Αφηρημένο

Οι περισσότεροι άνδρες διαγνώστηκαν με καρκίνο του προστάτη θα έχουν νωχελικός και ιάσιμη νόσο, ενώ περίπου το 15% αυτών των ασθενών θα προχωρήσει γρήγορα σε ένα ευνουχίσει ανθεκτικά και μεταστατικό στάδιο με υψηλή νοσηρότητα και θνησιμότητα. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός της μοριακής υπογραφής (ες) που ανιχνεύουν τους άνδρες σε κίνδυνο την πρόοδο της νόσου παραμένει ένα πιεστικό και ακόμα ακάλυπτη ανάγκη για αυτούς τους ασθενείς. Εδώ, χρησιμοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη πλατφόρμα ανακάλυψη συνδυάζοντας κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, ένα διαγονιδιακό αδενοκαρκινώματος του προστάτη ποντικού (TRAMP) μοντέλο και κλινικά σχολιασμένο δείγματα ανθρώπινου ιστού για τον προσδιορισμό της απώλειας της έκφρασης του microRNA-34b όπως αυτές σχετίζονται με συνέπεια με υποτροπή του καρκίνου του προστάτη. Μηχανιστικά, αυτό συνδέθηκε με επιγενετική αποσιώπηση της θέσεως MIR34B /C και αυξημένη απώλεια αριθμού αντιγράφων του DNA, επιλεκτικά σε ανδρογόνο-εξαρτώμενη καρκίνο του προστάτη. Με τη σειρά της, η απώλεια του miR-34b οδήγησε σε κατάντη απορρύθμιση και η υπερέκφραση του «βλαστική ικανότητα» δείκτη, Sox2. Τα ευρήματα αυτά προσδιορίζουν την απώλεια του miR-34b ως ένα ισχυρό βιοδείκτη για προστάτη εξέλιξη του καρκίνου σε όγκους ανδρογόνα-ευαίσθητο, και να προβλέψει ένα δυναμικό ρόλο των προγονικών /βλαστικών κυττάρων σηματοδότησης σε αυτό το στάδιο της νόσου

Παράθεση:. Forno Ι, Ferrero S, Russo MV, Gazzano G, Giangiobbe S, Montanari E, et al. (2015) Απελευθέρωση of Mir-34b /Sox2 Προβλέπει Καρκίνος του προστάτη Εξέλιξη. PLoS ONE 10 (6): e0130060. doi: 10.1371 /journal.pone.0130060

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ΑΥΣΤΡΙΑ

Ελήφθη: 16 Φεβ, 2015? Αποδεκτές: 15, Μαΐου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 24 Ιουνίου 2015

Copyright: © 2015 Forno et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα περιέχεται μέσα στο χαρτί και σε υποστηρικτικά αρχεία πληροφοριών. Επιπλέον, έχουν πρωτογενή δεδομένα array TLDA έχουν συμπεριληφθεί στην Συμπληρωματικές πληροφορίες

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από το Fondazione Cariplo με το βραβείο n. 2010-0846 (σε SB) (https://www.fondazionecariplo.it/it/index.html) και τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας χορηγεί CA140043 (σε LRL και DCA) και CA190027 (σε DCA) (http: //επιχορηγήσεις .nih.gov /επιχορηγήσεις /oer.htm). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται σπλαγχνική κακοήθεια στους άνδρες σε όλο τον κόσμο. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, προστάτη αντιπροσωπεύει το 26% του συνόλου των νέων περιπτώσεων καρκίνου και 9% του συνόλου του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους, κατέλαβαν τη δεύτερη για τον καρκίνο του πνεύμονα. Η πιθανότητα ανάπτυξης καρκίνου του προστάτη από τη γέννηση μέχρι το θάνατο είναι 1 στις 7, με την υψηλότερη συχνότητα στους άνδρες άνω των 70 ετών [1]. Αν και οι περισσότεροι άνδρες διαγνώστηκαν με καρκίνο του προστάτη θα έχει μια νωχελικός και ιάσιμη κλινική πορεία, περίπου το 15% αυτών των ασθενών θα εμφανίσει μια ταχέως προχωρά, ανθεκτική στη θεραπεία και μεταστατική νόσο στα οστά και σπλαχνικά όργανα με υψηλή νοσηρότητα και θνησιμότητα [2]. Καθώς δεν υπάρχουν αξιόπιστα μέσα για τον εντοπισμό των ασθενών που διατρέχουν κίνδυνο μεταστατικής διάδοσης είναι διαθέσιμα σήμερα [3], η αναζήτηση για μοριακή υπογραφή (ες) της εξέλιξης της νόσου, ιδιαίτερα μετάβαση σε ευνουχίσει αντίστασης [4] είναι επείγουσα και παραμένει σε μεγάλο βαθμό ανικανοποίητη ιατρική ανάγκη σε διαχείριση ενός διάγνωση του καρκίνου του προστάτη.

τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά, μη-κωδικοποίησης, ενδογενές RNA με πλειοτροπική λειτουργίες σε γονιδιακή έκφραση [5,6]. Αυτή η οδός είναι δραματικά αξιοποιηθεί στον καρκίνο, και μια ποικιλία από miRNAs έχουν συνδεθεί με απορυθμισμένη ογκογόνο ή όγκου οδών καταστολέα [7,8]. Αντίστοιχα, οι οδηγοί της κακοήθειας, συμπεριλαμβανομένων των εκτροπών του DNA, μεταγραφική απορύθμιση και επιγενετική αποσιώπηση συμβάλει στην ανώμαλη έκφραση των miRNAs [9,10]. Για τη σταθερότητά τους σε βιολογικά υγρά [11], και η σχετική ευκολία της ανίχνευσης σε κλινικά δείγματα [12], έχουν miRNAs επιδιωχθεί ως βιοδείκτες όγκων [8], για τους πιθανούς προγνωστική ή προγνωστική αξία τους σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού [13], το ήπαρ [ ,,,0],14,15], ή του πνεύμονα [16] του καρκίνου. Η απορρύθμιση της έκφρασης miRNA έχει επίσης παρατηρηθεί σε καρκίνο του προστάτη, σε σύγκριση με φυσιολογικό επιθήλιο [17-19], και σε ορισμένες περιπτώσεις που συνδέονται με μεταστατικό διάδοση [20-22], αλλά οριστική υπογραφή (ες) της εξέλιξης της νόσου, ειδικά ευνουχισμού-αντίσταση, δεν έχουν ταυτοποιηθεί.

σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη πλατφόρμα ανακάλυψη συνδυάζοντας καθιερωμένες κυτταρικές σειρές, ένα γενετικό μοντέλο ποντικού της εξέλιξης της νόσου, και τα δείγματα πρωτογενή ασθενών στο προφίλ διαφορική έκφραση miRNA στον καρκίνο του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

κλινικά δείγματα

Οι κλινικές και παθολογικές παραμέτρους των ασθενών προστάτη ή καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (ΚΥΠ) που εξετάστηκαν στις μελέτες αυτές περιγράφονται στον πίνακα 1. σε παγκόσμιο επίπεδο, μπορούμε ανακτηθεί αρχειακό ιστούς και τα κλινικά αρχεία από 192 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση 2004-2006 στο San Paolo νοσοκομείο ή Νοσοκομεία Granda Fondazione IRCCS Ca ‘στο Μιλάνο (Ιταλία), σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Institutional Review Boards (IRB) του Νοσοκομείο Σαν Πάολο (κωδικός 10664 ) και Fondazione IRCCS Ca ‘Granda-Ospedale Maggiore Policlinico (κωδικός 1381 – 1311). Λόγω της αναδρομικής φύσης αυτής της μελέτης και τη χρήση των πρακτικών ανωνυμίας των δεδομένων, η ανάγκη για γραπτή συγκατάθεση είχε αρθεί. Παρακολούθηση συνίστατο στην ενεργό παρακολούθηση των ασθενών με διαδοχικές μετρήσεις των επιπέδων (PSA) στον ορό προστατικό ειδικό αντιγόνο. Για τους ασθενείς προστάτη, βιοχημική υποτροπή ορίστηκε ως δύο διαδοχικά επίπεδα PSA μεγαλύτερες από 0,2 ng /ml

Η

Για μοριακή αναλύει τις περιπτώσεις πρέπει να έχει ικανοποιητική περιεχόμενο RNA (260/280 Απορρόφηση Λόγος & gt?. 1.2 και & lt? 2.1 και 500 ng του συνολικού RNA) σε τουλάχιστον μια αντίστοιχη φυσιολογική και όγκο του προστάτη δείγμα ανά ασθενή. Εξήντα έξι ασθενείς από τους 192 αξιολογηθούν ικανοποιημένοι αυτά τα κριτήρια και για πενήντα από αυτές, επίσης, προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ) βλάβη ήταν διαθέσιμο. Ως εκ τούτου, εμείς ταξινομημένο ασθενείς σε ένα πρώτο υποσύνολο με πλήρη διαθεσιμότητα των φυσιολογικών, ΡΙΝ και PCa ιστούς (n = 50, σειρά Α? Πίνακας 1), και σε ένα δεύτερο υποσύνολο αποτελείται από τους υπόλοιπους ασθενείς με μόνο συμφωνημένα φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων (n = 16, σειρά Β? Πίνακας 1). Επιθηλιακών ιστών για κανονικό προστάτη, ΡΙΝ και προστάτη χωριστά ανακτώνται από διάτρηση αρχειακό μπλοκ με μια βελόνα διαμέτρου 1 mm όπως περιγράφεται [23]. Κάθε δείγμα υπερέβαινε συστηματικά καθαρότητα 80% ως προς το περιεχόμενο των επιθηλιακών κυττάρων. Η κανονική δειγματοληψία ιστού διεξήχθη σε απόσταση τουλάχιστον 2 cm από νεοπλαστικό ιστό. Το πλήρες σύνολο των ασθενών που συμμετείχαν σε αυτή τη μελέτη (n = 192, σειρά C? Πίνακας 1). Χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή δεκαέξι ιστό πολύ μικρών συστοιχιών (TMA) μπλοκ [24] για ανοσοϊστοχημική αξιολόγηση

δείγματα καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (n = 10) ήταν οι ασθενείς που υποβλήθηκαν σε διουρηθρική εκτομή του προστάτη (TURP) σε Granda Νοσοκομείο Fondazione IRCSS Ca ‘(Μιλάνο), για τους οποίους προστάτη χαρτογράφηση ήταν αρνητική για την PCA και παρακολουθήθηκαν για τουλάχιστον 3 χρόνια (σειρά ΚΥΠ? Πίνακας 1). Αυτή η σειρά δεν περιλαμβανόταν στην πλατφόρμα ΤΜΑ και πλήρη τομές ιστού χρησιμοποιήθηκαν είτε για μοριακές ή ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις.

Οι κυτταρικές σειρές

Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές προστάτη RWPE-1, ΒΡΗ-1, LNCaP, DU145 και PC3 κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Η κανονική κυτταρική γραμμή RWPE-1 καλλιεργήθηκε σε κερατινοκυττάρων Serum-Free Medium συμπληρωμένο με 5 ng /ml EGF, 0,05 mg /ml βόειας εκχύλισμα υπόφυσης, και 1% Pen-Strep αντιβιοτικά κοκτέιλ. Όλες οι άλλες κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% Pen-Strep. Οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 θερμοκοιτίδα. Για miRNA επιμόλυνση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια 5×10

5 ανά φρεάτιο σε πλάκες έξι φρεατίων και επιμολύνθηκαν με 150 pmol του αναστολέα miR-34b (a-miR-34b? HSTUD0511), ή πρόδρομος miR-34b (ρ- miR34b? HMI0511), ή αντίστοιχα μη-στόχευσης αλληλουχίες (a-Ctrl ή ρ-Ctrl, αντίστοιχα HMC0002 και NCSTUD001) παρουσία του Lipofectamine 2000 (Life Technologies Inc., Carlsbad, CA, USA), όπως περιγράφεται [25]. Όλα τα μόρια miRNA ήταν από Sigma Aldrich, Μιλάνο, Ιταλία.

Laser υποβοηθούμενη μικροδιατομής των αλλοιώσεων του προστάτη από διαγονιδιακά αδενοκαρκινώματος του προστάτη Ποντίκι (TRAMP) ποντίκια

μπλοκ Αρχειακή ιστών του ουρογεννητικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένης της ουροδόχου κύστης, των σπερματοδόχων κύστεων και του προστάτη από πέντε ποντίκια TRAMP χρησιμοποιήθηκαν [26,27]. Όλοι οι ποντικοί είχαν αναπτύξει όγκους του προστάτη και θυσιάστηκαν στις 24 εβδομάδες ηλικίας. Όλα τα πειράματα σε ζώα έχουν ελεγχθεί και εγκριθεί από έναν Φροντίδα και Χρήση Επιτροπής Θεσμικών των ζώων στο Πανεπιστήμιο Τόμας Τζέφερσον. Δυσφορία και τραυματισμό των ζώων έχουν περιοριστεί σε αυτό που είναι αναπόφευκτη κατά τη διεξαγωγή της επιστημονικής πολύτιμη έρευνα. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες που διεξάγονται στο πλαίσιο αυτής της μελέτης σύμφωνα με τα εγκεκριμένα πρωτόκολλα για να διασφαλιστούν τα υψηλότερα πρότυπα στην ανθρώπινη φροντίδα στα ζώα. έχουν Αναλγητικά, αναισθητικά και ηρεμιστική φάρμακα έχουν χρησιμοποιηθεί όπως καθορίζεται από το κτηνιατρικό προσωπικό. Η ευθανασία έχει πραγματοποιηθεί από CO

2 αναισθησία. Η μέθοδος αυτή είναι σύμφωνη με τις συστάσεις του 1316 Panel της ευθανασίας της American Veterinary Medical Association

δείγματα προστάτη από ποντίκια TRAMP εμπλουτίστηκαν με PIN ή προστατικών όγκων (S1 σχήμα) με τη βοήθεια λέιζερ μικροδιατομής (LMD.? Leica Microsystems, Μιλάνο, Ιταλία) των επιθηλιακών αλλοιώσεων, όπως περιγράφεται [28]. Για miRNA προφίλ, προστάτη ή ιστοί PIN από διαφορετικά ζώα (n = 5 ανά ομάδα) συνενώθηκαν.

καθαρισμό RNA, ρετρομεταγραφή και microRNA προφίλ

Το συνολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το MasterPure RNA Καθαρισμός Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA), όπως περιγράφεται [28], και αναδρομικά μεταγραφομένων χρησιμοποιώντας τους εκκινητές Megaplex RT Ανθρώπου ή τρωκτικών πισίνες Α και Β v3.0 και κιτ Taqman microRNA ανάστροφη μεταγραφή. Ποντικού δείγματα ήταν προ-ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας Megaplex PreaAmp πισίνες τρωκτικών εκκινητή Α και Β Ανθρώπινα ή τρωκτικό TaqMan συστοιχίες χαμηλής πυκνότητας (TLDA) στη συνέχεια πραγματοποιείται για miRNA προφίλ σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη ή TRAMP προστάτη ιστών, αντίστοιχα. Ανθρώπινα TLDA περιλαμβάνει 754 miRNAs και 4 ενδογενή πυρηνισκικός RNAs (RNU44, RNU48 και U6snRNA), ενώ Τρωκτικό TLDA περιλαμβάνει 750 miRNAs, και 6 RNAs έλεγχο, εκ των οποίων 675 miRNAs και τρεις ενδογενείς ελέγχους (snoRNA135, snoRNA202 και U6snRNA) είναι ειδικά για το ποντίκι. Τόσο του Ανθρώπου και των τρωκτικών πλατφόρμα περιλαμβάνει ένα αρνητικό ανιχνευτή ελέγχου (ATH-miR-159a) ανά κάρτα. Για την επικύρωση, δεκαοκτώ επιλεγμένα miRNAs συν μεταγραφές αναφοράς (U6snRNA, RNU48, RNU44, και RNU24) και δύο αρνητικοί μάρτυρες (ATH-miR-159a και ένα καλά χωρίς αισθητήρα ανίχνευσης) αναλύθηκαν σε ανθρώπινα δείγματα (σειρά Α, Β και BPH? Πίνακα 1) χρησιμοποιώντας μια προσαρμοσμένη RT και προενισχυτή εκκινητών πισίνες μαζί με μια προσαρμοσμένη πλατφόρμα TLDA με προ-στίγματα εκκινητές και ανιχνευτές Taqman. Όλα τα αντιδραστήρια, κιτ και όργανα που χρησιμοποιούνται για miRNA προφίλ ήταν από την Life Technologies Inc. (τώρα μέρος της Thermo Scientific, Carlsbad, CA, USA).

ανάλυση μεθυλίωσης του MIR34B /C CpG νησί

Γονιδιωματικό DNA καθαρίστηκε από 4 κυτταρικές σειρές προστάτη (RWPE-1, ΒΡΗ-1, LNCaP, DU145), 16 PCa, και 12 φυσιολογικούς ιστούς προστάτη (από τη σειρά Β), και από 10 ΒΡΗ (σειρά ΒΡΗ) δείγματα με τη χρήση του QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Waltham, ΜΑ, USA). Διθειώδες νάτριο μετατροπή του DNA (400 ng) διεξήχθη χρησιμοποιώντας το EZ μεθυλίωσης του DNA-Gold Kit (Zymo Research Corporation, Irvine, CA). Η μεθυλίωση-ειδική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (MSP) ενός νησιού CpG ανάντη της θέσεως MIR34B /C διεξήχθη όπως περιγράφεται [29], χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές για την ανίχνευση του μη-μεθυλιωμένου (UM) ή μεθυλιωμένη (Μ) περιοχή: UM-εμπρός 5 ‘ – TGTTTTTTGGTGAAATGGGGTTTGAGGT-3 ‘UM-αντίστροφη 5′-CCTACAAACCAAACACCAAACACCCACA3 »? M-προς τα εμπρός 5’-CGGTGAAATGGGGTTCGAGGC-3 ‘M-αντίστροφη 5′-CCGAACACCGAACACCCGCG-3’. Το θερμικό προφίλ ήταν 95 ° για 10 λεπτά που ακολουθείται από 95 ° C για 1 λεπτό, 65 ° C για 1 λεπτό, και 72 ° C για 1 λεπτό για 45 κύκλους και στη συνέχεια 72 ° C για 7 λεπτά.

Αντιγραφή παραλλαγή αριθμός (CNV) ανάλυση

Genomic παραλλαγές του συμπλέγματος 11q23.1b και παρακείμενες θέσεις αναλύθηκαν με TaqMan αριθμό αντιγράφων δοκιμασία σε σχέση με το γονίδιο αναφοράς RNase Ρ, όπως περιγράφεται [30]. Οι αριθμοί αναγνώρισης δοκιμασίας είχαν ως εξής: Hs00608392_cn (CNV # 1? Ακριβή τοποθεσία 111.383.042), Hs03049129_cn (CNV # 2? Ακριβή τοποθεσία 111.368.721) και Hs06336326_cn (CNV # 3? Ακριβείς τοποθεσίες 81902545). Παραλλαγές σε αριθμό αντιγράφων του DNA είχαν προσδιοριστεί ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό αντιγραφής καλούντος. Όλες οι αναλύσεις, τα αντιδραστήρια και το λογισμικό ήταν από την Life Technologies Inc.

στόχοι miR-34b έκφραση ανάλυση

Υπερπλαστικοί (ΒΡΗ-1) ή του όγκου κυτταρικές γραμμές προστάτη (LNCaP και DU145) επιμολύνθηκαν με miR -34b μιμούνται /αναστολέα ή μάρτυρες για 72 ώρες και το συνολικό RNA καθαρίστηκε όπως περιγράφηκε παραπάνω. Στη συνέχεια, ελεύθερο DNA ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με τυχαία εξαμερή και SOX2, CDKN1A, ΚΟΑ, c-myc, HES1 έκφραση γονιδίων (TaqMan Gene Expression Αναλύσεις) ήταν σχετικά ποσοτικά σε ένα αντίγραφο αναφοράς (βήτα-2-μικροσφαιρίνη) από Σε πραγματικό Time PCR (qPCR). Όλα τα αντιδραστήρια και τα όργανα ήταν από την έκφραση Target Life Technologies Inc. στη συνέχεια υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τη 2 ^

-ΔCt τύπο, μέση κανονικοποιημένη και log2 μετατραπεί για την παραγωγή θερμότητας χάρτη χρησιμοποιώντας dChip softare (DNA-Chip Analyzer, www.dchip.org) όπως περιγράφεται [9].

ανοσοαποτύπωσης

τα κύτταρα συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση των miRNA μιμείται /αναστολέα και διαλυτοποιήθηκαν σε 100 μΙ ρυθμιστικού λύσης συμπληρωμένο με αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) , όπως περιγράφεται [25]. Κλάσματα (50 μg) του κάθε προϊόντος λύσης κυττάρου ανιχνεύθηκαν με 1 μg /ml των ακόλουθων πρωτογενών αντισωμάτων με c-Myc (κλώνος D84C12? Cell Signaling Technologies, Danvers, ΜΑ, USA), Sox2 (κλώνος D6D9? Cell Signaling Technologies), ή Notch 1 (κλώνος Α-8? Σάντα Κρουζ βιοτεχνολογίες, Santa Cruz, CA, USA). β-τουμπουλίνης (Sigma Aldrich) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Αντιδραστική ζώνες έγιναν ορατές με ECL Plus (GE Healthcare, Μιλάνο, Ιταλία).

προστάτη Ιστοί μικροσυστοιχίες (ΤΜΑ) κατασκευή και ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Από κάθε μία από τις 192 ασθενείς προστάτη (σειρά C ? Πίνακας 1), τέσσερις πυρήνες του όγκου του προστάτη, ένας πυρήνας ΡΙΝ και ένα δοκίμιο του φυσιολογικού παρεγχύματος αν είναι διαθέσιμο χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή 22 μπλοκ ΤΜΑ, όπως περιγράφεται [24], με κάποιες τροποποιήσεις [23]. FFPE ιστούς από ασθενείς με καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (ΒΡΗ σειρά? Πίνακας 1) χρησιμοποιήθηκαν ως πλήρη τμήματα και δεν συμπεριλήφθηκαν στην ΤΜΑ. Τέσσερις μm πάχους τομές από κάθε μπλοκ χρώστηκαν με ένα αντίσωμα προς Sox2 (1: 100? Cell Signaling), με διαμινοβενζιδίνη (DAB) ως χρωμογόνο. Η ανοσοϊστοχημεία έγινε χρησιμοποιώντας Benchmark Ultra Roche Ventana ανοσοκηλιδωτή (Roche Group, Tucson, AZ, USA). Όλα τα πλακίδια με αιματοξυλίνη. Δύο παθολόγους (ΦΕΚ και SF) τύφλωσε με τα κλινικά δεδομένα αξιολογούνται και σκόραρε όλες τις διαφάνειες. Όταν συνέβη διαφορές, η υπόθεση περαιτέρω αναθεωρηθούν ώστε να καταλήξουν σε συμφωνία βαθμολογίας. Μόνο αντιδραστικότητα για την πυρηνική Sox2 σε επιθηλιακά κύτταρα και όχι σε βασικό μυοεπιθηλιακά διαμέρισμα καταγράφηκε και το ποσοστό των ανοσοδραστικών κυττάρων σε δείγματα προστάτη ήταν κατά μέσο όρο μεταξύ των τεσσάρων πυρήνων από τον ίδιο ασθενή. Σύμφωνα με την προηγούμενη έκθεση [31], Sox2 ανοσολογική αντίδραση στη συνέχεια κατηγοριοποιούνται σε τέσσερις ομάδες και τα αποτελέσματα στη συνέχεια αποδίδεται ως εξής: σκορ 0 (αρνητική πυρηνική χρώση), 1 (1-10% των πυρηνικών Sox2), 2 (11-50% πυρηνικών Sox2), 3 (πάνω από το 50% των πυρηνικών Sox2).

Στατιστική Ανάλυση

miRNAs σχετικές ποσότητες (RQ) ελήφθησαν εισαγωγή αρχείων δεδομένων πρώτες TLDA στο λογισμικό DataAssist (Life Technologies Inc .) χρησιμοποιώντας μια τιμή των 35 ως όριο για τη μέγιστη επιτρεπόμενη Ct και παγκόσμια εξομάλυνση για ποσοτικοποίηση στόχων. τιμές RQ στη συνέχεια log2 μετασχηματίζονται και εισάγονται σε BRB ArrayTools (https://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) όπου Anova ή διαφορική έκφραση αναλύσεις διεξήχθησαν, όπως περιγράφεται [15]. παραμέτρους συσχέτισης μεταξύ της έκφρασης των miRNAs και κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές προήλθαν χρησιμοποιώντας Mann-Whitney U test, Friedman δοκιμή ή chi-square test για συνεχή ή διακριτή μεταβλητή, αντίστοιχα, χρησιμοποιώντας GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA) ή MedCalc ( Mariakerke, Βέλγιο) στατιστικό πακέτο. Δέκτης μέθοδο λειτουργίας χαρακτηριστικά (ROC) καμπύλη χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η ακρίβεια των miRNAs να διακρίνει σωστά μεταξύ καλοήθη νόσο, το PIN ή τον καρκίνο του προστάτη, και για τον εντοπισμό των ασθενών που είχαν αποτυχία PSA (PSA & gt? 0,2 ng /ml για τουλάχιστον δύο συνεχόμενες φορές) κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης, όπως περιγράφεται [15]. λογισμικό dChip χρησιμοποιήθηκε για ανεξέλεγκτους ιεραρχική ομαδοποίηση.

In vitro

πειράματα εκτελέστηκαν τουλάχιστον τρεις φορές και τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Μια τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

miRNA υπογραφές μοντέλα καρκίνου του προστάτη

Ξεκινήσαμε αυτή τη μελέτη από προφίλ της έκφρασης των miRNAs σε ένα πάνελ. του προστάτη τύπων καρκινικών κυττάρων με διαφορετικά ογκογόνο δυναμικό (S1 File) και τα ποντίκια TRAMP (S2 File). Σε αυτά τα πειράματα, η έκφραση miRNAs διαφοροποιούνται εύκολα ανδρογόνο αναίσθητη (DU145 και PC3) από-ευαίσθητους τύπους καρκίνου του προστάτη κυττάρων (Σχήμα 1Α). Συνεπώς, μη ογκογόνα RWPE-1 και ΒΡΗ-1 κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Α) συγκεντρωμένα χωριστά από πιο επιθετικές, κύτταρα LNCaP. Εμείς επόμενη επιλεγμένη miRNAs με βάση δύο κριτήρια: ένα 20-πλάσια διαφορά μεταξύ ανδρογόνο-ευαίσθητες ή μη ευαίσθητη τύπους κυττάρων και μη ογκογόνα RWPE-1 ή ογκογόνα LNCaP (Σχήμα 1Β) (i), και μια σημαντική μεταβολή (ρ & lt? 0.05 με ANOVA) στην έκφραση μεταξύ της κανονικής, υπερπλαστικό, ανδρογόνο-ευαίσθητα και μη ευαίσθητα κύτταρα (Σχ 1C) (ii). Οι αναλύσεις αυτές εντοπίστηκαν 18 miRNAs, και 16 από αυτές τις μεταγραφές είχαν ορθόλογα ποντικού (Σχήμα 1D).

Α) Heat-χάρτη της παγκόσμιας προφίλ miRNA (≈750 miRNAs) σε μη-ογκογόνο (RWPE-1, Κανονική) , υπερπλασίας (ΒΡΗ-1), ανδρογόνο-εξαρτώμενη (LNCaP, AR

Sens-PCA) ή ανεξάρτητο (DU145 και PC3, AR

ins-PCA) καρκινικά κύτταρα του προστάτη. Κόκκινο, υπερ-έκφραση? μπλε, υπο-έκφραση, αντίστοιχα. Β) ΝΕΦΕΛΟΓΡΑΜΜΑΤΑ διαγράμματα πραγματοποιήθηκαν μεταξύ ανδρογόνων-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από τα κύτταρα του προστάτη και μεταξύ των φυσιολογικών κυττάρων του προστάτη και AR

sens κύτταρα του προστάτη για να επιλέξετε miRNAs με διαφορική έκφραση σε κάθε κατεύθυνση (fold-αλλαγή) τουλάχιστον 20 πτυχώσεις. Ο κατάλογος των 41 miRNAs ταυτόχρονα μεταβάλλεται σε δύο συγκρίσεις δημιουργήθηκε. C) Σχηματικό διάγραμμα των κριτηρίων επιλογής που εγκρίθηκαν για τον εντοπισμό miRNAs πιθανώς σχετίζονται με την ΣΕΣΣ. Δ) Οι δεκαοκτώ miRNA υπογραφές που προσδιορίζονται στο Γ επιβεβαιώθηκαν από qPCR στα υποδεικνύεται κύτταρα του προστάτη. Όλα τα miRNAs εκτός από δύο (miR-577 και miR-886-3p) είχε ορθόλογα ποντίκι. Κόκκινο, λευκό και μπλε χρώματα με τη ζέστη χάρτη αντιπροσωπεύουν υψηλότερο, ίσο ή χαμηλότερο έκφρασης των miRNAs σε δείγματα σεβασμού προς το διάμεσο τιμή miRNA.

Η

επόμενο εκτελούνται παγκόσμια miRNA χαρακτηριστικών των τριών κύκλων PIN ή καρκινικές βλάβες από TRAMP ποντίκια (Σχήμα 2Α), χρησιμοποιώντας τη διαφορά αποκοπής 20-φορές σε έκφραση miRNA μεταξύ των δύο δειγμάτων (Σχήμα 2Β). Ένα εκατοντάδες είκοσι ένα miRNAs πληρούνται τα κριτήρια αυτά (Σχήμα 2Β και 2Γ), και 61 miRNAs είχε ανθρώπινη ορθόλογα (S1 πίνακα). Στην ανάλυση αυτή, μόνο τέσσερα miRNAs εκφράστηκαν διαφορικά σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη και δείγματα όγκων από ποντικούς TRAMP, συμπεριλαμβανομένων miR-34b-3ρ, miR-34γ-5ρ, miR-138, και miR-224 (Σχήμα 2Γ και 2Δ ). Κατά συνέπεια, το προφίλ έκφρασης αυτών των τεσσάρων microRNAs έδειξαν ότι DU145 ή PC3 κύτταρα ανδρογονο-ανεξάρτητοι ήταν πιο στενή σχέση με τους όγκους TRAMP, από άλλες κυτταρικές γραμμές ανθρώπου (Εικ 2Δ).

Α) Συνολική miRNA προφίλ του καρκίνου του προστάτη (PCA) ή προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ) βλάβες που απομονώθηκαν από ποντίκια TRAMP. Β) Scatterplot διάγραμμα των miRNAs με διαφορική έκφραση τουλάχιστον 20 πτυχώσεις ανάμεσα στο ΡΙΝ και προστάτη τους ιστούς των ποντικών TRAMP. Από τις προσδιοριζόμενες 121 απελευθερωμένη miRNAs (S1 πίνακα) 61 είχαν ανθρώπινη ορθόλογα. C, D) Σύγκριση των σημαντικών υπογραφών miRNA μεταξύ κυτταρικών γραμμών προστάτη και αλλοιώσεις TRAMP. Μόνο τέσσερις miRNAs ήταν κοινά μεταξύ των δύο πειραματικών συστημάτων. ανάλυση της έκφρασης ακολουθείται από ανεξέλεγκτους ιεραρχική ομαδοποίηση D) του miR-224, -34b-3ρ, -138 και miR-34γ-5P αποκαλύπτει ότι ανδρογόνα-ανεξάρτητους καρκινικά κύτταρα του προστάτη είναι πιο παρόμοιο με ιστούς TRAMP από το να ανδρογόνο-εξαρτώμενη ή μη ογκογόνων προστάτη ανθρώπινα κύτταρα.

Η

LNCaP του προστάτη μοντέλο αντικατοπτρίζει miRNA απορρύθμιση σε ανθρώπινο προστάτη ασθένεια

Εξετάσαμε την επόμενη των miRNAs που αναφέρονται ανωτέρω (n = 18) σε μια σειρά από 50 ασθενείς (σειρά Α ? Πίνακας 1) με ένα φάσμα βλαβών, συμπεριλαμβανομένων προστάτη, ΡΙΝ και φυσιολογικό επιθήλιο. MiR-31, miR-34b-3ρ, miR-205, miR-224 και miR-452 έδειξαν διαφορική επίπεδα έκφρασης μεταξύ των φυσιολογικών, PIN και προστάτη αντίστοιχα δείγματα (p & lt? 0.01 με τεστ Friedman? Σχήμα 3). Όλα τα miRNAs ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε σύγκριση με PCa φυσιολογικό επιθήλιο, που ταιριάζουν με τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με LNCaP, RWPE-1 ή ΒΡΗ-1 τύπους κυττάρων (Σχήμα 1 D).

Αντιστοιχισμένα φυσιολογικό προστάτη αδένες, προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ ) και του καρκίνου του προστάτη (PCA) αλλοιώσεις που διατίθεται από 50 ασθενείς εξετάστηκαν για επίπεδα έκφρασης των δεκαοχτώ επιλεγμένων miRNAs. MiR-31, 34β-3ρ, 205, 224 και miR-452 εμφάνισαν σημαντικά μεταβληθεί τα επίπεδα μεταξύ των τριών τάξεων του ιστού (p & lt? 0.01 με τεστ Friedman). Μπαρ, μέση τιμή ± SEM. RQ, σε σχέση με την ποσότητα των miRNAs

Η

επόμενο επικεντρώθηκε σε αυτά τα πέντε miRNAs, και εξέτασε πιθανή συσχέτιση τους με κλινικές παραμέτρους της εξέλιξης προστάτη, συμπεριλαμβανομένης της βιοχημικής υποτροπής (δύο διαδοχικές τιμές του PSA & gt?. 0.2 ng /ml κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης), το σκορ Gleason (GS ≤7

vs

GS & gt? 7), το μέγεθος του όγκου (Τ2

vs

Τ3-Τ4 PCA) και των λεμφαδένων μεταστάσεων. Για περαιτέρω επικύρωση, χρησιμοποιήσαμε ένα πρόσθετο, ανεξάρτητο σύνολο δεκαέξι ασθενείς (σειρά Β στον Πίνακα 1), για συνολικό αριθμό των 66 που αναλύθηκαν προστάτη. Σε αυτή την ανάλυση, μειωμένα επίπεδα των miRNAs συσχετίζεται με κλινικο-παθολογικές εξέλιξη του προστάτη (Πίνακας 2), και η διαφορική έκφραση του mir-31, miR-34b-3ρ και miR-452 θα μπορούσε να εισάγει διακρίσεις σημαντικά τους ασθενείς σύμφωνα με τη βιοχημική υποτροπή (Σχήμα 4Α). Στη συνέχεια, ρωτήσαμε αν το ίδιο σύνολο πέντε miRNAs θα μπορούσε να εισάγει διακρίσεις μεταξύ PIN και προστάτη βλάβες, έτσι παρόμοια με τη σχέση μεταξύ της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη-1 και κύτταρα LNCaP. Για αυτά τα πειράματα, αξιολογήσαμε δέκα ασθενείς που υποβλήθηκαν σε διουρηθρική προστατεκτομή για καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (ΚΥΠ σειρά στον Πίνακα 1), και παρακολουθήθηκαν για τουλάχιστον 3 χρόνια σε Granda Νοσοκομείο Fondazione IRCCS Ca ‘. Τόσο miR-31 και miR-34b-3ρ εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ PIN ή δείγματα προστάτη και BPH (p & lt? 0.001 από δοκιμασία Mann Whitney? Σχήμα 4Β). Διαφορετικά από το προφίλ που παρατηρείται σε κυτταρικές σειρές, τα επίπεδα miR-34b-3ρ αυξήθηκε περισσότερο από δέκα-πτυχώσεις σε δείγματα ΚΥΠ σε σύγκριση με το PIN ή του προστάτη. Τέλος, η έκφραση του miR-34b-3ρ διακρίσεις με ακρίβεια δείγματα PIN ή PCA από καλοήθη υπερπλασία του προστάτη, με ανάλυση ROC (p & lt? 0,0001? S2 σχήμα). επίπεδο έκφρασης MiR-205 ήταν χαμηλότερη σε καλοήθη υπερπλασία του προστάτη σε σύγκριση με το PIN (p = 0.0027? Σχήμα 4Β). Αντίθετα, miR-452 και miR-224 δεν εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ του προστάτη και καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη ή μεταξύ PIN και BPH, αντίστοιχα (Σχήμα 4Β).

Α) λειτουργούν χαρακτηριστικό (ROC) καμπύλη Receiver χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της ακρίβειας των miRNAs για τον εντοπισμό των ασθενών που είχαν αποτυχία PSA κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης. AUC? Περιοχή κάτω από την καμπύλη? CI, διάστημα εμπιστοσύνης. Β) MiR-31, 34b-3ρ, 205, 224 και miR-452 έκφραση αξιολογήθηκε με qPCR σε μη ζευγαρωμένα προκαρκινικές αδένες (PIN, n = 50), νεοπλασματικές αλλοιώσεις του προστάτη (PCA, n = 66), ή καλοήθη υπερπλασίας ιστούς (ΒΡΗ, n = 10). **, Ρ = 0,0027? *** P & lt? 0.001, όλα με δοκιμή Mann-Whitney. Μπαρ, μέση τιμή ± SEM. RQ, σε σχέση με την ποσότητα των miRNAs.

Η

MiR-34β καταστολή είναι ένας βιολογικός δείκτης του προστάτη

MiR-34β και miR-34γ μεταγράφονται από την ίδια θέση στο χρωμόσωμα 11 ( 11q23.1 κυτταρογενετική μπάντα? σχήμα 5Α), και η έκφρασή τους ρυθμίζεται από την επιγενετική, όπως οι νησιωτικές CpG μεθυλίωση [29], και η λειτουργία p53 [32]. Επομένως, εξετάσαμε τους ασθενείς ΒΡΗ, ένα υποσύνολο των δειγμάτων προστάτη (τυχαία επιλεγμένα από σειρά Β? Πίνακας 1), η κανονική δείγματα προστάτη, και μη ογκογόνων ή επεμβατική κυτταρικές προστάτη γραμμές για τις πιθανές διακυμάνσεις αριθμού αντιγράφων αλληλικές και την κατάσταση μεθυλίωσης του CpG νησί του τόπου MIR34B /C (Σχήμα 5Β-5G).

Α) Σχηματικό διάγραμμα του ανθρώπινου τόπου MIR34B /C στο χρωμόσωμα 11q. B, C) miR-34b-3ρ και έκφραση miR-34γ-5p στις ενδεικνυόμενες δείγματα φυσιολογικού προστάτη (πισίνα 10 δειγμάτων), η καλοήθης υπερπλασία του προστάτη (ΚΥΠ), ο καρκίνος του προστάτη (PCA) ή μη-νεοπλασματική (RWPE-1) , υπερπλασίας (ΒΡΗ-1) ή όγκου (LNCaP, DU145) κυτταρικές προστάτη γραμμές. D, E) Αντιγραφή αριθμού των γονιδιωματικών περιοχών DNA πλησίον MIR34B /C locus (CNV # 1? Hs00608392), ή με το γονίδιο BTG4 (CNV # 2, Hs03049129) αξιολογήθηκε με qPCR στα ίδια δείγματα που περιγράφονται στο πάνελ Β, Γ . οι τιμές αποκοπής για σημαντική απώλεια ή κέρδος των στόχων του DNA σε σχέση με μια δοκιμασία αναφοράς (RNase P) ορίστηκαν ως αντίγραφα & lt? 0.5 ή & gt? 4, αντίστοιχα (καμία μεταβολή: CNV = 2). F, G) Ανάλυση MIR34B /C CpG νησί επιγενετική κατάσταση διεξήχθη από ειδικούς μεθυλίωσης PCR σε συμφωνημένα κανονική ή νεοπλασματικών (PCA) παρέγχυμα του προστάτη, καλοήθης υπερπλασίας δείγματα και κυτταρικές σειρές του προστάτη. Ένα δείγμα θεωρήθηκε μερικώς μεθυλιωμένη (Μ /UM) εάν ενισχύεται και από τα δύο ζεύγη εκκινητών. Μ, μετουσιωμένες? UM, μη μεθυλιωμένα. Κενό, κανένας έλεγχος πρότυπο? NA, δείγμα δεν υπάρχουν διαθέσιμα στοιχεία.

Η

Σε αυτά τα πειράματα, miR-34b-3ρ μειώθηκε σε PCa, σε σύγκριση με την κανονική ή υπερπλαστικές δείγματα προστάτη, ΒΡΗ-1 ή LNCaP κύτταρα (Σχήμα 5Β). Σε αντίθεση, miR-34γ-5P είχε διαφορετική μορφή έκφρασης σε ανθρώπινους ιστούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι δύο μεταγραφές μπορεί να ρυθμίζεται ανεξάρτητα (Σχήμα 5C). Genomic ανάλυση αποκάλυψε ότι μόνο η εγγύς περιοχή στον τόπο MIR34B /C (δοκιμασία CNV # 1? Σχήμα 5D) παρουσίασαν απώλεια του αριθμού αντιγράφων του DNA, όπως τα πιο απομακρυσμένα ανιχνευτές (CNV # 2 και CNV # 3) δεν έδειξαν μεταβολές σε γενωμικό περιεχόμενο (Σχήμα 5Ε και S2 πίνακα). Απώλεια αριθμού αντιγράφων του DNA ήταν σημαντικά πιο έντονη σε ιστούς PCa, σε σύγκριση με καλοήθη υπερπλασίας αδένες (ρ = 0,01 με την ακριβή δοκιμή Fisher), και δεν ήταν ανιχνεύσιμη στην πισίνα των φυσιολογικών μαρτύρων (Εικ 5D). Τόσο CNV # 1 και # 2 χάθηκαν σε ΒΡΗ-1 και LNCaP κυτταρικών σειρών, πιθανώς αντανακλώντας την ταυτόχρονη ρύθμιση προς τα κάτω του miR-34b /c. Σε αντίθεση, τα κύτταρα DU145 δεν εμφάνισαν διαμόρφωση του miR-34b /έκφραση c, ή απώλεια αλληλικές αριθμού αντιγράφων (Σχ 5D και 5Ε).

Όταν αναλύθηκαν για επιγενετικές κατάσταση με μεθυλίωση-ειδική PCR, το νησί CpG ανάντη του τόπου MIR34B /C (Σχήμα 5F) ήταν σημαντικά πιο μεθυλιωμένο σε καρκίνους του προστάτη από το κανονικό ή υπερπλαστικών δείγματα προστάτη (50% έναντι 30% ή 0% αντίστοιχα, ρ = 0,026 με δοκιμή χ-τετράγωνο? Σχήμα 5G). Μια μερική βαθμός μεθυλίωσης μπορεί να ανιχνευθεί σε όλες τις κυτταρικές σειρές αλλά ΒΡΗ-1, στην οποία MIR34B /C locus ήταν επιγενετικώς σιγήσει (Σχ 5F και 5G). Μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η μειωμένη έκφραση του miR-34b σε προστάτη μπορεί να περιλαμβάνει ένα συνδυασμό των επιγενετικών αποσιώπησης και την απώλεια αριθμό αντιγράφων του DNA (S2 Πίνακας).

Ένας άξονας miR-34b-3ρ-SOX2 επιλεκτικά απορυθμισμένη στην εξαρτώμενων από ανδρογόνα PCa

MiR-34b-3ρ ρυθμίζει την έκφραση των παραγόντων αρχέγονων κυττάρων που σχετίζονται με, συμπεριλαμβανομένων των c-myc, Sox2, Met και Notch 1 [33,34], τα οποία έχουν επίσης ενοχοποιηθεί για καρκίνο του προστάτη [ ,,,0],35-37]. Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, η αναγκαστική έκφραση του προδρόμου αλληλουχιών miR-34b σε διαφορετικές κυτταρικές προστάτη γραμμές αλλά όχι ανταγωνιστή (Πίνακας Α σε S3 σχήμα), ισχυρά καταστέλλεται ενδογενή επίπεδα Sox2 σε ΒΡΗ-1 κύτταρα (Σχήμα 6Α), ενώ δεν διαφοροποιούν τα επίπεδα έκφρασης του c-myc, Notch 1 και Met (Πίνακες Β, C σε S3 Εικ). Αντιστρόφως, ανεξάρτητου από ανδρογόνα κύτταρα DU145 δεν δεικνύουν miR34b-διαμόρφωση της έκφρασης Sox2 (Σχήμα 6Α), και τα κύτταρα LNCaP δεν είχαν ανιχνεύσιμα επίπεδα Sox2 (S4 Εικ). Τέλος, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων δεν επηρεάστηκε σημαντικά υπό τις διαφορετικές συνθήκες που εξετάστηκαν (Πίνακας Δ στο Σχ S3).

έκφραση Α) Sox2 αναλύθηκε με ανοσοκηλίδωση σε ΒΡΗ-1 ή DU145 κυττάρων μετά από επιμόλυνση με μιμείται miR-34b ή αλληλουχία ελέγχου για 72 ώρες. Untr., Μη επεξεργασμένο δείγμα. p-miR-34b ή ένα-miR-34b, πρόδρομος ή ανταγωνιστή miR-34b? p-Ctrl ή ένα-Ctrl, μη στόχευση των ελέγχων για την πρόδρομη ή ανταγωνιστή μόρια. Β) Sox2 ανοσοαντιδραστικότητα αναλύθηκε σε προστάτη TMAs, η οποία περιελάμβανε φυσιολογικούς ιστούς, προ-νεοπλασματικών (ΡΙΝ) και όγκου (PCA) βλάβες από 192 ασθενείς και σε καλοήθη υπερπλασία του προστάτη ΒΡΗ) δείγματα (. Sox2 εκφράζεται υψηλά σε βασικό στρώμα κυττάρων από μη νεοπλασματικών ιστών και σε επιθηλιακά κύτταρα σε ιστό καρκίνου. C, D) Sox2 αυξημένη έκφραση χαρακτηρίζει προστάτη ιστών από το PIN ή βλάβες ΚΥΠ και διακρίνει τους ασθενείς του προστάτη με βιοχημική υποτροπή. Ο αριθμός των PIN, προστάτη ή περιπτώσεις καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη (C) ή των ασθενών προστάτη οι οποίοι υποβλήθηκαν ή όχι βιοχημική υποτροπή κατά τη διάρκεια της κλινικής παρακολούθησης (ορολογική PSA & gt? 0.2? D), σύμφωνα με τα αποτελέσματα της πυρηνικής χρώσης Sox2 απεικονίζεται. ρ = 0,02 ή ρ = 0.0006, αντίστοιχα με Chi-square τεστ.

Η

Όταν αναλύθηκαν σε ανθρώπινους ιστούς (Σχήμα 6Β), Sox2 εμφανίζεται εξαιρετικά ετερογενείς επίπεδα έκφρασης ειδικά σε προστάτη ιστούς που κυμαίνεται από 0% έως το 70% των θετικών πυρήνων (Σχήμα 1 C). Αντίθετα, το PIN ή BPH βλάβες παρουσίασαν ανοσολογική υψηλής Sox2 στα βασικά μυοεπιθηλιακά κύτταρα (δεν σκόραρε), ενώ τα επιθηλιακά διαμερίσματα τους εμφανίζεται χαμηλό επίπεδο Sox2 (≤10%? Sox2 βαθμολογία = 1? Σχήμα 1Γ). Όπως τεκμηριώνεται προηγουμένως [31,36,38], ανοσοαντιδραστικότητα για Sox2 ήταν ανατομικά περιορίζεται στην μυοεπιθηλιακά /βασικά κύτταρα σε μη νεοπλασματικά αδένες. Αντίθετα, αυτό το πρότυπο ήταν σταδιακά χάνεται στα δείγματα ΡΙΝ και του προστάτη. Πράγματι Sox2 έκφραση σε περισσότερο από το 10% των πυρήνων (βαθμολογίες Sox2 2 και 3) ήταν ένα χαρακτηριστικό της προστάτη σε σύγκριση με PIN ή δείγματα ΒΡΗ (ρ = 0,02 με Chi-square test). Σύμφωνα με αυτό το αποτέλεσμα, υψηλότερες βαθμολογίες Sox2 ήταν πιο συχνά σε προστάτη ιστούς των ασθενών που εμφάνισαν βιοχημική υποτροπή (p = 0,0006 από Chi-square test? Σχήμα 6D). Πράγματι, η πλειονότητα των Sox2 αρνητικών PCa (59 από 68, 87%) δεν παρουσίασαν βιοχημική υποτροπή αντίθετο προς PCA με Sox2 σε περισσότερες από 10% των κυττάρων (1 από 6, 0,17%? Σχήμα 6D)

Όχι άλλες κλινικές μεταβλητές που εξετάσθηκαν συσχετίστηκε σημαντικά με Sox2 έκφρασης.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε δείξει ότι η απώλεια του miR-34b συνδέεται με την εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη, και μπορεί με ακρίβεια διάκριση μεταξύ της καλοήθους υπερπλασίας και βλάβες PIN ή διεισδύοντας αδενοκαρκίνωμα του προστάτη στους ανθρώπους. Μηχανιστικά, αυτή η οδός αντανακλά επιγενετική αποσιώπηση και αντίγραφο του DNA απώλεια αριθμό του τόπου MIR34B /C στο χρωμόσωμα 11, με αποτέλεσμα την απορρύθμιση της έκφρασής του προς τα κάτω στόχος βλαστική ικανότητα, Sox2 στη ΣΕΣΣ. Είναι σημαντικό, απελευθερωμένη σηματοδότησης miR-34b φαίνεται να διαχωρίσουν επιλεκτικά με τα κύτταρα του προστάτη εξαρτώμενων από ανδρογόνα, προτείνοντας ένα πιθανό ρόλο αυτής της οδού σε υποτροπή της νόσου και ενδεχομένως κατά τη μετάβαση στην ευνουχίσει ανθεκτικά στάδιο.

Η οικογένεια miR-34 του miRNAs έχει προηγουμένως αναφερθεί για την καταστολή της ογκογένεσης με διαφορετικούς μηχανισμούς, συμπεριλαμβανομένης της διαμόρφωσης των μεταβάσεων κυτταρικού κύκλου, EMT, μετάσταση, ή βλαστική ικανότητα καρκίνος [33].