Αφηρημένο

Ιστορικό

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι με περίπου 1 εκατομμύριο περιπτώσεις, ο τρίτος πιο συχνός καρκίνος παγκοσμίως. Εκτεταμένη έρευνα βρίσκεται σε εξέλιξη για να αποκρυπτογραφήσει τα υποκείμενη γενετική μοτίβα με την ελπίδα να βελτιωθεί η έγκαιρη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου. Σε αυτή την κατεύθυνση, η πρόσφατη πρόοδος στις τεχνολογίες αλληλουχίας επόμενης γενιάς έχει ξεσηκώσει στον τομέα της γονιδιωματικής καρκίνου. Ωστόσο, ένα μειονέκτημα αυτών των μελετών παραμένει το μεγάλο ποσό των γενετικών παραλλαγών που προσδιορίζονται και την ερμηνεία τους.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εδώ παρουσιάζουμε το πρώτο έργο στο σύνολό exome NGS των πρωτογενών καρκίνων του παχέος εντέρου. Πραγματοποιήσαμε 454 ολόκληρο Pyrosequencing exome του όγκου καθώς και των παρακείμενων δεν επηρεάζονται φυσιολογικό κολονικό ιστό από μικροδορυφορική σταθερές (MSS) και μικροδορυφορικών ασταθείς ασθενείς (MSI) καρκίνο του παχέος εντέρου και εντοπίζονται πάνω από 50.000 μικρές παραλλαγές νουκλεοτιδίων για κάθε ιστό. Σύμφωνα με τις προβλέψεις που βασίζονται στις MSS και παθολογικούς μηχανισμούς MSI εντοπίσαμε οκτώ φορές περισσότερο σωματικά μη συνώνυμες παραλλαγές σε καρκίνους MSI σε σχέση με το MSS και ήμασταν σε θέση να αναπαράγει το αποτέλεσμα σε τέσσερις επιπλέον CRCs. βιοπληροφορική μας φιλτράρισμα προσέγγιση περιόρισε το ποσοστό των πιο σημαντικών μεταλλάξεις σε 359 για το MSI και 45 για MSS CRCs με προβλεπόμενη αλλάξει τις λειτουργίες των πρωτεϊνών. Σε αμφότερες τις CRCs, MSI και MSS, βρήκαμε σωματικές μεταλλάξεις στο ενδοκυτταρικό τομέα κινάσης του 1Α υποδοχέα μορφογενετικής πρωτεΐνης των οστών, BMPR1A, ένα γονίδιο όπου τα μέχρι στιγμής βλαστικής σειράς μεταλλάξεων που σχετίζονται με το σύνδρομο νεανική πολυποδίαση, και δείχνουν ότι οι μεταλλάξεις λειτουργικά βλάπτει τη λειτουργία της πρωτεΐνης .

Συμπεράσματα /Σημασία

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι με βαθιά αλληλουχίας των exomes όγκου μπορεί κανείς να είναι σε θέση να προβλέψει την κατάσταση μικροδορυφορικού της CRC και επιπλέον εντοπίσει δυνητικά κλινικά σχετικές μεταλλάξεις.

Παράθεση: Timmermann Β, Kerick Μ, Roehr C, Fischer Α, Isau Μ, Boerno ST, et al. (2010) σωματική μετάλλαξη προφίλ της MSI και MSS τον καρκίνο του παχέος εντέρου που προσδιορίζονται από Σύνολο exome Next Generation Sequencing και Βιοπληροφορική ανάλυση. PLoS ONE 5 (12): e15661. doi: 10.1371 /journal.pone.0015661

Συντάκτης: Amanda Ewart Toland, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο του Οχάιο Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 Αύγ 2010? Αποδεκτές: 19 του Νοέμβρη, 2010? Δημοσιεύθηκε: 22η Δεκεμβρίου 2010

Copyright: © 2010 Timmermann et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το γερμανικό Ομοσπονδιακό Υπουργείο Παιδείας και Έρευνας (01GS08105 «Mutanom,» 01GS08111 «Εντερική τροποποιητές») και το Max Planck Society. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί την τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου με περίπου 1 εκατομμύριο περιπτώσεις σε όλο τον κόσμο. Κατά τις τελευταίες δεκαετίες έχει γίνει σαφές ότι CRC εξελίσσεται μέσα από πολλαπλές οδούς και ότι αυτές οι οδοί μπορεί να οριστεί κατά προσέγγιση με βάση το μοριακό μοτίβα, όπως η ακεραιότητα του συστήματος επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων (MMR) ή μεταλλακτική και επιγενετικές μοτίβα. Ανεπάρκεια στην MMR αντανακλάται των μικροδορυφορικών αστάθεια (MSI), το οποίο έχει επίσης συσχετιστεί με την έκβαση της θεραπείας, αλλά η οποία πρέπει να αξιολογηθούν περαιτέρω σε επιπρόσθετες κλινικές μελέτες [1], [2], [3], [4], [ ,,,0],5], [6].

υψηλής απόδοσης μελέτες προσδιορισμού αλληλουχίας Sanger από την άλλη πλευρά έχουν δείξει ότι η συχνότητα μετάλλαξης των υποψήφιων γονιδίων του καρκίνου θα μπορούσε να είναι πολύ υψηλότερο από ό, τι αναμενόταν, και ότι ο συγκεκριμένος συνδυασμός των μεταλλάξεων θα μπορούσαν να επηρεάσουν το ιδιότητες του όγκου [7], [8], [9], [10], [11]. Με την ανάπτυξη των τεχνολογιών επόμενης γενιάς αλληλουχίας (NGS) η δυναμικότητα αλληλουχίας έχει αυξηθεί δραματικά και οι δαπάνες έχουν μειωθεί. Επιπλέον, και ιδιαίτερα σημαντικές για κλινικές ρυθμίσεις, NGS μπορεί να εφαρμοστεί σε σταθεροποιημένο με φορμαλίνη και εμβαπτισμένο σε παραφίνη υλικό FFPE ιστών, καθώς και πολύ υποβαθμισμένη DNA το οποίο συνήθως παρασκευάζεται σε τμήματα παθολογίας ή βρέθηκαν σε αρχαία DNA [12], [13]. Αρκετές μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει τεχνολογίες NGS για την αναγνώριση της υποκείμενης μετάλλαξης σε μονογενετικές ασθένειες [14], [15]. Ωστόσο, μόνο ένας περιορισμένος αριθμός μελετών αναφέρουν αλληλουχίας επόμενης γενιάς για τον εντοπισμό νέων γονιδίων υποψήφιος καρκίνο? μία από τις πρώτες μελέτες που εξετάστηκαν κυτταρογενετικά κανονική οξεία μυελογενή λευχαιμία, και ο καρκίνος του μαστού γονιδιώματα [16], [17]. Επιπλέον, μελέτες για το κακόηθες μελάνωμα και τον καρκίνο των πνευμόνων μικρών κυττάρων κυτταρικές σειρές έδωσαν την πρώτη γνώσεις σχετικά με γονιδιωματική αλλοιώσεις που προκαλούνται από την υπεριώδη έκθεση στο φως ή καπνό [18], [19].

Για να αποκτήσουν εικόνα για τα γονιδιώματα των μικροδορυφόρων σταθερή και ασταθή του παχέος εντέρου και να προσδιοριστούν λειτουργικά σχετικές μετάλλαξης χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση σύλληψης του DNA υβριδισμό με βάση ολόκληρο το exome που ακολουθείται από 454 αλληλουχίας επόμενης γενιάς [20]. Η εφαρμογή αυστηρών βιοπληροφορική ανάλυση, θα περιοριστεί το ποσό των λειτουργικά σημαντικών σωματικών μεταλλάξεων σε MSI σε 359 και 45 σε καρκίνους MSS, αναδεικνύοντας έτσι συγκεκριμένα μοτίβα μετάλλαξη, ανάλογα με την κατάσταση του μικροδορυφορικού. Ήμασταν σε θέση να επιβεβαιώσει τα αποτελέσματά μας με την αλληλούχιση των exomes τεσσάρων επιπλέον περιπτώσεων CRC (ένα MSI, τρεις MSS) χρησιμοποιώντας μια διαφορετική τεχνολογία εμπλουτισμού και αλληλουχίας. Μεταξύ αυτών των μεταλλάξεων είναι BRAF στον καρκίνο MSI και KRAS και TP53 στον καρκίνο MSS, περαιτέρω υπογραμμίζοντας την εγκυρότητα της προσέγγισης επιλογής μας [21]. Περαιτέρω λειτουργική χαρακτηρισμοί που προσδιορίζονται επαναλαμβανόμενες σωματικές μεταλλάξεις σε BMPR1A, μία πρωτεΐνη η οποία έχει συνδεθεί μέχρι σήμερα με το σύνδρομο νεανική πολυποδίαση, σύνδρομο καρκίνο προδιάθεση.

Αποτελέσματα

Sequence-ειδικό εμπλουτισμό και τη στρατηγική προσδιορισμού αλληλουχίας

αλληλουχία όγκου και φυσιολογικούς ιστούς που ταιριάζουν κόλον από δύο ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα υψηλής ποιότητας του παχέος εντέρου (G3), ασθενής 1 με ένα μικροδορυφορικών ασταθή και ασθενής 2 με ένα σταθερό μικροδορυφόρων όγκου (Πίνακας 1, Σχήμα S1). Για τον προσδιορισμό της βλαστικής γραμμής μεταλλάξεων εμείς αλληλουχία εκτός από ιστούς όγκου από κάθε ασθενή γειτονικά δεν επηρεάζονται φυσιολογικό κολονικό ιστό. Χρησιμοποιώντας αλληλουχίας Illumina και SNP συστοιχίες διαπιστώσαμε ότι ο όγκος του ασθενούς 1 είναι ο αριθμός αντιγράφων σταθερές, ενώ ασθενούς 2 έδειξε παραλλαγές που χρησιμοποιήσαμε για την επαναξιολόγηση των εντοπίστηκαν μεταλλάξεις υψηλής αυστηρότητας (Πίνακας S3).

Η

Αναλύσαμε τα πλήρη exomes άνω των 135.000 εξόνια με κυνηγετικό όπλο 454 αλληλούχιση μονού διαβάσει (Σχήμα 1, Σχήμα S1, S2 Σχήμα, Πίνακας 2). Για να αξιολογηθεί η επίδραση του βάθους κάλυψης επί της ευαισθησίας και της ειδικότητας του εντοπισμού παραλλαγής αλληλουχίας, γονότυπος κλήσεις της συστοιχίας Affymetrix SNP 6.0 συγκρίθηκαν σταδιακή στις ονομάζεται θέσεις νουκλεϊκού οξέος και οδήγησε σε μια ακρίβεια περισσότερο από 99% (Σχήμα S3) . Εκτός από την συστοιχία SNP, χρησιμοποιήσαμε ανάλυση αλληλουχίας Sanger για να επιβεβαιώσει 23 επιλεγμένες μεταλλάξεις (Πίνακας S5, Εικόνα S5).

(Α) διάγραμμα Venn των συλληφθέντων εξώνια φυσιολογικών και καρκινικών δειγμάτων. Κατέλαβε εξώνια με τουλάχιστον μία ανάγνωση μετρήθηκαν. (Β) Εκπρόσωπος κανονικοποιημένο διάγραμμα κάλυψης διανομής. Το κλάσμα των εξονίων δολώματος που καλύπτονται στο γονιδίωμα επίτευξη καλύψεις ίση ή χαμηλότερη από την κανονικοποιημένη κάλυψη υποδεικνύεται στον άξοναχ. Η μέση κάλυψη ανά εξόνιο διαιρέθηκε με τη μέση κάλυψη όλων των εξωνίων.

Η

Προσδιορισμός των σωματικών μεταλλάξεων σε ακολουθίες κωδικοποίησης για ένα MSI CRC

Ψάχνοντας για παραλλαγές σε περιοχές κωδικοποίησης βρήκαμε 12.767 και 12.518 μικρά πυρηνικά διακυμάνσεις 6428 και 6205 γονίδια, για όγκο και φυσιολογικό αντίστοιχα. Από αυτές τις παραλλαγές 1428 για τον έλεγχο και 2404 για όγκο έχουν ένα μέσο ετεροζυγωτίας ή ελάσσονα συχνότητα αλληλίου κάτω από 1% ή δεν έχουν προηγουμένως αναφερθεί σε dbSNP ή Γενώματα Έργου 1000 (Σχήμα 2). Από indels (μικρές προσθήκες και διαγραφές) σε ομοπολυμερικής περιοχές αποτελούν σημαντική πηγή σφαλμάτων αλληλουχίας του 454 πλατφόρμας αγνοούσαμε αυτό το είδος της μεταβολής στις αναλύσεις μας.

(Α) Σχηματική της ροής εργασίας βιοπληροφορικής ανίχνευσης SNV. (Β) Εξόρυξη λειτουργικά σχετικές σωματικών μεταλλάξεων για MSI και MSS του παχέος εντέρου. Παραλλαγές ανιχνεύθηκαν με την GS Mapper Αναφοράς πριν διηθούνται για τον εντοπισμό τους, το σχολιασμό στο dbSNP130 ή τις 1000genomes, σωματικά και λειτουργικά απομείωσης. Από dbSNP130 ή τις 1000genomes παραλλαγές με χρησιμοποιήθηκαν συχνότητες πάνω από 1%. Για MSI CRC 359 παραλλαγές και για MSS CRC 45 με εντοπίστηκαν προβλέψει αλλάξει τις λειτουργίες των πρωτεϊνών.

Η

σωματικών στρατηγική ανίχνευσης παραλλαγή μας σχεδιάστηκε για να ελαχιστοποιηθεί η ψευδώς θετικά σωματικά παραλλαγή κλήσεις αντί να καθορίσει ζυγωτίας. Χρησιμοποιήσαμε μια προσέγγιση σε δύο στάδια με δύο διαφορετικά επίπεδα αυστηρότητας για να ανιχνεύσει παραλλαγές σε καρκινικά και καλοήθεις ιστούς παρόμοια με Pleasance

et al.

[18]. Στο πρώτο στάδιο, οι παραλλαγές του όγκου που ονομάζεται κάτω από αυστηρά κριτήρια, τα οποία προσδιορίστηκαν με σύγκριση με τα δεδομένα συστοιχία προσδιορισμού του γονότυπου SNP. Το δεύτερο βήμα εξακριβωθεί αν η παραλλαγή του όγκου ήταν βλαστική ή σωματικά. Για να διατηρήσετε το ψευδώς αρνητικό ποσοστό στην καλοήθη ιστό σε λιγότερο από 10%, θέσαμε την κάλυψη cut-off σε 5-φορές, κάτω από τις οποίες αντλήθηκαν συμπεράσματα σχετικά με το αν μια παραλλαγή ήταν σωματικά ή βλαστική. Αν η κάλυψη cut-off συναντήθηκε, μία μόνο ανάγνωση δείχνει την ίδια παραλλαγή σε καλοήθεις και του όγκου των ιστών οδήγησε στην κατηγοριοποίηση της παραλλαγής ως βλαστική.

Με τη στρατηγική αυτή εντοπίσαμε 915 σωματικά μη συνώνυμες μεταλλάξεις που επηρεάζουν 864 γονίδια. Η πλειονότητα των σωματικών μεταλλάξεων ήταν εσφαλμένου νοήματος μεταλλάξεις (65%). Ωστόσο, πολλοί (7%) βρίσκονται εντός αμετάφραστες περιοχές των γονιδίων και μπορεί συνεπώς να οδηγήσει σε αλλοιωμένη έκφραση ή αυξημένη φθορά των ειδών mRNA. Επιπλέον, περίπου το 0,5% από αυτές τις μεταλλάξεις έχουν βρεθεί σε θέσεις ματίσματος και θα μπορούσαν να επηρεάσουν τα γεγονότα ματίσματος, που οδηγεί σε μία τροποποιημένη δομή μεταγραφικό. Επιπλέον, τρεις σωματικές παραλλαγές εντοπίστηκαν σε περιοχές miRNA (Πίνακας S6). Αυτές οι μεταλλάξεις έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον επειδή έχουν miRNAs ενοχοποιηθεί ως κύριος ρυθμιστές της ομοιόστασης του όγκου. Ανάλυση των συγκεκριμένων τύπων παραλλαγών νουκλεϊκών οξέων, συμπεριλαμβανομένων των γνωστών και άγνωστων παραλλαγές, ουσιαστικά έδειξαν τα αναμενόμενα ποσοστά των ανταλλαγών νουκλεοτιδίων, όπως προσδιορίζονται με υπολογισμούς χρησιμοποιώντας dbSNP130 (Σχήμα S4).

Λειτουργική ανάλυση των μεταλλάξεων για μια άνω και κάτω τελεία MSI καρκίνο

Επειδή δεν είναι όλα τα 1.304 σωματικές μεταλλάξεις είναι πιθανό να είναι παθολογικά σχετικές, επιδιώξαμε να εντοπίσει εκείνους που ίσως καταστρέψουν τη λειτουργία της πρωτεΐνης ή να επηρεάσει εξαιρετικά διατηρημένα αμινοξέα και θα μπορούσε, επομένως, να είναι λειτουργικά σημαντικό. Χρησιμοποιήσαμε Polyphen και MutationTaster εργαλεία ταξινόμησης να προβλέψει τις λειτουργικές συνέπειες των αλλαγών αμινοξέων ή μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου και διαπίστωσε ότι 359 γονίδια είχαν τουλάχιστον μία δυνητικά καταστροφική μετάλλαξη (Πίνακας S1) [22], [23].

Από οι δυνητικά καταστροφικές σωματικές μεταλλάξεις, 309 βρίσκονταν σε θέσεις άκρως συντηρημένες σε 44 διαφορετικά είδη, συμπεριλαμβανομένων opossum

(Monodelphis domestica)

, κοτόπουλο

(Gallus gallus)

και μύραινα

(Petromyzon marinus )

. Από αυτά, 259 βρίσκονται σε γονίδια που εκφράζονται στο κόλον, του οποίου 47 ήταν τα γονίδια επιδιόρθωσης, υποδοχέας, ή κινάση. Οπτικοποίηση των επιλεγμένων μεταλλάξεων στις πρωτεϊνικές δομές υποδεικνύει ότι αυτά τα νουκλεοτίδια είναι στην επιφάνεια της πρωτεΐνης, με πιθανό αποτέλεσμα διαταραχθεί αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης.

Ο κατάλογος των σωματικών μεταλλάξεων στον Καρκίνο (COSMIC) βάση δεδομένων είναι μια ολοκληρωμένη συλλογή καρκινογόνες που σχετίζονται με μεταλλάξεις. Περίπου το 39% των μεταλλαγμένων γονιδίων μας έχουν ήδη περιγραφεί σε αυτή τη βάση δεδομένων, και το 13% βρέθηκαν από ξύλο

et al

[10]. Όπως έκανε αυτές τις προηγούμενες βάσεις δεδομένων, βρήκαμε το

BRAF

p.V600E μετάλλαξη στην περίπτωση MSI και εντοπίσαμε

KRAS

και

TP53

μεταλλάξεις στον όγκο MSS.

Οι BRAF

μεταλλάξεις που βρέθηκαν σε περίπου 10% του ΚΕΣ, κυρίως MSI και 30 έως 35% όλων των ασθενών με σποραδική παχέος εντέρου φέρουν σωματικές

KRAS

και

TP53

μεταλλάξεις. Τα ευρήματα αυτά αποδεικνύουν περαιτέρω την ευαισθησία της στρατηγικής κατάταξη μας.

μεταλλάξεων τοπίο ενός MSS καρκίνου του παχέος εντέρου

Για το καρκίνο του παχέος εντέρου MSS εντοπίσαμε 10.622 μικρών πυρηνικών παραλλαγές. Μετά οι ίδιες διαδικασίες φιλτραρίσματος, όπως για τον καρκίνο MSI χρησιμοποιώντας τη βάση δεδομένων dbSNP και τα δεδομένα από το 1000 γονιδιώματος για το Project 1288 παραλλαγές παρέμειναν οι οποίοι είτε είχαν χαμηλό επιπολασμό ή ήταν άγνωστη. Από αυτά, 198 ήταν σωματικά και 45 είχαν προβλεφθεί να μεταβάλλουν την λειτουργία του γονιδίου βασίζονται σε MutationTaster και Polyphen υπολογισμούς (Σχήμα 2Β, πίνακας S2) [22], [23]. Σε σχέση με τον αριθμό αντιγράφων παραλλαγές πέντε από τις 45 ταυτοποιημένες μεταλλάξεις βρίσκονται εντός ενισχυμένες περιοχές, και, όπως ήταν αναμενόμενο, καμία σε περιοχές με διαγραφές. Οι αναλογίες των διαβάζει με αλληλουχία αναφοράς να μεταλλαγμένη αλληλουχία δεν υπερβαίνει αναλογίες σε αριθμό αντιγράφων σταθερές περιοχές η οποία υποστηρίζει τον αλγόριθμο SNV-κλήση.

Σε αντίθεση με τα 1.304 σωματικές μεταλλάξεις στον όγκο MSI βρήκαμε 198 σωματικές μεταλλάξεις στο MSS όγκου η οποία αποδεικνύει ότι το ελαττωματικό MMR σύστημα σε MSI όγκους οδηγεί σε μια σημαντική αύξηση των ποσοστών μετάλλαξης σε καρκίνο του παχέος εντέρου.

Επιπλέον, κοιτάζοντας διασταυρώσεις μεταξύ των δύο τύπων καρκίνου βρήκαμε BMPR1A, WDTC1 (WD και tetratricopeptode επαναλαμβάνει 1 ) και EHD3 (EH-τομέα που περιέχουν 3) μεταλλάσσεται σε δύο όγκους. Η επιλογή βασίστηκε σε λειτουργική ανεπάρκεια με μεγάλη πιθανότητα σε Polyphen και MutationTaster [22], [23]. Όλες οι μεταλλάξεις που βρίσκονται στην επιφάνεια της πρωτεΐνης και είναι πολύ συντηρημένες. Επειδή βρήκαμε σημαντικές σχετίζονται με τον καρκίνο οδούς που σχετίζονται μόνο με BMPR1A αλλά όχι με WDTC1 ή EHD3, και επιπλέον μεταλλάξεις βλαστικής σειράς σε BMPR1A είναι ένας γνωστός παράγοντας κινδύνου για το σύνδρομο νεανική πολυποδίαση, επιλέξαμε BMPR1A για πρόσθετες λειτουργικές δοκιμασίες (Σχήμα 3, Σχήμα S5) . Χρησιμοποιώντας δοκιμασίες ρεπόρτερ με άγριου τύπου και μεταλλαγμένες πρωτεΐνες BMPR1A ήμασταν σε θέση να αποδείξει ότι οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες είναι έντονα μειωμένη σε λειτουργία σηματοδότησης τους και ότι η διέγερση με ΒΜΡ2 οδηγεί σε μια μειωμένη μέγιστη δραστικότητα (Σχήμα 3D).

(Α ) διάγραμμα Αναλογική Βεν. Κλάσματα που ονομάζεται SNVs ταυτίζονται με τα στοιχεία γονιδιώματος του έργου και dbSNP130. Μόνο τα στοιχεία για τα οποία ήταν γνωστό ο ανήλικος συχνότητα αλληλόμορφο ή η μέση ετεροζυγωτία και κάτω από 1% χρησιμοποιήθηκαν για σύγκριση. (Β) Κατανομή συνώνυμα, εσφαλμένου νοήματος, ανοησία και μεταλλάξεις που επηρεάζουν τις κωδικόνιο έναρξης ή διακοπής φαίνονται σε σχέση με όλες τις σωματικές μεταλλάξεις. (Γ) BMPR1A μεταλλάξεις p.W487R και p.E502G βρίσκονται στην περιοχή της κινάσης πρωτεΐνης BMPR1A. αμινοξέα αναφορά οξέα είναι το πράσινο, οι μεταλλαγμένες μορφές εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα. Η καθαρή δομή στο αριστερό κάτω πλευρά δείχνει την περιοχή σύνδεσης ΑΤΡ. (D) BMPR1A μεταλλάξεις εμφανίζουν μειωμένη δραστικότητα σηματοδότησης. Δραστηριότητα του βάρους mBMPR1A, mBMPR1A E502G και mBMPR1A W487R προσδιορίστηκε σε κύτταρα C2C12 χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία γονίδιο της λουσιφεράσης ανταποκριτή SMAD-απόκρισης. Που προκαλείται από δραστικότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε με ΚβηϊΙΙβ acitivty. Η δραστικότητα των μη επιμολυσμένα κύτταρα καθορίστηκε στο 0% και η δραστικότητα του wt mBmpr1a ορίστηκε στο 100%. Σημαντικές διαφορές υπολογίστηκαν με δύο-tailed t-test και χαρακτηρίζονται ως:. * P ≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001

Η

MSI παχέος εντέρου λιμάνι έως 8 φορές σε περισσότερες κωδικοποίησης σωματικές μεταλλάξεις από MSS καρκίνους

Οι αναλύσεις που παρουσιάζονται μέχρι τώρα έχουν βασιστεί σε 454 σύνολό sequencings exome ενός παχέος ασθενή με καρκίνο για κάθε κατάσταση μικροδορυφόρων. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι η αυξημένη ποσότητα της κωδικοποίησης μεταλλάξεων σε καρκίνους MSI μπορούν να γενικευθούν και να μην οφείλεται στην τεχνολογία που χρησιμοποιείται ( «συστοιχία» εμπλουτισμού και 454 αλληλούχιση) εμείς αλληλουχία των exomes τεσσάρων επιπλέον του παχέος εντέρου, το καθένα με το ταίριασμα φυσιολογικούς ιστούς. Αυτή τη φορά χρησιμοποιήσαμε »στην υβριδοποίηση λύση» για τη λήψη του DNA που ακολουθείται από στερεό αλληλουχίας. Μετά από τις ίδιες διαδικασίες φιλτραρίσματος όπως περιγράφεται για τις δύο πρώτες ασθενείς που καθορίζεται και πάλι μέχρι και 8 φορές υψηλότερα ποσοστά μετάλλαξης για την MSI ορθοκολικό καρκίνο από ότι για καρκίνους MSS (Πίνακας 3). Σε αυτό το πλαίσιο βρήκαμε 532 μη συνώνυμες σωματικά SNVs στην πρόσθετη MSI CRC και μόνο 65, 74 και 76 στις τρεις περιπτώσεις MSS CRC. Έτσι, οι διαφορές στα ποσοστά μετάλλαξης είναι επαναλήψιμη και ανεξάρτητα από την τεχνολογία που χρησιμοποιείται αλληλουχίας.

Η

Συζήτηση

Η χρήση αλληλούχισης επόμενης γενιάς, έχουμε την αλληλουχία των exomes των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου MSS και MSI , με μέση καλύψεις των περίπου 20-φορές. Εφαρμόσαμε δύο όψεων αλγόριθμο ταξινόμησης για να αποκαλύψει λειτουργικά σχετικές μεταλλάξεις. Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, δείχνουμε για πρώτη φορά ότι μία συστοιχία-σύλληψη NGS ενός σταδίου ροής εργασίας είναι ένα ισχυρό εργαλείο για βαθιά χαρακτηρισμό των συμπαγών όγκων και δείχνουν ότι MSI όγκοι μεταφέρουν οκτώ φορές πιο λειτουργική σχετικές μεταλλάξεις από τους όγκους MSS (Σχήμα 2) .

Η λειτουργική επίδραση των σωματικών μεταβολών είχε προβλεφθεί χρησιμοποιώντας δύο λειτουργικά αλγόριθμους πρόβλεψης, Polyphen και MutationTaster, και βρήκαμε 359 σωματικές μεταλλάξεις για το MSI και 45 για τον καρκίνο MSS που είναι πολύ πιθανό να προκαλέσει λειτουργικές διαταραχές [ ,,,0],22], [23]. Η ετερογένεια των μεταλλαγμένων γονιδίων που δείχνει ότι δεν είναι ένα συγκεκριμένο γονίδιο

per se

αλλά η πληγείσα οδός παίζει σημαντικό ρόλο για την ανάπτυξη των όγκων. Από αυτή την άποψη βρίσκουμε μια σημαντική εμπλουτισμό των μεταλλάξεων στον καρκίνο σχετίζονται οδούς, όπως ο καρκίνος, η κυτταρική ανάπτυξη και την αντιγραφή του DNA, ανασυνδυασμό και επισκευή (Πίνακας S5). Είναι ενδιαφέρον, βρίσκουμε το 50% από τα πιο σημαντικά εμπλουτισμένο οδών στον καρκίνο MSS επίσης ως σημαντικά εμπλουτισμένη πορείες για τον καρκίνο MSI, υποδεικνύοντας ότι ακόμα κι αν οι καρκίνοι MSI φιλοξενούν έναν αυξημένο αριθμό μεταλλάξεων τόσο καρκίνων θα μπορούσαν να αναπτύξουν μέσω επικαλυπτόμενων παθολογικούς μηχανισμούς.

Ιστορικά, οι δοκιμές μικροδορυφόρου σε ορθοκολικούς καρκίνους ήταν η πρώτη προγνωστική δοκιμή για την ταυτοποίηση ενός μετάλλαξης υποκείμενης επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων (MMR). Δεδομένου ότι περισσότερο από το 90% των κληρονομικών μη πολυποδίαση παχέος εντέρου (HNPCC) δείχνουν MSI, η κατάσταση μικροδορυφόρων έχει γίνει μια κοινή διαγνωστικός δείκτης της MMR. Επιπλέον, τα πλεονεκτήματα επιβίωσης και θεραπευτικές συνέπειες έχουν αναφερθεί για ασθενείς με όγκους MSI [5], [24]. Χρησιμοποιώντας ultradeep αλληλούχιση ενός διατηρημένη περιοχή, UCR41, de Grassi και οι συνεργάτες του δείχνουν ότι η περιοχή αυτή έχει τα υψηλότερα ποσοστά μετάλλαξης στα δείγματα HNPCC ό, τι σε υγιείς ελέγχους και υποδηλώνουν ότι αυτό θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ευαίσθητος μοριακή δοκιμασία γενωμική αστάθεια [24]. Έχουμε επεκτείνει τις αναλύσεις τους σε ολόκληρο exomes και βρέθηκαν 8 φορές διαφορές στους αριθμούς των σωματική μετάλλαξη του MSI και MSS του παχέος εντέρου. Σε σύγκριση, μια μελέτη από Greenman

et al.

Οποία ανέφερε σχετικά με την αλληλουχία των 518 γονιδίων πρωτεϊνικής κινάσης σε 210 διαφορετικές ανθρώπινους καρκίνους βρεθεί περίπου 25 φορές υψηλότερο ρυθμό μετάλλαξης για MMR-ανεπαρκή καρκίνους [9]. Ωστόσο, αυτά είναι προεκτάσεις και σε αντίθεση με τη μελέτη μας θα περιλαμβάνονται οι όγκοι από διαφορετικές αφετηρίες και εξέτασε όλες τις σωματικές μεταλλάξεις ανεξάρτητα από το λειτουργικό ενδιαφέρον τους. Με την προσέγγιση αλληλουχίας μας εντοπίσαμε επίσης μια σωματική

MLH3

μετάλλαξη στον όγκο MSI, η οποία, παρόλο που

MLH3

μεταλλάξεις δεν ανήκουν στους κλασική μεταλλάξεις MMR στην CRC, θα μπορούσε να συμβάλει στην μικροδορυφορικού φαινότυπο αστάθεια [25]. Επιπλέον, ο συνδυασμός του MSI και

BRAF

μετάλλαξη, όπως ανιχνεύεται για τον όγκο MSI περιγράφεται, είναι πιο συχνά βρέθηκαν για CpG φαινότυπο νησί μεθυλίωσης 1 (CIMP1) όγκων που σχετίζονται με το

MLH1

υποκινητή μεθυλιώσεις [21], [26]. Η μεθυλίωση προαγωγού με τη σειρά του συνδέεται με μηχανισμούς γονιδιακή σίγηση οποία είναι ενδεικτικά ως εξήγηση για το καθεστώς MSI των όγκων. Από την άλλη πλευρά, έχει προταθεί ότι χρωμοσωμική αστάθεια (CIN) και CIMP αντιπροσωπεύουν δύο ανεξάρτητες και αντιστρόφως ανάλογη μηχανισμούς αστάθειας [27]. Οι CIMP-αρνητικών περιπτώσεων που σχετίζονται με p53 (71%) και

KRAS

(33%) μεταλλάξεις, αλλά σπάνια με το

BRAF

(2%) μεταλλάξεις. Από βρήκαμε μεγάλες διακυμάνσεις του αριθμού αντιγράφων, καθώς και

KRAS

και

TP53

μεταλλάξεις στον όγκο MSS αναλύεται αυτός ο όγκος είναι πιο πιθανό CIMP αρνητικά [5], [24].

Η στρατηγική προσδιορισμού αλληλουχίας και η ανάλυση που παρουσιάσαμε θα μπορούσε να είναι η βάση για τις μελλοντικές εργαλεία ταξινόμησης για παχέος εντέρου, επειδή μπορεί να επιτρέψει μια παράλληλη ανίχνευση μιας αυξημένης συχνότητας μετάλλαξης σε όγκους MSI, καθώς και την ανίχνευση της υποκείμενης MMR ελάττωμα. Επιπλέον, ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει μεταλλάξεις των γονιδίων που συχνά συνδέονται με ορισμένες υποτύπους του παχέος εντέρου, όπως

BRAF, KRAS

και

TP53

. Μέσα σε υψηλή γονίδια προτεραιότητα μας, που θα περιλαμβάνει όλα τα γονίδια που περνούν όλα τα φίλτρα επιλογής,

BMPR1A

ξεχωρίζει ως μεταλλαχθεί και στις δύο περιπτώσεις. Η συνολική δομή αποκαλύπτει ότι τα μεταλλαγμένα αμινοξέα βρίσκονται όλα στο Ο-τερματικό δέσμη ενδοκυτταρική έλικα στο πεδίο κινάσης πρωτεΐνης και υποδηλώνει ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών καταστρέφονται [28]. Βλαστικής σειράς

BMPR1A

μεταλλάξεις προδιαθέτουν στη νεανική σύνδρομο πολυποδίαση? Ωστόσο, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι επίσης σωματικές μεταλλάξεις θα μπορούσαν να διαδραματίσουν ένα σημαντικό ρόλο στην σποραδική ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος [29], [30], [31], [32], [33].

Εκτός από αυτές τις μεταλλάξεις που έχουμε επίσης, εντοπίστηκαν αρκετές μεταλλαγμένες στόχους φάρμακο για τον καρκίνο ή τα γονίδια που σχετίζονται με την έκβαση της θεραπείας, συμπεριλαμβανομένων των

BRAF, KRAS, FGFR2

και

mTOR

, οι οποίες θα μπορούσαν να βοηθήσουν να επιλέξουν τη βέλτιστη συνδυασμούς φαρμάκων. Ως τέτοια παρόμοια στοχευμένες προσεγγίσεις εκ νέου προσδιορισμό της αλληλουχίας και της βιοπληροφορικής φιλτράρισμα στρατηγικές θα μπορούσε να γίνει ένα χρυσό πρότυπο για την εξατομικευμένη θεραπεία καρκίνου του παχέος εντέρου στο μέλλον.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

η μελέτη έχει εγκριθεί από την Επιτροπή Ηθικής του Ιατρικού Πανεπιστημίου του Γκρατς. Για τα νέα δείγματα ασθενών έχουν δώσει γραπτή συγκατάθεση τους. Για τα παλαιά δείγματα (15 ετών) δεν επιγνώσει συναίνεση ήταν διαθέσιμο, ως εκ τούτου, όλα τα δείγματα και τα ιατρικά δεδομένα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη έχουν αμετάκλητα ανώνυμα.

Παρουσίαση περιστατικού και δείγμα ιστού συλλογή

Ασθενής 1 είχε ένα υψηλής ποιότητας (G3) αδενοκαρκίνωμα του εγγύς κόλον, ανέβασε pT-3C, pN-0, ρΜ-X, pR-0, μικροδορυφόρων ασταθή (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, αυτή η υπόθεση επελέγη λόγω της χρωμοσωμική σταθερότητα, όπως προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας αλληλούχιση του γονιδιώματος σε επίπεδο επόμενης γενιάς (NGS) (Σχήμα 1Β). Ο ασθενής 2 είχε ένα υψηλού βαθμού (G3) αδενοκαρκίνωμα του εγγύς κόλον, ανέβασε pT-4Β, PN-2, ρΜ-X, μικροδορυφόρων σταθερή.

Ανθρώπινος ιστός ελήφθη κατά τη διάρκεια χειρουργικής επέμβασης ήταν καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο . Κατεψυγμένες τομές (3 μm πάχους) παρασκευάστηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για να αξιολογήσει το περιεχόμενο των κυττάρων του όγκου. Ανατομές διεξήχθησαν κάτω από το μικροσκόπιο για να επιτευχθεί μια περιεκτικότητα κυττάρου όγκου του & gt? 80%. απομόνωση DNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Σύνολο exome DNA Εμπλουτισμός και Genome Sequencer FLX αλληλούχιση

Γονιδιωματικό DNA και των δύο ιστών υποβλήθηκε σε ολόκληρο σύλληψη ακολουθία exome χρησιμοποιώντας 2.1M Ανθρωπίνων exome Array Roche /NimbleGen του. Αυτή η συστοιχία βασίζεται στην κατασκευή 36.3 της ανθρώπινης αλληλουχίας γονιδιώματος, και συλλαμβάνει τις κωδικοποιητικές περιοχές των γονιδίων 16755 NCBI REFSEQ (περίπου 180.000 κωδικοποιητικά εξώνια), καθώς και 493 περιοχές miRNA. Όγκου και φυσιολογικών ιστών DNA υποβλήθηκαν σε ολόκληρη την αλληλουχία exome συλλαμβάνοντας σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. DNA διατμήθηκε με εκνέφωση να κατακερματίζουν μεγέθη κάτω 800bp, καθαρίζονται (Zymo Research) και των τελικών γυαλισμένο χρησιμοποίηση Τ4 DNA πολυμεράσης και Τ4 πολυνουκλεοτιδικής κινάσης. Linker προσαρμογείς pSel3 (5 ‘- CTCGAG ΑΑΤ TCT GGA TCC TC – 3’) και pSel4-P (5 ‘- Phos /GAG GAT CCA GAA ΤΤΟ TCG AGT Τ – 3’) συνδέθηκαν και επιλογής μεγέθους πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας AMPure DNA Καθαρισμός χάντρες (Agencourt). Ποιότητα ελέγχθηκε με το σύστημα Bioanalyzer. LM-PCR πραγματοποιήθηκε με LMPCR3 εκκινητές (5 ‘- GAG CUC AAU UCU GGA UCC UC – 3’), πριν η βιβλιοθήκη χρησιμοποιήθηκε για υβριδισμό στους 42 ° C για 72 ώρες. Οι συστοιχίες πλύθηκαν δύο φορές σε 47,5 ° C, δύο φορές σε θερμοκρασία δωματίου και δύο φορές στους 42 ° C με ρυθμιστικά διαλύματα έκπλυσης, όπως συνιστάται. Bound γονιδιωματικό DNA εκλούσθηκε με 125 mM NaOH για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και ενισχύθηκαν με LM-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές LMPCR3. Συλλαμβάνονται ενισχυμένα δείγματα υποβλήθηκαν σε ποσοτική PCR για μέτρηση της σχετικής εμπλουτισμό.

Το εμπλουτισμένο Nimblegen DNA χρησιμοποιήθηκε για να κατασκευαστεί μονόκλωνου Genome Sequencer FLX (454 /Roche) βιβλιοθήκες. Μετά PCRs γαλάκτωμα εκκινητές αλληλούχισης ανοπτήθηκαν προς το εκμαγείο και σφαιρίδια επωάστηκαν με Bst DNA πολυμεράση, απυράση, και μονόκλωνο πρωτεΐνη δέσμευσης. Pyrosequencing διεξήχθη σε πλάκα picotiter 70 × 75 mm σε 13 ξεχωριστές εκτελέσεις αλληλούχιση. Μετά την προεπιλογή επεξεργασία των πρώτων στοιχείων, η επανεύρεση της αλληλουχίας κλάδεμα φίλτρο χρησιμοποιείται για να αυξήσει την παραγωγή δεδομένων. (Παράμετροι που χρησιμοποιούνται: doValleyFilterTrimBack = false, vfBadFlowThreshold = 6, vfLastFlowToTest = 168, errorQscoreWindowTrim = 0,01)

Για την αλληλούχιση πραγματοποιήσαμε 13 Γονιδιώματος Sequencer FLX τρέχει, η οποία παρήγαγε πάνω από 558 εκατ βάσεις και 1.430.000 διαβάζει ανά περίοδο. . Διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν με το γονιδίωμα αναφοράς του ανθρώπου, NCBI χτίσει 36 (https://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg18/), χρησιμοποιώντας GS Αναφορά Mapper έκδοση 2.0.0.12 (Roche). Τα καλύτερα παιχνίδια στο γονιδίωμα χρησιμοποιήθηκαν ως θέση για το διαβάζει με πολλούς αγώνες. Μόνο μοναδικό διαβάζει με ένα ελάχιστο μήκος 50 bp χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση (βλέπε τρέξει Tab στατιστικά στοιχεία. 2).

Η ανίχνευση των παραλλαγών έγινε με την GS Αναφορά Mapper έκδοση 2.0.0.12 (Roche). Απολυμένοι διαβάζει αφαιρέθηκαν πριν παραλλαγή κλήσεις. Μόνο η HCDiff (υψηλή διαφορές εμπιστοσύνη) του λογισμικού GS Mapper χρησιμοποιήθηκαν ως βάση της ανίχνευσης παραλλαγής [20]. κλήσεις HCDiff θεωρούν τουλάχιστον τρεις διαβάζει με την παραλλαγή με τα δύο εμπρός και όπισθεν διαβάζει περιλαμβάνονται? Εναλλακτικά, οι βαθμολογίες ποιότητας στις διάφορες θέσεις πρέπει να είναι άνω των 20 (ή άνω των 30, αν ένα ομοπολυμερές των πέντε ή περισσότερες βάσεις εμπλέκεται). Ως πρόσθετα κριτήρια ποιότητας που χρησιμοποιούνται παραλλαγές μόνο με κάλυψη & gt?. 10 × υψηλής ποιότητας διαβάζει

Όλη η exome «σε διάλυμα» DNA Εμπλουτισμός και στερεών αλληλουχίας

εμπλουτισμοί και σταθερή προετοιμασία της βιβλιοθήκης πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο εμπλουτισμού SureSelect στόχος Agilent για το στερεό σύστημα Applied Biosystems. Εν συντομία, ολόκληρο γονιδιωματικό ΟΝΑ ψαλιδισμένα και επισκευάστηκε άκρο. Για συνδέσεις προσαρμογέα χρησιμοποιήθηκαν 30x υπέρβαση των προσαρμογέων. επιλογές Μέγεθος για 150-200 bp θραύσματα DNA διεξήχθησαν ακολουθείται από ένα nick-μετάφρασης και ενίσχυση βήμα με Platinum πολυμεράσης (Invitrogen) και Pfu-πολυμεράσης (Fermentas). Για τα υβριδικά επιλογή Οι βιβλιοθήκες ρυθμίστηκαν σε 500 ng σε 3,4 μΐ όγκο και προστίθεται στα διαλύματα SureSelect Block. Οι υβριδισμοί πραγματοποιήθηκαν για 24 ώρες στους 65 ° C, υβρίδια εκχυλίστηκαν με 500 ng Μ-280 Dynabeads στρεπταβιδίνης (Invitrogen) και τέλος εκλούεται με 50 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης. Μετά την ενίσχυση με Platinum πολυμεράσης οι βιβλιοθήκες προσδιορίστηκαν ποσοτικά με qPCR και η συγκέντρωση του DNA ρυθμίζεται ώστε να επιτευχθεί ένα κλάσμα 10-20% χάντρες μονοκλωνικό εκμαγείο στο γαλάκτωμα PCR χρησιμοποιώντας συνολικά 0,7 έως 1 δισεκατομμύριο σφαιρίδια. Διαδοχικές εμπλουτισμό χάντρα και εναπόθεση των 130 εκατομμυρίων χάντρες ανά διαφάνεια τρίμηνο (quad) ακολούθησε πρότυπο 50 τρεξίματα bp θραύσμα. Κάθε ένα από τα τέσσερα δείγματα ασθενών αναλύθηκε σε μία μόνο quad

Η χαρτογράφηση έγινε με τον αγωγό ευθυγράμμιση Bioscope τη χρήση του σπόρου & amp.? επεκτείνει τον αλγόριθμο με σκορ -2.0 ποινή αναντιστοιχία. Ενιαία νουκλεοτιδικές παραλλαγές (SNV) κλήθηκαν με τον αλγόριθμο DiBayes ενσωματωθεί στο πακέτο Bioscope.

Ενιαίου παραλλαγή νουκλεοτιδίου (SNV)

ανίχνευσης

υλικά ιστού γονότυπου στη συστοιχία Affymetrix 6.0, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. θέσεις Array με βαθμολογία ποιότητας (p-value) & lt? 0.1 χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση με τα δεδομένα αλληλουχίας. θέσεις δεδομένα αλληλουχίας χρησιμοποιήθηκαν εάν η κάλυψη τους υπερέβη το 3 φορές. Αυτό που παράγεται 46.000 και 49.000 θέσεις όγκου και καλοήθη ιστό, αντίστοιχα, που ήταν επιλέξιμες για σύγκριση. Για τον προσδιορισμό ψευδώς θετικά και ψευδώς αρνητικά ποσοστά, θέτουμε τα δεδομένα πίνακα ως πρότυπο και διακρίνονται μεταξύ κλήση αναφοράς και την εξάρτηση κλήσης SNP για τα δεδομένα του πίνακα.

Για την ανίχνευση σωματικών παραλλαγές, μια δικόρυφη στρατηγική εφαρμόστηκε με όγκο παραλλαγές που ονομάζεται κάτω από αυστηρά κριτήρια, ενώ οι παραλλαγές στον ιστό ελέγχου κλήθηκαν χρησιμοποιώντας λιγότερο αυστηρά κριτήρια: ένα ελάχιστο όριο για διαβάζει ορίστηκε με παραλλαγές του 15% του συνόλου διαβάζει σε μια δεδομένη θέση στον όγκο. Λιγότερο αυστηρά κριτήρια χρησιμοποιήθηκαν για την κλήση παραλλαγές ιστού έλεγχο με ελάχιστο μία παραλλαγή διαβάσει και ελάχιστη αποκοπή κάλυψη των 5. Για καλύψεις πάνω από 30 φορές μια παραλλαγή ανάγνωσης έγινε δεκτή.

Τριχοειδής αλληλουχίας

Συνέχεια επιβεβαίωση προσδιορίζονται SNVs διεξήχθη σε 3730 μέσο τριχοειδή αλληλουχίας ΑΒΙ (Applied Biosystems) ακολουθώντας πρότυπες διαδικασίες.

Προσδιορισμός Αντιγραφή παραλλαγές αριθμού

Προετοιμασία του ενιαίου βιβλιοθήκες ανάγνωσης και της αλληλουχίας ήταν πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της πλατφόρμας αλληλούχισης Solexa (GenomeAnalyzer ΙΙχ, Illumina) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ανάλυση εικόνας και της βάσης καλώντας διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Firecrest 1.9.5_14 και Ωτίδα 1.9.5_14 και διαβάζει ευθυγραμμίστηκαν με το ανθρώπινο γονιδίωμα (NCBI36) χρησιμοποιώντας Bowtie 0.9.7.1 [34]. Αντιγραφή ανάλυσης αριθμού έγινε σε R χρησιμοποιώντας το πακέτο DNAcopy [35]. Με λίγα λόγια, το DNA διαβάσετε συχνότητες προσδιορίσθηκαν για κάδους των 50 Kb. Η αναλογία συχνότητα log2 των αντίστοιχων κάδων υπολογίστηκε για όγκους έναντι των φυσιολογικών ιστών. Διάμεση τιμή των αναλογιών ήταν επικεντρωμένη στο μηδέν πείραμα σοφός. Συνδεθείτε αναλογίες εξομαλύνεται με DNAcopy χρησιμοποιώντας προκαθορισμένες τιμές και να αντιγράψετε παραλλαγή αριθμό ανιχνεύθηκε από DNAcopy χρησιμοποιώντας το ανώτατο όριο των δύο τυπικών αποκλίσεων.

Γονοτυπικές στη συστοιχία Affymetrix 6,0 διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Περιφέρειες της αύξησης του αριθμού αντιγράφων και την απώλεια προσδιορίστηκαν από την αντιστοίχιση και ανάλυση χρησιμοποιώντας το Hidden Markov Model (HMM) του λογισμικού Partek Γονιδιωματική Σουίτα (Partek Inc, St.Louis, ΜΟ) με τις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις παραμέτρων. Για ζεύγη ανάλυση, οι τιμές αριθμό αντιγράφων παρήχθησαν με τη σύγκριση του όγκου και καλοηθών προφίλ ιστός από τον ίδιο ασθενή.

Βιοπληροφορική ροής εργασιών

για κάθε ιστό, παραλλαγές σχολιάστηκαν με τη χρήση των μοντέλων γονίδιο που παράγεται από Ensembl ( Ensembl 54.36, www.ensembl.org). Όλες οι παραλλαγές χαρτογραφήθηκαν σε όλα τα μοντέλα μεταγραφή, η οποία οδήγησε σε πολλαπλές σχολιασμούς για αρκετές θέσεις. Για παράδειγμα, μία παραλλαγή μπορεί να οδηγήσει σε μια αλλαγή αμινοξέος σε μία μεταγραφή και εμφανίζονται στο UTR του άλλου.