύσει taregets του miR-29c. Οι 3′-UTRs της ιντεγκρίνης β1 (Intβ1) και ΜΜΡ2 φέρουν miR-29γ-θέσεις σύνδεσης. 3′-UTR του ιντεγκρίνης β1 και MMP 2 του miR-29c-θέσεις δέσμευσης έχει εξαιρετικά συντηρητικές αλληλουχίες στα θηλαστικά (Σχήμα 4Α και D). Οι μελέτες για τα πιθανά λειτουργίες του miR-29c στην κυτταρική προσκόλληση και την εισβολή μας ενθάρρυνε την περαιτέρω έρευνα σε β1 ιντεγκρίνης και ΜΜΡ2.

(Α) Οι διατηρούμενες στόχευση της 3′-UTRs του β1 ανθρώπινου int από ΜΙΚ 29c (υπογραμμισμένη). Η άγριου τύπου και μεταλλαγμένες αλληλουχίες του int β1 3′-UTR παρατίθενται για λόγους σύγκρισης. (Β) Δοκιμασία ρεπόρτερ Dual-λουσιφεράσης γονίδιο στόχο για int β1 σε 95d κύτταρα επιμολυσμένα με μιμείται miR-29c. **

σ

& lt? 0,01 (Μαθητή

t-test

, n = 3). (C) Δοκιμασία ρεπόρτερ Dual-λουσιφεράσης γονίδιο στόχο για int β1 σε 95C κύτταρα με ή χωρίς την επιμόλυνση αναστολείς Mir-29c. **

σ

& lt? 0,01 (Μαθητή

t-test

, n = 3). τοποθεσίες στην περιοχή ΜΜΡ2 3’UTR δεσμευτική (D) miR-29c (υπογραμμισμένη)? θέση δέσμευσης είναι εντόνως διατηρημένο σε σπονδυλωτά ζώα, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων. Τα άγριου τύπου και μεταλλαγμένες αλληλουχίες του ΜΜΡ2 3’UTR παρατίθενται για λόγους σύγκρισης. (Ε) δοκιμασία ανταποκριτή Dual-λουσιφεράσης των ΜΜΡ2 mRNA σε 95d κύτταρα επιμολυσμένα με μιμείται miR-29c. **

σ

& lt? 0,01 (Μαθητή

t-test

, n = 3). (F) δοκιμασία ανταποκριτή Dual-λουσιφεράσης των ΜΜΡ2 mRNA σε 95C κύτταρα με ή χωρίς την επιμόλυνση αναστολείς Mir-29c. **

σ

& lt? 0,01 (Μαθητή

t-test

, n = 3)

Η

Για να προσδιορίσετε αν ιντεγκρίνης β1 και ΜΜΡ2 καταστέλλονται από ΜΙΚ. 29c μέσω σύνδεσης προς mRNA τους 3′-UTR, πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης για την επαλήθευση της σχέσης μεταξύ του γονιδίου στόχου και δύο miR-29c. Η άγριου τύπου και μεταλλαγμένων β1 ιντεγκρίνης και MMP 2 mRNA 3′-UTR εισήχθησαν στο κατάντη περιοχή του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης από τον φορέα pMIR-REPORT, και συγκεκριμένα η ιντεγκρίνη β1 διάνυσμα 3′-UTR άγριου τύπου, ΜΜΡ 2 3 «-UTR φορέα, μετάλλαγμα ιντεγκρίνης διάνυσμα β1 3′-UTR και μεταλλαγμένων ΜΜΡ2 διάνυσμα 3′-UTR, αντίστοιχα. Χρησιμοποιήσαμε τον φορέα λουσιφεράσης pMIR-ΕΚΘΕΣΗ ως μάρτυρας γιατί δεν θα πρέπει να επηρεάζεται από οποιαδήποτε μιμείται miR-29c ή αναστολέα, και μπορεί επίσης να λειτουργήσει ως πρότυπο έλεγχος για την απόδοση επιμόλυνσης. Ως εκ τούτου,

Renilla

φορέα λουσιφεράσης (φορέας ρΡΙ_-ΤΚ) και φορέα λουσιφεράση πυγολαμπίδας συν-επιμολύνθηκαν με μιμείται ή αναστολέα. Σε 95d κυττάρων με μιμείται miR-29c, η δράση της λουσιφεράσης του άγριου τύπου β1 ιντεγκρίνης και διάνυσμα ΜΜΡ2 σχετική αναλογία αναστάλθηκε περίπου 2,00 φορές συγκριτικά με τον έλεγχο (Σχήμα 4 Β και C,

ρ

& lt? 0,01) . Αν και η μετάλλαξη β1 ιντεγκρίνης και διάνυσμα ΜΜΡ2 σε 95d κύτταρα έδειξαν χαμηλότερη δραστικότητα λουσιφεράσης από τον έλεγχο, δεν υπήρχε σημαντική διαφορά (

σ

& gt? 0,05). Σε 95C κύτταρα, η αναστολή της miR-29c έχει αύξηση β1 ιντεγκρίνης και δραστικότητα λουσιφεράσης ΜΜΡ2 (Σχήμα 4 Ε και F

ρ

& lt? 0,01) σε σύγκριση με κύτταρα που δεν διεγέρθηκαν με αναστολέα miR-29c λόγω της β1 ιντεγκρίνης και δραστικότητα λουσιφεράσης φορέα ΜΜΡ2, η οποία αναστέλλεται από ενδογενή miR-29c. Ομοίως, μεταλλαγμένο β1 ιντεγκρίνης και ΜΜΡ2 σε 95C κύτταρα δεν έδειξαν σημαντική αντίδραση στον έλεγχο (

σ

& gt? 0,05). Προφανώς, miR-29c στοχεύει β1 ιντεγκρίνης και ΜΜΡ2 άμεσα αφού κέρδος-of-λειτουργία του miR-29c σε 95d κυττάρων μειώθηκε σημαντικά την δραστικότητα λουσιφεράσης β1 ιντεγκρίνης και φορέα ΜΜΡ2, και απώλειας λειτουργίας του αναστολέα miR-29c σε 95C κύτταρα έδειξαν ότι ιντεγκρίνης β1 και ΜΜΡ2 διατηρεί επίπεδο έκφρασης του μόνο όταν τα κύτταρα δεν εκτίθενται σε αναστολέα miR-29c (Σχήμα 4).

miR-29c αναστέλλει την ενδογενή έκφραση πρωτεΐνης της β1 ιντεγκρίνης και ΜΜΡ2

για να διερευνηθεί περαιτέρω τα αποτελέσματα των miR-29c για ιντεγκρίνης έκφραση β1 και πρωτεΐνες ΜΜΡ2 από κηλίδωση Western. Σε 95d κύτταρα επιμολυσμένα με μιμείται miR-29c, η έκφραση της ιντεγρίνης β1 και ΜΜΡ2 στα επίπεδα πρωτεΐνης ήταν σημαντικά μικρότερη από εκείνη του αρνητικού μάρτυρα κυττάρων διαμολυσμένων με MiNC (Σχήμα 5,

ρ

& lt? 0,01) . Σε 95C κύτταρα, σε σύγκριση με κύτταρο επιμολυσμένα με IhNC, κηλίδωση Western αποτελέσματα έδειξαν β1 ιντεγκρίνης και έκφραση ΜΜΡ2 preotein ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω μετά επιμολύνθηκαν με αναστολέα miR-29c σε 95C (Σχήμα 5,

ρ

& lt? 0,01). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν β1 ιντεγκρίνης και ΜΜΡ2 είναι άμεσοι στόχοι του miR-29.

(Α) Επίδραση των miR-29c στην ενδογενή ιντεγκρίνης β1 πρωτεϊνών.