Αφηρημένο

φασματοσκοπία ποζιτρονίων εξόντωση της ζωής (PALS) παρέχει μια άμεση μέτρηση των ελεύθερων κενού όγκου μεγέθη σε πολυμερή και βιολογικά συστήματα. Αυτή η δωρεάν όγκου είναι κρίσιμη για την εξήγηση και κατανόηση των φυσικών και μηχανικών ιδιοτήτων των πολυμερών. Επιπλέον, PALS έχει πρόσφατα προταθεί ως ένα δυνητικό εργαλείο για την ανίχνευση του καρκίνου σε αρχικά στάδια, σχολαστικά τις διαφορές στην κλίμακα subnanometer κενά δωρεάν όγκου μεταξύ καρκινικών /υγιή δείγματα δέρματος από τον ίδιο ασθενή. Παρά τις πολλές έρευνες σχετικά με την ελεύθερη όγκο, σε συγκρότημα καρκινικούς ιστούς, δεν υπάρχουν μελέτες ποζιτρονίων εξόντωση των πολιτισμών καρκίνου ζωντανό κύτταρο έχει αναφερθεί. Έχουμε αποδείξει ότι PALS μπορεί να εφαρμοστεί στη μελέτη σε καλλιέργειες ανθρώπινων κυττάρων 3D διαβίωσης. Η τεχνική είναι επίσης ικανό να ανιχνεύει μεταβολές ατομική κλίμακα στο μέγεθος των ελεύθερων κενών όγκο λόγω των βιολογικών αποκρίσεων σε ΤΟΡ-β. PALS μπορεί να αναπτυχθεί για να χαρακτηρίσει την επίδραση των διαφορετικών συνθηκών καλλιέργειας στα κενά ελεύθερο όγκο των κυττάρων που αναπτύσσονται

in vitro

Η

Παράθεση:. Axpe E, Lopez-Euba T, Castellanos-Rubio Α, Merida D, Γκαρσία JA, Plaza-Izurieta L, et al. (2014) ανίχνευση των αλλαγών ατομική κλίμακα στο Free κενό όγκο μεγέθους των τρισδιάστατων του καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικής καλλιέργειας χρησιμοποιώντας Ποζιτρονίων εξαΰλωσης Φασματοσκοπία εφ ‘όρου ζωής. PLoS ONE 9 (1): e83838. doi: 10.1371 /journal.pone.0083838

Επιμέλεια: Βάρδα Rotter, Weizmann Institute of Science, το Ισραήλ

Ελήφθη: 12 Ιουλίου 2013? Αποδεκτές: 17 του Νοέμβρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 2η Ιανουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Axpe et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Τμήμα Βάσκων Βιομηχανίας δεν χορηγούν. SAI11 /263 – PRODETEC και Τμήμα Βάσκων Παιδείας, Πανεπιστημίων και Έρευνας δεν χορηγούν. IT /443/10. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ελεύθερη κενά όγκος διαδραματίζουν βασικό ρόλο σε μια ποικιλία μηχανικών ιδιοτήτων σε πολυμερή [1] και δυναμικές διεργασίες σε βιολογικά συστήματα, συμπεριλαμβανομένων των διαπερατότητα μικρών μορίων και τη διάχυση των φαρμάκων μέσω των κυτταρικών μεμβρανών [2]. φασματοσκοπία Positron εκμηδένιση διάρκεια ζωής (PALS) παρέχει μια άμεση μέτρηση των ελεύθερων κενού όγκου των μεγεθών σε πολυμερή και βιολογικά συστήματα σε μοριακό επίπεδο, και αυτό το ελεύθερο όγκο είναι κρίσιμη για την κατανόηση φυσικές και μηχανικές ιδιότητες των σύνθετων βιομοριακών συστημάτων όπως το κολλαγόνο [3], χοίρου φακό του ματιού [4], τομές εγκεφάλου αρουραίου [5] και το ανθρώπινο δέρμα [6].

έχει αποδειχθεί πρόσφατα ότι PALS είναι ευαίσθητη στις μεταβολές του ελεύθερου μέγεθος κενά όγκος που σχετίζονται με ορισμένους τύπους όγκων και είναι σε θέση να διακρίνουν μεταξύ υγιών και καρκινικών δείγματα δέρματος από τον ίδιο ασθενή. Έτσι, PALS έχει προταθεί ως ένα πιθανό εργαλείο για την ανίχνευση του σχηματισμού του καρκίνου στα πρώτα στάδια της ανάπτυξης του όγκου [6], [7]. Ωστόσο, κυτταρική σύνθεση των δειγμάτων ιστού ποικίλει από τον ίδιο οργανισμό και μπορεί να περιλαμβάνει αλλαγές στα άκυρα μεγεθών [8].

Η υπόθεσή μας είναι ότι βιολογικές αποκρίσεις σε περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως την κυτταρική διαφοροποίηση και οι αλλαγές στη δομή των κυττάρων αποικία συνοδεύονται από αλλαγές ατομική κλίμακα στην ελεύθερη μέγεθος κενό όγκο των κυττάρων, και ότι αυτές οι αλλαγές μπορεί να χαρακτηρίζεται από PALS. Για να δοκιμαστεί αυτή η ιδέα, χρησιμοποιήσαμε ένα μοντέλο καρκίνου του παχέος εντέρου καλλιέργειας Τ84 ανθρώπινο κύτταρο 3D κάτω από δύο διαφορετικές συνθήκες που οδηγούν σε διακριτές

in vitro

πολυκύτταρους οργάνωση των αποικιών. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν εντός κολλαγόνου τύπου Ι μήτρα γέλης με ή χωρίς αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού β (ΤΟΡ-β), παράγοντα ινοβλαστών προερχόμενο επηρεάζουν επιθηλιακά κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την κινητικότητα, και τη διαφοροποίηση των κυττάρων Τ84. Κύτταρα σε μορφή κολλαγόνου ανοργάνωτη συστάδες 3D κυττάρων μέσα στις γέλες, αλλά όταν αναπτύχθηκαν παρουσία του ΤΟΡ-β, τα επιθηλιακά κύτταρα Τ84 είναι σε θέση να οργανώνουν και να διαφοροποιηθούν σε μια διακριτή φαινότυπο που μοιάζει με εντερική κρύπτες [9]. Δείχνουμε ότι PALS μετρήσεις είναι σε θέση να ανιχνεύσει κλίμακας μεταβολές του μεγέθους κενών ατομικών στο αδενοκαρκίνωμα του κόλου καλλιέργειες ανθρώπινων κυττάρων 3D ανάπτυξη σε βάθος χρόνου και όταν έλαβαν θεραπεία με TGF-β.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

Ανθρώπινο αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου Τ84 κυτταρική σειρά (CCL 248, ATCC Rockville, MD, USA) παρασχέθηκε ευγενώς από τον καθηγητή Markku Μάκη (Κοιλιοκάκη Ομάδα μελέτης του Πανεπιστημίου του Τάμπερε, Φινλανδία). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια στο εργαστήριο. τροποποιημένο κατά Dulbecco μίγμα του Eagle μέσου F12 θρεπτικό (1:01) (DMEM-F12 ref 31330), πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (ref 15070) και διττανθρακικό νάτριο αγοράστηκαν από την Life Technologies (Ισπανία). Θερμικά αδρανοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (ref F9665), 10 × RPMI-1640 (ref R1145), θρυψίνη /EDTA (ref T4049), Triton Χ-100 (ref T9284), albumim από βόειο ορό (ref B4287) και ριβονουκλεάσης Α (παραπ R6513) ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (Ισπανία). Rat ουρά κολλαγόνο Ι (ref 354236) αγοράστηκε από την Beckton Dickinson (Ισπανία). Ο αυξητικός παράγοντας εξαλλαγής βήτα 1 ανασυνδυασμένη ανθρώπινη (rhTGF-β, ref 240-Β) αγοράστηκε από την R & amp? Συστήματα D (Ηνωμένο Βασίλειο) και παραφορμαλδεϋδη (ref 15710) από επιστήμες μικροσκοπία ηλεκτρονίων, Hoetch 33342 και Φαλλοϊδίνη-ΡΕ ελήφθησαν από Sigma- Aldrich (Ισπανία). Πλαστικά πιάτα ελήφθησαν από Corning Costar (Ισπανία) και οι πλάκες από Becton Dickinson (Ισπανία).

Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας που αποτελείται από DMEM-F12, 5% θερμικά αδρανοποιημένο εμβρυϊκό βόειο ορό και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη [9]. Τ84 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε φιάλες καλλιέργειας ιστών Τ75 σε 37 ° C σε ένα 5%

2 ατμόσφαιρα CO και περάστηκαν μία φορά την εβδομάδα μετά την επίτευξη του 80% συρροή. μέσο καλλιέργειας άλλαζε κάθε 2 ημέρες. Τ84 κύτταρα απομακρύνθηκαν από τις φιάλες με 6 ml 0,25% τρυψίνης-ΕϋΤΑ στους 37 ° C κατά τη διάρκεια 15 λεπτών. Στη συνέχεια, πλένονται σε μέσο, ​​συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 450 χ G επί 5 λεπτά και υποκαλλιεργήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων με κολλαγόνο. Τα κύτταρα σε αιώρηση μετρήθηκαν με ένα κυτταρικό μετρητή (

καταμέτρηση Coulter σωματιδίων και αναλυτής μέγεθος

, Beckman Coulter). Τ84 κύτταρα απλώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητα 1,5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο.

Για την παραγωγή 3-D αδρανών ουράς αρουραίου κολλαγόνου Ι χρησιμοποιήθηκε. Το κολλαγόνο αναμείχθηκε με οξεικό οξύ, 10 × RPMI-1640 και όξινο ανθρακικό νάτριο. Σε κάθε πείραμα χρησιμοποιήσαμε 1 ml κολλαγόνου, 125 μΙ RPMI-1640 10 × και 125 μΙ διττανθρακικού νατρίου.

Για να δημιουργήσετε την κουλτούρα 3D, 300 μΐ του μίγματος κολλαγόνου (3 mg /ml τελική συγκέντρωση) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάζονται στους 37 ° C για να πηκτωματοποιήσει. Μετά από 20 λεπτά επώασης, τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε επιπλέον 200 μΐ του μείγματος κολλαγόνου και σπάρθηκαν επί πηκτών κολλαγόνου. Τέλος, 1 ml DMEM-F12 μέσο καλλιέργειας προστέθηκε για να καλύψει 3D καλλιέργειες.

Για να προσδιορισθεί το βέλτιστο μήκος των πειραμάτων (δηλαδή ο κατάλληλος χρόνος στις κυτταρικές καλλιέργειες για τη μέτρηση της μέση ελεύθερη όγκου τους μέσω PALS) έχουμε επέλεξαν διαφορετικούς χρόνους πολιτισμό για να κάνουν μετρήσεις:. 6-13-20-27-34-41 ημέρες

κυττάρων διέγερση

για να προκαλέσουν αλλαγές στη μορφολογία των κυττάρων, αδρανών υλικών Τ84 επωάστηκαν με 10 ng /ml hrTGF-β1 προστίθενται στο μέσο καλλιέργειας [9]. Αυτές οι καλλιέργειες αναπτύχθηκαν σε καλλιέργεια μέχρι 41 ημέρες και το μέσο καλλιέργειας αλλάχθηκε κάθε δύο ημέρες.

ανοσοφθορισμού μικροσκοπία

7 και 17 ημερών 3D κυτταρικές καλλιέργειες μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη σε δωμάτιο θερμοκρασία για 30 λεπτά. Μετά από πλύση τρεις φορές με PBS, οι καλλιέργειες διαπερατά με 0,5% Triton Χ-100 σε 4 ° C όλη τη νύκτα και πλένεται και πάλι με PBS. Μετά τον αποκλεισμό με 3% BSA σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου επί 2 ώρες, οι καλλιέργειες επωάστηκαν με RNaseA 1 × (1:1000) σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα [10]. Νηματοειδής ακτίνη σημάνθηκε με φαλλοειδίνη-ΡΕ (1:1000) στους 4 ° C όλη τη νύκτα [11]. πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 (1:1000) στους 4 ° C για 3 ώρες.

Τα δείγματα αναλύθηκαν με συνεστιακό μικροσκόπιο της Olympus Fluoview FV500. Στοίβα αποσυνέλιξης και 3D ανακατασκευή των εικόνων που λαμβάνονται στον άξονα z για να κατασκευάσει βίντεο κίνησης πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό ImageJ.

Δωρεάν όγκο μετρήσεις κενό μέγεθος

Όσον αφορά το φασματόμετρο, ORTEC (ΗΠΑ) ηλεκτρονική ενότητες ήταν εξοπλισμένα με δύο BC-422 πλαστικές σπινθηριστές από το Saint-Gobain (ΗΠΑ) και δύο πολλαπλασιαστές H1949-50 Hamamatsu (Ιαπωνία) φωτογραφία ταιριάζει σε κάθετη θέση μέσα σε μια FFD-1402 ψυγείου από Radiber SA (Ισπανία). Η πηγή ποζιτρονίων ήταν

22NaCl από PerkinElmer (ΗΠΑ) περίπου 15 μΟί, εξατμίζεται ανάμεσα σε δύο Kapton φύλλα των 7,5 μm από CS Hyde (ΗΠΑ) και των 75 μm από την DuPont (ΗΠΑ) σφραγίζεται από ένα διπλής όψεως Kapton ταινία από CAPLINQ (Καναδάς). Από τη στιγμή που προορίζεται για τη μέτρηση φρέσκο, που ζουν κυτταροκαλλιέργειες, σχεδιάσαμε και συνθετικά ένα συγκεκριμένο κάτοχο του δείγματος για την μελέτη (συμπληρωματική εικ. 1).

συνεστιακή μικροσκοπία των 7 και 17 ημερών Τ84 σε τρισδιάστατο καλλιέργεια . Όλες οι εικόνες είναι 20 × μεγέθυνση. μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύουν 50 μm. Α) Οι αποικίες Τ84 παρατηρούνται με αντίθεση φάσης. πυρήνες Β) των κυττάρων χρωματίστηκαν με Hoechst. Γ) Οι νηματώδεις ακτίνης χρωματίζονται με Φαλλοϊδίνη-ΡΕ. Στο D, συγχωνεύθηκε εικόνες της Β και Γ

Η

PALS πειράματα έγιναν με ένα γρήγορο-γρήγορο σύστημα σύμπτωση χρονισμού με ένα πλήρες πλάτος στο μισό μέγιστη ανάλυση 0.260 ns (FWHM). Οι μετρήσεις διεξήχθησαν στους 4 ° C. Η διάρκεια ζωής των ποζιτρονίων παρέμεινε αμετάβλητη κατά μήκος του χρόνου από την έκθεση στην ακτινοβολία πηγής κατά τη διάρκεια των τριών μετρήσεων. Τα φάσματα διάρκεια ζωής συλλέγεται με περισσότερα από 3 × 10

6 μετρήσεις ανά φάσμα αναλύθηκαν με χρήση του προγράμματος LT_polymers [12]. Μετά την αφαίρεση της συνεισφοράς πηγή (31,6%, 0.382 ns), ποζιτρόνιο ζωές φάσματα αναλυθούν σε τρεις συνιστώσες. Ο μακροβιότερος διανομής συστατικό ανατέθηκε στο

ορθο

-Positronium (

o

-ΡS) κατανομή χρόνου ζωής, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6]. Το μέσο μέγεθος ακτίνα του όγκου κενών σε 3D καλλιέργειες εκτιμήθηκαν μέσω της εξίσωσης Tao-Eldrup [13], [14], με βάση την ποζιτρονίου παγίδευση σε σφαιρικές κενά σε πολυμερή: όπου

R

0 = R +

Δ

R

, και Δ

R

είναι μια εμπειρική παράμετρος τοποθετηθεί να είναι 1,66 Å [15].

Αποτελέσματα

Τ84 εντερικά επιθηλιακά κύτταρα αυξηθεί τρεις διαστάσεις σχηματίζεται ανοργάνωτη γύρο αποικίες σε 7 και 17 των πολιτισμών ημερών (Σχήμα 1. ελέγχου). Τα κύτταρα unpolarized και συγκεντρώθηκαν γύρω στις συστάδες των σφαιριδίων χωρίς οργανωμένη προσανατολισμό. πυρήνες κυττάρων διανεμήθηκαν γύρω από την αποικία, αλλά σε ένα ανοργάνωτο τρόπο (Βίντεο S1, S2 Βίντεο). Ωστόσο, όταν τα κύτταρα Τ84 αναπτύχθηκαν τρεις διαστάσεις με την παρουσία του TGF -β, οι αποικίες των κυττάρων παρουσίασε μια εξαιρετικά οργανωμένη δομή, ως ένα στρώμα ενός κυττάρου γύρω από ένα αυλό (Σχήμα 1. ΤΟΡ-β, Βίντεο S3, S4 Βίντεο) που περιβάλλουν ένα κεντρικό αυλό. διανομής νηματοειδή ακτίνη (Σχήμα 1.Γ) εντοπίζεται στην επένδυση των αυλών σφαίρας, αντανακλώντας TGF-β μεσολάβηση διαφοροποίηση (Βίντεο S3, S4 Βίντεο). Αυτή η εξαιρετικά οργανωμένη δομή είναι καλά αντιληπτή από διάφορα βίντεο στο συμπληρωματικές πληροφορίες.

Τα δεδομένα που λαμβάνονται από την PALS συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Όσον αφορά την ελεύθερη κενού όγκου των μεγεθών, και στις δύο μη διεγερμένα και TGF-β συνθήκες ανάπτυξης το κενό όγκοι των 3D καλλιέργειες αυξήθηκε για να φτάσει ένα μέγιστο (Σχήμα 2)? Για κανονικές συνθήκες ανάπτυξης ο μέσος όγκος κενού στην κορυφή ήταν 102 ± 1 A

3 σε 34 ημέρες, ενώ για τον πολιτισμό με TGF-β ήταν 111 ± 1 A

3 σε 20 ημέρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, τη στιγμή που η μέση κενός μέγεθος φτάσει σε ένα maximun, αυτή η τιμή άρχισε να μειώνεται σταδιακά: ο μέσος κενός όγκος μειώθηκε κατά 7% υπό κανονικές συνθήκες σε 1 εβδομάδα, και 16% σε 3 εβδομάδες υπό ΤΟΡ-β συνθήκες

η μπλε καμπύλη αντιπροσωπεύει καλλιέργειες ελέγχου και η κόκκινη καμπύλη αντιπροσωπεύει καλλιέργειες που έλαβαν θεραπεία με TGF-β.

η

η μέση διάρκεια ζωής και διανομή

o

-ΡS σε τρεις διάστατο κυτταροκαλλιέργειες ήταν αντίστοιχα 2-12% και 20-120% μεγαλύτερη σε σχέση με το κολλαγόνο (Πίνακας 1). Ανάλογα με το χρονικό σημείο της ανάπτυξης, η

o

-ΡS διανομής διάρκεια ζωής για τον ΤΟΡ-β καλλιέργειες ήταν μεταξύ 0,11 ± 0,08 NS σε 0,26 ± 0,07 NS μεγαλύτερο από μη διεγερμένα υπό συνθήκες ανάπτυξης.

Συζήτηση

Έχουμε δείξει ότι το μοντέλο καλλιέργειας Τ84 3D επιτρέπει την ειδική μελέτη του ελεύθερου όγκου σε ζωντανά κύτταρα με PALS. Βρήκαμε ότι PALS ανιχνεύει κλίμακα αλλαγές ατομική του μέσου μεγέθους κενός ελεύθερο όγκο σε καλλιέργειες 3D κυττάρων αδενοκαρκινώματος παχέως εντέρου του ανθρώπου πάροδο του χρόνου. Μορφολογικές αλλαγές που παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού σε καλλιέργειες κυττάρων σε διαφορετικές συνθήκες είναι σίγουρα η συνέπεια των μοριακών γεγονότων που λαμβάνουν χώρα στα κύτταρα και αντικατοπτρίζονται επίσης στις μετρήσεις PALS. Αν και κυτταρικής καλλιέργειας αναπτυξιακά συμβάντα δεν μπορεί να συσχετιστεί άμεσα με την ελεύθερο όγκο, τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι κυτταρικές αλλαγές πράγματι αντικατοπτρίζονται στην νανοδομή αυτών των καλλιεργειών. Η

o

-ΡS αλλαγές ζωής πιθανόν να προκύψουν από τις δυναμικές διεργασίες των κυτταρικών καλλιεργειών (ανάπτυξη, τη διαίρεση και τον θάνατο). Επιπλέον, ΤΟΡ-β επάγει κυτταρικό διαφοροποίησης, και αυτό συνοδευόμενα από μια αύξηση στην κατανομή του

o

-ΡS διάρκεια ζωής (και συνεπώς, των ελεύθερων μέγεθος όγκου) στις καλλιέργειες 3D κυττάρων. Το αποτέλεσμα αυτό συνεπάγεται μεγαλύτερη διασπορά του μεγέθους οπής σε δείγματα επεξεργασμένα με ΤΟΡ-β σε σύγκριση με μη διεγερμένα συνθήκες. κυτταρικό θάνατο θα μπορούσε να συμμετέχει στην αναπτυσσόμενη στο

o

-ΡS ζωές.

Είμαστε στην αυγή της PALS εφαρμογές σε πολύπλοκα συστήματα κυττάρων, αλλά τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι πολιτισμοί 3D κυττάρων (

o

-ΡS ζωής μετριέται σε ένα μείγμα κυττάρων και κολλαγόνο) μπορεί να είναι ένα καλό σημείο εκκίνησης για αυτό το είδος της έρευνας. Επί του παρόντος, PALS επιτρέπει μόνο χύμα μετρήσεις που δεν παρέχουν επαρκή ανάλυση για να διακρίνει

o

-ΡS ζωές σε μεμονωμένα κύτταρα από το σύνολο του πολιτισμού. Παρ ‘όλα αυτά, η μετρηθείσα αύξηση στη διάρκεια της ζωής και διανομές πρέπει να οφείλεται σε μοριακές και δομικές αλλαγές που επηρεάζουν τον ελεύθερο όγκο των κυττάρων και, κατά συνέπεια, ότι του πολιτισμού 3D. Επιπλέον, PALS είναι μια μη-διαταρακτική τεχνική? δεν διαταράσσει ούτε τη δομή του πολιτισμού 3D ούτε τη δυναμική των κυττάρων. Χρησιμοποιήσαμε το μοντέλο Τάο-Eldrup για πολυμερή κατά τον υπολογισμό των μεγεθών των ελεύθερων κενών όγκου από το

o

-ΡS ζωής, όπως έγινε στο παρελθόν σε πολλές μελέτες PALS σε βιολογικά συστήματα [3] – [7].

Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη μελέτη της εφαρμογής της PALS σε 3D ζουν κυτταροκαλλιέργειες και μάλιστα, περισσότερες μετρήσεις σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας που τροποποιούν διαφορετικές βιολογικές παραμέτρους που απαιτούνται, πριν αυτή η μέθοδος μπορεί να είναι θεωρείται δυνητικά χρήσιμο διαγνωστικό εργαλείο στην ανθρώπινη ασθένεια. Μαζί με την πειραματική έρευνα, μελέτες για να δείξει κατά πόσον οι τοπικές ηλεκτρικά πεδία που προκαλούνται από διαμεμβρανική τάση των κυττάρων που επηρεάζουν το σήμα ποζιτρόνιο, ή ποια μέρη του κυττάρου προτιμώνται στόχοι για την εξαΰλωση των ποζιτρονίων θα πρέπει επίσης να αναληφθούν. Επιπλέον, υπολογιστικές προσομοιώσεις για να αξιολογήσει την εφαρμογή του μοντέλου Τάο-Eldrup (εφαρμόζεται για τον χαρακτηρισμό ελεύθερο όγκο, σε πολυμερή) σε πιο πολύπλοκα βιολογικά θέμα θα είναι αναγκαία.

Εν κατακλείδι, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που ισχύουν PALS για ο χαρακτηρισμός των ζωντανών κυττάρων. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι κυτταρικές καλλιέργειες 3D είναι χρήσιμες για τη μέτρηση ελεύθερο όγκο σε ζωντανά κύτταρα με PALS σε ένα ρεαλιστικό και ελεγχόμενο τρόπο, και για την παρατήρηση των μεταβολών της ελεύθερης κενό όγκο μεγέθη σε κυτταρικές καλλιέργειες εξαιτίας συγκεκριμένων παραγόντων (π.χ., χρόνος ανάπτυξης και ΤΟΡ-β). Αυτή η μελέτη είναι σε συμφωνία με την τεχνική PALS ως έγκυρο εργαλείο για τον χαρακτηρισμό των βιολογικών συστημάτων και θα μπορούσαν να παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες στην έρευνα για τον καρκίνο στο ατομικό και μοριακό επίπεδο.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Σχεδιασμός και εγκατάσταση του κατόχου του δείγματος και την πηγή ποζιτρονίων για την εφαρμογή της PALS σε βιολογικά δείγματα και υγρά. Σχεδιάσαμε και συνθετικά ένα κάτοχος του δείγματος αλουμινίου για τη μέτρηση βιολογικών δειγμάτων και υγρά. Οι σπινθηριστές και φωτοπολλαπλασιαστές που χρησιμοποιούνται σε αυτό το έργο τοποθετήθηκαν σε κάθετη θέση. Το σχήμα δείχνει την διαμήκη τομή του υποδοχέα του δείγματος (1). Στο (2) περιγράφουμε το δείγμα γεμίζοντας την κάτω πλευρά της θήκης. Στο (3), έχουμε τοποθετήσει την πηγή Kapton πάνω από το δείγμα, που κάθεται στην προβολή αλουμινίου. Μπορούμε επίσης να δούμε πώς το

22Na προηγουμένως κατατεθεί ακριβώς στη μέση του Kapton, έτσι ώστε όλα τα ποζιτρόνια εξολεθρεύει στο δείγμα, και όχι στον κάτοχο. Αυτή η πηγή Kapton πρέπει να είναι ισχυρή, έτσι χρησιμοποιήσαμε ένα παχύτερο φύλλο Kapton 75 μm για το τμήμα που κάθεται στο προεξοχή συγκράτησης (Kapton φύλλο Β), σε σύγκριση με το 7,5-μm Kapton φύλλο Α στο (4) που δείχνουν πώς η πηγή ποζιτρονίων στριμώχνεται από δύο πανομοιότυπα υγρού /βιολογικά δείγματα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083838.s001

(TIFF)

βίντεο S1.

Ομοεστιακή ανοσοφθορισμού των τρισδιάστατων αποικίες Τ84 μετά από 7 ημέρες στην καλλιέργεια

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083838.s002

(AVI)

Βίντεο S2.

Ομοεστιακή ανοσοφθορισμού των τρισδιάστατων αποικίες Τ84 μετά από 17 ημέρες σε καλλιέργεια

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083838.s003

(AVI)

Βίντεο S3.

συνεστιακή ανοσοφθορισμού των τρισδιάστατων αποικίες Τ84 μετά από 7 ημέρες σε καλλιέργεια με 10 ng /ml ΤΟΡ-β

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083838.s004

(AVI)

Βίντεο S4 .

Ομοεστιακή ανοσοφθορισμού των τρισδιάστατων αποικίες Τ84 μετά από 17 ημέρες σε καλλιέργεια με 10 ng /ml ΤΟΡ-β

doi:. 10.1371 /journal.pone.0083838.s005

(AVI)

Ευχαριστίες

Τεχνική και ανθρώπινη υποστήριξη που παρέχεται από SGIker (UPV /EHU, MICINN, GV /EJ, ΕΤΠΑ και ΕΚΤ) αναγνωρίζεται με ευγνωμοσύνη.