Αφηρημένο

Ιστορικό

KRAS, BRAF

και

PIK3CA

μεταλλάξεις παρατηρούνται συχνά σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC). Ειδικότερα,

KRAS

μεταλλάξεις είναι ισχυροί προγνωστικοί παράγοντες για την κλινική έκβαση των EGFR-στοχευμένες θεραπείες, όπως cetuximab και panitumumab στον μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου (mCRC). Για την ανάλυση μετάλλαξης, οι τρέχουσες μέθοδοι είναι χρονοβόρες και δεν είναι άμεσα διαθέσιμα σε όλους τους ογκολόγους και παθολόγους. Έχουμε αναπτύξει μια νέα, απλή, ευαίσθητη και πλήρως αυτοματοποιημένο σύστημα μοριακής διάγνωσης (τροπολ) για το σημείο ελέγχου της φροντίδας (POCT). Εδώ αναφέρουμε τα αποτελέσματα μιας μελέτης σύγκρισης μεταξύ των AMD και άμεση αλληλούχιση (DS) στην ανίχνευση του

KRAS, BRAF

και

PI3KCA

σωματικές μεταλλάξεις.

Μεθοδολογία /Principal η εύρεση

DNA εκχυλίζεται από μια φέτα είτε κατεψυγμένα (n = 89) ή σταθεροποιημένο με φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη (FFPE) CRC ιστού (n = 70), και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για ανάλυση μετάλλαξης με amdS και DS . Όλες οι μεταλλάξεις (n = 41 μεταξύ κατεψυγμένα και 27 μεταξύ των δειγμάτων FFPE) που ανιχνεύεται από DS ήταν επίσης επιτυχώς (100%) που ανιχνεύεται από το amdS. Ωστόσο, 8 κατεψυγμένα και 6 FFPE δείγματα ανιχνεύθηκε ως άγριου τύπου στην ανάλυση DS παρουσιάστηκαν ως μεταλλάκτες στην ανάλυση amdS. Με αναλύσεις κλωνοποίηση αλληλουχίας, αυτές οι ασύμφωνα δείγματα επιβεβαιώθηκαν ως αληθινή μεταλλάξεις. Ένα δείγμα είχε ταυτόχρονες «hot spot» μεταλλάξεις του

KRAS

και

PIK3CA

, και δοκιμασία κλωνοποίησης comfirmed ότι E542K και E545K δεν ήταν στο ίδιο αλληλόμορφο. Γονοτυπική ποσοστά κλήσης για το DS ήταν 100,0% (89/89) και 74,3% (52/70) σε κατεψυγμένα και FFPE δείγματα, αντίστοιχα, για την πρώτη προσπάθεια? λαμβάνοντας υπόψη ότι από τροπολ ήταν 100,0% και για τα δύο σύνολα δειγμάτων. Για την αυτοματοποιημένη εξαγωγή DNA και ανίχνευση μετάλλαξης από AMD, κατεψυγμένα ιστούς (n = 41) ήταν επιτυχία ανιχνεύονται όλες οι μεταλλάξεις μέσα σε 70 λεπτά.

Συμπεράσματα /Σημασία

των AMD έχει ανώτερη ευαισθησία και την ακρίβεια πάνω από DS, και είναι πολύ πιο εύκολο να εκτελέσει από τα συμβατικά εντάσεως εργασίας χειροκίνητη ανάλυση μετάλλαξης. Των AMD έχει μεγάλες δυνατότητες για τον εξοπλισμό POCT για ανάλυση μετάλλαξης

Παράθεση:. Kitano S, Myers J, Nakamura J, Yamane Α, Yamashita Μ, Nakayama M, et al. (2013) A Novel Πλήρως αυτοματοποιημένο Μοριακή Διαγνωστική Συστήματος (τροπολ) για παχέος Ανίχνευση Καρκίνου μετάλλαξη. PLoS ONE 8 (5): e62989. doi: 10.1371 /journal.pone.0062989

Επιμέλεια: Αντώνης WI. Lo, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 8η Ιανουαρίου του 2013? Αποδεκτές: 27 Μαρ 2013? Δημοσιεύθηκε: May 9, 2013

Copyright: © 2013 Kitano et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από την εταιρεία των συγγραφέων (Τορραη ΕΚΤΥΠΩΣΕΙΣ CO., LTD.). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από την εταιρεία των συγγραφέων (Τορραη PRINTING CO., LTD. ). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Το ανθρώπινο

KRAS

ογκογονίδιο μεταλλάσσεται σε πάνω από το 30% των CRC, και πάνω από 3.000 σημειακές μεταλλάξεις έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα [1]. Οι πιο συχνές αλλοιώσεις ανιχνεύονται στο κωδικόνιο 12 (-82% όλων των αναφερόμενων

KRAS

μεταλλάξεις) και στο κωδικόνιο 13 (~ 17%), οι οποίες είναι και οι δύο στο εξόνιο 2 του

KRAS

γονίδιο [2] και φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της CRC [3].

BRAF

κωδικοποιεί μια κινάση σερίνης /thereonine που ενεργοποιεί την οδό RAS-ΜΑΡΚ, και μετάλλαξης του έχουν βρεθεί σε 4-15% των CRC.

PIK3CA

κωδικοποιεί την καταλυτική υπομονάδα ρ110 άλφα του ΡΙ3Κ [4], και μεταλλαγμένων PIK3CA διεγείρει την οδό ΑΚΤ και προάγει την ανάπτυξη των κυττάρων σε διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων CRC [5].

PIK3CA

μεταλλάξεις έχουν περιγραφεί στο 10% -30% των CRC [6], και σχετίζονται με

KRAS

μετάλλαξη. Υπήρξε μια έκθεση ότι η παρουσία των μεταλλάξεων στο

PIK3CA

,

KRAS

, ή

BRAF

στο CRC έδειξε χειρότερη έκβαση των ασθενών [7], και μεταξύ των ασθενών που υποβάλλονται σε μια θεραπευτική εκτομή του CRC,

PIK3CA

μετάλλαξη συνδέεται με μικρότερη ειδική για τον καρκίνο επιβίωση [8]. Ωστόσο, η αρνητική επίδραση του

PIK3CA

μετάλλαξη μπορεί δυνητικά να περιορίζεται σε ασθενείς με

KRAS

όγκους άγριου τύπου [8].

Το cetuximab και panitumumab είναι αποτελεσματικά επιδερμικού αυξητικού παράγοντα υποδοχέα (EGFR) στοχευμένες παράγοντες για μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου (mCRC), αλλά οι ασθενείς των οποίων οι όγκοι έχουν

KRAS

μεταλλάξεις εκτός G13D [9] είναι γενικά πιστεύεται ότι δεν επωφελούνται από αυτούς τους παράγοντες [10], [11]. Περαιτέρω, μεταλλάξεις στα

BRAF

και

PIK3CA

έχουν επίσης αναφερθεί ότι επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα της στοχεύουν EGFR παράγοντες [12], [13]. Λαμβάνοντας υπόψη τη σημαντική αξία αυτών των μεταλλάξεων στην πρόβλεψη του κλινικού αποτελέσματος σε ασθενείς mCRC, μια γρήγορη, αξιόπιστη και ευαίσθητη τεχνική ταυτόχρονα τον εντοπισμό τους θα είναι απαραίτητη για την ενημέρωσε φαρμακοθεραπεία. Μέχρι στιγμής, αν και έχουν αναπτυχθεί πολλές τεχνολογίες, αυτές περιορίζονται από την περίπλοκη διαδικασία, το υψηλό κόστος, χαμηλή απόδοση ή άλλα θέματα. Για παράδειγμα, η άμεση αλληλούχιση Sanger (DS) επί του παρόντος εξακολουθεί να θεωρείται ως ένα χρυσό πρότυπο για την ανίχνευση αυτών των μεταλλάξεων. Ωστόσο, η μέθοδος DS απαιτεί πολλαπλά στάδια, που στερούνται την ικανότητα για την αυτοματοποιημένη ανάλυση. Επίσης, έχει μια μακρά σειρά-γύρω-χρόνο και είναι συνολικά σχετικά ακριβά σε σύγκριση με άλλες μεθόδους. Άλλες νεοαποκτηθέντα μεθόδους συμπεριλαμβανομένης της PCR που σχετίζονται με τις τεχνολογίες [14] – [17], πλατφόρμες αλληλουχίας [18], [19], και άλλες μεθόδους, όπως η διαχείριση των ανθρώπινων πόρων (ανάλυση τήξης High Resolution) [20] η ανάλυση είναι πιο ευαίσθητα και βολικό από το DS , ωστόσο είναι επίσης χρόνο και εργασία που καταναλώνουν [21], και δεν είναι άμεσα διαθέσιμα για τους περισσότερους κλινικούς ιατρούς, απαιτώντας συχνά ότι το δείγμα όγκου να σταλεί σε ένα εργαστήριο αναφοράς, με πιθανό αποτέλεσμα καθυστερήσεις θεραπείας.

Έχουμε αναπτύξει μια πλήρως αυτοματοποιημένη γενετική αναλυτής amdS το οποίο περιλαμβάνει διαδικασίες για την εκχύλιση του DNA /καθαρισμού, ενίσχυσης DNA (PCR), ανίχνευση μετάλλαξης με χημεία Invader® [22], [23], και την ερμηνεία γονότυπο. AmdS μπορεί να καλέσει ένα κατάσταση μετάλλαξης αυτόματα σε 70 λεπτά μετά την προσθήκη ενός δείγματος (

π.χ.,

Εκχυλίζεται γονιδιακό DNA ή δείγμα ιστού ομογενοποίημα) στο φυσίγγιο. Εδώ, αναφέρουμε μια μελέτη σκοπιμότητας των AMD για την ανίχνευση σωματικών

KRAS

,

BRAF

και

PI3KCA

μεταλλάξεις σε ιστούς CRC σε σύγκριση με το DS σε ένα διπλό-τυφλό τρόπο. Αξιολογήσαμε πρώτα την ευαισθησία του amdS χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία τιτλοδότησης με τεχνητά κατασκευασμένο πλασμίδιο DNA. Μια κλινική μελέτη παράσταση στη συνέχεια διεξήχθη για να αξιολογηθεί περαιτέρω η ακρίβεια, η ειδικότητα και η ευαισθησία του συστήματος σε σύγκριση με το DS. Επιπλέον, η ανάλυση κλωνοποίηση αλληλουχίας διεξήχθη προκειμένου να επικυρωθεί η ασύμφωνα κατάστασης μεταλλάξεων μεταξύ των AMD και DS. Η ευελιξία του συστήματος στην ανίχνευση μεταλλάξεων από ιστούς με διαφορετικές στερεωτικά (κατεψυγμένα και FFPE) αξιολογήθηκε επίσης. Επιπλέον, εξετάσαμε την ικανότητα του συστήματος σε ένα πλήρως αυτοματοποιημένη λειτουργία: από την εκχύλιση του DNA με την ανίχνευση μετάλλαξης, χρησιμοποιώντας μία ελάχιστη ποσότητα ( PCR διεξήχθη για τα κατεψυγμένα ID = 56756, ID = 63.440 και FFPE ID = 41947, ID = 7053306 δείγματα με PrimeSTAR® GXL DNA πολυμεράση. Άλλα δείγματα διεξήχθησαν PCR με GoTaq® DNA πολυμεράση. Πιθανές συχνότητα μετάλλαξης σε ένα δείγμα = (αριθμός των μεταλλαγμένων ακολουθίας) /(αριθμός των επιτυχημένων ακολουθίας). Αν η συχνότητα ήταν υψηλότερη από ER, το δείγμα θεωρήθηκε ως θετικό για μετάλλαξη. Σημείωση: Δεν επιβεβαιώθηκε εάν ρυθμός μετάλλαξης ενός δείγματος ήταν σε θέση να να ποσοτικοποιηθεί με την ανάλυση κλωνοποίησης. (C) Venn διάγραμμα του

KRAS

,

BRAF

και

PIK3CA

μεταλλάξεις. Σε αυτό το γράφημα, αυτές οι συχνότητες μετάλλαξης δεν υπολογίζεται για τα δείγματα αλλά για τους ασθενείς. 6 δείγματα πάρθηκαν από ίδιους ιστούς και προετοιμάζονται για τόσο κατεψυγμένα και FFPE φέτα. Το amdS αναλύσεις για αυτά τα 6 δείγματα έδειξαν τα ίδια αποτελέσματα και για τις δύο Κατεψυγμένα και FFPE φέτα.

Η

Σχήμα 3C συνοψίζει τις συχνότητες των μεταλλάξεων σε όλους τους ασθενείς (n = 153) με βάση την ανίχνευση amdS. ποσοστά μετάλλαξης του

KRAS

,

BRAF

και

PIK3CA

ήταν 28,7% (44/153), 2,5% (4/153) και 10,1% (16/153) , αντίστοιχα. Η συχνότητα των συνυπάρχουν μεταλλάξεις στο

KRAS

ή

PIK3CA

ήταν 3,9% (6/153).

των AMD και DS συγκρίθηκαν για την ανθεκτικότητα στην ανίχνευση μετάλλαξης από δείγματα DNA παρασκευάσθηκε με τη χρήση διαφορετικών μεθόδων. Η εμπορική DNA κιτ καθαρισμού Qiagen (QIAmp® DNA Micro kit) χρησιμοποιήθηκε με κατεψυγμένα ιστούς, και άλλο εμπορικό κιτ εξαγωγής DNA (Quick Απόσπασμα ™) χρησιμοποιήθηκε με ιστούς FFPE. Γονοτυπική ποσοστά κλήσης για το DS ήταν 100,0% (89/89) και 74,3% (52/70) σε κατεψυγμένα και FFPE δείγματα, αντίστοιχα, για την πρώτη προσπάθεια? λαμβάνοντας υπόψη ότι από τροπολ ήταν 100,0% και για τα δύο σύνολα δειγμάτων. Το Σχήμα 4Α δεικνύει μία περίπτωση ανίχνευσης μετάλλαξης G13D, στην οποία το δείγμα ελήφθη από τον ίδιο ασθενή και υποβάλλονται σε επεξεργασία σε δύο κατεψυγμένα και FFPE φέτες. Ενώ το κατεψυγμένο δείγμα έχει μια σαφή ηλεκτροφόρημα, το δείγμα FFPE έδειξε θορυβώδη σήματα. Δέκα οκτώ δείγματα επανεξετάστηκαν για DS, και 10 από αυτά πέτυχε. Ωστόσο, 8 δείγματα δεν ήταν σε θέση να αναλυθούν τόσο στο εμπρός και αντίστροφες κατευθύνσεις μετά από πολλές προσπάθειες. Από αυτά τα 8 δείγματα, 7 δείγματα δεν θα μπορούσαν να αναλυθούν για το

BRAF

μεταλλάξεις, και 1 δείγμα δεν θα μπορούσαν να αναλυθούν τόσο για

KRAS

και

PIK3CA

μεταλλάξεις. Σε αντίθεση, των AMD απόλυτα ονομάζεται αυτά τα δείγματα ως άγριου τύπου για το

KRAS

,

BRAF

και

PIK3CA

γονίδια.

CRC ιστοί προετοιμασμένοι για δύο κατεψυγμένα και FFPE μορφή. Αυτά τα δείγματα αναλύθηκαν με δύο DS και amdS. DS παρέλειψε να καλέσει τον γονότυπο του ιστού FFPE λόγω θορυβώδη electrophenogram. Το ίδιο δείγμα ξανά αλληλουχία, και ονομάζεται ως

KRAS

άγριου τύπου. αποτελέσματα ανάλυσης (Β) amdS με διαφορετικές συνολική ποσότητα του πλασμιδιακού DNA. Στερεά σύμβολα (•? 100 fg /καλά, ▪? 10 fg /καλά, ▴? 1fg /και) δείχνουν το σήμα των δειγμάτων που περιέχουν 5% μεταλλαγμένα, και τα κενά σύμβολα (○? 100 fg /καλά, □? 10 fg /καλά, △? 1 fg /φρεάτιο) δείχνουν g πλασμιδικού DNA περιέχει περίπου 210 αντίγραφα. αποτελέσματα ανάλυσης (Γ) amdS με διαφορετικό ποσό του άγριου τύπου γονιδιωματικού DNA. (○? 100 ng /φρεάτιο, □? 10 ng /φρεάτιο, △? 1 ng /φρεάτιο).

Η

Η ευρωστία της ανίχνευσης μετάλλαξης για ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων δείγματος ελέγχθηκε επίσης για amdS. Το Σχήμα 4Β δείχνει το αποτέλεσμα του πειράματος πλασμιδιακού DNA. 5% του μεταλλαγμένου σήματος DNA είχε σαφή διαχωρισμό από υπόβαθρα για την περιοχή από 1 fg /φρεάτιο σε 100 fg /φρεάτιο του συνολικού DNA πλασμιδίου, το οποίο αντιστοιχεί σε 10 αντίγραφα έως 1000 αντίγραφα του στόχου μεταλλαγμένου DNA ανά αντίδραση. αριθμός αντιγράφων του 1 fg /φρεάτιο πλασμιδιακού DNA (210 αντίγραφα) είναι ισοδύναμο με 0,63 ng /φρεάτιο του γενωμικού DNA. Η ποσότητα του γενωμικού DNA (εκχυλίζεται κατεψυγμένου ιστού) που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη κλινικής απόδοσης ήταν 10 ng /φρεάτιο, και ότι εμπίπτει στο φάσμα του παραπάνω πειράματος. Ωστόσο, προκειμένου να ελέγξει τη στάθμη του σήματος υποβάθρου, διεξήχθησαν επιπλέον πειράματα με διάφορες ποσότητες του ανθρώπινου γενωμικού DNA. Το Σχήμα 4C δεικνύει ότι τα σήματα υποβάθρου είναι σταθερά και σχεδόν ταυτόσημη με εκείνη του πειράματος πλασμιδιακού DNA (Σχήμα 4Β) για την περιοχή από 1 ng έως 100 ng ανά φρεάτιο.

μελέτη σκοπιμότητας ενός πλήρως αυτοματοποιημένου

KRAS

,

BRAF

και

PIK3CA

Μετάλλαξη Ανίχνευση με τροπολ

Σε αυτό το πείραμα, το αργό εκχύλιση των δειγμάτων κατεψυγμένου ιστού (n = 41) πραγματοποιήθηκε με χειροκίνητη σύνθλιψη , και το ακατέργαστο ομογενοποίημα στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε ως ένα δείγμα για πλήρως αυτοματοποιημένη ανάλυση μετάλλαξης με τροπολ.

τα αποτελέσματα της πλήρως αυτοματοποιημένη ανάλυση μετάλλαξης ήταν τέλεια σύμφωνη με τις προηγούμενες μελέτες κλινικής απόδοσης (Πίνακας 5). Επιπλέον, amdS ήταν σε θέση να ανιχνεύσει όλα τα μεταλλάγματα (3/41) που DS δεν μπορούσε να ανιχνεύσει. Έτσι, amdS θα μπορούσε να ανιχνεύσει όλες τις φωτογραφίες

KRAS

(14/41, 34,1%) και

PIK3CA

(8/41, 19,5%) μεταλλάξεις ακόμη και από αυτά τα δείγματα ομογενοποιημένου (~ 1 mg ιστού).

Η

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη αξιολόγησε των AMD σε δύο σειρές (κατεψυγμένα και FFPE) των πρωτογενών ιστών CRC συνολικού ύψους 159 δείγματα. Τα δεδομένα μας πρότειναν των AMD έχει μεγαλύτερη ευαισθησία και ευελιξία από ό, τι DS. Η ανώτερη ικανότητα του συστήματος μας μπορεί να αποδοθεί στην υψηλή ευαισθησία (& gt? 0,5%) και η πιστότητα της χημείας Invader® τα οποία περιέχουν την ικανότητα ενίσχυσης σήματος [22], [23]. Αυτό έχει ιδιαίτερη σημασία για ανίχνευση μετάλλαξης όταν μεταλλαγμένο επίπεδο είναι εξαιρετικά χαμηλή. Τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 4Β και 4C δείχνουν amdS μπορεί να διατηρήσει μια ευαισθησία ανίχνευσης μετάλλαξης 5% με ένα πολύ ευρύ φάσμα (100 συγκρατεί) της συγκέντρωσης του δείγματος. Επιπλέον, Kotoura

et al

. έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι η PCR αποδοτικότητα του DS και σε πραγματικό χρόνο PCR δοκιμασία που βασίζεται σε δείγματα FFPE-ΟΝΑ που υπέστη κατακερματισμού του DNA [27]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3 και Σχήμα 4Α, τα αποτελέσματα της ανάλυσης μετάλλαξης μέσω amdS υποστηρίχθηκαν από τα αποτελέσματα κλωνοποίησης, και ο amdS έδειξε σημαντική υπεροχή στο DS στην ευαισθησία του για την ευρεία γκάμα ποσό DNA και την ποικιλία των κατάσταση στερέωσης.

Επιπλέον, το σύστημα των AMD πέτυχε ένα πλήρως αυτοματοποιημένο ανίχνευση

KRAS

,

BRAF

και

PIK3CA

μεταλλάξεις με ομογενοποιημένο κατεψυγμένα δείγματα CRC, η οποία είναι συμφέρουσα για την ανάλυση πολύτιμα δείγματα όπως ιστούς βιοψίας. Η διαδικασία ανίχνευσης μετάλλαξης του amdS είναι πολύ απλή και δεν απαιτεί πειραματική τεχνική και εμπειρία.

Ένα από τα βασικά πράγματα είναι ότι, στην ανάλυση κλωνοποίηση, παρατηρήσαμε ότι χρησιμοποιούνται συνήθως εμπορική Taq DNA πολυμεράση έχει μία όχι- τόσο χαμηλή ER, ενώ PrimeSTAR® GXL DNA πολυμεράσης με ένα ‘→ 5’ δραστηριότητα 3 εξω-νουκλεάση (επιμέλεια) έχει λιγότερο ER. Ως εκ τούτου, όταν εξαιρετικά υψηλή ευαισθησία απαιτείται για μία δοκιμασία όπως η ανίχνευση μετάλλαξης του ελεύθερου κυττάρων DNA σε δείγματα αίματος (ορός ή πλάσμα), θα πρέπει να χρησιμοποιούνται υψηλής πιστότητας πολυμεράση DNA.

Ως αποτέλεσμα της αξιολόγησης για την κλινική CRC ιστούς (n = 159) με τη χρήση των AMD, τα πρότυπα μετάλλαξης ανιχνεύεται σε δείγματα μας είναι πολύ συνεπής με όσα έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [28] – [30]. Παρατηρήσαμε πολύ ενδιαφέρουσα συνύπαρξη πολλαπλών μεταλλάξεων μεταξύ των τριών γονιδίων. Για παράδειγμα, 6 από 153 δείγματα (3,9%) κατείχαν διπλό (μία για την τριπλή) μεταλλάξεις, που υποστηρίζουν την υπόθεση της συνεργιστική ογκογένεσης μεταξύ

KRAS

και

PIK3CA

[29], [31] . Επιπλέον, υπήρχαν δύο δείγματα που κατείχε τόσο

KRAS

G13D και

PIK3CA

(E545K ή /και E542K) μεταλλάξεις.