Αφηρημένο

Η ΑΤΡ-περιορισμένου Ρ2Χ7 έχει αποδειχθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην εισβολής και μετάσταση ορισμένων όγκων. Ωστόσο, οι πιθανές συνδέσεις και υποκείμενων μηχανισμών μεταξύ Ρ2Χ7 και του καρκίνου του προστάτη δεν έχουν διευκρινιστεί. Εδώ, αποδείξαμε ότι Ρ2Χ7 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε ορισμένες κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Κάτω ρύθμιση των Ρ2Χ7 με siRNA σημαντικά εξασθενημένο ΑΤΡ- ή ΒζΑΤΡ με γνώμονα τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη in vitro, και ανέστειλε διεισδυτικότητα όγκου και μεταστάσεων σε γυμνούς ποντικούς. Επιπλέον, αποσιώπηση του Ρ2Χ7 αξιοσημείωτα εξασθενημένων ΑΤΡ- ή BzATP- οδηγείται αλλαγές έκφραση του ΕΜΤ /γονιδίων που σχετίζονται με την εισβολή σαλιγκάρι, Ε-καδερίνης, κλαουδίνης-1, IL-8 και ΜΜΡ-3, και εξασθένησε τη φωσφορυλίωση της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και ERK1 /2 in vitro. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε γυμνούς ποντικούς. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι Ρ2Χ7 διεγείρει κυτταρική εισβολή και μετάσταση στον καρκίνο του προστάτη κύτταρα μέσω ορισμένων γονιδίων ΕΜΤ /εισβολή σχετίζονται, καθώς και ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και ERK1 /2 μονοπάτια σηματοδότησης. Ρ2Χ7 θα μπορούσε να είναι ένα πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό στόχο για τον καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Qiu Υ, Λι W-h, Zhang Η-q, Liu Υ, Tian X-X, Fang W-G (2014) Ρ2Χ7 Μεσολαβεί ΑΤΡ-Driven ικανότητα εισβολής σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 9 (12): e114371. doi: 10.1371 /journal.pone.0114371

Επιμέλεια: Jean Κανελλόπουλος, Πανεπιστήμιο Paris Sud, Γαλλία

Ελήφθη: 15 Ιουνίου, 2014? Αποδεκτές: 6 Νοέμ 2014? Δημοσιεύθηκε: 8 Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Qiu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις σε WGF από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81321003, 30971152), και 973 Πρόγραμμα (2010CB529402) από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι ένας από τους πιο κοινούς κακοήθεις όγκους, και επίσης μία από τις κύριες αιτίες θανάτου των ανδρών που σχετίζονται με τον καρκίνο παγκοσμίως [1]. Οι περισσότεροι από τους ασθενείς δεν πεθαίνουν από τοπική πρωτογενούς όγκου, αλλά απομακρυσμένων μεταστάσεων. Η διαδικασία της μετάστασης του καρκίνου αποτελείται από διαδοχικές και αλληλένδετα συμβάντα [2]. Από τη μία πλευρά, τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να αποκτήσουν τα μεταναστευτικά και επεμβατικές δυνατότητες από επιθηλιακά μετάβαση μεσεγχυματικά (EMT), η οποία τους επιτρέπει να αποκτήσουν την ικανότητα να διεισδύουν περιβάλλοντες ιστούς και τελικά μεταστάσεις σε μακρινές περιοχές [3]. Από την άλλη πλευρά, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και μικροπεριβάλλον του όγκου είναι απαραίτητα για την μεταστατική διάδοση των όγκων κυττάρων [4]. προηγούμενες μελέτες μας έχουν επικεντρωθεί σε μια σημαντική μόριο μικροπεριβάλλον του όγκου, 5′-τριφωσφορική αδενοσίνη (ΑΤΡ).

Εκτός από την κατοχή μια ενδοκυτταρική ρόλο στο μεταβολισμό των κυττάρων ως πηγή ενέργειας, ATP έχει γίνει ευρέως αποδεκτή ως ένα εξωκυτταρικό μόριο σηματοδότησης, και μπορεί να απελευθερωθεί προς το εξωκυτταρικό περιβάλλον τόσο φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις όπως νευροδιαβίβαση, ιστοί βλάβη, et al [5], [6], [7]. Είναι πλέον σαφές ότι το ΑΤΡ είναι ένα από τα άφθονα βιοχημικών συστατικών του μικροπεριβάλλον του όγκου και διαδραματίζει βασικό ρόλο στην αλληλεπίδραση ξενιστή-όγκου. Το εξωκυτταρικό ΑΤΡ δρα σαν ένα μόριο σηματοδότησης μέσω της αλληλεπίδρασης με τους υποδοχείς Ρ2 και μεσολαβεί μία ποικιλία βιολογικών διεργασιών, όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή [8], [9], [10]. Οι υποδοχείς Ρ2 διαιρούνται σε δύο διακριτές οικογένειες: πρωτεΐνη G υποδοχέων που συνδέονται Ρ2Υ (Ρ2Υ1, 2, 4, 6, 11, 12, 13 και 14) και με πύλη υποκατάστατη διαπερατό κατιόν κανάλι Ρ2Χ υποδοχείς (P2X1-7) [11]. Ένας αριθμός υποδοχέων Ρ2 έχουν αναφερθεί ότι εκφράζονται σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [10], [12]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι εξωκυτταρικό ΑΤΡ ήταν ένα σημαντικό προ-επεμβατική παράγοντα και Ρ2Υ2 ήταν ένας από τους βασικούς υποδοχείς που μεσολαβεί ΑΤΡ-προωθείται μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη [10]. Ωστόσο, βρήκαμε επίσης ότι η ΑΤΡ-μεσολάβηση προ-εισβολής, δεν μπορεί να καταργηθεί πλήρως μετά από μέγιστη αποσιώπηση της Ρ2Υ2, υποδεικνύοντας ότι κάποιο άλλο υπότυπο (ες) υποδοχέα μπορεί να εμπλέκεται σε αυτή τη διαδικασία. Μεταξύ της οικογένειας υποδοχέα Ρ2Χ, Ρ2Χ7 είναι η τελευταία κλωνοποιημένα μέλος [13], και αρχικά θεωρήθηκε ότι είναι μια κυτταρολυτική υποδοχέα από την παρατεταμένη ενεργοποίηση του οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο [14]. Πρόσφατα, βρέθηκε ότι Ρ2Χ7 ήταν εκφράζεται σε αφθονία σε καρκινικά κύτταρα της λευχαιμίας, νευροβλαστώματος, μελανώματος, καθώς επίσης και στον προστάτη, του μαστού και του καρκίνου του θυρεοειδούς [15], [16], [17], [18], [19], και ακόμη και προτείνεται να είναι ένας βιοδείκτης για τον καρκίνο πρώιμο στάδιο [17], [20], [21]. Επιπλέον, η ενεργοποίηση του Ρ2Χ7 αναφέρθηκε ότι έχουν αντι-αποπτωτικά αποτελέσματα, διεγείρουν την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων [22], [23], και ακόμη και για την προώθηση της κυτταρικής διεισδυτικότητα σε μερικά καρκινικά κύτταρα [24], [25], η οποία έρχεται σε αντίθεση με την αρχική παραδοχή ότι Ρ2Χ7 ήταν μια «υποδοχέας θανάτου». Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ως στόχο να διερευνήσει το ρόλο της Ρ2Χ7 στην εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου του προστάτη, και να αποκαλύψει τις υποκείμενων μηχανισμών.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά και αντισώματα

ATP, ΒζΑΤΡ, KN62, LY294002, U0126 και Digitonin λήφθηκαν από Sigma (St Louis, MO, USA). αντίσωμα κουνελιού αντι-Ρ2Χ7 (# APR-008) ελήφθη από Alomone Labs (Jerusalem, Israel), και τα αντισώματα της β-ακτίνης (# ΤΑ-09), ERK1 /2 (# SC-94) και Ε-καδερίνης (# SC-7870) ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Αντισώματα του σαλιγκαριού (# 3895S), κλαουδίνης-1 (# 4933P), ρ-ΑΚΤ (# 4056S), ΑΚΤ (# 4691S), και ρ-ERK1 /2 (# 9101S) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ , ΗΠΑ). HRP-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού (# ΖΒ-2305) και IgG αντι-κουνελιού κατσίκας (# ΖΒ-2301) ελήφθησαν από ΟηΟεηε (Maryland, USA). Fluo-τέσσερις (# F14201) ελήφθη από την Molecular Probes (Eugene, OR, USA). HBSS (# 14025092) αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA).

Κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

Το 1Ε8 και 2Β4 κύτταρα που προέρχονται από το κύτταρο καρκινώματος ανθρώπινου προστάτη PC-3M γραμμή. 1Ε8 ήταν άκρως μεταστατική, ενώ 2Β4 ήταν μη μεταστατικό [26]. 22RV1 προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή και BPH1 αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, ΝΥ, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2 στους 37 ° C.

ανάστροφη μεταγραφή και PCR πραγματικού χρόνου

το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. 2 μg ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας MMLV αντίστροφης μεταγραφάσης (Promega, Madison, Wisconsin, USA), και PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ΑΒΙ StepOne σύστημα πραγματικού χρόνου PCR (Applied Biosystems, USA). Οι ειδικοί εκκινητές αγοράστηκαν από την Invitrogen και παρατίθενται στο S1 πίνακα. Οι συνθήκες θερμικού κύκλου ήταν ως ακολούθως: 10 λεπτά στους 95 ° C, 30 κύκλοι των 15 s στους 95 ° C και 1 λεπτό στους 60 ° C. Σχετικά επίπεδα έκφρασης του γονιδίου, κανονικοποιημένη έκφραση σε β-ακτίνη, υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το 2

-. △△ μέθοδος Ct [27]

Η λύση των κυττάρων και Western Blot ανάλυση

ολόκληρου κυτταρικού λύματος εκχυλίζεται με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (Applygen Technologies Inc, Πεκίνο, Κίνα) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης και αναστολείς φωσφατάσης (Roche, Mannheim, Germany). Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο BCA (Applygen Technologies Inc, Πεκίνο, Κίνα). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE γέλη και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), τα οποία επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύχτα με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια Ρ2Χ7 (1:200), Ε-καδερίνης (1:500), κλαουδίνης-1 (1:1000), σαλιγκάρι (1:1000), β-ακτίνη (1:1000), ERK1 /2 (1:1000), ΑΚΤ (1:1000), ρ-ERK1 /2 (1:1000) ή ρ-ΑΚΤ (1:1000) αντιστοίχως. Ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν με χημειοφωταύγεια (Applygen Technologies Inc) και ποσοτικοποιείται με ανάλυση πυκνομετρίας με τη χρήση Ποσότητα One λογισμικού (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA)

τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία ΑΤΡ, και το υπερκείμενο συλλέχθηκε μετά από διαφορετικές αγωγή. Το υπερκείμενο αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μετά από φυγοκέντρηση στις 12000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C. Τα επίπεδα της IL-8 και ΜΜΡ-3 πρωτεΐνης μετρήθηκαν ξεχωριστά χρησιμοποιώντας την IL-8 ELISA kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και ΜΜΡ-3 κιτ ELISA (Boster, Wuhan, Κίνα) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση της IL-8 και ΜΜΡ-3 προσδιορίστηκαν με σύγκριση της απορρόφησης με το πρότυπο πρωτεΐνης, και στη συνέχεια κανονικοποιήθηκαν σε συνολική πρωτεΐνη.

διαμόλυνσης κυττάρων

Για παροδική γονιδιακή σίγηση, δύο ξεχωριστές siRNA ολιγονουκλεοτίδια Ρ2Χ7 στόχευση χρησιμοποιήθηκαν με αλληλουχίες ως εξής: Ρ2Χ7 siRNA1, 5′-CTAGGATAATGTCCAACTAAA-3 ‘και Ρ2Χ7 siRNA2, 5′-CACAGTGTCTTTGACACCGCA-3’. Ένα siRNA αγωνίζομαι χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. 1Ε8 και 2Β4 κύτταρα καρκίνου του προστάτη επιμολύνθηκαν με τα παραπάνω siRNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAi Max (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Για σταθερή γονιδιακή σίγηση, δύο πλασμίδια με shRNA (σύντομη φουρκέτα RNA ) με στόχο Ρ2Χ7 κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας GFP Νέο σύστημα κλωνοποίησης pGPU6 //(Genepharma Co, Ltd, Shanghai, Κίνα). Οι αλληλουχίες στόχευσης Ρ2Χ7 ήταν ως εξής: shRNA1, 5′-GCATGAATTATGGCACCATTA-3 ‘, και shRNA2, 5′-GCAATTCAGGGCGGAATAATG-3’. Η pGPU6 /GFP /Neo φορέα με μία αλληλουχία σκαρφάλωμα shRNA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. διαμόλυνση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. κυτταρικοί κλώνοι με σταθερά νοκ ντάουν του Ρ2Χ7 ιδρύθηκαν στα κύτταρα 1Ε8 από Geneticin (G418) επιλογή.

Για την υπερ-έκφραση, μια έκφραση φορέα που κωδικοποιεί πλήρους μήκους ανθρώπινη Ρ2Χ7 (hP2X7) κατασκευάστηκε γονίδιο (Genepharma Co, Ltd , Σαγκάη, Κίνα), και διαμολύνθηκε σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη 22RV1.

In vitro δοκιμασία μετανάστευσης και εισβολή δοκιμασία

Οι ικανότητες μετανάστευση και διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων του προστάτη αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία Boyden τμήματος, σύμφωνα με η μέθοδος που περιγράφεται από τον Albini et al [28], με κάποιες τροποποιήσεις. Η μετανάστευση των κυττάρων αναλύθηκε με χρήση 24 φρεατίων θαλάμους Transwell που περιείχε 8 μΜ μέγεθος πόρων από τερεφθαλικό πολυαιθυλένιο ένθετα κυτταρικής μεμβράνης καλλιέργειας (Costar, San Diego, CA, USA). Το ανώτερο διαμέρισμα σπάρθηκε με 0.5 × 10

5 βιώσιμα κύτταρα και το κατώτερο διαμέρισμα γεμίζεται με 600 μΐ ΝΙΗ3Τ3 ρυθμισμένο μέσο ως χημειοελκτικό. Μετά την επώαση με ή χωρίς ΑΤΡ επί 12 ώρες στους 37 ° C σε μια υγροποιημένη ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2, οι θάλαμοι αφαιρέθηκαν. Τα κύτταρα επί της άνω πλευράς του θαλάμου απομακρύνθηκαν με μπατονέτες μύτες, και τα κύτταρα στην κάτω πλευρά των μεμβρανών βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες μετά από στερέωση σε 4% φορμαλδεΰδη. Κυττάρων επεμβατική ικανότητα εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τα ίδια ένθετα όπως αναφέρθηκε ανωτέρω, αλλά με την μεμβράνη καλύπτεται με μία μεμβράνη Matrigel (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Σε αυτή την περίπτωση, 1 × 10

5 βιώσιμα κύτταρα σπάρθηκαν στο άνω διαμέρισμα. Οι μεμβράνες κόπηκαν και τοποθετήθηκαν επάνω σε πλάκες και τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο σε μεγέθυνση × 200. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές, και τα αποτελέσματα για τη μετανάστευση και την εισβολή ομαλοποιήθηκαν με τους μάρτυρες.

Ηθική δήλωση

Όλα τα ποντίκια τέθηκαν σε ελεύθερη (SPF) περιβάλλον ειδικά παθογόνα. Όλα τα ζώα αντιμετωπίζονται σύμφωνα με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες και τα πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου του Πεκίνου (Νο LA2011-72).

In vivo δοκιμασία

Το αρσενικό BALB /c γυμνά ποντίκια (4 παλιά εβδομάδων) αγοράστηκαν από το Τμήμα ζώων του Πανεπιστημίου του Κέντρου Επιστημών Υγείας του Πεκίνου και τυχαιοποιήθηκαν σε τρεις ομάδες (n = 8 ανά ομάδα). Δύο κλώνοι 1Ε8 με σταθερή knockdown του Ρ2Χ7 όπως επίσης και ένας αρνητικός κλώνος ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν στα ακόλουθα πειράματα. Τα κύτταρα στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης συλλέχθηκαν και ρυθμίστηκε με PBS με την συγκέντρωση του 5 × 10

6 κύτταρα /ml, και 200 ​​μί εναιώρημα κυττάρων εγχύθηκε υποδορίως σε κάθε πρόσθια περιοχή πλευρά γυμνών ποντικών. Οκτώ εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό, όλοι οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία μέσω αυχενική εξάρθρωση, και οι πρωτογενείς όγκοι μαζί με μερικά όργανα όπως το συκώτι, οι πνεύμονες, τα νεφρά και λεμφαδένες αποκόπηκαν. Οι όγκοι, ήπατα, πνεύμονες και τα νεφρά των ποντικών σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεϋδη, εμβαπτίστηκαν σε παραφίνη και κατόπιν κόπηκαν σε 4-5 μm φέτες. Για να παρατηρήσουμε το μακρινό μικρομεταστάσεων του πρωτογενούς όγκου, αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ) κηλίδα διεξήχθη στις διαφάνειες ιστούς. Εν τω μεταξύ, μερικές ιστούς όγκων λύθηκαν με ρυθμιστικό λύσης RIPA για ανίχνευση της πρωτεΐνης εκφράσεις γονιδίων ΕΜΤ /εισβολή που σχετίζονται με τη χρήση ανάλυσης στυπώματος Western. Επιπλέον, ορισμένα δείγματα όγκων βυθίστηκαν σε μέσο OTC, και κατεψυγμένες τομές πάχους 5 μm προετοιμάστηκαν για δοκιμασία ανοσοφθορισμού.

ανοσοφθορισμού δοκιμασία

Για τη χρώση ανοσοφθορισμού, τα δείγματα όγκων βυθίστηκαν σε μέσο OTC , παρασκευάστηκαν και κατεψυγμένες τομές 5 μm σε πάχος. Οι τομές στερεώθηκαν με ακετόνη για 10 λεπτά στους -20 ° C, και στη συνέχεια μη ειδική σύνδεση μπλοκαρίστηκε σε ορό κατσίκας για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές επωάστηκαν όλη τη νύχτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια Σαλιγκάρι (Cell Signaling Technology), Ε-καδερίνης (Santa Cruz), ή κλαουδίνης-1 (Invitrogen), αντίστοιχα, και στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα συζευγμένο με FITC δεύτερο αντίσωμα (Sigma) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. χρώση DAPI χρησιμοποιήθηκε για να απεικονίσει πυρήνες. Εικόνες ελήφθησαν με συνεστιακή μικροσκόπηση.

Fluo-τέσσερις και προσδιορισμούς πρόσληψης βρωμιούχο αιθίδιο

Οι αλλαγές στην ελεύθερη εσωτερική συγκέντρωση ασβεστίου μετρήθηκαν με τον φθορίζοντα δείκτη Fluo-τέσσερις. Κύτταρα επιστρώθηκαν επί 1 mm γυάλινο πάτο πιάτο φορτώθηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C με 1 μΜ Fluo-τέσσερις σε ρυθμιστικό HBSS. Η περίσσεια χρωστικής απομακρύνθηκε με έκπλυση των κυττάρων δύο φορές με HBSS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 10 λεπτά σε HBSS, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ή χωρίς ΑΤΡ και ΒζΑΤΡ όπως υποδεικνύεται στο σχήμα θρύλους. Εικόνες αποκτήθηκαν σε 5 s διαστήματα? πολυάριθμα κύτταρα σε ένα οπτικό πεδίο μετρήθηκαν για 350 s για να ληφθεί η μέση τιμή σήματος φθορισμού Fluo-4. Για τη μέτρηση της πρόσληψης αιθίδιο, βρωμιούχο αιθίδιο (25 μΜ) προστέθηκε σε διαλύματα υπερσύντηξης. Εικόνες αποκτήθηκαν σε 5 s διαστήματα για 900 s. Η συνολική πρόσληψη βρωμιούχου αιθιδίου εκτιμήθηκε με την προσθήκη διγιτονίνη (100 μΜ) σε κυψελίδα. Η επίδραση διαπερατότητας του ΑΤΡ ή ΒζΑΤΡ εκτιμήθηκε με σύγκριση με την διαπερατότητας μετράται παρουσία του διγιτονίνης.

Η επιβίωση των κυττάρων δοκιμασία

Για την εκτίμηση της επιβίωσης των κυττάρων, 2 × 10

5 κυττάρων σπάρθηκαν ανά φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων σε μέσο καλλιέργειας ελέγχου ή σε παρουσία 1 mM ΑΤΡ (ή 100 μΜ ΒζΑΤΡ), και αναπτύχθηκαν για 24 ώρες. Η επιβίωση των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ και τα δεδομένα εκφράσθηκαν ως% κυτταρική επιβίωση σε σύγκριση με το μάρτυρα. Τα αποτελέσματα επικυρώθηκαν με χειροκίνητη καταμέτρηση των κυττάρων. Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Ανάλυση δεδομένων και στατιστική

Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το λογισμικό SPSS 19.0. Του Student

t-test

διεξήχθη για να αξιολογηθούν οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων, και μη-παραμετρική ANOVA χρησιμοποιήθηκε όταν συγκρίθηκαν πολλαπλά μέσα. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Ο καρκίνος του προστάτη κύτταρα εξέφρασαν λειτουργικό Ρ2Χ7

Πρώτον, αναλύσαμε την έκφραση του mRNA της Ρ2Χ7 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη 1Ε8, 2Β4 και 22RV1 καθώς επίσης και σε μη-κακοήθη επιθηλιακά αθανατοποιημένη προστάτη κύτταρο BPH1 χρησιμοποιώντας PCR πραγματικού χρόνου, και βρήκαν ότι Ρ2Χ7 ήταν σημαντικά εκφράζεται σε 1Ε8 και 2Β4 κύτταρα καρκίνου του προστάτη, ενώ η έκφραση του ήταν πολύ εξασθενημένο σε κύτταρα 22RV1 και BPH1 (Σχ. 1Α). Επιπλέον, η πρωτεΐνη Ρ2Χ7 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται σε 1Ε8 και 2Β4 (Εικ. 1Β) κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Στη συνέχεια, εξετάσαμε την ενδοκυτταρική συγκέντρωση ελεύθερου ασβεστίου ([Ca

2+] ί) για να προσδιοριστεί κατά πόσον Ρ2Χ7 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη ήταν λειτουργικό. Εξωκυττάριο ΑΤΡ (1 mM) ή ΒζΑΤΡ (100 μΜ) θεραπεία προκάλεσε μια αξιοσημείωτη αύξηση της [Ca

2 +] i στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη, παρακολουθείται από Fluo-4 φθορισμού. Ωστόσο, KN62 (1 μΜ), ένας ανταγωνιστής Ρ2Χ7, ανέστειλε σημαντικά ΑΤΡ ή ΒζΑΤΡ επαγόμενη [Ca

2+] ι αυξάνουν (Σχ. 1 C). πρόσληψη αιθίδιο καταγράφηκε επίσης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη μετά από διεγερμένα με ΑΤΡ ή ΒζΑΤΡ, η οποία αναστάλθηκε σημαντικά όταν KN62 προστέθηκε στο εξωτερικό διάλυμα (Εικ. 1 D-E). Όλα αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Ρ2Χ7 που εκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη ήταν λειτουργικό.

(Α) σχετική έκφραση του mRNA του Ρ2Χ7 ομαλοποιήθηκε με β-ακτίνης μεταγραφής στα κύτταρα 1Ε8, 2Β4, 22RV1 και BPH1. επίπεδα (Β) Protein του Ρ2Χ7 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western και δεδομένα ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη. Πρωτεΐνη έκφραση του Ρ2Χ7 σε κύτταρα BPH1 ορίστηκε ως 1. Οι τιμές παρουσιάζονται ως μέση ± s.d. (Κατακόρυφες ράβδοι). (C) Αντιπροσωπευτική ενδοκυτταρικό ασβέστιο αλλαγές σε απόκριση σε ΑΤΡ (1 mM) ή ΒζΑΤΡ (100 μΜ) παρουσία ή απουσία KN62 (1 μΜ). (D) Αντιπροσωπευτική πρόσληψη αιθίδιο κυττάρων καρκίνου του προστάτη στη βασική κατάσταση ή κατά τη διέγερση με ΑΤΡ (1 mM) ή ΒζΑΤΡ (100 μΜ) παρουσία ή απουσία KN62. ΑΤΡ /ΒζΑΤΡ προστέθηκε, όπως υποδεικνύεται από το βέλος, προς τα HBSS που περιέχει βρωμιούχο αιθίδιο 25 μΜ. (Ε) Αιθίδιο ένταση φθορισμού στην βασική κατάσταση ή κατά τη διέγερση με ΑΤΡ (1 mM) ή ΒζΑΤΡ (100 μΜ) παρουσία ή απουσία KN62, παρουσιάστηκε ως ποσοστό σε σχέση με την αξία του διγιτονίνη επαγόμενης διαπερατότητα. Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt?. 0.05

Η

Ρ2Χ7 είχε εμπλακεί σε ΑΤΡ /ΒζΑΤΡ με γνώμονα τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη in vitro

Ρ2Χ7 έχει αποδειχθεί ότι υπερ-εκφράζεται σε αρκετοί όγκοι [15], [16], [17], [18], [19], ωστόσο, ο ρόλος του στην εξέλιξη του καρκίνου παραμένει ασαφής. Οι προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι εξωκυτταρικό ΑΤΡ θα μπορούσε να ενισχύσει τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη [29], [30]. Έχουμε αναρωτηθεί αν Ρ2Χ7 έπαιξε ρόλο στην ATP μεσολάβηση βιολογική συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Πρώτον, αναλύσαμε την επίδραση του Ρ2Χ7 στην επιβίωση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη, και βρέθηκε ότι η ενεργοποίηση του Ρ2Χ7 με ΑΤΡ ή ΒζΑΤΡ δεν είχε καμία επίδραση στη βιωσιμότητα του κυττάρου (Εικ. 2Α). Αντίθετα, βρήκαμε ότι η ενεργοποίηση του Ρ2Χ7 με ΑΤΡ προκάλεσε σημαντική αύξηση της μετανάστευσης κυττάρων και εισβολής του καρκίνου του προστάτη κύτταρα (Σχ. 2C-D). Στη συνέχεια, δύο ξεχωριστές siRNAs (siRNA1 και siRNA2) χρησιμοποιήθηκαν για να φιμώσουν έκφραση Ρ2Χ7, και κάθε siRNA επιτευχθεί μια εξέχουσα επίδραση στην εξουδετέρωση των Ρ2Χ7 σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχ. 2Β). Κάτω ρύθμιση των Ρ2Χ7 με siRNA αξιοσημείωτα ανέστειλε ΑΤΡ με γνώμονα τη μετανάστευση και την εισβολή του 1Ε8 και 2Β4 κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχ. 2C-D). Ομοίως, knockdown του Ρ2Χ7 επίσης μπλοκάρει σημαντικά ΒζΑΤΡ μεσολάβηση μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων προστάτη σε 1Ε8 και 2Β4 κύτταρα καρκίνου του προστάτη (S1 Σχήμα). Περαιτέρω, η υπερ-έκφραση του Ρ2Χ7 ευδιάκριτα ενισχυμένης ΑΤΡ-επαγόμενη μετανάστευση και εισβολή σε 22RV1 κύτταρα καρκίνου του προστάτη (S2A-Β Σχήμα). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι Ρ2Χ7 συμμετείχε στην ΑΤΡ μεσολάβηση μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων προστάτη.

(Α) και 1Ε8 2Β4 κύτταρα καρκίνου του προστάτη υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 mM ΑΤΡ για 12 ώρες και 24 ώρες. Η επιβίωση των κυττάρων εκτιμήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ και τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν με εκείνες υπό συνθήκες ελέγχου. (Β) 1Ε8 και 2Β4 κύτταρα επιμολύνθηκαν με δύο διαφορετικά siRNAs Ρ2Χ7 (siRNA1 και siRNA2) ή έναν έλεγχο siRNA (NC). πειραμάτων Western Blot που διεξήχθησαν για την ανίχνευση της knockdown αποδοτικότητα. (C-D) Ιη vitro δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολής διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο των μεθόδων απουσία (έλεγχος) ή παρουσία 1 mM ΑΤΡ (ΑΤΡ 12 h). Δεδομένα της κυτταρικής μετανάστευσης ή εισβολή υπολογίστηκαν ως ποσοστό των κυττάρων ελέγχου. Τα αποτελέσματα αποδεικνύεται από ιστογράμματα και οι τιμές παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± s.d. (Κατακόρυφες ράβδοι). Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt?. 0.05

Η

Ρ2Χ7 συμμετείχε στην ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης ΕΜΤ /εισβολή που σχετίζονται με τον καρκίνο του προστάτη κύτταρα

Με τη χρήση ανάλυσης cDNA μικροσυστοιχιών, προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι εξωκυτταρικό ΑΤΡ θα μπορούσε να ρυθμίσει την έκφραση του mRNA του σαλιγκαριού, Ε-καδερίνης, κλαουδίνης-1 και IL-8, τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στη ΕΜΤ και την εξέλιξη του όγκου [10]. Εκτός αυτού, προηγούμενη μελέτη μας στον καρκίνο του προστάτη έδειξαν ότι η θεραπεία ΑΤΡ θα μπορούσε να αυξήσει την έκφραση της ΜΜΡ-3, η οποία είναι ευρέως εμπλέκονται στην εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου [30]. Ως εκ τούτου, έχουμε αναρωτηθεί αν Ρ2Χ7 συμμετείχαν σε αυτές ΑΤΡ-μεσολάβηση γονιδιακή έκφραση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, με την παρουσία ΑΤΡ, εκφράσεις του σαλιγκαριού, IL-8 και ΜΜΡ-3 ήταν σημαντικά αυξημένα σε κύτταρα καρκίνου προστάτη 1Ε8 και 2Β4, ενώ εκφράσεις Ε-καδερίνης και κλαουδίνης-1 ευκρινώς μειωθεί. ΒζΑΤΡ έδειξε παρόμοια επίδραση επί των εκφράσεων γονιδίων ΕΜΤ /εισβολή που σχετίζονται με τον καρκίνο του προστάτη κύτταρα (S3 Σχήμα). Παρ ‘όλα αυτά, μετά από knockdown του Ρ2Χ7 με siRNA, οι αλλαγές στις εκφράσεις του σαλιγκαριού, IL-8, ΜΜΡ-3, Ε-καδερίνης και κλαουδίνης-1, με τη μεσολάβηση ΑΤΡ ή ΒζΑΤΡ, ήταν εξασθενημένα (Εικ. 3 και S3 Σχήμα). Επιπλέον, μπλοκάροντας συγκεκριμένα την ενεργοποίηση των Ρ2Χ7 από ανταγωνιστή KN62, ΑΤΡ και ΒζΑΤΡ δεν θα μπορούσε να επηρεάσει τις εκφράσεις του σαλιγκαριού, E-cadherin και κλαουδίνης-1 πια (S4 και S5 Σχημάτων). Ομοίως, ΑΤΡ οδήγησε σε αυξημένη έκφραση του σαλιγκαριού και μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης σε 22RV1 κύτταρα τα οποία εξέφρασαν εξωγενώς Ρ2Χ7 (S2C Σχήμα). Όλα αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι Ρ2Χ7 ήταν απαραίτητη για την ΑΤΡ αλλαγές που προκαλούνται από έκφραση των γονιδίων ΕΜΤ /εισβολή που σχετίζονται με τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

Ρ2Χ7 σιγήσει κύτταρα (siRNA1 και siRNA2) και τα κύτταρα ελέγχου siRNA (NC) κατεργάστηκαν με ή χωρίς 1 mM ΑΤΡ επί 12 ώρες. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του σαλιγκαριού (Α), Ε-καδερίνης (Β) και κλαουδίνης-1 (Γ) εξετάστηκαν με ανάλυση κηλίδος Western. Τα επίπεδα πρωτεΐνης της IL-8 (D) και ΜΜΡ-3 (Ε) εκτιμήθηκαν με δοκιμασία ELISA. Εκφράσεις των πρωτεϊνών αυτών κανονικοποιήθηκαν προς τις αντίστοιχες έκφρασή τους σε κύτταρα ελέγχου (χωρίς ΑΤΡ). Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± s.d. (Κατακόρυφες ράβδοι). Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt?. 0.05

Η

Ενεργοποίηση της PI3K /AKT και ERK1 /2 μονοπάτια σηματοδότησης ήταν κρίσιμη στην ΑΤΡ- /ΒζΑΤΡ με γνώμονα τις αλλαγές μετανάστευση, την εισβολή και την έκφραση των γονιδίων EMT /εισβολή που σχετίζονται με

σε προηγούμενη μελέτη μας, έχει αποδειχθεί ότι ATP ενεργοποιείται ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και ERK1 /2 οδών σηματοδότησης σε έναν χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε 1Ε8 και 2Β4 κύτταρα καρκίνου του προστάτη [29], [30]. Εδώ, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία ΒζΑΤΡ προκάλεσαν επίσης αξιόλογη ενεργοποίηση ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και ERK1 /2 οδών σηματοδότησης σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη (S6a-Β Σχήμα). Για να κατανοήσουμε τη λειτουργική επίδραση της PI3K /AKT και ERK1 /2 μονοπάτια σηματοδότησης σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη, δύο φαρμακολογικών αναστολέων, LY294002 και U0126 χρησιμοποιήθηκαν για να εμποδίσει PI3K /AKT και ERK1 /2 σηματοδοτικό μονοπάτι, αντίστοιχα (Εικ. 4Α-Β και S6A- Β Σχήμα). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ΑΤΡ- και ΒζΑΤΡ με γνώμονα τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων του προστάτη ήταν σημαντικά κατασταλεί όταν ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδού ή ERK1 /2 σηματοδότηση ανεστάλη (Σχ. 4C-D και S6C-D Σχήμα). Επιπλέον, η αναστολή της ΡΙ3Κ είτε /ΑΚΤ ή ERK1 /2 μονοπατιού σηματοδότησης μετρίασε σημαντικά τις αλλαγές έκφραση των γονιδίων ΕΜΤ /εισβολή σχετίζονται επάγεται από ΑΤΡ ή ΒζΑΤΡ σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη (Σχ. 5 και S7 Σχήμα).

IE8 και 2Β4 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LY294002 (διαδρομές συμβολίζεται ως LY294002) ή U0126 (λωρίδες συμβολίζεται ως U0126) ή χωρίς κατεργασία (χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος, λωρίδες συμβολίζεται ως NC). (Α-Β) LY294002 και U0126 ανέστειλαν ΑΤΡ μεσολάβηση ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και την ενεργοποίηση ERK1 /2, αντίστοιχα. (C-D) Επιπτώσεις της LY294002 και U0126 για τη μετανάστευση και την εισβολή στην 1Ε8 και 2Β4 κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Δεδομένα της κυτταρικής μετανάστευσης ή εισβολή υπολογίστηκαν ως ποσοστό των κυττάρων ελέγχου. Τα αποτελέσματα αποδεικνύεται από ιστογράμματα, και οι τιμές παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± s.d. (Κατακόρυφες ράβδοι). Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * Ρ & lt?. 0.05

Η

IE8 και 2Β4 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LY294002 (διαδρομές συμβολίζεται ως LY294002) ή U0126 (λωρίδες συμβολίζεται ως U0126) ή χωρίς κατεργασία (χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος, λωρίδες συμβολίζεται ως NC ). Εκφράσεις του σαλιγκαριού (Α), Ε-καντερίνη (Β) και κλαουδίνης-1 (C) ανιχνεύθηκαν με Western blots. Εκφράσεις της IL-8 (D) και ΜΜΡ-3 (Ε) ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ELISA. Εκφράσεις των πρωτεϊνών αυτών κανονικοποιήθηκαν προς τις αντίστοιχες έκφρασή τους σε κύτταρα ελέγχου (χωρίς ΑΤΡ). Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± s.d. (Κατακόρυφες ράβδοι). Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt?. 0.05

Η

Ρ2Χ7 ήταν απαραίτητη για την ATP /ΒζΑΤΡ που προκαλείται από την ενεργοποίηση της PI3K /AKT και ERK1 /2 μονοπάτια σηματοδότησης

Από παρατηρήσαμε ότι Ρ2Χ7 καθώς και PI3K /AKT και ERK1 /2 σηματοδότησης οδών εμφάνισαν σημαντικές επιπτώσεις στην ΑΤΡ- και ΒζΑΤΡ με γνώμονα τις αλλαγές μετανάστευση, την εισβολή και την έκφραση των γονιδίων EMT /εισβολή που σχετίζονται με τον καρκίνο του προστάτη κύτταρα, αναρωτηθήκαμε αν Ρ2Χ7 συμμετείχε στην ΑΤΡ- και ΒζΑΤΡ που προκαλείται από την ενεργοποίηση του PI3K /AKT και ERK1 /2 μονοπάτια σηματοδότησης. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6 και S8 σχήμα, νοκ ντάουν του Ρ2Χ7 οδήγησε σε περίοπτη αναστολή των ΑΤΡ- και ΒζΑΤΡ-επαγόμενη φωσφορυλίωση της PI3K /AKT και ERK1 /2 μονοπάτια σηματοδότησης. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υπέδειξαν ένα σημαντικό ρόλο του Ρ2Χ7 σε ΑΤΡ-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και ERK1 /2 μονοπάτια σηματοδότησης.

Ρ2Χ7 σιγήσει κύτταρα (siRNA1 και siRNA2) και τα κύτταρα ελέγχου siRNA (NC) κατεργάστηκαν με ή χωρίς 1 mM ΑΤΡ για 15 λεπτά. πειραμάτων Western Blot που διεξήχθησαν για να αναλύσουν το επίπεδο φωσφορυλίωσης του ΑΚΤ (Α) και ERK1 /2 (Β). Εκφράσεις του ρ-ΑΚΤ και ρ-ERK1 /2 κανονικοποιήθηκαν προς τις αντίστοιχες έκφρασή τους σε κύτταρα ελέγχου (χωρίς ΑΤΡ). Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± s.d. (Κατακόρυφες ράβδοι). Τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt?. 0.05

Η

Ρ2Χ7 ήταν απαραίτητη για την in vivo εισβολής και της μετάστασης, καθώς και ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων EMT /εισβολή που σχετίζονται με

Τέλος, αναλύσαμε την in vivo επίδραση του Ρ2Χ7 επί εισβολή και μεταστάσεων σε γυμνούς ποντικούς. Οι όγκοι σε ποντικούς, που αναπτύχθηκε με υποδορίως κύτταρα ελέγχου, εμφανίζεται σημαντική διεισδυτικότητα σε κοντινά ιστούς όπως το λίπος και μυς. Επιπλέον, τα ποντίκια ένεση με κύτταρα ελέγχου, το 37,5% από αυτούς που παρουσιάζονται απομακρυσμένων μεταστάσεων για τους νεφρούς και το 87,5% παρουσίασε λεμφαδενικές μεταστάσεις. Ωστόσο, στις δύο ομάδες ένεση με κύτταρα Ρ2Χ7-σιγήσει, μόνον ένας ποντικός είχε μετάσταση σε λεμφαδένα (Εικ. 7).

(Α) κύτταρα 1Ε8 διαμολύνθηκαν σταθερά με Ρ2Χ7 shRNA ή σκαρφάλωμα shRNA (NC ). Δύο σταθεροί κλώνοι Ρ2Χ7 shRNA (shRNA1 και shRNA2) έχουν δειχθεί ότι εκφράζουν χαμηλά επίπεδα του Ρ2Χ7 χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. (Β) Αντιπροσωπευτική φωτογραφία τομών όγκου και γειτονικούς ιστούς (χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε)). Ράβδοι κλίμακας = 100 μm. (Γ) Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες του τμήματος του νεφρού και του τμήματος λεμφαδένα (χρωματίστηκαν με Η &? Ε) από ποντίκια που φέρουν όγκο. Ράβδοι κλίμακας = 50 μm. (D) Ο αριθμός των μικρομεταστάσεων στο νεφρό και λεμφαδένα ανά τμήμα από ποντίκια που φέρουν όγκο. * P & lt?. 0.05

Η

Αναλύσαμε επίσης τις εκφράσεις του σαλιγκαριού, E-cadherin, κλαουδίνης-1 και IL-8, καθώς και τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της ΑΚΤ και ERK1 /2 στην πρωτοβάθμια ιστούς όγκων του ποντίκια που σχηματίζεται από τον έλεγχο 1Ε8 κύτταρα shRNA και τα κύτταρα Ρ2Χ7 shRNA. Μετά knockdown του Ρ2Χ7, εκφράσεις του σαλιγκαριού και IL-8 ήταν προφανώς ανέστειλαν ενώ εκφράσεις του Ε-καδερίνης και κλαουδίνης-1 αυξήθηκαν σημαντικά (Σχ. 8Α-C). Εκτός αυτού, Ρ2Χ7 knockdown ανέστειλε σημαντικά την ενεργοποίηση του ΑΚΤ και ERK1 /2 σε καρκινικούς ιστούς (Σχ. 8D). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν in vitro.

(Α) χρώση ανοσοφθορισμού για σαλιγκάρι, Ε-καδερίνης, κλαουδίνης-1 (πράσινο) και DAPI (μπλε) διεξήχθησαν σε καρκινικούς ιστούς των ποντικών. Εικόνες ελήφθησαν με συνεστιακή μικροσκοπία. Ράβδοι κλίμακας αντιπροσωπεύουν 75 μm ή 25 μm, όπως φαίνεται στο Σχήμα. (Β) Κηλίδωση Western διεξήχθη για την ανίχνευση των επιπέδων πρωτεΐνης του σαλιγκαριού, Ε-καδερίνης και κλαουδίνης-1 σε ιστούς όγκων. (C) ELISA χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί η έκφραση της IL-8. (D) κηλίδωση Western Διεξήχθη η ανάλυση του επιπέδου φωσφορυλίωσης των ΑΚΤ και ERK1 /2 σε ιστούς όγκων. Για κάθε ομάδα, τουλάχιστον τρεις διακριτές όγκους από τρία διαφορετικά ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα. * P & lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Πολλές μελέτες έδειξαν ότι το εξωκυτταρικό μικροπεριβάλλον των όγκων που περιέχονται πολύ υψηλότερες συγκεντρώσεις ΑΤΡ από τους υγιείς ιστούς, και ΑΤΡ θα μπορούσε να αποτελέσει μια αγχωτική ερέθισμα στην εξέλιξη του καρκίνου [7]. ΑΤΡ μπορεί να εκκρίνεται από τα ζωντανά κύτταρα του όγκου σε μικροπεριβάλλον τους σε σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις, καθώς και να απελευθερώνονται από νεκρωτικών κυττάρων στις περιοχές περιβλαβικής των καρκίνων [6], [7], [24]. Ως πανταχού παρούσα εξωκυτταρικό αγγελιοφόρος, ATP λειτουργίες μέσω της αλληλεπίδρασής της με υποδοχείς Ρ2Χ και Ρ2Υ.

Μεταξύ των υποδοχέων Ρ2 εμπλέκεται από εξωκυτταρικό ΑΤΡ, Ρ2Χ7 είναι το ένα που εκφράζεται πιο σταθερά ή ακόμη και υπερ-εκφράζεται από τα κύτταρα του όγκου. Ρ2Χ7 είναι μια ΑΤΡ-περιορισμένου διαύλου ιόντος και έχει από καιρό γνωστό για την κυτταροτοξική δράση της, ωστόσο, αυξανόμενες ενδείξεις πρότειναν ένα ρόλο για Ρ2Χ7 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Ρ2Χ7 έχει αποδειχθεί ότι διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό των λεμφοειδών κυττάρων και την προώθηση της ορό ανεξάρτητη ανάπτυξη [22], [23]. Εκτεταμένες μελέτες σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος έδειξαν τον σημαντικό ρόλο του Ρ2Χ7 ως υποδοχέας ανοσορυθμιστική εμπλέκονται στην ιντερλευκίνη (IL) -1β ωρίμανση και την απελευθέρωση, την παρουσίαση αντιγόνου και μοσχεύματος έναντι ξενιστή αντίδραση [31], [32], [33]. Κατά την τελευταία δεκαετία, η υψηλή έκφραση των Ρ2Χ7 έχει βρεθεί σε διαφορετικά είδη όγκων και έχουν συσσωρευθεί ενδείξεις δείχνουν τα προ-καρκινικές επιδράσεις του Ρ2Χ7 [15], [16], [17]. Μελάνωμα κυττάρων με υψηλής έκφρασης Ρ2Χ7, εμφανίζεται αντι-αποπτωτικό αποτέλεσμα [16]. Μετά την επιμόλυνση με Ρ2Χ7, ινοβλάστες ΗΕΚ293 και κύτταρα καρκινώματος κόλου CT26 καταδεικνύεται με βελτιώσεις στην ογκογένεση, in vivo την ανάπτυξη και την αγγειογένεση, και μείωση στην απόπτωση [34]. Εκτός αυτού, η ενεργοποίηση του Ρ2Χ7 προωθείται μετανάστευση και διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων του μαστού [24] και λεμφοειδών κυττάρων νεόπλασμα [35]. Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι Ρ2Χ7 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε ορισμένες κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Knockdown του Ρ2Χ7 με siRNA ακύρωσε σημαντικά ΑΤΡ-ενισχυμένη μετανάστευση και εισβολή in vitro. Εκτός αυτού, τα κάτω ρύθμιση Ρ2Χ7 οδήγησε σε αξιοσημείωτη αναστολή της ικανότητας εισβολής του όγκου και των μεταστάσεων σε γυμνούς ποντικούς. Περαιτέρω, η υπερ-έκφραση του Ρ2Χ7 αξιοσημείωτα ενισχυμένη ΑΤΡ μεσολάβηση μετανάστευση και εισβολή σε 22RV1 καρκινικά κύτταρα προστάτη, παρέχοντας περαιτέρω απόδειξη ότι Ρ2Χ7 ήταν ένας από τους βασικούς ρυθμιστές της προστάτη εισβολής και μεταστάσεις καρκίνου.

Ο επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) αποτελεί σημαντικό βήμα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου και σχετίζεται στενά με υψηλή κινητικών και επεμβατική χαρακτηριστικό των καρκινικών κυττάρων.