Αφηρημένο

Οι μεγάλες προκλήσεις που αντιμετωπίζουμε στη θεραπεία του καρκίνου με πακλιταξέλη (ΡΤΧ) είναι η αντίσταση των ναρκωτικών και σοβαρές παρενέργειες. Οι μαζικές προσπάθειες έχουν γίνει για να ξεπεραστούν αυτές οι κλινικές προκλήσεις συνδυάζοντας PTX με άλλα φάρμακα. Σε αυτή τη μελέτη, ανέφεραν την πρώτη προκλινικά δεδομένα ότι πραζικουαντέλη (PZQ), ένα αντι-παράσιτο παράγοντα, θα μπορούσε να ενισχύσει σημαντικά την αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της ΡΤΧ σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές, συμπεριλαμβανομένων ΡΤΧ ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές. Με βάση την τιμή του δείκτη συνδυασμού, αποδείξαμε ότι PZQ ενισχυμένη συνεργικά ΡΤΧ επαγόμενη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης. Η συν-θεραπεία PZQ και ΡΤΧ προκάλεσε επίσης σημαντική μιτωτική σύλληψη και ενεργοποιείται το αποπτωτικό καταρράκτη. Επιπλέον, σε συνδυασμό με την PZQ ΡΤΧ οδήγησε σε πιο έντονη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου σε σύγκριση με κάθε φάρμακο μόνο σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε τις πιθανές μηχανισμοί αυτής της συνεργιστικής αποτελεσματικότητα που προκαλείται από PZQ και ΡΤΧ, και βρήκαμε ότι η συν-θεραπεία των δύο φαρμάκων θα μπορούσε σημαντικά να μειώσει την έκφραση του αναστολέα φυλοσύνδετη πρωτεΐνης απόπτωσης (ΧΙΑΡ), ένα αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη . Τα δεδομένα μας απέδειξαν περαιτέρω ότι τα κάτω ρύθμιση ΧΙΑΡ ήταν απαραίτητη για την συνεργιστική αλληλεπίδραση μεταξύ PZQ και ΡΤΧ. Μαζί, αυτή η μελέτη προτείνει ότι ο συνδυασμός των PZQ και ΡΤΧ μπορεί να αντιπροσωπεύει μια νέα και αποτελεσματική αντικαρκινική στρατηγική για τη βελτιστοποίηση της θεραπείας ΡΤΧ

Παράθεση:. Wu ZH, Lu Mk, Χου LY, Λι Χ (2012) Πραζικουαντέλη συνεργιστικά Ενισχύει Η πακλιταξέλη αποτελεσματικότητα να εμποδίζουν τον καρκίνο ανάπτυξη των κυττάρων. PLoS ONE 7 (12): e51721. doi: 10.1371 /journal.pone.0051721

Επιμέλεια: Ιωσήφ Alan Bauer, Ίδρυμα Bauer Έρευνας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19 Ιουλίου του 2012? Αποδεκτές: 5, Νοέμβρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 12, Δεκεμβρίου του 2012

Copyright: © 2012 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα για την Προώθηση ταλέντα της βασικής επιστήμης, Κίνα (J1030626) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm)? Το Έργο Κλειδί της Fujian Επαρχιακό Προγράμματα για την Επιστήμη και την Τεχνολογία (2011Y0050)? και Η τεχνολογία Ίδρυμα Καινοτομίας της Επιστήμης και Τεχνολογίας του Προεδρείου της Xiamen, Κίνα (2011S0567). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

έγινε μια νέα τάση που στρέφονται ένα παλιό φάρμακο για νέες χρήσεις ειδικά για τη θεραπεία του καρκίνου, διότι αυτές συνήθως χρησιμοποιούνται παλαιά φάρμακα μπορεί να έχουν ένα κρυφό ταλέντο ή καλές προοπτικές στην αντιμετώπιση του καρκίνου. Το γεγονός είναι ότι όλα κατεργασία έχει γίνει ήδη, η οποία μας επιτρέπει να μετακινήσετε το φάρμακο στην κλινική πιο γρήγορα και να μειωθεί το κόστος για την ανάπτυξη φαρμάκων [1], [2]. Η έννοια της «νέες χρήσεις για παλιά φάρμακο» παρέχει έναν αποτελεσματικό τρόπο για να ξαναβρεί νέες χρήσεις για τα υπάρχοντα φάρμακα με γνωστή φαρμακοκινητική και προφίλ ασφάλειας. Ορισμένα επιτυχημένα παραδείγματα για αυτό το είδος της ανάπτυξης του καρκίνου του φαρμάκου είχαν προηγουμένως αναφερθεί όπως θαλιδομίδη [3], η βιταμίνη C [4] – [6], μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα (μη στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα) [7] – [11]. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι αρτεμισινίνη, ένα αντι-παράσιτο παράγοντα, και τα παράγωγά της, είχε βαθιά κυτταροτοξικότητα κατά των καρκινικών κυττάρων από διαφορετικούς όγκους [12] – [16], που παρέχει την ώθηση για την ανάπτυξη αντι-παράσιτο φαρμάκων σε αντικαρκινικά φάρμακα. Praziquantel (PZQ), ένα άλλο αντι-παράσιτο παράγοντα, έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη θεραπεία διαφόρων σχιστοσωμίαση με καλή αποτελεσματικότητα [17], [18]. Είναι ενδιαφέρον, αναφέρθηκε ότι PZQ μπορεί να ενισχύσει τις χυμικές και κυτταρικές ανοσολογικές αποκρίσεις του ξενιστή έναντι νόσων [19], [20]. Θα ήταν ενδιαφέρον να διερευνηθεί αν PZQ έχει αντικαρκινική δράση η οποία εξακολουθεί να είναι ασαφές μέχρι στιγμής.

Σε αυτή τη μελέτη, σκοτώνοντας δραστηριότητα PZQ σε καρκινικά κύτταρα αξιολογήθηκε με διαφορετικές αναλύσεις. Ερευνήσαμε επίσης τα αποτελέσματα της συνδυασμένης θεραπείας με PZQ και το συνήθως χρησιμοποιούμενο χημειοθεραπευτικό φάρμακο paclitaxel (ΡΤΧ). ΡΤΧ είναι μια σταθεροποίησης μικροσωληνίσκων παράγοντα ο οποίος μπορεί να προωθήσει τη σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων, με αποτέλεσμα την σύλληψη των κυττάρων σε G2 /M φάση του κυτταρικού κύκλου και οδηγούν σε απόπτωση [21], [22]. Ως ένα από τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα αντικαρκινικά φάρμακα, ΡΤΧ έχει επιδείξει ισχυρή αποτελεσματικότητα έναντι ευρέος φάσματος κακοηθειών, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, της κεφαλής και του τραχήλου, των ωοθηκών και μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, όπως επίσης και σάρκωμα Kaposi [23]. Ωστόσο, εμφάνιση των κλινικών αντίστασης και ευρύ φάσμα σοβαρών παρενεργειών παραμένουν σημαντικά προβλήματα με τη θεραπεία PTX [24] – [26]. Κατά συνέπεια, πολλές πρόσφατες μελέτες επικεντρώθηκαν στην συνεργική θεραπεία PTX με στόχο να βρεθεί μια αποτελεσματική λύση για την αντιμετώπιση ΡΤΧ ανθεκτικά πρόβλημα και τη μείωση της τοξικότητας που προκαλείται από ΡΤΧ, χωρίς να διακυβεύεται η αποτελεσματικότητα του φαρμάκου [27], [28].

Εδώ, αναφέραμε ότι PZQ μπορούσε συνεργικά ενισχύουν την ανάπτυξη-ανασταλτική δράση του ΡΤΧ σε μια ποικιλία κυτταρικών σειρών καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των ΡΤΧ ανθεκτικές κυτταρικές σειρές όπως DLD1 και Η1299, αν και θεραπεία PZQ μόνη δεν ασκούν κυτταροτοξικότητα σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα. PZQ θα μπορούσε επίσης να ενισχύσει σημαντικά ΡΤΧ επαγόμενη σύλληψη μιτωτική και απόπτωση. Σε περαιτέρω μελέτες, δείξαμε ότι αυτή η κυτταροτοξική συνέργεια μεταξύ PZQ και ΡΤΧ εμπλέκονται κάτω ρύθμιση του ΧΙΑΡ. Η ικανότητα των PZQ να ενισχύουν τις αντικαρκινικές επιδράσεις του ΡΤΧ επιβεβαιώθηκε στη συνέχεια σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Τα αποτελέσματα αυτά παρέχονται σημαντικές συνέπειες για τη βελτιστοποίηση της θεραπείας ΡΤΧ. Συνδυάζοντας PZQ με ΡΤΧ μπορεί να αντιπροσωπεύει μία νέα και αποτελεσματική αντικαρκινική στρατηγική.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές Κυττάρων και Cell Culture

ανθρώπινου κόλον κυτταρική σειρά καρκίνου DLD-1, καρκίνος του μαστού κυτταρική σειρά ZR-7530, καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικές σειρές SPC-α-1 και Ltep-α-2 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640. Human μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα κυτταρική γραμμή Η1299, του τραχήλου της μήτρας κυτταρική σειρά καρκίνου HeLa και ανθρώπινου μαστού καρκινική κυτταρική γραμμή Bcap37 διατηρήθηκαν σε DMEM. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (GIBCO, Carlsbad, CA), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 mg /mL στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2. Όλες οι κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από την Τράπεζα Κυττάρων της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Οι κυτταρικές σειρές ήταν απαλλαγμένα από μυκόπλασμα όταν δοκιμάζεται με δοκιμή που βασίζεται σε PCR Mycoplasma [29], [30].

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Paclitaxel (ΡΤΧ), ροσκοβιτίνη, το πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι Bim, Puma, και ο μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (mAb) έναντι β-ακτίνης ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). Praziquantel (PZQ) παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Ιούνιο Lu (Nanjing Φαρμακευτικές συν το εργοστάσιο., LTD, Nanjing, Κίνα). MG132 ήταν από την Calbiochem (Darmstadt, Γερμανία). Το πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι διασπασμένο πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP? Ρ89) και φωσφο-ιστόνης Η3 (Ser-10) (Ρ-Η3) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Το πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι Noxa, bax, Bak, κασπάσης-3, Survivin, Bcl-2, και Bcl-X

L ήταν από την Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Το mAb ποντικού έναντι ΧΙΑΡ ήταν από BD Transduction Laboratories (San Diego, CA). δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση κατσίκας αντι-κουνελιού και τις αίγες χρένο αντι-ποντικού αγοράστηκαν από την Pierce Biotechnology (Rockford, IL).

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με 3- (4 , 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, 5-διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο (ΜΤΤ). Κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων επωάστηκαν με υποδεικνύεται φάρμακα στους 37 ° C για διαφορετικές χρονικές περιόδους. Στη συνέχεια, το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε και μέσο που περιέχει ΜΤΤ (0,5 mg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες επωάστηκαν για επιπλέον 2-4 ώρες σε CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C. Οι κρύσταλλοι φορμαζάνης διαλύθηκαν σε 100% DMSO και η απορρόφηση στα 570 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών. Κάθε δείγμα μετρήθηκε εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Το σχετικό ποσοστό επιβίωσης υπολογίστηκε διαιρώντας την απορρόφηση των κατεργασμένων κυττάρων από εκείνη του μάρτυρα σε κάθε πείραμα. ΡΤΧ και PZQ σαν απλούς παράγοντες και σε συνδυασμό στις υψηλότερες συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται στα πειράματα που αναφέρθηκαν δεν παρεμβαίνουν με τα αντιδραστήρια δοκιμασίας ΜΤΤ σε πειράματα ελέγχου μας (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

Κυττάρων CycleAnalysis

Για την ανάλυση του περιεχομένου του DNA και του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν μία φορά με PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη στους 4 ° C όλη τη νύχτα. Κατά τον χρόνο για ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και επανα-εναιωρήθηκαν σε διάλυμα χρώσης (100 μg /mL RNase και 100 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου σε PBS). Αφού τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι, η κατανομή του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε από μια ροή Coulter EPICS XL κυτταρόμετρο (Beckman Coulter, Miami, FL).

Ανάλυση Western Blot

ανάλυση κηλίδος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Εν συντομία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 20 mM Tris-HCl (ρΗ = 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton-Χ 100, 1 mM φαινυλομεθανοσουλφονυλο φθορίδιο, 10 μg /mL λευπεπτίνη, 2 μg /mL απροτινίνη, 10 mM NaF, 1 mM Na

3νο

4, και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη χρήση του (BCA) δοκιμασία δικινχονινικού οξέος. Cellular πρωτεΐνες υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου-δωδεκυλ νάτριο και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore, Bedford, ΜΑ). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με TBS-Tween 20 (0,5%) που περιέχει 5% άπαχο γάλα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Μετά από τρεις πλύσεις με TBS-Tween 20, οι μεμβράνες επωάστηκαν με αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού ή συζευγμένο με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα κατσίκας χρένου αντι-ποντικού για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι μεμβράνες πλύθηκαν με TBS-Tween 20 και πάλι και αναπτύσσονται με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Pierce, Rockford, IL). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα πρωτογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:1000, εκτός για αντι-β-ακτίνης, το οποίο χρησιμοποιήθηκε σε μια αραίωση 1:5000. Τα συζευγμένα με υπεροξειδάση δευτερογενή αντισώματα αντι-κουνελιού ή κρένου αντι-ποντικού χρησιμοποιήθηκαν σε αραίωση 1:5000.

DAPI χρώση

Μετά την φαρμακευτική αγωγή, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 3,7% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, στη συνέχεια επωάζεται με το διάλυμα χρώσης (0.3% Triton-X 100 και 1 μg /mL σε PBS ϋΑΡΙ) για 5 λεπτά αποφεύγοντας φως σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα εξετάστηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon). Τα κύτταρα που έχουν κατακερματισμένη και ομοιόμορφα συνοπτικές πυρήνες θεωρήθηκαν ως αποπτωτικά κύτταρα, και η απόπτωση εκφράστηκε ως ποσοστό υπολογίζεται από τον αριθμό των κυττάρων με πυρηνική αποπτωτική μορφολογία διαιρούμενο με το συνολικό αριθμό των κυττάρων που εξετάστηκαν.

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 1.5 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο και εκτέθηκαν σε φαρμακευτική αγωγή. Μετά από 10 ημέρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες (0.5% κρυσταλλικό ιώδες και 20% μεθανόλη) για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, οι πλάκες πλύθηκαν με αποσταγμένο νερό και φωτογραφήθηκε. Αποικίες που περιείχαν περισσότερο από 50 κύτταρα μετρήθηκαν. Οι τιμές για κάθε κατάσταση εκφράστηκαν ως ποσοστό σε σχέση με ελέγχους που δέχτηκαν φορέα. Κάθε συνθήκη δοκιμασία πραγματοποιήθηκε σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα.

ανοσοφθορισμού χρώσης

Τα κύτταρα σε καλυπτρίδες στερεώθηκαν σε 4% παραφορμαλδεϋδη σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά, πλύθηκαν με PBS, κατέστησαν διαπερατά με 0.2% Triton-X100 σε PBS για 10 λεπτά, και στη συνέχεια αποκλείστηκαν με 3% αλβουμίνη βόειου ορού σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Αντι-φωσφο-ιστόνης Η3 (Ser-10) (Ρ-Η3) αντίσωμα (αραίωση 1:100) προστέθηκε και επωάστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από έκπλυση με PBS που περιέχει 0,02% Triton Χ-100 και 1.5% BSA, οι καλυπτρίδες επωάστηκαν με Alexa Fluor 647 αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (αραίωση 1:200) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, τα κύτταρα επωάστηκαν με 1 μg /ml σε PBS DAPI για 5 λεπτά πριν τοποθετηθεί σε 90% γλυκερόλη και σφραγισμένο με βερνίκι νυχιών. Μιτωτικός δείκτης εκφράστηκε ως ποσοστό της P-H3-θετικά κύτταρα σε σχέση με τον συνολικό αριθμό των κυττάρων που εξετάστηκαν.

πλασμίδια, Cell Επιμόλυνση και παρεμβολή RNA

Οι ΧΙΑΡ εκφράζει πλασμίδιο pcDNA3- myc-ΧΙΑΡ ήταν ένα δώρο από τον Dr. John C. Reed (The Institute Burnham, La Jolla, USA) και το άδειο pcDNA3 χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. διαμόλυνση κυττάρων διεξήχθη χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Για να knockdown ΧΙΑΡ, shRNA αλληλουχία στόχευσης ΧΙΑΡ (GTGGTAGTCCTGTTTCAGC) κλωνοποιήθηκε σε ένα φορέα λεντοϊού Lenti-Lox3.7 (pLL3 0.7). Μία αλληλουχία χωρίς αντίστοιχο τμήμα στο ανθρώπινο γονιδίωμα (GATCATGTAGATACGCTCA) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Για την παραγωγή των μολυσματικών shRNA εκφράζουν φακοϊούς, 293 κύτταρα Τ επιμολύνθηκαν με pLL3.7 λεντοϊού διάνυσμα μαζί με φορείς συσκευασιών pVSV-G, pRSV-Rev και pMDL gag /pol RRE. 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, ο ιός που περιέχει το υπερκείμενο μέσων συλλέχθηκαν, πέρασε μέσω ενός φίλτρου 0.45 μπι και χρησιμοποιήθηκε για μολυσμένα κύτταρα μετά την προσθήκη 10 μg /mL Polybrene.

σε πραγματικό χρόνο Reverse Transcription-PCR

το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πρώτου κλώνου cDNA συντέθηκε από το ολικό RNA χρησιμοποιώντας έναν εκκινητή ολιγο-άΤ και Moloney ποντικού ανάστροφης μεταγραφάσης ιού λευχαιμίας (Takara, Shiga, Japan). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε στο Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Mortlake, Αυστραλία) και SYBR πράσινο (ΒΙΟ-V, Xiamen, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε ως αντιδραστήριο ανίχνευσης. Οι αλληλουχίες εκκινητή για ΧΙΑΡ και αφυδρογονάση γλυκεραλδεϋδης-3-φωσφορικής (GAPDH) ήταν: ΧΙΑΡ (προς τα εμπρός: 5′-GACAGTATGCAAGATGAGTCAAGTCA-3 ‘? Αντίστροφος: 5′-GCAAAGCTTCTCCTCTTGCAG-3′), GAPDH (προς τα εμπρός: 5′-CCACCCATGGCAAATTCC-3 «? αντίστροφη: 5’-TGGGATTTCCATTGATGACAAG-3 ‘). Κάθε δείγμα εις τριπλούν. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό σειρά Rotor-Gene 6000 1.7 (Corbett Research, Mortlake, Αυστραλία). Οι σχετικές ποσότητες RNA ομαλοποιήθηκαν σε GAPDH mRNA.

Ξενομοσχεύματος και Θεραπεία Διαδικασίες

Όλες οι διαδικασίες ζώων είχαν εγκριθεί από την Επιτροπή Φροντίδας Ζώων και Χρήση του Πανεπιστημίου Xiamen. Κύτταρα όγκου (DLD-1, 2 × 10

6) ενέθηκαν υποδορίως σε αθυμικά γυμνά ποντίκια (BALB /c, ηλικίας 4-5 εβδομάδων). Όταν ο όγκος του όγκου έφθασε 25-35 mm

3, τα ζώα τυχαιοποιήθηκαν και κατατάσσονται σε διάφορες ομάδες θεραπείας (η = 6 σε κάθε ομάδα). Τα ζώα ενέθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με PZQ μόνο (100 mg /kg), ΡΤΧ μόνο (30 mg /kg), ή συνδυασμός των PZQ (100 mg /kg) και ΡΤΧ (30 mg /kg). ΡΤΧ διαλύθηκε σε ίσους όγκους Cremophor EL και αιθανόλης, και περαιτέρω αραιώνεται με PBS πριν από την ένεση. ΡΤΧ δόθηκε στις ημέρες 5, 9, και 13 μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων. PZQ διαλύεται σε αραβοσιτέλαιο δόθηκε την ημέρα 5, 7, 9, 11, και 13 μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων. Για τη θεραπεία μονού παράγοντα, όχημα δόθηκε στη θέση του PZQ ή ΡΤΧ με το ίδιο χρονοδιάγραμμα. Το μέγεθος του όγκου προσδιορίστηκε με χρήση δαγκάνες. Ο όγκος του όγκου (mm

3) υπολογίστηκε από τον τύπο: (α) Χ (b

2) × 0,5, όπου το α είναι το μήκος του όγκου και το b είναι το πλάτος του όγκου σε χιλιοστά

στατιστική ανάλυση.

οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM. Για να προσδιορίσετε σημαντικές διαφορές στα δεδομένα,

t

δοκιμή εφαρμόστηκε η δίπλευρη unpaired Student. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε Ρ & lt? 0.05. αλληλεπιδράσεις με άλλα φάρμακα εξετάστηκαν για συνέργεια ή ανταγωνισμού με τη χρήση διάμεση δόση Effect ανάλυση. (CalcuSyn? Biosoft, Ferguson, ΜΟ)

Αποτελέσματα

PZQ δεν ασκεί καμία κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα

Η κυτταροτοξικότητα PZQ επί διαφόρων κυττάρων όγκου εξετάστηκε πρώτα με καρκινικές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα (SPC-α-1, Ltep-α-2 και Η1299), κύτταρα καρκίνου του μαστού (Bcap37 και ZR7530), κύτταρα κολπικού καρκινώματος (HeLa ) και καρκίνου του κόλον κύτταρα (DLD-1). Ωστόσο, PZQ επαγόμενη ούτε αναστολή ανάπτυξης ούτε την απόπτωση, ακόμη και σε συγκεντρώσεις τόσο υψηλές όσο 100 μΜ (Εικ. S1), υποδεικνύοντας ότι PZQ δεν ασκούν καμία κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα όγκου.

Το Co-θεραπεία του PZQ και ΡΤΧ Συνεργιστικά Αναστέλλει Tumor Growth κυττάρων

επόμενο αξιολογηθεί αν PZQ θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, όπως η πακλιταξέλη (ΡΤΧ) με δοκιμασία ΜΤΤ. Βρήκαμε ότι PZQ βελτιωθεί σημαντικά η αναστολή της ανάπτυξης από ΡΤΧ σε διάφορες κυτταρικές σειρές όγκων συμπεριλαμβανομένων δύο ΡΤΧ ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές, DLD-1 και Η1299 (Σχ. 1Α, το Σχ. S2). Κάναμε περισσότερα από ακόλουθα πειράματα μας με αυτές τις δύο ΡΤΧ ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές. Να αποκτήσουν περαιτέρω διορατικότητα σε αυτό το αποτέλεσμα συνδυασμού, μελέτες δόσης-απόκρισης διεξήχθησαν όπως έδειξε στο Σχ. 1Β. PZQ θα μπορούσε να ενισχύσει την ευαισθησία των κυττάρων DLD-1 προς ΡΤΧ σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του ΡΤΧ και PZQ. δοκιμασία σχηματισμού αποικίας έδειξε επίσης ότι ο συνδυασμός PZQ και ΡΤΧ αξιοσημείωτα κατέστειλε τον σχηματισμό αποικίας σε σχέση είτε με αγωγή με τον παράγοντα μόνο (Σχ. 1 C). ανάλυση διάμεση δόση αποτέλεσμα ήταν χρησιμοποιείται για να χαρακτηρίσει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ PZQ και PTX σε σχέση με υποχωρεί βιωσιμότητα των κυττάρων. Συνδυασμός τιμές δείκτη & lt? 1,0, που προέρχεται από την επίδραση μιας σειράς συγκεντρώσεων PZQ και ΡΤΧ στην DLD-1 και Η1299 κυτταρικές σειρές, έδειξε μία συνεργική δράση μεταξύ PZQ και ΡΤΧ

(Α (Σχήμα 1D).. ) Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ μετά από διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PZQ μόνο, ΡΤΧ μόνο ή σε συνδυασμό των δύο φαρμάκων σε συγκεντρώσεις και χρονικά σημεία όπως υποδεικνύεται παρακάτω: HeLa, ZR7530, DLD-1 και Η1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΜ PZQ μόνο, 10 ηΜ ΡΤΧ μόνο, ή σε συνδυασμό και οι δύο για 48 ώρες? Bcap37 και τα κύτταρα SPC-Α-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 30 μΜ PZQ, 5 ηΜ ΡΤΧ μόνο, ή και τα δύο για 48 ώρες? Ltep-α-2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο με 30 μΜ PZQ, 5 ηΜ ΡΤΧ μόνο, ή και τα δύο για 60 ώρες. (Β) DLD-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ΡΤΧ απουσία ή παρουσία 20 ή 40 μΜ PZQ για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε στη συνέχεια με δοκιμασία ΜΤΤ. (C) DLD-1 και Η1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΜ PZQ μόνο, 10 ηΜ ΡΤΧ μόνο ή τον συνδυασμό για 10 ημέρες. Οι αποικίες στη συνέχεια χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν. (D) DLD-1 και Η1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις PZQ και ΡΤΧ σε σταθερή αναλογία (2000:1) για 48 ώρες. Μετά βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε σε κάθε κατάσταση, ο δείκτης συνδυασμού (CI) υπολογίστηκε όπως περιγράφεται στο τιμές CI «Υλικά και Μέθοδοι». & Lt? 1,0 υποδεικνύουν μια συνεργική αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο φαρμάκων. Όλες οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα.

Η

αποτέλεσμα του συνδυασμού των PZQ και ΡΤΧ στην απόπτωση επαγωγή

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ενίσχυση της ΡΤΧ-κυτταρικό θάνατο που επάγεται από PZQ, αναλύσαμε εκχυλίσματα κυττάρων για την έκφραση αποπτωτικών δεικτών όπως πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP) διάσπαση. Ο συνδυασμός είχε ως αποτέλεσμα σημαντική διάσπαση της PARP σε μία ποικιλία διαφορετικών κυτταρικών σειρών, ενώ η χορήγηση του PZQ ή ΡΤΧ μόνα όχι (Σχ. 2Α), υποδεικνύοντας σημαντική ενεργοποίηση του αποπτωτικού καταρράκτη με αυτό το συνδυασμό. Επιπλέον, το ποσοστό του πληθυσμού υπο-G1 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, σε σύγκριση με τη θεραπεία με κάθε παράγοντα ξεχωριστά, ο συν-θεραπεία του PZQ με ΡΤΧ αυξηθεί σημαντικά τη συσσώρευση των κυττάρων στη φάση υπο-G1. Επιβεβαιώσαμε επίσης αυτά τα αποτελέσματα με πυρηνική χρώση με ϋΑΡΙ, μια εναλλακτική δοκιμασία κυτταρικής απόπτωσης. Το ποσοστό των κυττάρων με αποπτωτικών πυρήνων ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ομάδα συνδυασμού από ό, τι στην ομάδα μονό-θεραπείας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια εξετάσαμε τη συμβολή των κασπασών στην απόπτωση που επάγεται από την συν-επεξεργασία των PZQ και ΡΤΧ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2C, κασπάσης 3 διάσπαση ενεργοποίησης και PARP δεσμεύτηκαν με την ευρέως φάσματος αναστολέας κασπάσης-ίτηκ. Η θεραπεία με-ίτηκ επίσης μπλοκάρει σημαντικά την απόπτωση που επάγεται από την συν-επεξεργασία των PZQ και ΡΤΧ (Σχ. 2D). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι κυτταρικής απόπτωσης που επάγεται από την συν-επεξεργασία των ΡΤΧ και PZQ εξαρτάται από δραστικότητα κασπάσης.

(Α) Τα αναφερόμενα κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο Σχ. 1Α, και η απόπτωση εξετάστηκε με ανάλυση Western του διασπασμένου PARP (άρθρο-PARP) επίπεδο. (Β) DLD-1 και Η1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο με 20 μΜ PZQ, 10 ηΜ ΡΤΧ μόνο ή τον συνδυασμό για 48 ώρες. Στη συνέχεια, κλάσμα υπο-G1 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. (C) DLD-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 μΜ PZQ και 10 ηΜ ΡΤΧ απουσία ή παρουσία 20 μΜ αναστολέα κασπάσης-ίτηκ για 48 ώρες, και η έκφραση της κασπάσης 3 και θρου-PARP εξετάστηκαν με κηλίδα Western. (Δ) Μετά από κύτταρα DLD-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο Γ, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίστηκε με χρώση ϋΑΡΙ. Όλες οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα.

Η

Το Co-θεραπεία PZQ και ΡΤΧ θα μπορούσε να προκαλέσει μιτωτική αναστολή σε καρκινικά κύτταρα

Η κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει τα αποτελέσματα της PZQ και ΡΤΧ στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων του όγκου. Η συν-θεραπεία του PZQ και ΡΤΧ αυξημένη δοσοεξαρτώμενο την G2 /M πληθυσμού σε σύγκριση με τη θεραπεία ΡΤΧ μόνη της σε κύτταρα DLD-1 (Σχ. 3Α). Για να διευκρινιστεί το προφίλ του G2 /M-συσσωρευμένων κυττάρων που επάγεται από τον συνδυασμό, εξετάσαμε μιτωτικό δείκτη σε DLD-1 κύτταρα κατεργασμένα με ΡΤΧ απουσία ή παρουσία PZQ. Όπως ήταν αναμενόμενο, η θεραπεία ΡΤΧ μόνος δοσοεξαρτώμενο αυξημένο μιτωτικό δείκτη (Σχ. 3Β). ΡΤΧ σε συνδυασμό με PZQ οδήγησε περαιτέρω σε μια αύξηση στο μιτωτικό δείκτη (Σχ. 3Β). Βρήκαμε επίσης ότι θα μπορούσε να προωθήσει PZQ δραματικά ΡΤΧ μεσολάβηση αύξηση στο επίπεδο έκφρασης της φωσφορυλιωμένης ιστόνης Η3 (Ser-10) (Ρ-Η3), ένας μιτωτικός δείκτης (Σχ. 3C). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι PZQ ενισχυμένη ΡΤΧ επαγόμενη μιτωτική σύλληψη σε καρκινικά κύτταρα.

(Α) DLD-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 ηΜ ή 20 ηΜ ΡΤΧ απουσία ή παρουσία 20 μΜ PZQ για 12 ώρες, και του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Μετά DLD-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως ανωτέρω, μιτωτικός δείκτης προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι» (Β), και το επίπεδο έκφρασης της φωσφο-ιστόνης Η3 (Ser-10) (Ρ-Η3) παρακολουθήθηκε με κηλίδα Western ( ΝΤΟ). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα.

Η

ένα πείραμα χρονικής πορείας βασίζεται στην κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι η αύξηση της G2 /M του πληθυσμού προηγείται εκείνο του πληθυσμού υπο-G1 σε DLD-1 κύτταρα αγωγή με το συνδυασμό των PZQ και ΡΤΧ (Σχ. 4Α), υποδεικνύοντας επίμονη G2 /M σύλληψη πιθανώς οδήγησε σε απόπτωση. Στη συνέχεια εξετάστηκε κατά πόσον υπήρχε συσχέτιση μεταξύ μιτωτική σύλληψη και την απόπτωση που προκαλείται από την συν-επεξεργασία των PZQ και ΡΤΧ. Ένας αναστολέας της CDK, ροσκοβιτίνης, χρησιμοποιήθηκε. Η ροσκοβιτίνη μπορούσε επιλεκτικά αναστέλλουν CDK1, CDK2 και CDK5 και την πρόοδο του κύκλου των κυττάρων μπλοκ εμποδίζοντας τα κύτταρα από την εισαγωγή των S και Μ φάσεις [32]. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, ανέστειλε ροσκοβιτίνη σχεδόν εντελώς την G2 /M σύλληψης που προκαλείται από την συν-επεξεργασία των PZQ και ΡΤΧ σε κύτταρα DLD-1. Η αύξηση του μιτωτικός δείκτης προέκυψε από την συν-επεξεργασία των PZQ και ΡΤΧ επίσης επέστρεψε στο επίπεδο ελέγχου μετά την προσθήκη της ροσκοβιτίνης (Εικ. 4C), υποδεικνύοντας ότι η ροσκοβιτίνη ανέστειλαν την μιτωτική σύλληψη που προκαλείται από το συνδυασμό αυτό. Εντυπωσιακά, η ροσκοβιτίνη ανέστειλαν επίσης PZQ ενισχυμένη ΡΤΧ-μεσολαβούμενη απόπτωση σχεδόν εντελώς, όπως προσδιορίζεται με αποπτωτικά πληθυσμός sub-G1 και ανάλυση Western της διασπασμένης ΡΑΚΡ (Εικ. 4D και Ε). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με Η1299 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αυξημένη απόπτωση που επάγεται από την συν-επεξεργασία των PZQ και ΡΤΧ πιθανόν προέκυψε από την αυξημένη σύλληψη μιτωτική που προκαλείται από αυτό το συν-θεραπείας.

(Α) Μετά από κύτταρα DLD-1 ήταν συν-επεξεργασία με 20 μΜ PZQ και 10 ηΜ ΡΤΧ για δεικνυόμενα χρονικά σημεία, τα G2 /M και Sub-G1 κλάσματα προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. (Β) DLD-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα συνδυασμό PZQ (20 μΜ) και ΡΤΧ (10 ηΜ) με ή χωρίς 12.5 μΜ ροσκοβιτίνη για 12 ώρες, και στη συνέχεια κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. κύτταρα (C) DLD-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο (Β), και μιτωτικός δείκτης προσδιορίστηκε. Μετά DLD-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα συνδυασμό PZQ (20 μΜ) και ΡΤΧ (10 ηΜ) σε παρουσία ή απουσία 12.5 μΜ ροσκοβιτίνης για 48 ώρες, η απόπτωση εκτιμήθηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του πληθυσμού υπο-G1 (D) και Western ανάλυση του επιπέδου θρου-PARP (Ε). Όλες οι τιμές που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα.

Η

Το Co-θεραπεία PZQ και ΡΤΧ θα μπορούσε να ρυθμίζουν προς τα κάτω ΧΙΑΡ Πρωτεΐνη

Για να αξιολογεί τον υποκείμενο μηχανισμό της συνεργιστική κυτταροτοξικότητα μεταξύ PZQ και ΡΤΧ, αξιολογήσαμε τα αποτελέσματα των δύο παραγόντων, είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό, σε διάφορες απόπτωση ρυθμιστικών πρωτεϊνών σε κύτταρα DLD-1. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Α, η θεραπεία με PZQ ή ΡΤΧ μόνο δεν μετέβαλε την έκφραση του ΧΙΑΡ. Ωστόσο, έκθεση των κυττάρων στον συνδυασμό PZQ και ΡΤΧ οδήγησε σε αξιοσημείωτη μείωση στο επίπεδο του ΧΙΑΡ. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές στην έκφραση των άλλων πρωτεϊνών, όπως Bcl-X

L, επιζών, Puma, Bim, Noxa, Βαχ και Bak, παρατηρήθηκαν σε κύτταρα που εκτίθενται σε ΡΤΧ μόνο, PZQ μόνο ή το συνδυασμό.

(Α) DLD-1 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο με 20 μΜ PZQ, 10 ηΜ ΡΤΧ μόνο ή τον συνδυασμό για 24 ώρες. Στη συνέχεια, η έκφραση του Bcl-XL, Bcl-2, Survivin, ΧΙΑΡ, Bim, Puma, Noxa, Βαχ και Bak παρακολουθήθηκαν με κηλίδα Western. (Β) μετά από έκθεση των κυττάρων DLD-1 σε ένα συνδυασμό 20 μΜ PZQ και 10 ηΜ ΡΤΧ σε παρουσία ή απουσία 20 μΜ-ίτηκ για 24 ώρες, η έκφραση του ΧΙΑΡ προσδιορίστηκε με στύπωμα Western. (Γ) Η1299 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μόνο με 20 μΜ PZQ, 10 ηΜ ΡΤΧ μόνο ή τον συνδυασμό για 24 ώρες, μετά τις οποίες η έκφραση του ΧΙΑΡ εξετάστηκε. (Δ) Μετά από κύτταρα DLD-1 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως στο (Α), ολικό RNA απομονώθηκε και ΧΙΑΡ mRNA ποσοτικοποιήθηκε με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Μετά την κανονικοποίηση προς GAPDH mRNA, οι τιμές έκφρασης ΧΙΑΡ mRNA για κάθε κατάσταση ήταν σε σχέση με κύτταρα μάρτυρες υποστεί αγωγή με έκδοχο. κύτταρα (Ε) DLD-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα συνδυασμό 20 μΜ PZQ και 10 ηΜ ΡΤΧ απουσία ή παρουσία 10 μΜ MG132 για 24 ώρες και στη συνέχεια έκφραση του ΧΙΑΡ παρακολουθήθηκε με κηλίδα Western. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα.

Η

Για να προσδιοριστεί αν οι αλλαγές στην έκφραση του ΧΙΑΡ εξαρτώνται από την ενεργοποίηση της κασπάσης, υποβάλλαμε σε αγωγή DLD-1 κυττάρων με το συνδυασμό φαρμάκου παρουσία ή απουσία του αναστολέα της κασπάσης-ίτηκ. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5Β,-ίτηκ είχε μικρή επίδραση στην προς τα κάτω ρύθμιση των ΧΙΑΡ που προκαλείται από το συνδυασμό του PZQ και ΡΤΧ, υποδεικνύοντας ότι οι μεταβολές στην έκφραση του ΧΙΑΡ ήταν κασπάσης-ανεξάρτητη. Κάτω ρύθμιση των ΧΙΑΡ παρατηρήθηκε επίσης σε Η1299 κύτταρα συν-επεξεργασία με PZQ και ΡΤΧ (Εικ. 5C), γεγονός που υποδηλώνει ότι η διαμόρφωση της πρωτεΐνης αυτής μπορεί να μην είναι κυτταρική σειρά ειδικών.

Προσπαθήσαμε να προσδιοριστεί ο μηχανισμός με η οποία ΧΙΑΡ ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε απάντηση της από κοινού αντιμετώπιση των PZQ και ΡΤΧ. Για να διερευνηθεί κατά πόσο ο συν-θεραπεία PZQ και ΡΤΧ θα μπορούσε να ρυθμίζουν την έκφραση ΧΙΑΡ στο μεταγραφικό επίπεδο, χρησιμοποιήσαμε την αντίστροφη μεταγραφή-PCR. Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, σε συνδυασμό με θεραπεία PZQ και ΡΤΧ δεν οδήγησε σε σημαντική μεταβολή στα επίπεδα mRNA του ΧΙΑΡ (Σχ. 5D).

Μια άλλη πιθανή εξήγηση για ΧΙΑΡ κάτω ρύθμιση θα μπορούσε να αποικοδόμηση του ΧΙΑΡ με η πρωτεασώματος. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε κατεργασμένα κύτταρα DLD-1 με τον συνδυασμό φαρμάκου παρουσία ενός αναστολέα πρωτεασώματος, MG132. Καταστολή της ΧΙΑΡ σε DLD-1 κύτταρα κατεργασμένα με τον συνδυασμό PZQ και ΡΤΧ ήταν σχεδόν πλήρως καταργηθεί με MG132 (Σχ. 5Ε). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι PZQ και PTX θα μπορούσε να προκαλέσει υποβάθμιση ΧΙΑΡ μέσω του πρωτεασώματος με τη μεσολάβηση της οδού.

ΧΙΑΡ Παίζει σημαντικό ρόλο στην Synergistic κυτταροτοξικότητα της PZQ και ΡΤΧ

Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα, διερεύνησε κατά πόσο ρύθμιση προς τα κάτω του ΧΙΑΡ πράγματι διαμεσολαβείται κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από το συνδυασμό των PZQ και ΡΤΧ. Εμείς παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα DLD-1 με ένα πλασμίδιο που περιέχει επισύναψη επιτόπου ΧΙΑΡ (myc-ΧΙΑΡ) και ένα άδειο πλασμίδιο που χρησίμευσε ως μάρτυρας. Η διαμόλυνση επιβεβαιώθηκε με Western blot (Εικ. 6Α). Η υπερέκφραση του ΧΙΑΡ σε κύτταρα DLD-1 σημαντικά εξασθενημένο PZQ ενισχυμένη ΡΤΧ επαγόμενη κυτταροτοξικότητα, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση της βιωσιμότητας των κυττάρων και του πληθυσμού υπο-G1 (Σχ. 6Β και C).

(Α) κηλίδας Western έδειξε έκφραση ΧΙΑΡ σε κύτταρα DLD-1 στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με pcDNA3-myc-ΧΙΑΡ ή φορέα ελέγχου. (Β) 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με pcDNA3-myc-ΧΙΑΡ και του φορέα ελέγχου, τα κύτταρα DLD-1 υποβλήθηκαν σε αγωγή μόνο με 20 μΜ PZQ, 10 ηΜ ΡΤΧ μόνα ή τον συνδυασμό για 48 ώρες, και στη συνέχεια η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. (C) 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με pcDNA3-myc-ΧΙΑΡ και του φορέα ελέγχου, τα κύτταρα DLD-1 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα συνδυασμό 20 μΜ PZQ και 10 ηΜ ΡΤΧ. Στη συνέχεια, το κλάσμα υπο-G1 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. (D) DLD-1 κύτταρα μολύνθηκαν με ένα φακοϊό ελέγχου κωδικοποιεί shRNA ή ΧΙΑΡ shRNA για 48 ώρες, και η έκφραση του ΧΙΑΡ αναλύθηκε με στύπωμα Western. (Ε) DLD-1 κύτταρα μολύνθηκαν με ένα φακοϊό ελέγχου κωδικοποιεί shRNA ή ΧΙΑΡ shRNA για 48 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 20 μΜ και μόνο PZQ, 10 ηΜ ΡΤΧ μόνα ή συνδυασμού για 48 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Όλες οι τιμές που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τρία ξεχωριστά πειράματα.

Η

Για να μελετήσει περαιτέρω το ρόλο της ΧΙΑΡ στη συνέργεια μεταξύ PZQ και PTX, χρησιμοποιήσαμε φακοϊό μεσολάβηση μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) σε νοκ ντάουν ΧΙΑΡ σε κύτταρα DLD-1. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά τη μόλυνση, και η έκφραση ΧΙΑΡ αναλύθηκε με στύπωμα Western. Σε σύγκριση με DLD-1 κύτταρα μολυσμένα με τον έλεγχο shRNA, κύτταρα μολυσμένα με ΧΙΑΡ shRNA εμφάνισε καταστέλλεται δραματικά έκφρασης ΧΙΑΡ (Εικ. 6D). Είμαστε δίπλα αξιολόγησε την επίδραση της ΧΙΑΡ νοκ ντάουν στη βιωσιμότητα των κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Ε, μπλοκάροντας την έκφραση του ΧΙΑΡ δεν είχε καμία επίδραση επί της ευαισθησίας των κυττάρων DLD-1 σε θεραπεία PZQ. Ωστόσο, ΧΙΑΡ knockdown ευαισθητοποιημένα σημαντικά κύτταρα DLD-1 προς ΡΤΧ επαγόμενη κυτταροτοξικότητα (Σχ. 6Ε). Επιπλέον, η κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από την συν-επεξεργασία των PZQ και ΡΤΧ ενισχύθηκε επίσης σε κύτταρα DLD-1 ΧΙΑΡ-knockdown (Σχ. 6Ε). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ΧΙΑΡ διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση της συνεργιστικής κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από την συν-επεξεργασία των PZQ και ΡΤΧ.

Ο συνδυασμός των PZQ και ΡΤΧ καταστέλλει την ανάπτυξη όγκων

in vivo

για να ελέγξετε εάν η συν-θεραπεία PZQ και ΡΤΧ έχει καμία επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου

in vivo

, έχουμε δημιουργήσει ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια με ΡΤΧ-ανθεκτικά κύτταρα DLD-1. Υποδορίως κύτταρα DLD-1 οδήγησε σε εκθετικά αυξανόμενη όγκων σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς (Σχ. 7Α). Συνδυασμένη θεραπεία με PZQ και ΡΤΧ κατέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου σε σχέση με τη θεραπεία ΡΤΧ και μόνο, ενώ PZQ χορηγηθεί μόνη δεν ήταν σε θέση να αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου στους DLD-1 ποντίκια που φέρουν ξενομοσχεύματα (Σχ. 7Α και Β). Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η θεραπεία με συνδυασμό PZQ και ΡΤΧ οδήγησε σε & gt? 50% μείωση στο βάρος του όγκου (Σχήμα 7C)..