Αφηρημένο

Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι η τρίτη κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Τρέχουσες συνήθεις πρακτικές για την αντιμετώπιση των HCC είναι λιγότερο από ικανοποιητική λόγω του καρκίνου βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ) μεσολάβηση μετεγχειρητική υποτροπή. Για το λόγο αυτό, η στόχευση των ΚΕΠ ή των καρκινικών κυττάρων με ΚΕΠ ιδιότητες παρόμοιες έχει γίνει μια νέα προσέγγιση για τη θεραπεία της HCC. GLA εμφανίζει αποτελέσματα κατά του όγκου από το ότι εξασθενεί τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, εισβολή, και την αγγειογένεση των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, οι λειτουργίες του GLA στη ρύθμιση των ΚΕΠ-όπως ιδιότητες στα κύτταρα HCC, και οι μοριακοί μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω στο παραμένουν ασαφείς. Εδώ βρήκαμε ότι GLA εξασθένισε τις ΚΕΠ ιδιότητες παρόμοιες με το microRNA-148a (MIR-148a) μεσολάβηση αναστολή της αυξητικού παράγοντα μεταμόρφωσης βήτα (ΤΟΡ-β) /SMAD2 σηματοδοτικό μονοπάτι σε κυτταρικές σειρές HCC (HepG2, Huh-7, και MHCC97H). Πράγματι, GLA ανέστειλε τις ενεργοποιήσεις /εκφράσεις αμφοτέρων των ΤΟΡβ-επαγόμενη και την ενδογενή SMAD2. Περαιτέρω, GLA βελτίωσε την έκφραση του miR-148a σε μία δόση /ώρα-εξαρτώμενο τρόπο. MiR-148a, το οποίο στοχεύει το

SMAD2

-3’UTR, μείωσε την έκφραση και τη λειτουργία της SMAD2. Νοκ ντάουν του miR-148a κατάργησε το GLA που προκαλείται από την αναστολή των TGF-β /σηματοδοτικό μονοπάτι SMAD2 και των ΚΕΠ, όπως ιδιότητες στα κύτταρα HCC. Η μελέτη μας βρήκε ένα νέο μηχανισμό που GLA αναστέλλει τα ΚΕΠ-όπως ιδιότητες των κυττάρων HCC από miR-148a-μεσολάβηση αναστολή των TGF-β /οδός σήμα SMAD2, η οποία μπορεί να βοηθήσει στον εντοπισμό πιθανών στόχων για τις θεραπείες του HCC.

Παράθεση: Jiang F, Mu J, Wang Χ, Ye Χ, Si L, Ning S, et al. (2014) η κατασταλτική επίδραση του miR-148a σε TGF-β Smads σηματοδοτικό μονοπάτι εμπλέκεται στην γλαβριδίνη-Induced Αναστολή των καρκινικά βλαστικά κύτταρα-Like Properties στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα κύτταρα. PLoS ONE 9 (5): e96698. doi: 10.1371 /journal.pone.0096698

Επιμέλεια: Lian-Yue Yang, Xiangya Νοσοκομείο της Κεντρικής Νοτίου Πανεπιστημίου, Κίνα

Ελήφθη: 2 Ιαν, 2014? Αποδεκτές: 10 Απριλίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: May 7, 2014

Copyright: © 2014 Jiang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81171987, 30972507) και ένα έργο που χρηματοδοτήθηκε από την Προτεραιότητα Ακαδημαϊκό Πρόγραμμα Ανάπτυξης των Jiangsu Ιδρυμάτων Ανώτατης Εκπαίδευσης (PAPD). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι η πιο κοινή κακοήθεια συκώτι και η τρίτη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σχετίζονται παγκοσμίως [1]. Οι τρέχουσες τυποποιημένες πρακτικές για τη θεραπεία του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, η χειρουργική εκτομή και η χημειοθεραπεία είναι λιγότερο από ικανοποιητική, λόγω της μετάστασης και η μετεγχειρητική υποτροπή [1]. Μια έννοια προταθεί για να εξηγήσουν τα χαρακτηριστικά των νεοπλασματικών ιστών είναι η ύπαρξη της αυτο-ανανέωσης, τα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν, που ονομάζεται καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) [2]. έχουν ΚΕΠ έχουν εντοπιστεί σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων HCC. Μέσα σε έναν όγκο, ΚΕΠ, τα οποία αποτελούν ένα μικρό μέρος των νεοπλασματικών κυττάρων, ορίζονται από την ικανότητά τους να παράγουν νέους όγκους [3]. Για το λόγο αυτό, η στόχευση των καρκινικών κυττάρων με ΚΕΠ ιδιότητες παρόμοιες έχει γίνει ο νέος τρόπος για τη θεραπεία ανθρώπινων καρκίνων του ήπατος.

Η ρίζα του

Glycyrrhiza glabra

(γλυκόριζα) έχει χρησιμοποιηθεί για πολλούς αιώνες στην Ασία και την Ευρώπη ως αντιοξειδωτικό, αντίδοτο, μαλακτικό, αποχρεμπτικό και ένα φάρμακο για αλλεργική φλεγμονή, καθώς και ένα αρωματικές και γλυκαντικές παράγοντα [4]. Γλαβριδίνη [GLA, (

R

) -4- (3, 4-διϋδρο-8, 8-διμεθυλ) -2

H

, 8

H

βενζο [ ,,,0],1, 2

β

: 3, 4

β

‘] dipyran-3-υλο) -1, 3-βενζολοδιόλη] είναι μια πολυφαινολικών φλαβονοειδών και ένα κύριο συστατικό στο υδρόφοβο κλάσμα του γλυκόριζα extract [5]. Εκτός από την οιστρογονική δράση, GLA επιδεικνύει ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δραστηριοτήτων, συμπεριλαμβανομένης νευρο-προστατευτικά, καρδιαγγειακά-προστατευτικές, αντι-φλεγμονώδη, κλπ [5] – [7]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι GLA παρουσιάζει αποτελέσματα κατά του όγκου, με εξασθένηση της πολλαπλασιασμός, μετανάστευση /την εισβολή, και την αγγειογένεση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [8], [9]? Ωστόσο, τα αποτελέσματα του GLA επί των ΚΕΠ ιδιότητες παρόμοιες στα κύτταρα HCC, και των μοριακών μηχανισμών που διέπουν σε παραμένουν ασαφείς.

Ο αυξητικός παράγοντας εξαλλαγής βήτα (ΤΟΡ-β) είναι ένας κρίσιμος ρυθμιστής που εμπλέκονται στην ανάπτυξη των κυττάρων, διαφοροποίηση και ανάπτυξη [10]. Είναι επίσης η πιο ισχυρή ηπατική φιλο-ινογόνων κυτοκίνη που παράγεται κυρίως από ενεργοποιημένα μεσεγχυματικά κύτταρα κατόπιν χρόνια ηπατική βλάβη [11]. Στην έναρξη και ανάπτυξη διαφόρων όγκων, ΤΟΡ-β επάγει την επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), το οποίο είναι ένα κρίσιμο κυτταρικό συμβάν στην απόκτηση του ΚΕΠ ιδιότητες παρόμοιες [12], [13]. Ως εκ τούτου, οι αναστολείς ΤΟΡ-β έχουν αναπτυχθεί για αντικαρκινικές θεραπείες [14], [15]. Τρέχουσα μελέτη υποδεικνύει ότι η αναστολή του ΤΟΡ-β αναστέλλει τη γενιά του ΚΕΠ, το οποίο ενισχύει τη δράση της χημειοθεραπείας κατά του καρκίνου τριπλά αρνητικός μαστού [16]. Στην παρούσα μελέτη, επεξεργασία κυτταρικές σειρές HCC (HepG2, Huh-7, και MHCC97H) από GLA για να καθορίσει τις αρχές της μοριακής αλλαγές, με έμφαση στην ΚΕΠ-όπως ιδιότητες και οδός TGF-β.

Υλικά και μέθοδοι

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

κυτταρικές σειρές HCC (HepG2 και Huh-7) και ανθρώπινη φυσιολογική ηπατική κυτταρική γραμμή (L-02) ελήφθησαν από τη Σαγκάη Ινστιτούτο κυτταρικής Βιολογίας, κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). κυτταρική σειρά MHCC97H (κύτταρα HCC με υψηλό μεταναστευτικό δυναμικό) λήφθηκε από το συκώτι Ινστιτούτο Καρκίνου, Zhongshan Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Fudan, Σαγκάη της Κίνας. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C σε κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, Life Technologies /Gibco, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Life Technologies /GIBCO), 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Life Technologies /Gibco, Gaithersburg, MD). GLA (καθαρότητα ≥98.0%) αγοράστηκε από την Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ, USA). Όλα τα άλλα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικού βαθμού ή ανώτερου βαθμού διαθέσιμα.

ανάστροφης τρανσκριπτάσης αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Ολικό RNA (2 μα) μεταγράφηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας αντίστροφη ΑΜν μεταγραφάσης (Promega, Madison, USA). Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται είναι όπως απαριθμούνται στον Πίνακα S1. Η αντίδραση PCR αξιολογήθηκε με τον έλεγχο των προϊόντων PCR σε 2% w /v πηκτές αγαρόζης. Συγκροτήματα κανονικοποιήθηκαν με τη χρήση του

Γλυκεραλδεΰδη 3-φωσφορική αφυδρογονάση (GAPDH)

για τη διόρθωση για τις διαφορές στα φόρτωση των cDNA.

ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-)

Ολικό RNA (1 μ§) μεταγράφηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας το TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) με miRNA-ειδικά βρόχου αντίστροφους εκκινητές. Οι συνθήκες αντίδρασης ήταν ως εξής: 42 ° C για 15 λεπτά και 85 ° C για 5 s. qRT-PCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα κιτ TaqMan PCR από Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems) για 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. Η

U6

snRNA χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Διπλώστε αλλαγές στην έκφραση του κάθε γονιδίου υπολογίστηκαν από έναν κύκλο συγκριτικής όριο μέθοδο (CT), χρησιμοποιώντας τον τύπο 2

-. (ΔΔCt)

Δυτική κηλίδες

Τα κυτταρολύματα διαχωρίζονται με νάτριο δωδεκυλ θειικό άλας (SDS) ηλεκτροφόρηση και μεταφέρθηκε σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο -πολυακρυλαμιδίου γέλη (PVDF) μεμβράνες (Millipore, Billerica, USA)? τα ανοσοσύμπλοκα ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν SMAD2 και ρ-SMAD2 (Ser 465/467, Cell Signaling Technology)? GAPDH (Sigma). Οι κηλίδες κανονικοποιήθηκαν με τη χρήση GAPDH για τη διόρθωση για τις διαφορές στη φόρτωση των πρωτεϊνών.

σχηματισμός σφαιροειδές

Σε μη-προσκολλημένα 24 φρεάτια πιάτα (Costar, US), επεξεργασμένα κύτταρα (2 χ 10

3) αιωρήθηκαν σε καθορισμένες, ελεύθερο ορού μέσο αποτελούμενο από DMEM /F-12 (Gibco), 10 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου παράγοντα βασικής ανάπτυξης ινοβλάστης (bFGF, Ε & amp? D Systems, USA), και 10 ng /ml του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF, R &? D Systems). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 10 ημέρες, και στη συνέχεια μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan).

Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη

πλάκες μαλακού άγαρ παρασκευάστηκαν σε 24-πηγαδιών πιάτα με επι- στρώματα 0.70% αγαρόζη σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS. Για να ελεγχθεί η ικανότητά τους για ανάπτυξη αποικίας σε μαλακό άγαρ, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν σε πυκνότητα 1 × 10

3 σε 2 mL 0.35% αγαρόζη πάνω από τη βάση άγαρ. Οι καλλιέργειες τροφοδοτήθηκαν κάθε τρεις ημέρες? μετά από 14 ημέρες, οι αποικίες μετρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο (Olympus).

τηλέφωνα επιμόλυνση

Anti-con, αντι-miR-148a, Con-μιμούνται, και miR-148a-μιμητικό ήταν συντίθεται με RiBoBio Co. κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA) για 12 ώρες, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για τη δοκιμασία ανάκτηση γονίδιο, αφού τα κύτταρα MHCC97H επιμολύνθηκαν με αντι-miR-148a για 12 ώρες, αυτά καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS (Gibco), 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Gibco ) για άλλες 24 ώρες, που ακολουθείται από επιμολυσμένα με Con-μιμητικό ή miR-148a-μιμητικό για 12 ώρες.

λουσιφεράσης ανταποκριτής δοκιμασία

Η pGL3-

SMAD2

-3 «κατασκεύασμα UTR-Luc αγοράστηκε από Shuntian Βιολογία (Σαγκάη). Το πλασμίδιο phRL-tk (που χρησιμοποιείται ως εσωτερικός έλεγχος για αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης και κυτταροτοξικότητα των χημικών δοκιμής) που περιέχει το γονίδιο λουσιφεράσης Renilla αγοράστηκε από την Promega. Εν συντομία, κύτταρα HepG2 καλλιεργήθηκαν σε 24-πηγαδιών δίσκους καλλιέργειας κυττάρων. Τα κύτταρα πολλαπλασιάστηκαν σε 60 έως 80% συρροή μετά από 24 ώρες καλλιέργειας. Αντι-con ή αντι-miR-148a ήταν συν-επιμολύνθηκαν με το ρεπόρτερ κατασκευάσματα αντίστοιχα, με χρήση αντιδραστηρίου Lipofecamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μετά από μια περίοδο επώασης 12 h, το μέσο επιμόλυνσης αντικαταστάθηκε. Στη συνέχεια, μετά τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0 ή 20 μΜ GLA για 24 ώρες, αυτά συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS (ρΗ 7.4). Τα κύτταρα λύθηκαν με παθητική ρυθμιστικού λύσης (Promega). Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν αμέσως με ένα φωτόμετρο πλάκας 96-φρεατίων (Σύστημα Ανίχνευσης Berthold, Pforzheim, Germany). Τα ποσά των λουσιφεράση και λουσιφεράση της Renilla μετρήθηκαν με το κιτ Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι τιμές λουσιφεράσης δραστηριότητα για κάθε προϊόν λύσης κανονικοποιήθηκαν προς την δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla. Η σχετική δραστικότητα μετατράπηκε σε πλάσια επαγωγή πάνω από την τιμή ελέγχου του οχήματος.

Στατιστική ανάλυση

προκύπτουσες τιμές παρουσιάστηκαν ως το μέσο ± SD.

t

δοκιμή ενός μαθητή, και μια μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από

t

τεστ Dunnett χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων.

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

GLA μειώνει τα ΚΕΠ-όπως ιδιότητες στα κύτταρα HCC

Για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων. GLA χρησιμοποιώντας στη μελέτη μας, εκθέσαμε HepG2 ή κύτταρα L-02 στο 0, 5, 10, 20, 40, ή 80 μΜ GLA για 24, 48, ή 72 ώρες. Όπως φαίνεται στα Σχήματα. S1A και S1B, δεν υπήρχε ανιχνεύσιμη επίδραση του 10 ή 20 μΜ GLA σε κυτταρικές βιωσιμότητες ούτε σε κύτταρα HCC (HepG2), ούτε στα φυσιολογικά κύτταρα του ήπατος (L-02). Γι ‘αυτό και επιλέξαμε αυτές τις συγκεντρώσεις για περαιτέρω έρευνα.

Η αυξημένη έκθεση των ΚΕΠ-όπως ιδιότητες διαδραματίζει καίριο ρόλο στην έναρξη, την ανάπτυξη και το αποτέλεσμα των διαφορετικών καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του HCC [2].

CD44

,

CD90

,

CD133

, και

EpCAM

είναι οι δείκτες κυτταρικής επιφάνειας του καρκίνου του ήπατος βλαστικών κυττάρων [17] – [19] , περαιτέρω,

Oct-4

και

ΔΜΣ-1

είναι τα βασικά γονίδια «βλαστική ικανότητα» στα ΚΕΠ από διάφορες μορφές καρκίνου [13], [20]. Εδώ, όπως φαίνεται στο Σχήμα. 1Α και 1Β, GLA μειώθηκε τις εκφράσεις αυτών των γονιδίων σε κύτταρα HepG2 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο? Εν τω μεταξύ, οι μειώθηκε εκφράσεις του

CD44

και

EpCAM

παρατηρήθηκαν επίσης σε άλλα δύο κύτταρα HCC (Huh-7 και MHCC97H).

(Α) κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία κατά 0, 10, ή 20 μΜ GLA για 72 ώρες. RT-PCR αναλύσεις

CD44

,

EpCAM

,

CD133

,

CD90

,

Oct-4

, και

ΔΜΣ-1

? (Β) Huh-7 και MHCC97H κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0 ή 20 μΜ GLA για 72 ώρες. RT-PCR αναλύσεις

CD44

και

EpCAM

? (Γ και Δ) και HepG2 Huh-7 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0 ή 20 μΜ GLA για 72 ώρες. (C) Ελεύθερη διακύμανση, βιώσιμη σφαίρες που αποτελούνται από κύτταρα (bar = 250 μm)? (D) Σφαίρα ποσοτικοποίησης (μέση ± SD, η = 3)? (Ε και F) και HepG2 MHCC97H κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0 ή 20 μΜ GLA για 72 ώρες. σχηματισμό (Ε) Αποικία στο μαλακό άγαρ (bar = 250 μm)? αριθμούς (F) Αποικίας (μέση ± SD, η = 3). ** P & lt?. 0.01 σε σύγκριση με το μέσο κύτταρα ελέγχου (

t

δοκιμή μαθητή)

Η

Σχηματισμός σφαιροειδή καταδεικνύει την ικανότητα των κυττάρων για αυτο-ανανέωση και για την έναρξη /ανάπτυξη όγκους [2]. Στη συνέχεια, η ικανότητα των κυττάρων HCC για το σχηματισμό των σφαιριδίων κατά τη διάρκεια της θεραπείας GLA προσδιορίστηκε. Όπως φαίνεται στα Σχήματα. 1C και 1D, GLA μείωσε το σχηματισμό σφαιροειδών σε HepG2 και τα κύτταρα Huh-7. Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη είναι ένα χαρακτηριστικό των κακοήθων κυττάρων [21]. Έχουμε καθορίζεται περαιτέρω τα αποτελέσματα της GLA στις κακοήθεις ιδιότητες στα κύτταρα HCC. Όπως φαίνεται στα Σχήματα. 1Ε και 1Ρ, GLA μείωσε την ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη σε HepG2 και MHCC97H κύτταρα.

ΤΟΡ-β /Smads σήματος μονοπάτι εμπλέκεται στην ανύψωση του ΚΕΠ ιδιότητες παρόμοιες στα κύτταρα HepG2

ΤΟΡ -β /Smads μονοπάτι έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει τα βλαστικά ιδιότητες παρόμοιες σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [22]. Εδώ βρήκαμε ότι ο TGF-β βελτίωσε τις εκφράσεις του CD44 και EpCAM (Σχήμα. 2Α). Περαιτέρω, σε κύτταρα HepG2 ΤΟΡ-β-αγωγή, οι ικανότητες του σχηματισμού σφαιροειδών και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη ενισχύθηκαν (Σχήματα. 2Β και 2C). Ωστόσο, σε SMAD2 (ένα κλασικό παράγοντα κατάντη ρυθμίζεται από ΤΟΡ-β, [16]) knockdown κυττάρων HepG2, τέτοιο φαινόμενο που προκαλείται από ΤΟΡ-β ήταν εξασθενημένος (Σχήματα. 2D-2F).

(Α -C) κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0 ή 10 ng /ml ΤΟΡ-β για 48 ώρες. (D-F) Αφού τα κύτταρα HepG2 επιμολύνθηκαν με 10 ηΜ SMAD2-siRNA για 12 ώρες, υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 ng /ml ΤΟΡ-β για 48 ώρες. (Α και Δ) RT-PCR αναλύσεις

CD44

και

EpCAM

? (Β και Ε, αριστερά) Ελεύθερη διακύμανση, βιώσιμη σφαίρες που αποτελούνται από κύτταρα (bar = 250 μm)? (Β και Ε, δεξιά) Σφαίρα ποσοτικοποίησης (μέση ± SD, η = 3)? (C και F, αριστερά) σχηματισμός αποικιών στο μαλακό άγαρ (bar = 250 μm)? (C και F, δεξιά) αριθμούς αποικιών (μέση ± SD, η = 3). * Ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με μέσο κύτταρα ελέγχου ή κύτταρα Con-siRNA επιμολυσμένα θεραπεύονται με ΤΟΡ-β (

t

δοκιμή Student)

Η

GLA μπλοκάρει το ΤΟΡ-β /SMAD2. μονοπάτι σήματος σε κύτταρα HCC

στη συνέχεια εξέτασαν τις επιδράσεις του GLA στο ΤΟΡ-β επαγόμενη ενεργοποίηση SMAD2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα. 3Α, GLA μπλοκάρει την ΤΟΡβ-επαγόμενη φωσφορυλίωση SMAD2 και την έκφραση του

Σαλιγκάρι

(ο μεταγενέστερος γονίδιο του SMAD2, [23])? Είναι ενδιαφέρον ότι, GLA εξασθενημένο επίσης την έκφραση του συνολικού mRNA SMAD2 και πρωτεΐνης παρουσία ή απουσία ΤΟΡ-β. Γι ‘αυτό και το επόμενο καθορίζονται τα αποτελέσματα της GLA στις εκφράσεις των ενδογενών SMAD2. Όπως φαίνεται στα Σχήματα. 3Β και 3C, GLA μείωσε την έκφραση και την ενεργοποίηση των ενδογενών SMAD2 σε κύτταρα HCC (HepG2, Huh-7, και MHCC97H). Και το γεγονός ότι

SMAD2

mRNA μειώθηκε κατά GLA, υποθέσαμε ότι αυτό κατασταλτική επίδραση θα μπορούσε να μεσολαβείται από τα miRNAs.

(Α) Αφού τα κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με 0 ή 20 μΜ GLA για 12 ώρες, εκτέθηκαν σε 0 ή 10 ng /ml ΤΟΡ-β για 24 ώρες. (Κορυφή) αναλύσεις Western blot ρ-SMAD2 και SMAD2, (κάτω) RT-PCR αναλύσεις

SMAD2

και

σαλιγκάρι

? (Β) κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0, 10, ή 20 μΜ GLA για 72 ώρες. (Κορυφή) κηλίδες Western αναλύσεις της π-SMAD2 και SMAD2, (κάτω) RT-PCR αναλύσεις

SMAD2

και

σαλιγκάρι

? (C) Huh-7 και MHCC97H κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0 ή 20 μΜ GLA για 72 ώρες. RT-PCR αναλύσεις

SMAD2

και

σαλιγκάρι

.

Η

GLA βελτιώνει την έκφραση του miR-148a στα κύτταρα HCC

Με τη χρήση TargetScan 6.2 (www.targetscan.org), βρήκαμε ότι το miR-148a είχε προβλεφθεί για να δεσμεύσει το

SMAD2

-3 ‘UTR. Οι θέσεις στόχοι του miR-148a στο

SMAD2

mRNA εκτέθηκαν στο σχήμα. 4Α. Στη συνέχεια προσδιορίζονται τα αποτελέσματα της GLA στην έκφραση του miR-148a στα κύτταρα HCC. Όπως φαίνεται στα Σχήματα. 4Β και 4C, GLA βελτίωσε την έκφραση του miR-148a σε μία δόση /χρονοεξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα HepG2. Εν τω μεταξύ, GLA αυξημένα επίσης την έκφραση του miR-148a σε Huh-7 και MHCC97H κύτταρα (Σχήμα 4D).

(Α) Οι αλληλουχίες στόχους του miR-148a στην 3′-UTR του

SMAD2

? (Β) κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0, 10, ή 20 μΜ GLA για 24 ώρες. qRT-PCR αναλύσεις της έκφρασης του miR-148a (μέση ± SD, η = 3)? (Γ) Κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 0 ή 20 μΜ GLA για 0, 8, 16, 24, ή 48 ώρες. qRT-PCR αναλύσεις της έκφρασης του miR-148a (μέση ± SD, η = 3)? (D) Huh-7 και MHCC97H κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0 ή 20 μΜ GLA για 24 ώρες. qRT-PCR αναλύσεις της έκφρασης του miR-148a (μέσος όρος ± SD, η = 3). ** P & lt?. 0.01 σε σύγκριση με το μέσο κύτταρα ελέγχου (

t

δοκιμή μαθητή)

Η

GLA αναστέλλει την SMAD2 από miR-148a στα κύτταρα HCC

Με βάση την η πρόβλεψη ότι υπάρχουν θέσεις στόχους του miR-148a σε

SMAD2

mRNA και ότι GLA αυξημένα την έκφραση του miR-148a, υποθέσαμε ότι miR-148a μπορεί να εμπλέκεται στην επαγόμενη από GLA μειωμένη έκφραση SMAD2 . Εδώ, knockdown του miR-148a (Σχήμα. 5Α) οδήγησε σε σημαντική αύξηση της δράσης της λουσιφεράσης (Σχήμα. 5Β), και μπλοκάρει την επαγόμενη από GLA μειωμένη έκφραση και ενεργοποίηση των SMAD2 σε κύτταρα HepG2 (σχήμα. 5C). Εν τω μεταξύ, η υπερέκφραση του miR-148a (Σχήμα. 5D) σε κύτταρα Huh-7 μείωσε την έκφραση και την ενεργοποίηση των SMAD2 (Σχήμα. 5Ε). Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε δοκιμασία ανάκαμψη γονίδιο να επιβεβαιώσει περαιτέρω το συμπέρασμά μας. Σε κύτταρα MHCC97H, νοκ ντάουν του miR-148a αυξημένα την έκφραση του

SMAD2

, ωστόσο, την αποκατάσταση των miR-148a από μιμούνται καταργηθεί τέτοιο αποτέλεσμα (Σχήμα. 5F και 5G).

(Α- Γ) Μετά από τα κύτταρα HepG2 ήσαν προ-επιμολύνθηκαν με αντι-con ή αντι-miR-148a για 12 ώρες, εκτέθηκαν σε 0 ή 20 μΜ GLA για 72 ώρες. (Α) qRT-PCR αναλύσεις της έκφρασης του miR-148a (μέση ± SD, η = 3)? (Β) δοκιμασίες λουσιφεράσης δημοσιογράφος ανάλυση των αποτελεσμάτων των miR-148a στο

SMAD2

3’UTR? (C) RT-PCR αναλύσεις

SMAD2

και

σαλιγκάρι

(επάνω), και κηλίδες Western αναλύσεις της π-SMAD2 και SMAD2 (κάτω). ** P & lt? 0,01 σε σύγκριση με το μέσο κύτταρα ελέγχου, και

## ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τα κύτταρα HepG2 αντιμετωπίζονται από GLA μόνα τους ή με κύτταρα HepG2 αντι-con-επιμολυσμένα αντιμετωπίζονται από GLA (ANOVA που ακολουθείται από του Dunnett

t

test). κύτταρα Huh-7 (D και Ε) επιμολύνθηκαν με con-μιμητικό ή miR-148a-μιμητικό για 12 ώρες. (D) qRT-PCR αναλύσεις της έκφρασης του miR-148a (μέση ± SD, η = 3)? (Ε) RT-PCR αναλύσεις

SMAD2

και

σαλιγκάρι

(επάνω), και κηλίδες Western αναλύσεις SMAD2 (κάτω)? ** Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τα κύτταρα Huh-7 επιμολυσμένα με con-μιμητικό (t test Student). (F και G) Αφού τα κύτταρα MHCC97H επιμολύνθηκαν με αντι-miR-148a για 12 ώρες, αυτά καλλιεργήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη για άλλες 24 ώρες, ακολουθούμενη από επιμολυσμένα με con-μιμητικό ή miR-148a-μιμητικό για 12 ώρες. (F) qRT-PCR αναλύσεις της έκφρασης του miR-148a (μέση ± SD, η = 3)? (G) RT-PCR αναλύσεις

SMAD2

. ** P & lt? 0,01 σε σύγκριση με τα κύτταρα MHCC97H επιμολυσμένα με αντι-con,

## ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τα κύτταρα MHCC97H επιμολυσμένα με αντι-miR-148a συν con-μιμούνται (ANOVA που ακολουθείται από του Dunnett

t

δοκιμή).

η

GLA μειώνει τα ΚΕΠ-όπως ιδιότητες στα κύτταρα HCC από miR-148a

από TGF-β /SMAD2 βελτιώνει τα ΚΕΠ-όπως ιδιότητες, και δεδομένου ότι miR-148a στόχοι SMAD2, υποθέσαμε ότι το GLA μειώνει τα ΚΕΠ-όπως ιδιότητες από miR-148a στα κύτταρα HCC. Εδώ, νοκ ντάουν του miR-148a μπλοκάρει το GLA που προκαλείται από μειωμένη έκφραση του

CD44

και

EpCAM

mRNA (Σχήμα. 6Α). Για τα κύτταρα HepG2, knockdown του miR-148a μπλοκαριστεί ο GLA επαγόμενη μειωμένο σχηματισμό σφαιροειδή (Σχήματα. 6Β και 6C). Για Huh-7 κύτταρα, η υπερέκφραση του miR-148a εξασθένησε την ικανότητα του ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη (Σχήματα. 6D και 6Ε). Στη συνέχεια χρησιμοποιήσαμε δοκιμασία ανάκαμψη γονίδιο να επιβεβαιώσει περαιτέρω το συμπέρασμά μας. Σε κύτταρα MHCC97H, νοκ ντάουν του miR-148a αυξημένα την έκφραση του

CD44

και

EpCAM

, και βελτίωσε το σχηματισμό σφαιριδίων? Ωστόσο, η αποκατάσταση του miR-148a με μιμητικό καταργούνται τέτοιο αποτέλεσμα (Σχήμα. 6F-6Η).

(AC) Μετά HepG2 ή Huh-7 κύτταρα προ-επιμολύνθηκαν με αντι-con ή αντι-miR-148a για 12 ώρες, εκτέθηκαν σε 0 ή 20 μΜ GLA για 72 ώρες. (Α) RT-PCR αναλύσεις

CD44

και

EpCAM

? (Β) Ελεύθερη διακύμανση, βιώσιμη σφαίρες που αποτελούνται από κύτταρα HepG2 (bar = 250 μm)? (Γ) Σφαίρα ποσοτικοποίηση (μέση ± SD, η = 3)? ** Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με μέσο κύτταρα HepG2 ελέγχου, και

## ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τα κύτταρα HepG2 αντι-con-επιμολυσμένα αντιμετωπίζονται από GLA (ANOVA που ακολουθήθηκε από

t

τεστ Dunnett). κύτταρα Huh-7 (D και Ε) επιμολύνθηκαν με con-μιμητικό ή miR-148a-μιμητικό για 12 ώρες. (D) σχηματισμός αποικιών στο μαλακό άγαρ (bar = 250 μm)? αριθμούς (Ε) Αποικίας (μέση ± SD, η = 3). ** Ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με μέσο ελέγχου κύτταρα Huh-7 ή με κύτταρα Huh-7 επιμολυσμένα με con-μιμητικό (ANOVA που ακολουθήθηκε από

t

τεστ Dunnett). (F-Η) κύτταρα MHCC97H υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Σχήμα. 5F. (F) RT-PCR αναλύσεις

CD44

και

EpCAM

? (G) Ελεύθερη διακύμανση, βιώσιμη σφαίρες που αποτελούνται από κύτταρα MHCC97H (bar = 250 μm)? (H) Σφαίρα ποσοτικοποίησης (μέση ± SD, η = 3)? ** P & lt? 0,01 σε σύγκριση με τα κύτταρα MHCC97H επιμολυσμένα με αντι-con,

## ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με τα κύτταρα MHCC97H επιμολυσμένα με αντι-miR-148a συν con-μιμούνται (ANOVA που ακολουθείται από του Dunnett

t

δοκιμή).

η

συζητήσεις

η τρέχουσα χημειοθεραπεία κατά του HCC στοχεύει συνήθως το μεγαλύτερο μέρος του πληθυσμού του όγκου άμεσα, η οποία είναι σε θέση να συρρικνωθεί το πρωτοπαθούς όγκου, όμως, αποτυγχάνει να εξαλειφθεί με συνέπεια τις βλάβες . Η ανακάλυψη των ΚΕΠ έχει αλλάξει την άποψή μας για την καρκινογένεση και τη χημειοθεραπεία. ΚΕΠ, επίσης ονομαστεί «καρκινικά κύτταρα έναρξης», έχουν την ικανότητα να παράγουν νέους όγκους. Με βάση αυτή την ιδέα, ΚΕΠ είναι υπεύθυνη για το σχηματισμό και την ανάπτυξη των νεοπλασματικών ιστών και είναι ανθεκτικά στους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, που εξηγεί γιατί τα παραδοσιακά φάρμακα μπορεί να συρρικνωθεί αρχικά έναν όγκο αλλά αδυνατούν να την εξαλείψουν, επιτρέποντας την επανάληψη [24]. Εδώ, εμείς επιλέξαμε την HepG2, Huh-7, και κυτταρικές σειρές MHCC97H να μελετηθούν τα αποτελέσματα του GLA επί των ΚΕΠ ιδιότητες παρόμοιες επειδή αυτοί οι κυτταρικές γραμμές εμφάνισαν ΚΕΠ-όπως ιδιότητες, και έχουν χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση των επιδράσεων των φυτοχημικών στην ΚΕΠ -όπως κύτταρα «πλευρά του πληθυσμού» [24] – [27]

GLA, ένα ισοφλαβονοειδές του

G.. glabra L. ρίζες

, αναστέλλει την εξαρτώμενη από τυροσινάσης βιοσύνθεση μελανίνης αποτελεσματικά, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να χρησιμεύσει ως υποψήφιο για παράγοντες λεύκανσης δέρματος [5]. Εκτός αυτού, έχει επίσης συνδεθεί με ένα ευρύ φάσμα των βιολογικών ιδιοτήτων όπως αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, οιστρογονική, νευροπροστατευτικές, κλπ [5] – [7]. Πρόσφατες μελέτες αποκαλύπτουν τα αντικαρκινικά αποτελέσματα που προκαλούνται από GLA, ότι εμποδίζει την οξειδωτική κατάτμηση του DNA σε UVB-ακτινοβολημένα ανθρώπινα κερατινοκύτταρα κύτταρα HaCaT [28]? Εν τω μεταξύ, αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του μαστού [8]? Επιπλέον, αναστέλλει την μετανάστευση, εισβολή, και αγγειογένεσης με την αναστολή της οδού σηματοδότησης FAK /Rho [29]? περαιτέρω, ενισχύει επίσης την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας με αναστολή της Ρ-γλυκοπρωτεΐνης και αντοχής πολυφαρμάκου πρωτείνη 1 Σύνθεση [30]. Εδώ εντοπίσαμε ότι το GLA εξασθενημένο (α) οι εκφράσεις του CD44, CD133, CD90, και EpCAM, (β) την ικανότητα σχηματισμού σφαιριδίων (ένας δείκτης για την αυτο-ανανέωση), και (γ) την ικανότητα της αγκύρωσης-ανεξάρτητη ανάπτυξη ( ένας χαρακτήρας κακοήθων κυττάρων) σε HepG2, Huh-7 και κύτταρα MHCC97H, προτείνοντας μια νέα λειτουργία που GLA θα μπορούσε να ρυθμίσει τα ΚΕΠ ιδιότητες παρόμοιες σε κύτταρα HCC.

στο ήπαρ, ο ΤΟΡ-β είναι ένας σημαντικός σύνδεσμο μεταξύ χρόνιο τραυματισμό, κίρρωσης και ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, και μπορεί να σερβιριστεί ως βασικό στόχο για θεραπεία HCC [15], [31]. σηματοδότηση ΤΟΡ-β έχει κινηθεί από την πρόσδεση του ΤΟΡ-β στον υποδοχέα ΤΟΡ-β II (ΤΟΡβ-RII), ακολουθούμενη από την ενεργοποίηση του ΤΟΡβ-RI, /3 φωσφορυλίωση Smad2, και σχηματισμό των Smad2 /3/4 για τα σύμπλοκα [ ,,,0],10]. Υπάρχει μια σχέση μεταξύ της ΤΟΡ-β και ΚΕΠ, με την απόδειξη που υποδηλώνει ότι η ΤΟΡ-β επάγει EMT, η οποία οδηγεί στην απόκτηση του ΚΕΠ ιδιότητες παρόμοιες [12], [13]. Εδώ βρήκαμε ότι (α) κατεργασία του ΤΟΡ-β επαγόμενη υποθετικό δείκτες καρκίνου στέλεχος και η αυξημένη ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και σχηματισμό των σφαιριδίων σε κύτταρα HepG2 και (β) εξουδετέρωση του Smad2 αντιστραφεί αυτές τις επιδράσεις, γεγονός που υποδηλώνει ότι η σηματοδότηση του ΤΟΡ-β διαδραμάτισε σημαντικό ρόλο στην ενίσχυση των ΚΕΠ-όπως ιδιότητες στα κύτταρα HCC. Ωστόσο, η σχέση μεταξύ του TGF-β και GLA-ρυθμίζεται ΚΕΠ-όπως ιδιότητες δεν έχει εξεταστεί προηγουμένως. Στην παρούσα μελέτη, GLA μείωσε το ΤΟΡ-β-επαγόμενη φωσφορυλίωση του SMAD2. Σημαντικά, GLA εξασθένησε την έκφραση και την ενεργοποίηση των ενδογενών SMAD2 σε κύτταρα HCC, υποδεικνύοντας ότι ο ΤΟΡ-β /SMAD2 μονοπάτι μπορεί να εμπλέκεται στην επαγόμενη από GLA κατασταλτική επίδραση στις ΚΕΠ ιδιότητες παρόμοιες σε κύτταρα HCC.

miRNAs είναι τα μη-κωδικοποιούν μικρά ολιγονουκλεοτίδια RNA που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση [32]. Σε αρκετές όγκοι μερικές miRNAs εκφράζονται διαφορικά σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς [33]. Ωστόσο, τα δίκτυα miRNAs και η ρύθμισή τους της μετάφρασης του mRNA και της έκφρασης της πρωτεΐνης στα ΚΕΠ-όπως ιδιότητες στα κύτταρα HCC εξακολουθούν να διευκρινιστεί. MiR-148a είναι ένα προ-αποπτωτικό miRNA στοχεύοντας Bcl-2 [34]. Επιπλέον, η αναστολή της miR-148a με υπερ-μεθυλίωση σχετίζεται με μετάσταση σε πολλούς τύπους όγκων και με προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων που σχετίζονται με τη μετάσταση [35]. Στο ήπαρ, miR-148a παρουσιάστηκε για πρώτη φορά να διαφοροποιούν τα επίπεδα του κυτοχρώματος P450 3A4 μέσω μετα-μεταγραφικά ρύθμιση της 3’UTR του Χ Υποδοχέα πρεγνανίου (

PXR

) mRNA [36]. Προηγούμενη μελέτη δείχνει ότι το miR-148a εμπλέκεται στην αντι-μετάσταση των κυττάρων HCC από τις αναστολές της Wnt1 μεσολάβηση EMT και απόκτηση των ΚΕΠ-όπως ιδιότητες [24]. Εδώ, με τη χρήση TargetScan 6.2, διαπιστώσαμε ότι το miR-148a είχε προβλεφθεί για να δεσμεύσει το

SMAD2

-3 ‘UTR. Επιπλέον, νοκ ντάουν του miR-148a οδήγησε σε σημαντική αύξηση της έκφρασης /ενεργοποίηση των SMAD2 και ΚΕΠ-όπως ιδιότητες σε GLA-θεραπεία HepG2 κύτταρα. Περαιτέρω, η υπερέκφραση του miR-148a μείωσε την έκφραση /ενεργοποίηση των SMAD2 και CSC-όπως ιδιότητες σε Huh-7 και MHCC97H κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι η αναστολή της SMAD2 με miR-148a θα μπορούσε να μεσολαβήσει του GLA-εξασθενημένο ΚΕΠ ιδιότητες που μοιάζουν σε κύτταρα HCC.

Εν κατακλείδι, GLA εξασθένισε τις ΚΕΠ ιδιότητες παρόμοιες με την αναστολή του ΤΟΡ-β /Smads μονοπάτι. Πράγματι, το GLA βελτίωσε την έκφραση του miR-148a, το οποίο στοχεύει στην SMAD2-3’UTR και κάτω-ρυθμίζονται το SMAD2 έκφραση /ενεργοποίησης. Knockdown του miR-148a κατάργησε την GLA-επαγόμενη αναστολή της ΤΟΡ-β /SMAD2 και τα ΚΕΠ ιδιότητες παρόμοιες στα κύτταρα HCC (Σχήμα. 7). Κατανόηση ένα νέο μηχανισμό, με τον οποίο GLA αναστέλλει τα ΚΕΠ-όπως ιδιότητες των κυττάρων HCC, η μελέτη μας μπορεί να βοηθήσει στον εντοπισμό πιθανών στόχων για τις θεραπείες του HCC.

Η

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Επιδράσεις της GLA για τους δείκτες βιωσιμότητας και ΚΕΠ σε HepG2 και L-02 κύτταρα. (Α και Β) HepG2 ή L-02 κύτταρα κατεργάστηκαν με 0, 5, 10, 20, 40, ή 80 μΜ GLA για 24, 48, ή 72 ώρες, αντίστοιχα. Τα βιωσιμότητες κύτταρα εκτιμήθηκαν με WST-8 υδρόλυση χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο Μετρώντας Kit-8 δοκιμασίας. Οι σχετικές αναλογίες της βιωσιμότητας των κυττάρων προσδιορίστηκαν με σύγκριση των κυττάρων που εκτέθηκαν σε καμία GLA. (Γ) Ε-02 κύτταρα κατεργάστηκαν με 0 ή 20 μΜ GLA για 72 ώρες. qRT-PCR ανάλυση της έκφρασης του

CD44

,

EpCAM

, και

CD133

(μέση τιμή ± SD, η = 3)

doi:. 10.1371 /περιοδικό .pone.0096698.s001

(ΔΕΘ)

πίνακα S1.

εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για RT-PCR

doi:. 10.1371 /journal.pone.0096698.s002

(DOCX)