Αφηρημένο

Στόχοι

Ο ρόλος των Sonic hedgehog (ΕΛΕΡΠΕ) στα επιθηλιακά μετάβαση μεσεγχυματικά (EMT) του καρκίνου του παγκρέατος (PC) είναι γνωστή, ωστόσο, ο μηχανισμός του είναι ασαφής. Επειδή ΕΛΕΡΠΕ προωθεί την ανάπτυξη των καρκινικών κυρίως μέσω Gli1, επιδιώξαμε να κατανοήσουμε το μηχανισμό με τον προσδιορισμό των στόχων Gli1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα.

Μέθοδοι

Κατ ‘αρχάς, ερευνήσαμε την εισβολή, τη μετανάστευση, και EMT στα κύτταρα PC επιμολυσμένα με φορείς λεντοϊών Gli1 παρεμβολές ή ΕΛΕΡΠΕ υπερέκφραση φορείς

in vitro

και

in vivo

. Στη συνέχεια, προσδιορίσαμε τα προφίλ του γονιδίου-στόχου του Gli1 σε κύτταρα PC χρησιμοποιώντας δοκιμασίες μικροσυστοιχιών cDNA. Τέλος, οι πρωτογενείς ρυθμιστικών δικτύων κατάντη της ΕΛΕΡΠΕ-Gli1 σηματοδότηση στα κύτταρα PC μελετήθηκαν μέσα από λειτουργικές αναλύσεις αυτών των στόχων.

Αποτελέσματα

Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν υπάρχει μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης μετά από αυξημένη έκφραση της ΕΛΕΡΠΕ /Gli1. Η μετανάστευση των κυττάρων PC αυξήθηκε σημαντικά με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο μέσα σε 24 ώρες από την έκφραση Gli1 (

P

& lt? 0,05). Η αναλογία των ηπατικών μεταστάσεων και ενδοσπληνική μικρογραφία μετάσταση αυξήθηκαν σημαντικά μετά την ενεργοποίηση των σημάτων SHH-Gli1 σε γυμνά ποντίκια. Χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχία cDNA, εντοπίσαμε 278 ρυθμίζεται προς τα πάνω και 59 ρυθμίζεται προς τα κάτω γονιδίων κατά την έκφραση σε κύτταρα Gli1 AsPC-1. Τα στοιχεία δείχνουν ότι τα σήματα ΕΛΕΡΠΕ-Gli1 προώθηση EMT μεσολαβώντας ένα πολύπλοκο δίκτυο σηματοδότησης συμπεριλαμβανομένων TGFβ, Ras, Wnt, αυξητικούς παράγοντες, PI3K /AKT, ιντεγκρίνες, διαμεμβρανική 4 υπεροικογένεια (TM4SF), και S100A4.

Συμπέρασμα

τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η στόχευση των μοριακών συνδέσεων μεταξύ ΕΛΕΡΠΕ-Gli1 σηματοδότησης και EMT θα μπορούσε να παράσχει αποτελεσματικές θεραπείες για PC

Παράθεση:. Xu Χ, Zhou Υ, Xie C, Wei Sm, Gan η , He S, et al. (2012) Genome-Wide Screening αποκαλύπτει μια EMT Μοριακής Δίκτυο διαμεσολαβείται από Sonic Hedgehog-Gli1 Σηματοδοσίας σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 7 (8): e43119. doi: 10.1371 /journal.pone.0043119

Επιμέλεια: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Ιουνίου, 2012? Αποδεκτές: 17 Ιουλίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 10 Αυγούστου 2012

Copyright: © Xu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81072005 και 81172312) και της Επιτροπής Σαγκάη Επιστήμης και Τεχνολογίας (10ZR1423300). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Sonic hedgehog (ΕΛΕΡΠΕ) εμπλέκεται σε εμβρυακή οργανογένεση ως μορφογονίδιο. Ακατάλληλη ενεργοποίηση των σημάτων ΕΛΕΡΠΕ κατά τη διάρκεια αποτέλεσμα το σχηματισμό του παγκρέατος σε αγενεσία και αρκετές παθήσεις του παγκρέατος [1]. SHH αποκλείεται από τις αναπτυσσόμενες πάγκρεας, καθώς και την ώριμη όργανο, αλλά ρυθμίζεται αυξητικά σε χρόνια παγκρεατίτιδα, παγκρεατικό νωρίς ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (PanIN) αλλοιώσεις, και διηθητικό καρκίνο του παγκρέατος (PC) [2]. Η ανώμαλη ρύθμιση προς τα πάνω SHH αναφέρθηκε στο υποσύνολο ανθρώπινα κύτταρα PC και θα μπορούσε να είναι ένας πρωταρχικός μεσολαβητής κρίσιμη ανάπτυξης PC [3].

Το Hedgehog (ΗΗ) οδού σηματοδότησης είναι στενά συνδεδεμένη με μετάσταση όγκου και την πρόγνωση σε κλινικές μελέτες και είναι που απαιτείται για την μετάσταση όγκου PC σε ορθοτοπική μοντέλα ποντικού [3], [4]. Πρόσφατα, αυτή η οδός θεωρήθηκε για να ενορχηστρώσει την επαναπρογραμματισμό των καρκινικών κυττάρων μέσω επιθηλιακών μετάβαση μεσεγχυματικά (EMT). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα πρόσφατα στοιχεία διαπίστωσε ότι η Shh ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε γεμσιταβίνη ανθεκτικά PC κύτταρα που εκφράζουν ταυτόχρονα τον καρκίνο βλαστοκυττάρων (ΚΕΠ) δείκτες [5]. Επειδή οι SHH επαγόμενη προϊόντα γονιδίου-στόχου μπορεί να συμβάλει στην αυτο-ανανέωση, την επιβίωση και μετανάστευση των καρκινικών προγονικών κυττάρων και Gli1 μπορεί να παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην κακοήθη συμπεριφορά των PC κυττάρων [6], [7], τον εντοπισμό στόχων Gli1 είναι ένα λογικό βήμα για την κατανόηση του μηχανισμού της στα κύτταρα PC.

Η

Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να παράσχει ένα πλαίσιο για τις πρωτογενείς ρυθμιστικών δικτύων κατάντη της ΕΛΕΡΠΕ-Gli1 σηματοδότηση στα κύτταρα PC. Επιδιώξαμε επίσης να καθοριστεί εάν τα γονίδια στόχου ειδικών Gli1 συνδεθείτε ΕΛΕΡΠΕ-Gli1 σηματοδότησης και EMT, παρέχοντας έτσι μια θεραπευτική στρατηγική για PC.

Υλικά και μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Η κυτταρικές σειρές PC (BxPC3, AsPC-1, και Panc-1 όλα τα αποθηκευμένα από την κινεζική Ακαδημία Επιστημών.) καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS). Όλα τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 σε αέρα.

Vector κατασκευή και τη μόλυνση των κυττάρων

Οι φορείς λεντοϊών μεταφοράς για ανθρώπινη Gli1 shRNA ή SHH cDNA κατασκευάστηκαν από Genechem Co., Ltd, Shanghai, Κίνα. Το σύστημα αυτό περιλαμβάνει το φορέα λεντοϊού pLVTHM, το πλασμίδιο φάκελο pMD2G, και τα πλασμίδια συσκευασία pRSV-REV και pMDlg-pRRE. Η φακοϊό-SHH (L-SHH) περιέχει 3,3-kb αλληλουχία κωδικοποίησης SHH και το φακοϊό-Gli1i (L-Gli1i) περιέχει μικρά φουρκέτα Gli1 RNA με την αλληλουχία στόχευσης του shRNA, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (5′-CTCCACAGGCATACAGGAT-3 ») [8]. Η φακοϊό ελέγχου (L-C) δεν περιλαμβάνουν ακολουθίες παρεμβολής Gli1 ή αλληλουχίες ΕΛΕΡΠΕ cDNA και υπηρέτησε ως έλεγχος. Λεντοϊών κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση DNA. Η ανασυνδυασμένη lentivirus παρήχθη από παροδικής επιμόλυνσης κυττάρων 293Τ μετά από ένα πρότυπο πρωτόκολλο. Όταν BxPC3, AsPC-1, και τα κύτταρα Panc-1 ήταν περίπου 50% συρρέοντα (σε RPMI-1640 που περιέχει 2% FCS), αυτοί μολύνθηκαν με τους λεντοϊού κατασκευάσματα σε ΜΟΙ 5. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 72 ώρες για περαιτέρω πειράματα. Για τον προσδιορισμό των λειτουργικών L-ΕΛΕΡΠΕ και L-Gli1i κατασκευάζει, αναλύσαμε συνήθως έκφραση ΕΛΕΡΠΕ και Gli1 από qRT-PCR

Α:. Έκφραση της ΕΛΕΡΠΕ, Gli1, Patched1, και mRNAs E-cadherin παρουσία της L -Gli1i και ΕΛΕΡΠΕ μεταγωγή. Β:. Κηλίδα Western που δείχνει πρωτεΐνη έκφραση του Gli1, Ε-καδερίνης, και GAPDH σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές

Η

εκχύλιση RNA και σε πραγματικό χρόνο προσδιορισμούς RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη με αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ολικό RNA (100 ng) μεταγράφηκε αντίστροφα σε όγκο 20 μΐ και 2 μΐ cDNA χρησιμοποιήθηκε για την PCR, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. (Takara Βιοτεχνολογίας, Dalian, Κίνα). Οι αλληλουχίες εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα 1. CT (κατώφλι κύκλου) οι τιμές καθορίστηκαν σε τιμές CT του GAPDH

A1-9:. κρυσταλλικό ιώδες χρώση των κυττάρων PC μέσω των πόρων πολυανθρακικής μεμβράνης (χ 200 μεγέθυνση). Β: Οι αριθμοί κυττάρων από κύτταρα που μεταναστεύουν PC όπως αναλύεται από φρεατίων δοκιμασία. C1-3: Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων όπως προσδιορίζεται με ΜΤΤ (C1: Κύτταρα BxPC-3? C2: κύτταρα AsPC-1? Γ3: κύτταρα Panc-1). *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

εκχύλιση πρωτεϊνών και western αποτύπωση δοκιμασίες

Η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται με ρυθμιστικό RIPA σύμφωνα με πρότυπες μεθόδους και τα δείγματα ομαλοποιήθηκαν ως προς την περιεκτικότητα πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο κιτ (Bio-Rad Laboratories Inc Philadelphia, ΡΑ USA). Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 6% SDS-PAGE (για Gli1 πρωτεΐνης) και 12% SDS-PAGE (για SHH, Ε-καδερίνης, και GAPDH). Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF και μεμβράνες επωάστηκαν για 2 ώρες σε ρυθμιστικό διάλυμα TBST, που ακολουθείται από ολονύκτια επώαση στους 4 ° C με τα πρωτογενή αντισώματα [1:1000 (ν /ν) για ΕΛΕΡΠΕ, E-cadherin, ή GAPDH και 1: 500 (ν /ν) για Gli1] σε διάλυμα αποκλεισμού και οπτικοποίηση χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης ECL (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ, USA)

Α:. σπλήνας όγκων και μεταστάσεων ήπατος σε ένα μακροσκοπικό δείγμα της ομάδα L-ΕΛΕΡΠΕ. Β: Σπλήνα όγκων και μεταστάσεων ήπατος σε ένα μακροσκοπικό δείγμα της ομάδας ί-C. C, D, και Ε: εικόνες μικροσκοπία φθορισμού. F, G και Η: Lightmicroscopy εικόνες. (C, F: Σπλήνα όγκων από την ομάδα L-Gli1i? D, G: ενδοσπληνική μικρογραφία μεταστάσεις από την ομάδα L-C? Ε, Η: ηπατικές μεταστάσεις από την ομάδα L-SHH). *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01

Η

Transwell δοκιμασίες

προσδιορισμούς κυττάρων εισβολής (24 -Καλά κιτ δείγμα? Chemicon, Bedford, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη εισβολή γραμμή κυττάρων PC και τη μετανάστευση. Εν συντομία, τα κύτταρα PC (1 × 10

5) έχουν χωριστά σπάρθηκαν σε μέσο άνευ ορού σε προ-επικαλυμμένες θαλάμους Matrigel transwell (άνω τμήμα), το οποίο περιείχε πολυανθρακικές μεμβράνες με 8-μm πόρους. Τα μέσα που περιέχουν 2% FCS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Οι θάλαμοι Transwell στη συνέχεια τοποθετήθηκαν επί των πλακών 24 φρεατίων. Μετά από επώαση για 24 ώρες, η μετανάστευση των κυττάρων PC προσδιορίσθηκε με φωτογράφηση της μεμβράνης μέσω του μικροσκοπίου. Μετρήσεις καταγράφηκαν από τις 5 περιοχές με τις υψηλότερες συγκεντρώσεις των κυττάρων σε μεγάλη μεγέθυνση ισχύος (× 200). Η μέση τιμή των πεδίων θεωρήθηκε η καταμέτρηση μετανάστευση των κυττάρων PC

Α:. Συστάδα δεδομένων cDNA μικροσυστοιχιών συγκρίνοντας L-C και τα κύτταρα L-Gli1i. Β: Λειτουργική ταξινόμηση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Βλέπε επίσης Πίνακα 2.

Η

Η

δοκιμασίες ανάπτυξης των κυττάρων

Η ανάπτυξη των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ΜΤΤ [3- (4, 5 διμεθυλο-2-θειαζολυλ) -2.5 -diphenyl- 2Η-τετραζολίου] δοκιμασίες. Εν συντομία, οι κυτταρικές σειρές PC καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. προσδιορισμοί ΜΤΤ Διεξήχθησαν μετά από 12, 24, 48, και προσδιορίστηκαν 72 ώρες και οπτικές πυκνότητες σε ένα μήκος κύματος 490 nm.

ηπατικές μεταστάσεις επαγωγή από σπληνικά ένεση

Τρεις ομάδες AsPC-1 κύτταρα (φακοϊό-Gli1i, φακοϊό-ελέγχου και φακοϊό-SHH) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση μετάστασης μετά ενδοσπληνική εμβολιασμό σε γυμνά ποντίκια, όπως περιγράφεται προηγουμένως [9]. Εν συντομία, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με μεθοξυφλουράνιο, ένας ανήλικος κοιλιακή τομή αριστερό πλευρό έγινε, και η σπλήνα εκτέθηκε. κύτταρα AsPC-1 εγχύθηκαν στην σπλήνα με μια βελόνα 30-gauge. Η σπλήνα επεστράφη στην κοιλιά, και η πληγή έκλεισε σε μία στρώση με συνδετήρες τραύματος. Μετά από 8 εβδομάδες, συλλέξαμε το ήπαρ και τη σπλήνα και παράγεται συνεχής κατεψυγμένες τομές. Εμείς βάφονται τα τμήματα με αιματοξυλίνη και ηωσίνη και μετρήθηκαν οι όγκοι σπλήνα, ενδοσπληνική μικρογραφία μεταστάσεις, και ηπατικών μεταστάσεων κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού και οπτικό μικροσκόπιο. Όλα τα πρωτόκολλα πείραμα ζώων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή των ζώων Ερευνών του Πανεπιστημίου Tongji

Α: τα γονίδια-στόχοι και τη σηματοδότηση που εμπλέκονται στην EMT ρυθμίζεται από Gli1 στα κύτταρα PC?. Β:. Το υποθετικό μοντέλο στιχομυθία μέσα στο μοριακό δίκτυο EMT διαμεσολαβείται από την Shh-Gli1 σηματοδότησης

Η

cDNA μικροσυστοιχιών αναλύει

AsPC-1 κύτταρα μετάγονται με L-Gli1i και LC χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμασίες cDNA μικροσυστοιχιών με την Array GeneChip Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0. Τρία πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε ένα μόνο σύνολο παρασκεύασμα RNA από τα κύτταρα. Οι τιμές σήματος παρουσιάζονται ως η μέση τιμή 3 πειραμάτων επαναληπτικές. ανιχνεύσεις cDNA μικροσυστοιχίας και στατιστικές αναλύσεις των αποτελεσμάτων γονιδιακής έκφρασης διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10].

Στατιστικές Αναλύσεις

Για όλες τις στατιστικές αναλύσεις, χρησιμοποιήσαμε λογισμικό SPSS17.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, USA). Συνεχείς μεταβλητές εκφράζονται ως μέσος όρος ± SE. t-τεστ για μη ζευγαρωμένα του Student χρησιμοποιήθηκαν για στατιστική αξιολόγηση.

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

λεντοϊών-Gli1i και -SHH αποτελεσματικότητα μεταγωγής και των κυττάρων PC EMT ρυθμίζεται από την Shh-Gli1 σηματοδότησης

επιμολυσμένα τρεις κυττάρων PC γραμμές με τον φορέα λεντοϊού Gli1 παρεμβολές (L-Gli1i), ΕΛΕΡΠΕ πάνω-φορέα έκφρασης (L-ΕΛΕΡΠΕ), και τον φορέα ελέγχου (LC). Επαληθεύσαμε μεταβολές στην ενεργοποίηση της ΕΛΕΡΠΕ-Gli1 σηματοδότησης με την αξιολόγηση της έκφρασης της ΕΛΕΡΠΕ, Gli1 και Patched1 χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο RT-PCR. Η σε πραγματικό χρόνο τα δεδομένα RT-PCR αποκάλυψε ότι τα γονίδια Gli1 και Patched1 σημαντικά μειωτικά από την L-Gli1i μεταγωγή, ενώ Gli1 και Patched1 ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω από τη μεταγωγή L-ΕΛΕΡΠΕ σε σύγκριση με το LC (

P

& lt? 0,01? Σχήμα 1Α). Gli1 και Patched1 ήταν γονίδια στόχους στους περισσότερους τύπους κυττάρων με ΕΛΕΡΠΕ σηματοδότηση ενεργοποιείται, ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα δείχνουν οι φορείς λεντοϊών αλλάξει αποτελεσματικά την ενεργοποίηση των σημάτων SHH-Gli1. Τα επίπεδα E-cadherin mRNA ήταν δραστικά μειωμένη από την αυξημένη ΕΛΕΡΠΕ /Gli1-έκφραση σε κύτταρα PC. Μια παρόμοια τάση παρατηρήθηκε με την πρωτεΐνη Ε-καδερίνης.

εισβολή PC κυττάρων και μετανάστευση ρυθμίζεται από την Shh-Gli1 σηματοδότησης

Τα δεδομένα από τις δοκιμασίες transwell έδειξαν ότι ένας αυξημένος αριθμός κυττάρων από το κυτταρικές σειρές PC εισέβαλαν σε ένα Gli1 δοσοεξαρτώμενο τρόπο μέσω του Matrigel επικαλυμμένα φίλτρο μέσα σε 24 ώρες (

P

& lt? 0,05? Σχήμα 2Α1-A9, Β).

Ο SHH-Gli1 μονοπάτι σηματοδότησης ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC

δεδομένα ΜΤΤ μας έδειξαν ότι η L-Gli1i μεταγωγής /ΕΛΕΡΠΕ δεν επηρέασε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσα σε 24 ώρες. Ωστόσο, μετά από 48 ώρες, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων PC αυξήθηκε με ιική μεταγωγή (Σχήμα 2C1-C3).

ηπατικές μεταστάσεις μετά την ένεση του AsPC-1 κύτταρα σε γυμνά ποντίκια ρυθμίζεται από την Shh-Gli1 σηματοδότησης

τα δεδομένα μας από το γυμνό μοντέλο ποντικών έδειξαν ότι 8 εβδομάδες μετά ενδοσπληνική ένεση AsPC-1 κύτταρα, υπήρχαν σπλήνα όγκους σε 8 από 10 ποντικούς στην ομάδα L-Gli1i, 8 από 9 ποντίκια στην ομάδα LC, και 9 του 9 ζώα στην ομάδα L-ΕΛΕΡΠΕ. Οι μέσοι αριθμοί του σπληνός μικροσκοπικά όγκοι ήταν 2.6, 4.9 και 8.9, αντίστοιχα. Η συχνότητα εμφάνισης των μεταστάσεων του ήπατος ήταν 3 από 8 ποντίκια στην ομάδα L-Gli1i, 5 από 8 ποντίκια στην ομάδα L-C, και 8 από 9 ζώα στην ομάδα L-SHH. Οι μέσοι αριθμοί των μεταστάσεων του ήπατος ήταν 2,7, 4,2, και 6,7, αντίστοιχα (Σχήμα 3, Πίνακας 2).

cDNA μικροσυστοιχιών αναλύσεις των γονιδίων στόχων Gli1 σε AsPC-1 κύτταρα

Το γονίδιο Patched1 , ένα άμεσο στόχο Gli1, ρυθμίζεται αυξητικά 1,71341 φορές σε αυτή τη μελέτη. Ως εκ τούτου, θέτουμε 1,7 φορές ρύθμιση ως το πρότυπο γονιδίου-στόχου. Χρησιμοποιώντας αυτό το όριο, τα δεδομένα προφίλ του γονιδίου-στόχου έδειξε ότι 278 γονίδια ρυθμίζεται προς τα πάνω και 59 γονίδια μειωτικά κατά Gli1 στα κύτταρα AsPC-1. (Πίνακας 3). Οι ρυθμιζόμενες γονίδια ταξινομούνται σε διάφορες κατηγορίες με βάση την καλά τεκμηριωμένη και καθιερωμένες βιολογικές ή παθολογική λειτουργία. Γονίδια που ρυθμίζονται από Gli1 ανήκουν ανήκουν κυρίως στις εξής κατηγορίες: κελί εισβολή /μετανάστευση, αγγειογένεση, κυτταρική επιβίωση, μεταφορά, μεταβολισμό, μεταγωγής σήματος, και το ανοσοποιητικό σύστημα άμυνας (Σχήμα 4). Στη συνέχεια συγκρίνεται αυτών των γονιδίων στόχων με τα προηγούμενα δεδομένα από την αναζήτηση στη βάση δεδομένων Medline για διαλογή διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων PC και σηματοδότηση SHH γονίδια στόχους οδό. Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, εντοπίσαμε 58 ρυθμίζεται αυξητικά γονίδια (Πίνακας 4) και 1 ρυθμίζεται προς τα κάτω γονίδιο κατά αναστολή Gli1 σε οθόνη μας που είχαν προηγουμένως βρεθεί να ρυθμίζονται ομοίως στον υπολογιστή. Χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο, βρήκαμε 22 ρυθμίζεται αυξητικά γονίδια κατόπιν αναστολής Gli1 που είχαν προηγουμένως βρέθηκε να συσχετίζεται με σηματοδότηση SHH (Πίνακας 4). Επιπλέον, 15 από 22 γονίδια που αναφέρθηκαν ότι υπερεκφράζεται σε PC ενεπλάκησαν σε κύτταρο μετάσταση, συμπεριλαμβανομένων ITGB4, ANG, VEGFA, S100A4, WNT5A, και TGFB2 καθώς και την επιβίωση των κυττάρων, όπως BCL2, BIRC3, IGFBP6, KLF4, και Plau. Τουλάχιστον 8 γονίδια (WNT5A, BCL2, IGFBP6, PTCH1, MSX2, TGFB2, HOXC6 και SOX13) είχαν προηγουμένως αποδειχθεί ότι είναι άμεσοι στόχοι της σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ [10], [11].

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, τα γονίδια στόχου επιβίωση των κυττάρων θα μπορούσαν να χωριστούν σε διάφορες κατηγορίες: (1) τα γονίδια του πολλαπλασιασμού που σχετίζονται, όπως είναι IGFBP6, IGF1R, IRS1, EGFR, και ALOX5, (2) γονίδια σχετίζονται με την απόπτωση, όπως BIRC3 και Bcl-2, (3) γονίδια συνδέονται με τον κύκλο των κυττάρων, όπως CCNG2, CDC2L6, και CDK6, και (4) τα γονίδια συντήρησης CSC orCSCs. Ο φαινότυπος των βλαστικών κυττάρων που περιλαμβάνονται κυρίως EMT, αντι-θεραπεία, και βλαστικών κυττάρων δεικτών. Το IGF μονοπάτι σηματοδότησης ήταν ένα βασικό μονοπάτι πολλαπλασιασμού που σχετίζονται και η οικογένεια Bcl-2 ήταν ένα σημαντικό κλασικό αποπτωτικό μονοπάτι σηματοδότησης. Έχει αναφερθεί ότι Gli1 ρυθμίζει άμεσα τη μεταγραφή CCND και δεδομένα μας δείχνει ότι μπορούν να ρυθμίζουν CCNG2 με τον ίδιο τρόπο [7]. Το γονίδιο κωδικοποιεί πρωτεΐνη ABCC3 πολυφαρμάκου αντοχή σχετιζόμενη 3 (MRP3), η οποία εμπλέκεται στην αντίσταση χημειοθεραπεία των καρκινικών κυττάρων [12]. Επιπλέον, προς τα πάνω ρύθμιση MTS και CTPS προς τα κάτω ρύθμιση έχει επίσης αναφερθεί να οδηγήσει σε αντίσταση χημειοθεραπεία [13]. Επιπλέον, KLF4 είναι ένας δείκτης βλαστικών κυττάρων που προωθεί καρκινικά βλαστικά συντήρηση πληθυσμό κυττάρων και CD59 ρύθμιση προς τα πάνω μπορεί να σχετίζεται με το ανοσοποιητικό διαφυγή των κυττάρων του όγκου [14], [15]. Είναι ενδιαφέρον, HUS1 μειορρύθμιση πιθανό αποδυναμώνει τους μηχανισμούς επιδιόρθωσης βλαβών του DNA [16].

Η αγγειογένεση είναι απαραίτητη για μετάσταση καρκίνου, καθώς και για τη συντήρηση ΚΕΠ μικροπεριβάλλον. Ουσιαστική στοιχεία δείχνουν ότι η ενεργοποιημένη σηματοδότηση SHH μπορεί να είναι μία από αγγειογένεση έναρξη μονοπατιού σηματοδότησης κατά την διάρκεια του παγκρέατος καρκινογένεση, αν και ο ακριβής μηχανισμός δεν είναι γνωστός [17]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι Gli1 ρυθμίζεται αυξητικά σημαντικά προ-αγγειογόνοι παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της ANG, VEGFA, PDGFA, TNFRSF12A, και IL-8, γεγονός που υποδηλώνει ότι έχει ένα σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο στην αγγειογένεση PC. Επιπλέον, σε αυτή τη μελέτη, ο VEGF και PDGF έγιναν αυξητικά κατά την ίδια στιγμή, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι μηχανισμοί proangiogenesis της οδού SHH δεν είναι μόνο εμπλέκονται σε ενδοθηλιακά κύτταρα (ECs) tuberformation, αλλά επίσης ωρίμανση τοίχωμα του αγγείου.

αναφέρθηκε ότι η ενεργοποίηση της οδού σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ συνοδεύεται EMT, και EMT απαιτείται για τη μετανάστευση της ΕΛΕΡΠΕ κύτταρα που αποκρίνονται κατά τη διάρκεια της μορφογένεσης των ιστών. Ωστόσο, δεν υπήρχε καμία απόδειξη ότι Gli1 ρυθμίζονται απευθείας σαλιγκάρι ή γυμνοσάλιαγκα μεταγραφή. Στην παρούσα μελέτη, τα δεδομένα προφίλ στόχο έδειξαν ότι η Shh σηματοδότηση στα EMT εμπλέκεται ένα πολύπλοκο δίκτυο αλληλοπαρεμβολές (Σχήμα 5Α). Τα γονίδια στόχοι ΕΜΤ σχετίζονται συνοψίζονται ως εξής: (1) ΤΟΡ-β οδού σηματοδότησης:

ΤΟΡβ2

και

TGFβR3

. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι TGFβ σηματοδότηση είναι σημαντικά αυξημένα σε PC με μετάλλαξη Smad4, με αποτέλεσμα την απώλεια της Smad4-εξαρτώμενη αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και την αυξημένη Smad4 ανεξάρτητη ΕΜΤ [18]. (2) Ras μονοπάτι σηματοδότησης: RAB27B, RAB8B, RASA4, RHEBL1, RHOU, RRAS, και RIN2. Τα στοιχεία δείχνουν το Ras /ERK1 /2 Οι οδοί που εμπλέκονται στο μετασχηματισμό μεσεγχυματικών κυττάρων PC [19]. (3) Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι: wnt5a. Προηγούμενη μελέτη υποδεικνύει ότι wnt5a προωθεί EMT μέσω μιας μη-κλασικής οδού [20]. (4) σηματοδοτικό μονοπάτι PI3K /AKT: ITPKb. ΡΙ3Κ βρέθηκε να ενισχύσει σαλιγκάρι πυρηνική αποικισμού μέσω ενεργοποίησης ΡΑΚ1 του μονοπατιού σηματοδότησης ΑΚΤ σε ΕΜΤ [21]. ΑΚΤ λειτουργεί ως κεντρικό σημείο για την μεταγωγή εξωκυτταρικού (αυξητικούς παράγοντες συμπεριλαμβανομένης της ινσουλίνης, IGF-1, και EGF) και ενδοκυτταρική (όπως μεταλλαγμένες ή ενεργοποιημένων κινασών τυροσίνης υποδοχέα, ΡΤΕΝ, Ras, και Src) σήματα [22]. (5) αυξητικού παράγοντα και οδών σηματοδότησης υποδοχέων:

IGF1R, IGFBP6, IGFL2, EGFR, PDGFA,

και

VEGFA

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η μη φυσιολογική ενεργοποίηση αυτών των οδών προωθεί επιθηλιακών που προέρχονται όγκου. επέκταση και εξέλιξη μέσω της προώθησης της EMT-όπως μεταβάσεις. Όσον αφορά τους μηχανισμούς, IGFR σηματοδότησης επάγει την έκφραση των παραγόντων μεταγραφής σαλιγκάρι και Zeb [23]. PDGF μπορεί να επάγει ΕΜΤ μέσω ενεργοποίησης του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt [24]. VEGF και EGF μπορεί να αυξήσει των σαλιγκαριών και την έκφραση της πρωτεΐνης Twist [25]. (6) Οι ιντεγκρίνες: I

TGA3, ITGB4,

και

ITGB6

. Έχει αναφερθεί ότι οι α3 και β4 υπομονάδες μπορούν να κάνουν μέχρι ιντεγκρίνες λαμινίνη πρόσδεσης με άλλες υπομονάδες, όπως α3β1 ή α6β4, και αυτές οι υπομονάδες μπορούν να παλμιτοϋλιωμένη που μπορεί να συμβάλει στην ιντεγκρίνη τετρασπανίνη αλληλεπιδράσεις [26]. Οι πιθανές prometastatic λειτουργίες αυτών ιντεγκρίνης υπομονάδων, ιδίως β4, αναφέρθηκαν προηγουμένως και φωσφορυλίωση τυροσίνης των β4 Shc θέση πρόσδεσης αποτελέσματα σε αποσυναρμολόγηση ημιδεσμοσώματα και κινητοποίηση σηματοδότησης ενεργοποιημένης ιντεγκρίνης α6β4. Κινητοποιείται α6β4 διακόπτες από κερατίνη στη σύνδεση ακτίνης και μπορεί να μεσολαβήσει τη μετανάστευση και την εισβολή των ισομορφών λαμινίνη [26]. (7) TM4SF:

TSPAN1

TSPAN1 γονίδιο υπερ-έκφραση ανιχνεύθηκε σε καρκίνο του ήπατος, καρκίνο του προστάτη, του καρκίνου του στομάχου, του καρκίνου του τραχήλου, και καρκίνο του παχέος εντέρου [27].. Έχει προταθεί ότι η γονιδιακή έκφραση TSPAN1 συσχετίζεται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την πρόγνωση του καρκίνου. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι TSPAN1, ως μέλος της TM4SF, μπορούν να συμμετέχουν στη διαδικασία EMT των κυττάρων PC. Ωστόσο, απομένει να προσδιοριστεί πώς αλληλεπιδρά με ιντεγκρίνες, αυξητικούς παράγοντες, ή άλλες πρωτεΐνες TM4S. (8) Τα microRNAs:

miR-21

. Μελέτες έχουν δείξει ότι miR-21 συνδέεται με το PC μετάσταση και πρόγνωση και μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT [28], [29]. (9) οικογένεια γονιδίων S100A:

S100A4

. Έχει αναφερθεί ότι S100A4 και Ε-καδερίνης είναι αντιστρόφως ρυθμίζονται σε διάφορα συστήματα κυττάρου και ότι S100A4 προάγει την έκφραση των ουσιωδών παραγόντων μεταγραφής, Twist και σαλιγκάρι, κατά τη διαδικασία EMT, καθώς και δείκτες μεσεγχυματικά, συμπεριλαμβανομένων βιμεντίνη και MMPs [30 ], [31].

Ενδιαφέρουσες, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι το μοριακό δίκτυο EMT μεσολάβηση σηματοδότηση ΕΛΕΡΠΕ μπορεί να περιέχει τουλάχιστον δύο σημαντικά θετική ανάδραση βρόχους στα κύτταρα PC. Το πρώτο είναι η θετική ανάδραση μεταξύ ΕΛΕΡΠΕ και σηματοδότηση TGFβ.

In vitro

και

in vivo

στοιχεία δείχνουν τη στιχομυθία μεταξύ του TGFβ και ΕΛΕΡΠΕ αποτελέσματα στην αμοιβαία επαγωγή. TGFβ απορυθμίζεται ΕΛΕΡΠΕ και ενεργοποιείται Gli1 κατά την επαγωγή EMT? Ωστόσο, η Shh σηματοδότηση υπερεκφράζονται ΤΟΡβ2 και TGFBR3 όπως καταδεικνύεται σε αυτό και μια προηγούμενη μελέτη [32], [33]. Η δεύτερη θετική βρόχος ανάδρασης είναι μεταξύ ΕΛΕΡΠΕ και Ras σηματοδότησης. Προηγουμένως, οι μελέτες έδειξαν ότι η μετάλλαξη του K-RAS ήταν ένα βασικό μηχανισμό της ΕΛΕΡΠΕ και Gli1 ρύθμιση προς τα πάνω σε κύτταρα PC και σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι Gli1 ρυθμίζεται προς τα πάνω αρκετές Ras που σχετίζονται με τα γονίδια για την ενεργοποίηση σηματοδότησης Ras [34].

με βάση τις προηγούμενες μελέτες και τα δεδομένα μας, εικάζουν ότι αυτό το μοριακό δίκτυο θα μπορούσε να ξεκινήσει με το

k-ras

μεταλλάξεις, που ακολουθείται από ΕΛΕΡΠΕ ενεργοποίηση σηματοδότησης, και, τέλος, το σήμα TGFβ ενώνει και μια θετική μορφές βρόχος ανάδρασης μεταξύ των τριών μονοπάτια. Το σήμα ΕΛΕΡΠΕ συνεχώς ενισχύεται μέσω αυτής της θετικής ανάδρασης και προωθεί άμεσα EMT μέσω της ρύθμισης της EMT που σχετίζονται με τα γονίδια στόχους Gli1, όπως

IGFR1, VEGF, EGF,

και

S100A4

. (Σχήμα 5Β). Ωστόσο, το μοντέλο αυτό μοριακό δίκτυο μπορεί να είναι πιο περίπλοκη, με τη συμμετοχή των επιπλέον πρωτεϊνών σηματοδότησης, όπως ιντεγκρίνες, PI3K /AKT, και WNT.

Ευχαριστίες

Ευχαριστούμε όλα τα μέλη του Κεντρικού Εργαστηρίου της δέκατης Νοσοκομείο του Πανεπιστημίου Tongji.