Αφηρημένο

Ιστορικό

μετάσταση συνδέεται με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα μεταγραφή-1 (MALAT- 1) υπερεκφράζεται κατά την διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου και προάγει την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή σε πολλούς συμπαγείς όγκους. Ωστόσο, ο ρόλος του στον καρκίνο των ωοθηκών παραμένει λίγο κατανοητή.

Μέθοδοι

Εκδήλωση MALAT-1 ανιχνεύτηκαν σε 37 φυσιολογική ωοθηκική ιστούς και 45 ωοθηκών ιστούς με ανάστροφη μεταγραφή αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT- PCR). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων παρατηρήθηκε με CCK-8 δοκιμασία? Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης? Η μετανάστευση των κυττάρων ανιχνεύθηκε με τη μετανάστευση transwell και δοκιμασία εισβολής. Προκειμένου να αξιολογηθεί η λειτουργία του MALAT-1, σε συνδυασμό με την shRNA DNA μικροσυστοιχία και ανάλυση Λειτουργικό εμπλουτισμού διεξήχθησαν για τον προσδιορισμό των επιπτώσεων της μεταγραφικής MALAT-1 σίγηση σε κύτταρα OVCAR3. έκφραση RNA και πρωτεΐνης μετρήθηκαν με qRT-PCR και κηλίδωση Western, αντιστοίχως.

Αποτελέσματα

Βρήκαμε ότι προς τα πάνω ρύθμιση του MALAT-1 mRNA σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών και ενισχυμένη MALAT-1 έκφραση συσχετίστηκε με το στάδιο της νόσου. Εξόντωση MALAT-1 έκφραση σε κύτταρα OVCAR3 ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, μετανάστευση, και εισβολή, που οδηγεί σε G0 /G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Υπερεκφράζεται MALAT-1 έκφραση σε κύτταρα SKOV3 προωθούνται κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή. Προς τα κάτω ρύθμιση του MALAT-1 οδήγησε σε σημαντική μεταβολή της γονιδιακής έκφρασης (τουλάχιστον 2-φορές) σε 449 γονίδια, τα οποία ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό, του κυτταρικού κύκλου, και πρόσφυση. Ως συνέπεια της MALAT-1 knockdown, έκφραση πρωτεΐνης ΜΜΡ13 μειώθηκε, ενώ η έκφραση της ΜΜΡ19 και ADAMTS1 αυξήθηκε.

Συμπεράσματα

Η παρούσα μελέτη διαπίστωσε ότι MALAT-1 εκφράζεται εξαιρετικά εις ωοθηκών όγκων. MALAT-1 προάγει την ανάπτυξη και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, γεγονός που υποδηλώνει ότι MALAT-1 μπορεί να συμβάλλει σημαντικά στην ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Zhou Υ, Xu Χ, Lv Η, Wen Q, Li J , Tan L, et al. (2016) The Long ΜΗ ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΤΙΚΌ RNA MALAT-1 εκφράζεται έντονα σε καρκίνο των ωοθηκών και προκαλεί την ανάπτυξη των κυττάρων και τη μετανάστευση. PLoS ONE 11 (5): e0155250. doi: 10.1371 /journal.pone.0155250

Επιμέλεια: Zhiqian Zhang, το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Αντικαρκινικό Νοσοκομείο & amp? Ινστιτούτο, ΚΙΝΑ

Ελήφθη: 4 Γενάρη του 2016? Αποδεκτές: 26, Απρίλη, 2016? Δημοσιεύθηκε: May 26, 2016

Copyright: © 2016 Zhou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από τον Οργανισμό Επιστήμης και Τεχνολογίας πληροφοριών της Guangzhou (Αρ 2010GNE00221) και μελέτης μηχανισμού των MALAT1 Προώθηση εισβολή και Μετάσταση της Καρκίνος των ωοθηκών από Στοχευμένες ρύθμιση STAT3 μονοπάτι σηματοδότησης (Αρ 2014A020212517)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα επιθηλιακά καρκινώματος των ωοθηκών ( EOC) είναι η πιο θανατηφόρα κακοήθεια γυναικολογικό, αντιπροσωπεύοντας σημαντικές θανάτου από καρκίνο κάθε χρόνο [1]. και [2]. Λόγω μη ειδικά συμπτώματα στο πρώιμο στάδιο της νόσου και την έλλειψη αποτελεσματικών τεχνικών διαλογής στην κλινική, η πλειοψηφία (έως 75%) των ασθενών που διαγιγνώσκονται σε προχωρημένα στάδια όταν η νόσος έχει ήδη εξαπλωθεί πέρα ​​από τη λεκάνη, με αποτέλεσμα σε μια φτωχή πρόγνωση [3,4]. Παρά τις συνεχείς προσπάθειες για τη βελτίωση της διάγνωσης και της θεραπείας του ΕΓΚ, επανεμφάνιση του όγκου και των μεταστάσεων παραμένουν σημαντικά εμπόδια για την επιτυχή θεραπεία των ασθενών ΕΓΚ [5]. Έτσι, η έρευνα για τον καρκίνο των ωοθηκών έγκαιρη ανίχνευση και βελτίωση των υφιστάμενων στρατηγικών θεραπείας χρειάζεται επειγόντως.

Είναι ευρέως αποδεκτό ότι η ανάπτυξη του καρκίνου είναι αποτέλεσμα της τροποποιημένης γονιδιακής έκφρασης ή /και οι διαρθρωτικές αλλαγές των γονιδίων που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη. Ωστόσο, τα δεδομένα αλληλούχισης του γονιδιώματος σε επίπεδο αποκάλυψε ότι χιλιάδων γονιδίων στερούνται ικανότητας κωδικοποίησης πρωτεΐνης, ενώ παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, την επιβίωση και την απόπτωση, και ογκογένεση ή άλλες ασθένειες [6]. Η έρευνά μας εστιάζεται σε MALAT-1, ταυτοποιήθηκε αρχικά σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, είναι ένα μεγάλο μη-κωδικοποίησης RNA που συνδέεται στενά με τη μετάσταση του όγκου και ρυθμίζει την έκφραση διαφόρων γονιδίων μετάστασης σχετιζόμενη [7]. MALAT-1 βρίσκεται στο χρωμόσωμα 11q13.1, εκτείνεται μία γονιδιωματική περιοχή 8.7kb, και εκφράζεται ευρέως σε φυσιολογικούς ιστούς, ειδικά στον πνεύμονα και του παγκρέατος [8] ,. MALAT-1 είναι ειδικά διατηρείται στους πυρηνικούς στίγματα [9] όπου οι προ-mRNA παράγοντες ματίσματος εμπλουτισμένη και ως εκ τούτου, μπορεί να λειτουργήσει ως ένα συγκρότημα, την αποθήκευση και /ή διαμέρισμα τροποποίηση [10]. MALAT-1 έχει επίσης εμπλακεί στην πρόοδο του όγκου [11]. Δεδομένων έδειξε ότι MALAT-1 που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου μέσω της ρύθμισης του εναλλακτικού ματίσματος των γονιδίων του στόχου [12] ή γονιδιακή έκφραση [13,14]. MALAT-1 έκφρασης έχει βρεθεί να είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα σε πολλούς συμπαγείς όγκους, όπως του πνεύμονα [8], το ήπαρ [15], και καρκίνων του προστάτη [16] και έχει μια λειτουργία προαγωγής όγκων. Σε αυτή τη μελέτη, μετρήσαμε τα επίπεδα έκφρασης MALAT-1 σε πρωτογενή φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών και των ωοθηκών των όγκων και διερευνήθηκαν του βιολογικού ρόλου του MALAT-1 στην παθογένεση του καρκίνου των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

2.1 Tissue δείγματα

37 επιθηλιακά δείγματα φυσιολογικών ωοθηκών και 45 δείγματα ιστών καρκίνου των ωοθηκών ελήφθησαν από την τρίτη Ενταγμένο Νοσοκομείο της Guangzhou Ιατρικό Πανεπιστήμιο κατά την περίοδο 2009-2013. Όλες οι περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών δεν έλαβαν θεραπεία πριν από το χειρουργείο και διαγνώστηκαν ιστολογικά σύμφωνα με το βιβλίο ΠΟΥ γυναικολογικών παθολογίας (πίνακας 1). Αυτά τα δείγματα ιστού καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από την θεσμική αναθεώρηση της ευρείας της Guangzhou Πανεπιστήμιο Ιατρικής και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς πριν από τη συμμετοχή της εν λόγω μελέτης.

Η

2.2 γραμμή κυττάρων και του πολιτισμού

Ο καρκίνος των ωοθηκών κυτταρική γραμμή OVCAR3, SKOV3 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) και καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και 1% στρεπτομυκίνη /πενικιλίνη στους 37 ° C σε 5% CO

2. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε λογαριθμική φάση ανάπτυξης για όλα τα πειράματα που περιγράφονται παρακάτω.

Απομόνωση

2,3 RNA και qRT-PCR

Το συνολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε από τους ιστούς και κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Takara Bio, Inc., Shiga, Japan) και στη συνέχεια αντίστροφα μεταγράφηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας PrimeScript RT μάστερ μιξ (Takara) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. qPCR διεξήχθη για να προσδιοριστεί η έκφραση του MALAT-1, ΜΜΡ-13, ΜΜΡ-19, ADAMTS1, και του mRNA β-ακτίνης χρησιμοποιώντας ένα κιτ SYBR Green MIX από την Promega (Madison, WI, USA) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Οι εκκινητές αλληλουχίες που φαίνονται στον Πίνακα 2. Τα επίπεδα mRNA β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός συμπερασμού.

Η

2.4 Σχεδιασμός και κατασκευή MALAT-1vectors και γονίδιο διαμόλυνση

Για να αξιολογηθεί ο ρόλος του MALAT-1 σε καρκίνο των ωοθηκών, θα χτυπηθεί κάτω MALAT-1 έκφρασης χρησιμοποιώντας Τα siRNAs και υπερεκφράζεται MALAT-1 έκφρασης χρησιμοποιώντας pcDNA3.1 (+) – MALAT-1 (α-MALAT-1). Εμείς σχεδιαστεί και κατασκευαστεί τέσσερα σετ MALAT-1 shRNA ολιγονουκλεοτίδια (shM1-Μ4) και κλωνοποιήθηκε τους στο pGPU6 /GFP /Neo φορέα (Τζίμα, Σαγκάη, Κίνα). Οι αλληλουχίες ήταν MALAT-1-shM1, 5′-GCCGAAATAAATGAGAGAT GA-3 ‘? shM2, 5’-GG CAGCTGTTAACAGATAAGT-3 ‘? shM3, 5’-GCTGTGGAGTTCTTA AATATC-3 ‘? shM4, 5’-GGGCTTCAGTGATGGGATAGT-3 ‘. Η pGPU6 /GFP /Neo φορέα που περιέχει μια τυχαία ακολουθία DNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος σκαρφάλωμα (SHNC). Μετά την κλωνοποίηση, την ενίσχυση, και της αλληλουχίας του DNA, επιμολύναμε αυτούς τους φορείς σε κύτταρα OVCAR3. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα όταν φθάνει 70-80% συρροή. OVCAR3 επιμολύνθηκαν με shM1, shM2, shM3, shM4, ή SHNC χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. SKOV3 επιμολύνθηκαν με pcDNA3.1 (+) – MALAT-1 και pcDNA3.1 (SKOV3-NC). Τα κύτταρα εξετάστηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας μορφομετατροπής. Τα κύτταρα στη συνέχεια συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση qRT-PCR MALAT-1 έκφρασης. Επειδή MALAT-1 shM3 ήταν πιο αποτελεσματική στην επίτευξη νοκ ντάουν της MALAT-1 έκφρασης, όλες οι επόμενες πειράματα πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση αυτού του shRNA.

2.5 κυττάρων δοκιμασία πολλαπλασιασμού

Για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της MALAT-1 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, πρέπει πρώτα σπαρμένα κύτταρα σε πλάκες 96 φρεατίων με 5 χ 10

3cells /φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με MALAT-1-shM3, SHNC, aMALAT-1 και SKOV3-NC. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό CCK-8 (Biyuntian, Σαγκάη, Κίνα) σε βήματα 24 ώρες για μέχρι και 96 ώρες. Εν συντομία, 10 μΐ διαλύματος CCK-8 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο της κυτταρικής καλλιέργειας και οι πλάκες επωάστηκαν περαιτέρω για άλλες 2,5 ώρες. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στη συνέχεια με ανάλυση FACS κατά την απορρόφηση 450 nm. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές ανεξάρτητα.

2.6 Transwell μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και εισβολή

δοκιμασία

Οι θάλαμοι Transwell με 8 μm πόρους ελήφθησαν από την Corning (Corning, ΝΥ, USA ). Κύτταρα μετεμβολιασμένα συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε DMEM χωρίς FBS σε συγκέντρωση 1 Χ 10

6 κύτταρα σε 100 μΐ, και στη συνέχεια σπέρνονται σε άνω θαλάμους της πλάκας 24 φρεατίων. Τα χαμηλότερα θάλαμοι πληρώθηκαν με 600 μΐ DMEM που περιείχε 10% FBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες. Στο τέλος του πειράματος, τα κύτταρα που μετανάστευσαν στην αντίστροφη πλευρά της μεμβράνης Transwell σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη, βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες, και στη συνέχεια μετρήθηκαν υπό ένα ελαφρύ μικροσκόπιο σε μεγέθυνση x100. Εξετάστηκε κατά μέσο όρο πέντε οπτικά πεδία. Για τη δοκιμασία εισβολή των καρκινικών κυττάρων, η μεμβράνη Transwell προ-επικαλύπτονται με 30 μΙ Matrigel (1: 3 αναμεμιγμένη με PBS? BD Biosciences, Heidelberg, Germany) και προχώρησε η ίδια όπως περιγράφεται παραπάνω

2.7 Cell. κύκλου και απόπτωση με κυτταρομετρία ροής

δοκιμασία

τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε πυκνότητα 5-10 χ 10

6 κύτταρα /ml και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 75% παγωμένη αιθανόλη και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο 400 μΙ διαλύματος (ΡΙ) (BestBio, Σαγκάη, Κίνα) για 30 λεπτά και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε ανάλυση του κύκλου με ένα κυτταρόμετρο ροής (BD). Για την ανάλυση απόπτωσης, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 5 μΙ αννεξίνης V-FITC (BD Biosciences) για 15 λεπτά και 5 μΐ ΡΙ για άλλα 5 λεπτά πριν υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

2.8 χαρακτηρισμού του διαφορική γονιδιακή έκφραση μετά MALAT-1 νοκ ντάουν στον ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

Ολικό RNA εξήχθη με το αντιδραστήριο ΤΡΙΖΟΙ και υπολογίζεται από την NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific). Η ακεραιότητα των RNA αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). βιβλιοθήκες cDNA κατασκευάστηκαν από δείγματα με έναν αριθμό ≥7.0 ακεραιότητα RNA (RIN). Σύνολο RNAs μεταγράφηκαν σε διπλή κλάδοι cDNA και στη συνέχεια συντίθεται cRNAs. Στη συνέχεια, 2η cDNAs κύκλος συντέθηκαν από cRNAs. Ακολούθησε τον κατακερματισμό και την επισήμανση βιοτίνη, το 2ο cDNAs κύκλο υβριδίστηκαν πάνω στην μικροσυστοιχία. Μετά το πλύσιμο και χρώση, τα συστοιχίες σαρώθηκαν από τον σαρωτή Affymetrix 3000 (Affymetrix)

2.9 Gene ανάλυση έκφρασης

λογισμικό Genespring (έκδοση 12.5? Agilent Technologies). Χρησιμοποιήθηκε για να ολοκληρωθεί η γονιδιακή έκφραση ανάλυση. Διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (DEG) ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας φορές αλλαγή, καθώς και τους υπολογισμούς αξίας P. Το όριο για την επιλογή διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων ήταν μια πτυχή της αλλαγής & gt? 2.0 και μια τιμή Ρ & lt? 0.05. KEGG και ανάλυση GO διεξήχθησαν για να καθορίσουν τις πορείες και GO όρων που συνδέονται με διαφορικά εκφρασμένων mRNAs. Ιεραρχική Ομαδοποίηση (HCL) πραγματοποιήθηκε για να εμφανιστεί μοτίβο έκφρασης του γονιδίου διακρίνεται »μεταξύ των δειγμάτων.

2.10 Ανάλυση της έκφρασης του mRNA της βαθμούς με από qRT-PCR

Για να επαληθεύσετε τα αποτελέσματα μικροσυστοιχιών, δώδεκα εκφράζεται με διαφορετικό τρόπο γονίδια επιλέχθηκαν για την επικύρωση qRT-PCR χρησιμοποιώντας κιτ SYBR Green MIX (Promega, USA) και ένα γρήγορο 7500 Real-Time PCR σύστημα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, usingβ-ακτίνη ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Συγκριτικό ποσοτικοποίηση προσδιορίστηκε με τη μέθοδο υπολογισμού 2-ΔΔCt. Υποψήφια γονίδια γονίδιο andβ-ακτίνης ενισχύθηκαν με την ίδια αντίδραση και πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. αλληλουχίες εκκινητών της PCR παρατίθενται στον Πίνακα 2.

εκχύλιση 2,11 πρωτεϊνών και

κηλίδος Western

ολικής κυτταρικής πρωτεΐνης εκχυλίστηκε από επιμολυσμένα κύτταρα και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Beyotime, Πεκίνο , Κίνα). Αυτά τα δείγματα πρωτεΐνης αναλύθηκαν σε 10% SDS μετουσιωμένο πηκτή πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF με μέγεθος πόρων 0,45 μm (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Μετά τον αποκλεισμό εντός 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε Tris-based αλατούχο-Tween 20 (TBST) για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντι-ανθρώπινα αντισώματα ποντικού /κουνελιού στη συνιστώμενη αραίωση [ADAMTS1 και ΜΜΡ19 σε αραίωση 1: 1000, ΜΜΡ13 σε 1: 500 (όλα από την Abcam, Cambridge, MA, USA)] όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά πλύθηκαν σε TBST, οι μεμβράνες επωάστηκαν περαιτέρω με ένα δευτερεύον αντι-ποντικού (1: 2500) ή αντι-κουνελιού (1: 10.000) αντίσωμα για 1 ώρα. Ενισχυμένης χημειοφωταύγειας λύση (ECL) προστέθηκε πάνω στις μεμβράνες και η έκφραση της πρωτεΐνης προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας την εργασία στο εργαστήριο Image Acquisition και Ανάλυση Λογισμικού (UVP, ορεινές, CA, USA). Γλυκεραλδεΰδη αφυδρογονάση 3-φωσφορικής (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

2.12 Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Οι διαφορές μεταξύ δύο ομάδων αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την ακριβή δοκιμή Fisher ή

t

δοκιμή Student, ενώ η διαφορά μεταξύ των πολλαπλών ομάδων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από τεστ πολλαπλών συγκρίσεων Bonferroni του. Διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μετά από νοκ ντάουν της MALAT-1 έκφρασης αξιολογήθηκαν με τη χρήση cDNA μικροσυστοιχιών (Affymetrix HTA 2.0), που αναγνωρίζεται ως φορές αλλαγές και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το

t

test του Student. p & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

3.1 Διαφορική έκφραση MALAT-1 mRNA σε δείγματα ωοθηκικού καρκίνου ιστού

MALAT-1 mRNA έκφραση στον έλεγχο κανονική ωοθήκη και πρωτεύοντες ιστούς καρκίνου των ωοθηκών αξιολογήθηκε με qRT-PCR και ομαλοποιήθηκε με ένα εσωτερικό έλεγχο (β-ακτίνη). Έκφραση MALAT-1 σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών είναι σημαντικά υψηλότερη από εκείνη της υπό κανονικές ωοθήκη (Σχήμα 1). Επιπλέον, MALAT-1 έκφραση συνδέεται σημαντικά με τα στάδια ΦΥΓΩ, αλλά καμία συσχέτιση ταυτοποιήθηκε μεταξύ MALAT-1 έκφραση και την ηλικία, ιστολογικό τύπο, βαθμό, ή η παρουσία ασκίτη (Πίνακας 1). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι υψηλό επίπεδο MALAT-1 έκφραση συνδέεται με την εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών.

MALAT-1 έκφραση είναι σημαντικά υψηλότερη σε ιστούς καρκίνου των ωοθηκών. *

σ

& lt? 0.05.

Η

3.2 MALAT-1 συνδέονται με τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

Στη συνέχεια, κατασκευάσαμε τέσσερις Τα siRNAs που στοχεύουν MALAT-1. shRNA3 ήταν η πιο αποτελεσματική για τη φίμωση έκφραση MALAT-1 σε κύτταρα OVCAR3 (Σχήμα 2Α). Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε αυτό shRNA σε όλα τα ακόλουθα πειράματα. MALAT-1 knockdown μείωσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών που αρχίζει από την ημέρα 2 φτάνοντας στα υψηλότερα επίπεδα από την ημέρα 5 (Σχήμα 3Α). Επιπλέον, MALAT-1 knockdown επίσης κατέστειλε σημαντικά μετανάστευση OVCAR3 και ικανότητα εισβολής (Σχ 3C και 3Ε). SKOV3 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται από επιμολυσμένα με pcDNA3.1 (+) -. MALAT-1 και προς τα πάνω ρύθμιση MALAT-1 επάγεται SKOV3 πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και εισβολή (σχήμα 3Β και 3D και 3F)

(Α) qRT- PCR ανάλυση του MALAT-1 έκφραση εξής shRNA knockdown. κύτταρα OVCAR3 αναπτύχθηκαν και επιμολύνθηκαν με τέσσερα διαφορετικά MALAT-1 shRNA φορείς (shM1 να shM4) και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση qRT-PCR. *

σ

& lt? . 0,05 έναντι ομάδων ελέγχου κύτταρα (Β) SKOV3 αναπτύχθηκαν και επιμολύνθηκαν με pcDNA3.1 (+) – MALAT-1 και pcDNA3.1 (NC) και υποβλήθηκαν σε ανάλυση qRT-PCR, *

ρ

& lt? 0,05 έναντι ομάδων ελέγχου.

Η

(Α) και (Β) Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων CCK-8 δοκιμασίας. Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα αναπτύχθηκαν και επιμολύνθηκαν και στη συνέχεια υποβάλλεται σε CCK-8 δοκιμασίας. *

σ

& lt? 0,05 έναντι ομάδων ελέγχου. (C) και του όγκου δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων (D) Transwell. Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα αναπτύχθηκαν και επιμολύνθηκαν και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε δοκιμασία Transwell μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. (Ε) και προσδιορισμό κυτταρικής εισβολής (F) Transwell όγκου. Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα αναπτύχθηκαν και επιμολύνθηκαν και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε δοκιμασία εισβολής καρκινικών κυττάρων Transwell **

ρ

& lt? 0,0001 έναντι ομάδων ελέγχου.

Η

3.3 Νοκ ντάουν της MALAT-1 επάγει την απόπτωση και συλλήψεις κυτταρικού κύκλου σε G0 /G1

φάση

Επειδή νοκ ντάουν της MALAT-1 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 3Α ), μπορούμε στη συνέχεια εξετάστηκαν MALAT-1 στη ρύθμιση της λειτουργίας πρόοδο του κύκλου των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών και απόπτωση. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι τα αποπτωτικά κύτταρα σε κύτταρα OVCAR3-shM3 ήταν σημαντικά αυξημένη σε 17,8%, σε σύγκριση με 0,03% στα κύτταρα OVCAR3-SHNC και 0,02% σε γονικά κύτταρα OVCAR3 (ρ & lt? 0.001, Σχήμα 4Α και 4C). Επιπλέον, η ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι η knockdown του MALAT-1 έκφραση συνέλαβαν τον κύτταρα OVCAR3-shM3 στο Go /G1 φάση του κυτταρικού κύκλου και τα ποσοστά των κυττάρων στην S και G2 /M φάσεις επίσης μειώθηκαν (P & lt ? 0,05, Σχήμα 4Β και 4D). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι η ανασταλτική επίδραση του MALAT-1 knockdown επί του πολλαπλασιασμού και της ανάπτυξης OVCAR3 μπορεί να προκαλείται από διακοπή του κυτταρικού κύκλου και αυξημένη απόπτωση.

(Α) εξόντωση MALAT-1 οδήγησε σε κύτταρο όγκου απόπτωση. κύτταρα OVCAR3 επιμολυσμένα με MALAT-1 shM3 αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής για την απόπτωση. (Β) Νοκ ντάουν της MALAT-1 οδήγησε σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου. κύτταρα OVCAR3 επιμολυσμένα με MALAT-1 shRNA3 αναλύθηκαν με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για τη διανομή του κυτταρικού κύκλου. (Γ) Ποσοτικοποίηση των δεδομένων στην Α *** p & lt? 0,0001 έναντι των ελέγχων. (Δ) Ποσοτικοποίηση των δεδομένων σε Β, * ρ & lt? 0.05 έναντι ελέγχων.

Η

3.4 Η ελαττωμένη MALAT-1 επηρεάζει την έκφραση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων

Τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης του OVCAR3-SHNC και τα κύτταρα OVCAR3-shM3 αναλύθηκαν με ανάλυση μικροσυστοιχιών, και 449 σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια (& gt? 2 φορές) ταυτοποιήθηκαν. Μεταξύ αυτών, 206 γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω, ενώ 243 γονίδια ρυθμίστηκαν προς τα πάνω σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών με shRNA μεσολάβηση MALAT -1-σίγησης σύγκριση με τον έλεγχο OVCAR3 κύτταρα. Μια ξεχωριστή λίστα των γονιδίων που ρυθμίζονται από MALAT-1, όπως αποδεικνύεται από ανεξέλεγκτους ιεραρχική ομαδοποίηση (Σχήμα 5Α). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε qRT-PCR για 12 επιλέγονται τυχαία genesto επιβεβαιώνουν τα αποτελέσματα των μικροσυστοιχιών. Τα αποτελέσματα qRT-PCR είναι πολύ συγκρίσιμα με τα αποτελέσματα από την ανάλυση μικροσυστοιχιών cDNA, στην οποία

FRK

,

MUC 16

,

MAP2K6

,

FXYD3

,

FDCSP

,

ΜΑΟΒ

,

GBP2

, και

TNFSF10

είχαν καθοδική ρύθμιση,

NEXN

,

TSPAN2

,

ANKRD1

, και

BHLHE41

ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κύτταρα OVCAR3-shM3 σε σύγκριση με τα κύτταρα SHNC (Σχήμα 6). Επιπλέον, GO και ανάλυση εμπλουτισμό KEGG από τα πιο πάνω και τα κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια, αντίστοιχα, εντοπίζονται σημαντικά υπερεκπροσωπούνται λειτουργίες τονίζοντας το ρόλο της MALAT -1 σχετικά με την εισβολή και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Επιπλέον Regul ation μεταγραφής, θετική ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, του κυτταρικού κύκλου, την κυτταρική ανάπτυξη και προσκόλληση κυττάρου με σηματοδότηση ή P53 μονοπάτια σηματοδότησης ΜΑΡΚ επηρεάστηκαν από MALAT-1 έκφρασης. (S1-S4 Σχήματα).

Ανεξέλεγκτη ιεραρχική ανάλυση ομαδοποίησης των παγκόσμιων προφίλ έκφρασης των διαφορετικά εκφρασμένων γονιδίων. Στήλη αντιπροσωπεύει sampl, και γραμμή αντιπροσωπεύει γονίδιο, το πράσινο αντιπροσωπεύει μια έκφραση χαμηλότερο γονίδιο επίπεδο και το κόκκινο αντιπροσωπεύει μια σχετική υψηλότερη της γονιδιακής έκφρασης.

Η

Το γράφημα έδειξε ότι η μέση διαφορά φορές, FRK, MUC 16, MAP2K6, FXYD3 , FDCSP, ΜΑΟΒ, GBP2, TNFSF10 ήταν κάτω-ρυθμίζονται, NEXN, TSPAN2, NKRD1, BHLHE41 ήταν επάνω-ρυθμίζονται σε κύτταρα OVCAR3-shM3. (Ρ & lt? 0,05)

Η

3.5 MALAT-1 μπορεί να εμπλέκεται στον καρκίνο των ωοθηκών με τη ρύθμιση της έκφρασης του

ΜΜΡ13

,

ΜΜΡ19

,

ADAMTS1

Μεταξύ αυτών βαθμούς με 79 γονίδια ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται κατά τουλάχιστον 3 φορές. Σύμφωνα με τις τελευταίες μελέτες,

ΜΜΡ19

,

ADAMTS1

και

ΜΜΡ13

γονίδια συνδέονται στενά με τη μετάσταση και την ανάπτυξη των κακοηθών όγκων. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε qRT-PCR και κηλίδωση Western για να επιβεβαιωθεί η έκφραση

ΜΜΡ19

,

ADAMTS1

και

ΜΜΡ13

γονιδίων μεταξύ OVCAR3-shM3 και τα κύτταρα OVCAR3-SHNC. Η έκφραση του mRNA του

ΜΜΡ13

ρυθμίζεται μειωτικά στα κύτταρα shM3, ενώ η έκφραση του

ΜΜΡ19 και ADAMTS1

αυξήθηκε (** Ρ & lt? 0,01, Σχήμα 7Α). Η έκφραση πρωτεΐνης ήταν σύμφωνο με τα αποτελέσματα mRNA (Σχήμα 7Β). Καταστολή της MALAT-1 οδήγησε σε προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του

ΜΜΡ13

και up-ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων

ΜΜΡ19 και ADAMTS1

, υποδεικνύοντας ότι MALAT-1 μπορεί να εμπλέκεται στον καρκίνο των ωοθηκών με τη ρύθμιση της έκφρασης της έκφρασης του mRNA

ΜΜΡ13

,

ΜΜΡ19

,

και ADAMTS1

γονίδια.

(Α) της ADAMTS1, ΜΜΡ13 και ΜΜΡ19 ρυθμίζονται από MALAT -1. * P & lt? 0,05 έναντι των ομάδων ελέγχου. (Β) έκφραση πρωτεΐνης ADAMTS1, ΜΜΡ13, ΜΜΡ19 και μεταβάλλονται ως αποτέλεσμα της MALAT-1 knockdown. (Γ) Ποσοτικοποίηση της Β * p & lt? 0,05 έναντι του ελέγχου.

Η

Συζήτηση

στο ανθρώπινο γονιδίωμα, τα δεδομένα της αλληλουχίας του DNA απέδειξε ότι αν και χιλιάδων γονιδίων στερούνται ικανότητας κωδικοποίησης πρωτεΐνης, θα μπορούσαν ωστόσο να διαδραματίσουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση την κυτταρική ανάπτυξη, την επιβίωση, απόπτωση, και ογκογένεση [6]. Μη-κωδικοποίησης του RNA μπορούν να ταξινομηθούν ανάλογα με το μέγεθος τους σε miRNAs (22 nt), piRNAs (18-30 nt), μικρή μεταφραστική ρυθμιστική RNAs (100-200nt), και πολύ περισσότερο ncRNAs (μέχρι 10.000 nt) [17] . Η μακρά μη κωδικεύουσα RNA με μήκος & gt? 200 που αποκτήθηκε nt ουσιαστική προσοχή πρόσφατα. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την έκφραση MALAT-1 σε επιθηλιακούς ιστούς καρκίνου των ωοθηκών και διερευνήθηκαν το ρόλο του MALAT-1 στη ρύθμιση της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων και εισβολή in vitro. Βρήκαμε ότι MALAT-1 mRNA ήταν υπερεκφράζεται σε όγκο tissuesand MALAT-1 έκφραση συνδέεται με την εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών. Εξόντωση MALAT-1 έκφραση κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του όγκου, τη μετανάστευση και την εισβολή, συνελήφθησαν κυττάρων στην φάση G0 /G1 του κυτταρικού κύκλου, και απόπτωση. Εντοπίσαμε περαιτέρω 79 γονίδια των οποίων η έκφραση ήταν σημαντικά μεταβληθεί (& gt? 3 φορές) μετά MALAT-1 νοκ ντάουν. Είναι ενδιαφέρον ότι, τρία από αυτά τα γονίδια,

ΜΜΡ19

,

ADAMTS1

, και

ΜΜΡ13

, έχουν προηγουμένως εμπλακεί στη ρύθμιση της αγγειογένεσης, εξω-κυτταρική μήτρα, κυτταρική προσκόλληση, και εξέλιξης του καρκίνου. Έτσι, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η υπερέκφραση του MALAT-1 θα μπορούσε να προωθήσει την πρόοδο του καρκίνου των ωοθηκών με τη ρύθμιση της έκφρασης του

ΜΜΡ19

,

ADAMTS1

και

ΜΜΡ13

γονίδια.

η μετάσταση είναι η κύρια αιτία θνησιμότητας σε ασθενείς με καρκίνο. Ο υποκείμενος μηχανισμός για τη μετάσταση των όγκων και η υποτροπή είναι πολύ περίπλοκη, συμπεριλαμβανομένης της προσκόλλησης καρκινικών κυττάρων, εισβολή, ενδαγγείωση, κυκλοφορία, εξαγγείωση, και η ανάπτυξη σε απομακρυσμένες οργανισμούς [18]. Αλλαγές στην ενδοκυτταρική μονοπάτια σηματοδότησης που ελέγχουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση καθώς και την εξωκυτταρική έκκριση πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση, η μετανάστευση, και πρωτεόλυση είναι υψίστης σημασίας για τη μετάσταση καρκίνου [19]. Πρόσφατα, η λειτουργία των μη-κωδικοποίησης RNA, όπως MALAT-1, κατά τη διάρκεια της μετάστασης αρχίζει να εκτιμηθεί [8, 14]. Σε γυναικολογικές κακοήθειες, καρκίνο των ωοθηκών διαγιγνώσκεται συνήθως ως μεταστατική νόσο. τρέχουσα μελέτη μας δείχνει ότι προς τα πάνω ρύθμιση MALAT-1 σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών. Πράγματι, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι MALAT-1 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε διάφορους τύπους καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του ήπατος, του παγκρέατος, και καρκίνοι του προστάτη. Επιπλέον, MALAT-1 έχει υπηρετήσει ως μεταστατική και στην επανάληψη βιοδείκτη για μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και ηπατοκυτταρικό καρκίνο [15]. Ωστόσο, οι μελλοντικές μελέτες με μεγαλύτερο μέγεθος δείγματος που απαιτείται για να επιβεβαιώσει τα αποτελέσματα μας.

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι τα κύτταρα όγκου ήταν ικανά να παράγουν παράγοντες που επάγουν αγγειογένεση όγκου, καθώς και μεταλλοπρωτεϊνασών και σχετικά μόρια να αποικοδομούν εξωκυτταρική μήτρα [20 ]. τρέχουσα μελέτη μας έδειξε MALAT-1 knockdown διαμορφωμένο την έκφραση ΜΜΡ13 και ΜΜΡ19, τα μέλη της οικογένειας μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας (ΜΜΡ) των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην αλλαγμένη εξωκυττάρια μήτρα μεταβολισμό, την εξέλιξη του όγκου και τη μετάσταση [21, 22]. Ορισμένες προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η ΜΜΡ 13 είναι ασυνήθιστα εκφράζεται σε ορισμένους συμπαγείς όγκους, όπως θηλώδους καρκινώματος του θυρεοειδούς και του παχέος εντέρου και σχετίζεται με την εξέλιξη και τη μετάσταση [23,24]. Σε αντίθεση, ΜΜΡ19, η οποία εμφανίζει μοναδικά δομικά χαρακτηριστικά, παίζει διπλό ρόλο σε ιστούς. Από τη μία πλευρά, η ανεπάρκεια ΜΜΡ19 αύξησε την πρώιμη αγγειογενετική απόκριση, ενεργώντας ως αρνητικός ρυθμιστής της εισβολής. Ωστόσο, ΜΜΡ-19, η οποία είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε διάφορους ιστούς του καρκίνου, διευκολύνει προσβολή όγκου [25]. Συνεπής με την αντι-αγγειογενετική δραστικότητα της ΜΜΡ19, αρκετές αναφορές έχουν καταδείξει ότι μεταλλοπεπτιδάση με θρομβοσπονδίνης τύπου-1 μοτίβο (ADAMTS1), η οποία ρυθμίζεται προς τα πάνω σε MALAT-1-αποσιώπηση κύτταρα να αναστέλλει την αγγειογένεση [26-28]

, και μειωμένη ADAMTS1 διεγείρονται μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων του μαστού [29].

Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχει καμία αναφορά που εμπλέκουν MALAT-1 στη ρύθμιση της έκφρασης ΜΜΡ ή ADAMTS1 στον καρκίνο των ωοθηκών. Παρ ‘όλα αυτά, με βάση τα σημερινά δεδομένα μας, υποθέτουμε ότι η αποτελεσματικότητα του MALAT-1 για την προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου των ωοθηκών μπορεί να διαμεσολαβείται από τα πάνω ρύθμιση της ΜΜΡ13 και προς τα κάτω ρύθμιση ΜΜΡ19 και ADAMTS1.

Για να διευκρινιστεί περαιτέρω η μοριακούς μηχανισμούς MALAT-1-επαγόμενη μετάσταση, προσδιορίσαμε γονίδια που ρυθμίζονται από MALAT-1 έκφραση, με σύγκριση shRNA-ανέστειλε έναντι του ελέγχου καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Περαιτέρω διερεύνηση των γονιδίων στόχων και της οδού σηματοδότησης θα δώσει νέα εικόνα των μοριακών μηχανισμών της MALAT-1 που εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών και θα βοηθήσει στην οικοδόμηση μιας ισχυρότερης πρόβλεψης και πρόληψης κανόνα στον καρκίνο των ωοθηκών.

Υποστήριξη Πληροφοριών

S1 Εικ. GO εμπλουτισμό ανάλυση της βιολογικής διαδικασίας της επάνω ρυθμισμένη και κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια

doi:. 10.1371 /journal.pone.0155250.s001

(JPG)

S2 Εικ. GO εμπλουτισμό ανάλυση του κυτταρικού συστατικού του επάνω ρυθμισμένη και κάτω-ρυθμίζονται μεταγραφές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0155250.s002

(JPG)

S3 Εικ. GO εμπλουτισμό ανάλυση των μοριακών λειτουργίες του επάνω ρυθμισμένη και κάτω-ρυθμίζονται μεταγραφές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0155250.s003

(JPG)

S4 Εικ. Ανάλυση εμπλουτισμό KEGG (ανάλυση οδός)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0155250.s004

(JPG)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Jiachun Lv για χρήσιμες συμβουλές με πειράματα .