Αφηρημένο

Το σουλφίδιο βραδείας απελευθέρωσης υδρογόνου (H

2δ) του δότη, GYY4137 , προκάλεσε εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση θανάτωση επτά διαφορετικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών ανθρώπου (HeLa, HCT-116, Hep G2, HL-60, MCF-7, MV4-11 και U2OS), αλλά δεν επηρέασε την επιβίωση των φυσιολογικών ινοβλαστών ανθρώπινου πνεύμονα (IMR90, WI-38) όπως προσδιορίζεται με αποκλεισμό trypan blue. θειούχου νατρίου (NaHS) ήταν λιγότερο ισχυρό και δεν δραστηριοποιούνται σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Ένα δομικό ανάλογο της GYY4137 (ZYJ1122) έλλειψη θείου και από εκεί δεν είναι σε θέση να απελευθερώσει H

2S ήταν ανενεργό. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας κλωνογονική δοκιμασία. Η επώαση του GYY4137 (400 μΜ) σε μέσο καλλιέργειας οδήγησε στην παραγωγή χαμηλής (& lt? 20 μΜ) συγκεντρώσεις H

2S διατηρηθούν για 7 ημέρες. Σε αντίθεση, η επώαση των NaHS (400 μΜ) κατά τον ίδιο τρόπο οδήγησε σε πολύ υψηλότερη (μέχρι 400 μΜ) συγκεντρώσεις H

2S η οποία επέμεινε για μόνο 1 ώρα. Μηχανιστικές μελέτες αποκάλυψαν ότι GYY4137 (400 μΜ) επωάζονται για 5 ημέρες με MCF-7 αλλά όχι IMR90 κύτταρα προκάλεσε την παραγωγή της διασπασμένης ΡΑΚΡ και διασπασμένη κασπάση 9, ενδεικτική μιας προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα. GYY4137 (αλλά όχι ZYJ1122) προκάλεσε επίσης μερική G

2 /M σύλληψη αυτών των κυττάρων. Ποντίκια ξενομόσχευμα μελέτες χρησιμοποιώντας HL-60 και MV4-11 κύτταρα έδειξαν ότι GYY4137 (100-300 mg /kg /ημέρα για 14 ημέρες) μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι GYY4137 εμφανίζει αντικαρκινική δράση με την απελευθέρωση H

2S σε περίοδο ημερών. Προτείνουμε επίσης ότι ο συνδυασμός της απόπτωσης και του κυτταρικού κύκλου σύλληψη συμβάλλει προς αυτή την κατεύθυνση και ότι H

2S δωρητές θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω ως πιθανοί παράγοντες αντι-καρκίνου

Παράθεση:. Lee ZW, Zhou J, ο Τσεν CS, Zhao Υ, Tan CH, Li L, et al. (2011) Η βραδείας απελευθέρωσης Υδρόθειο Δωρητών, GYY4137, Εκθέματα Μυθιστόρημα αντικαρκινικές επιδράσεις

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 6 (6): e21077. doi: 10.1371 /journal.pone.0021077

Επιμέλεια: Ιωσήφ Alan Bauer, Ίδρυμα Bauer Έρευνας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 27 του Μαρτίου του 2011? Αποδεκτές: 17 του Μαΐου, 2011? Δημοσιεύθηκε: 20 Ιουνίου 2011

Copyright: © 2011 Lee et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίζεται από το Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σιγκαπούρης επιχορήγηση της έρευνας για την PKM, LWD και CHT (R-183-000-240-720, R183-000-240-101, R183-000-268-733). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το υδρόθειο (H

2S) συντίθεται φυσικά από κυστεΐνη με διάφορα ένζυμα συμπεριλαμβανομένων λυάση κυσταθειονίνης γ (CSE), κυσταθειονίνης β συνθετάση (CBS) και 3-mercaptosulfurtransferase (3-MST) σε ένα ευρύ φάσμα κύτταρα θηλαστικών και μη θηλαστικών τόσο

in vitro

και

in vivo

. Κατά την τελευταία δεκαετία, έχουν πολυάριθμες φυσιολογικές και παθοφυσιολογικές ρόλοι έχουν προταθεί για αυτό το αέριο, μαζί με μια πληθώρα κυτταρικών και μοριακών στόχων συμπεριλαμβανομένης μιας σειράς διαύλων ιόντων, ένζυμα και παράγοντες μεταγραφής [1].

Εκτός από το δυναμικό της ρόλους στην κανονική φυσιολογία υπάρχει επίσης μια ολοκληρωμένη βιβλιογραφία που περιγράφει την τοξικότητα του H

2S και του ρόλου της ως περιβαλλοντική ρύπου [2]. Ένας αριθμός μελετών έχουν διερευνήσει τον ρόλο της H

2S στην ενεργοποίηση κυτταρικό θάνατο και παρουσιάστηκαν στοιχεία ότι αυτό το αέριο μπορεί να ασκήσει τόσο προ- και αντι-αποπτωτική δραστικότητα σε καλλιεργημένα κύτταρα [3], [4]. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός (ες) που συμμετέχουν παραμένουν ασαφείς.

Ίσως προκαλεί έκπληξη, έχουν υπάρξει λίγες μελέτες για την επίδραση του H

2S σε καρκινικά κύτταρα

in vitro

και υπάρχουν αναφορές για επίδρασή του στην εξέλιξη του όγκου

in vivo

. Αρκετά χρόνια πριν αναφέραμε ότι H

2S προστατεύονται τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου (HCT-116) από την απόπτωση που οφείλονται ισοθειοκυανικό σε β-φαινυλαιθυλ [5]. Άλλοι ανέφεραν στη συνέχεια ότι H

2S αυξάνει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων ανθρώπινου κόλον και μειώνει την απόπτωση σε αρκετές κυτταρικές σειρές (π.χ. HCT-116, [6]), ενώ μειώνεται η επιβίωση σε άλλες κυτταρικές γραμμές ανθρώπινου κόλον (π.χ. WiDr, [7]) . Αυτές οι διαφορετικές παρατηρήσεις είναι δύσκολο να συμβιβαστεί. Ωστόσο, μία εξήγηση μπορεί να βρίσκεται στην επιλογή του H

2S δότη. θειούχων αλάτων όπως όξινο θειούχο νάτριο (NaHS) και θειούχου νατρίου (Na

2S) έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για τη μελέτη των βιολογικών αποτελεσμάτων αυτού του αερίου σε πολλά κύτταρα, ιστούς και ζώα. Κατά την προσθήκη του νερού, αυτά τα άλατα δημιουργούν ένα μεγάλο ποσό H

2S σε μικρό χρονικό διάστημα. Επειδή κυτταρική καλλιέργεια λαμβάνει χώρα σε μία περίοδο ωρών ή ημερών, είναι πιθανό ότι η μικρή, εάν υπάρχει, H

2S είναι παρούσα σε μέσο μέσα σε σύντομο χρονικό διάστημα από την προσθήκη είτε NaHS ή Na

2S. Ετσι, ενώ δεν υπάρχουν άμεσες μετρήσεις έχουν γίνει μέχρι αυτό το σημείο, φαίνεται πιθανό ότι η συγκέντρωση του H

2S ότι ο καρκίνος (ή πράγματι άλλοι) μη καρκινικά κύτταρα εκτίθενται σε διάρκεια καλλιέργειας με NaHS θα είναι υψηλή κατά την έναρξη και όχι παρατεταμένη διάρκεια του πειράματος. Έτσι, μπορεί να είναι δύσκολο να εξαχθούν σαφή συμπεράσματα σχετικά με την ικανότητα του H

2S να επηρεάζουν την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων με τη χρήση θειούχων αλάτων ως παράγοντες δότη.

Με αυτό κατά νου, έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι GYY4137 απελευθερώνει H

2S αργά τόσο σε υδατικά μέσα και όταν χορηγούνται σε υγιή ζώα σε περίοδο ωρών έως ημερών [8], [9]. Έχουμε τώρα συνέκρινε την επίδραση του GYY4137 και NaHS στην επιβίωση μιας σειράς καρκίνου και μη καρκινικά κύτταρα σε καλλιέργεια και συσχετίστηκε επίδρασή τους με μεταβολές στη συγκέντρωση του H

2S στο μέσο. Επιπλέον, έχουμε εξετάσει την επίδραση της GYY4137 στην αύξηση του όγκου χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια.

Υλικά και Μέθοδοι

Πρωτόκολλα έγιναν με την έγκριση του Εθνικού Πανεπιστημίου της Σιγκαπούρης (NUS) επιτροπή δεοντολογίας (IRB, κωδικό αναφοράς: 09-120E) και NUS θεσμική φροντίδα των ζώων και την Επιτροπή Χρήση (IACUC, αριθμός πρωτοκόλλου: 804/05).

Χημική σύνθεση GYY4137 και ZYJ1122

GYY4137 συντέθηκε χημικά στο σπίτι όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. ZYJ1122 (μορφολιν-4-ιο diphenylphosphinate) συνετέθη ως εξής. Σε ένα διάλυμα διφαινυλοφωσφινικό οξύ σε διχλωρομεθάνιο (1,0 mmol, 1,0 ισοδ.) (DCM? 2 ml) σε θερμοκρασία δωματίου, μορφολίνη (. 2,0 mmol, 2,0 ισοδύναμα) προστέθηκε στάγδην. Η αντίδραση αναδεύτηκε στην ίδια θερμοκρασία για 1 ώρα και το προϊόν στη συνέχεια συλλέγεται με διήθηση αναρρόφησης. Το καθαρό προϊόν λαμβάνεται μετά από πλύση με ψυχρό DCM. Λευκό στερεό λήφθηκε ως απόδοση 56%.

1Η NMR (500 ΜΗζ,

3, ppm): δ = 7.77-7.74 (m, 4Η), 7,38-7,32 (m, 6Η), 3.77-3.75 (m, 4Η), 2,95-2,93 (m, 4Η)? LRMS (ESI) m /z 217.2 (Μ

-). Η καθαρότητα και οι δομές των ενώσεων επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας Proton Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού Φασματομετρίας (

1 NMR) και φασματομετρία μάζας (σχήματα S1, S2, S3, S4).

Μέτρηση H

2S

Η παραγωγή H

2S είτε από NaHS (Sigma), GYY4137 ή ZYJ1122 (όλα 400 μΜ) προσδιορίστηκε σε κλάσματα (100 μl) που αποσύρονται σε χρονικά διαστήματα (έως 7 ημέρες) από καλλιεργημένα MCF- 7 κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM? Sigma) όπως περιγράφεται παρακάτω. Η συγκέντρωση του H

2S (που προσδιορίζεται ως συνδυασμός των ελεύθερων H

2S, HS

– και S

2-) μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Εν συντομία, μέσο (100 μΙ) αναμίχθηκε με 0,85% w /v μείγμα ψευδαργύρου /οξικού 3% ΝαΟΗ (αναλογία 1: 1, 100 μΙ). Μεθυλενίου μπλε ακολούθως που σχηματίζεται με την προσθήκη Ν, Ν-διμεθυλο-ρ-φαινυλενοδιαμίνη διϋδροχλωρική-βαφή και FeCl

3 (τελικές συγκεντρώσεις, 2,5 mM και 3,3 mM, αντίστοιχα) και η απορρόφηση παρακολουθείται ακολούθως εις 670 nm. Η συγκέντρωση του H

2S (όπως ορίζεται ανωτέρω) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας πρότυπη καμπύλη του NaHS. (0-400 μΜ? R

2 = 0,9987)

Κυτταρική καλλιέργεια και η κυτταρική βιωσιμότητα

Όλες οι κυτταρικές σειρές εκτός HCT-116 λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Ανθρώπινου τραχηλικού καρκινώματος (HeLa), ορθοκολικό καρκίνωμα (HCT-116), ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (Hep G2), οστεοσάρκωμα (U2OS), αδενοκαρκίνωμα του μαστού (MCF-7) και ανθρώπινους ινοβλάστες διπλοειδή πνεύμονα (IMR90 και WI-38) καλλιεργήθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% ν /ν εμβρυϊκό ορό βοοειδούς (FBS? HyClone), πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (100 U /ml? Sigma) και L-γλουταμίνη (2 mM? Caisson) στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2. Ανθρώπινα κύτταρα οξείας προμυελοκυτταρικής λευχαιμίας (HL-60) καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 20% ν /ν FBS καίτοι η ανθρώπινη μυελομονοκυτταρική λευχαιμία (MV 4-11) κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI με 10% ν /ν FBS κάτω από τις ίδιες συνθήκες επώασης. πληθυσμών ζωντανών κυττάρων που επωάστηκαν με NaHS, GYY4137 ή ZYJ1122 (400 ή 800 μΜ) συλλέχθηκαν μετά από 5 ημέρες και μετρήθηκαν εις τριπλούν μετά από χρώση με trypan blue χρησιμοποιώντας αιμοκυτταρόμετρο. απόκριση συγκέντρωσης για GYY4137 (100-1000 μΜ) δημιουργήθηκαν σε MCF-7, HL-60 και MV4-11 εκτέθηκαν σε φάρμακα για 5 ημέρες και η ικανότητα να μειώνουν την επιβίωση αξιολογήθηκε ως IC

50 αξίες. σχηματισμός αποικίας χρησιμοποιώντας κύτταρα MCF-7 αξιολογήθηκε επίσης με μία δοκιμασία κλωνογόνο επιβίωση όπως περιγράφεται αλλού [11]. Εν συντομία, τα κύτταρα MCF-7 (10000) σπάρθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες των 6-φρεατίων παρουσία GYY4137, NaHS ή ZYJ1122 (200 έως 600 μΜ) για 10 ημέρες έως ότου οι αποικίες ήταν εύκολα ορατή. Αποικίες στη συνέχεια χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες (5% w /v) και οι αντιπροσωπευτικές εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ChemiGenius 2 Bio Σύστημα απεικόνισης (SynGene Ltd).

In vivo

αποτελεσματικότητα του GYY4137

Το πειραματικό πρωτόκολλο ζώο έχει περιγραφεί προηγουμένως [12]. Εν συντομία, θηλυκό, σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) (17-20 g, ηλικίας 4-6 εβδομάδων) εκτράφηκαν στο σπίτι και να διατηρείται καθ στα απαλλαγμένα από ειδικά παθογόνα (SPF) μονωτές. Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα HL-60 και MV4-11 κύτταρα (1 χ 10

7) (& gt? 95% βιωσιμότητα) πλύθηκαν δύο φορές σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο και υποδορίως με ένεση στο χαλαρό δέρμα ανάμεσα στις ωμοπλάτες και το αριστερό μπροστινό πόδι του παραλήπτη ποντίκια. Τα ζώα υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με GYY4137 (100, 200 και 300 mg /kg /ημέρα, ΙΡ) ή αλατούχο διάλυμα (1 ml /kg /ημέρα, ip) για 14 ημέρες αρχίζοντας 14 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων στο οποίο σημείο τα ποντίκια είχαν ψηλαφητούς όγκους του 100 χιλιοστά

3 μέσου μεγέθους Όλα τα ζώα παρακολουθούνται στενά. Το βάρος και το μέγεθος του όγκου μετρήθηκαν σε καθημερινή διαστήματα. Για τη μέτρηση του μεγέθους του όγκου, το μήκος (L) και το πλάτος (W) του όγκου μετρήθηκαν με παχύμετρο, και ο όγκος του όγκου (TV) υπολογίστηκε ως TV = (L χ W

2) /2.

Κυτταρικού Κύκλου Ανάλυση και κηλίδωση Western

MCF-7 κύτταρα (40.000) επωάστηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων παρουσία ή απουσία GYY4137 (400 μΜ) για 5 ή 8 ημέρες. Κύτταρα κατεργασμένα με ZYJ1122 χρησιμοποιήθηκαν ως ένας έλεγχος. Για την ανάλυση του προφίλ του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 70% ν /ν αιθανόλη σε πάγο για τουλάχιστον 2 ώρες και στη συνέχεια χρωματίστηκαν σε διάλυμα ιωδιούχου προπιδίου (20 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου, 100 μg /ml RNase Α και 0.1% ν /v Triton Χ-100) για 15 λεπτά στους 37 ° C. Βιτρώ κύτταρα στη συνέχεια υπόκειται σε ανάλυση περιεχομένου του DNA με κυτταρομετρία ροής (Dako κυανό ADP) και τα δεδομένα που λαμβάνονται υποβλήθηκε σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό Σύνοδο Κορυφής (Beckman Coulter). Κυτταρολύματα από MCF-7 υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε ρυθμισμένο με Tris φυσιολογικό ορό (TBS) που περιέχουν μη-λιπαρό ξηρό γάλα (5% β /ο) και στη συνέχεια επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα (1 μg /ml) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν α-PARP, α-διασπάστηκε-PARP, α-διασπάστηκε-κασπάσης 9 (Cell Signaling Ltd.) και α-τουμπουλίνης (Sigma).

Στατιστική ανάλυση

Κυττάρων επιβίωση, IC

50 και όγκων όγκοι εκφράζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (SEM). Για

in vitro μελέτες

, την επιβίωση των κυττάρων και των δύο μη-αγωγή (ΝΤ) και ομάδες αγωγής αναλύθηκε χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από μια post-hoc t τεστ. Για

in vivo

μελέτες, οι συγκρίσεις μεταξύ της ομάδας ελέγχου του οχήματος και διαφορετικές θεραπείες δόση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας γραμμικό μεικτό μοντέλο για τις διαμήκεις ανάλυση δεδομένων με το λογισμικό SPSS (IBM).

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Απελευθέρωση H

2S από NaHS και GYY4137 σε μέσο καλλιέργειας

επώασης είτε NaHS ή GYY4137 σε μέσο καλλιέργειας είχε ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση ανιχνεύσιμων ποσοτήτων H

2S όπως αντανακλάται από την αύξηση της συγκέντρωσης του H

2S (μΜ) μετά από αφαίρεση των κλασμάτων και ανάλυσης για μπλε σχηματισμό μεθυλενίου. Απελευθέρωση H

2S από NaHS ήταν ραγδαία – και κορυφώθηκε σε ή πριν από 20 λεπτά και μειώνεται σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα κατά 90 λεπτά. Σε πλήρη αντίθεση, H

απελευθέρωση 2S από GYY4137 ήταν πολύ χαμηλότερη (& lt? 10% εκείνης που παρατηρείται με NaHS), αλλά διατηρήθηκε, παραμένοντας υψηλότερο από την αρχική τιμή για έως και 7 ημέρες. Αριθ απελευθέρωση H

2S ήταν εμφανές από ZYJ1122, ένας έλεγχος για GYY4137 έλλειψη θείου και επομένως ανίκανος να σχηματίσει H

2S, κάτω από τις ίδιες πειραματικές συνθήκες για έως και 7 ημέρες (Σχήμα 1Α). Οι χημικές δομές των GYY4137 και ZYJ1122 φαίνεται στο ένθετο στο Σχήμα 1Α.

(Α) H

2S απελευθέρωσης προφίλ του NaHS, GYY4137 και ZYJ1122. H

2S απελευθερώνεται από NaHS, και GYY4137 (400 μΜ) προσδιορίστηκε σε κλάσματα (100 μΐ) μέσου αποσύρονται σε χρονικά διαστήματα (έως 7 ημέρες) από καλλιεργημένα κύτταρα MCF-7. Συγκέντρωση του H

2S ποσά αξιολογήθηκε φασματοφωτομετρικά χρησιμοποιώντας Ν, Ν-διμεθυλο-ρ-φαινυλενοδιαμίνη-διυδροχλωρίδιο και αποτελέσματα έδειξαν την H

2S συγκέντρωση (μΜ). H

απελευθέρωση 2S από GYY4137 ήταν σημαντικά διαφορετική (

P

& lt? 0,05) από T = 0 σε όλα τα χρονικά σημεία από 0,3 ώρα έως 7 ημέρες. H

απελευθέρωση 2S από NaHS ήταν σημαντικά διαφορετική (

P

& lt? 0,05) από T = 0 σε όλα τα χρονικά σημεία μέχρι 1,5 ώρες. Καμία ανιχνεύσιμη H

2S απελευθερώθηκε από ZYJ1122 (400 μΜ) υπό τις ίδιες πειραματικές conditons. Τα αποτελέσματα δείχνουν μέση ± s.e. Δηλαδή, η = 3. Οι χημικές δομές των GYY4137 και ZYJ1122 φαίνονται στο ένθετο. καμπύλη (Β) Ανάπτυξη αναλύσεις MCF-7, HL-60 και MV4-11 κύτταρα επεξεργασμένα με NaHS, GYY4137 και ZYJ1122 (400 μΜ) επί 5 ημέρες. Η επιβίωση των κυττάρων προσδιορίστηκε με χρώση trypan blue. Τα αποτελέσματα δείχνουν την ανάπτυξη των κυττάρων ως ποσοστό σε σχέση με τους αριθμούς των κυττάρων NT την ημέρα 5 και είναι μέσες ± s.e. σημαίνει, n = 3.

Η

Επίδραση των NaHS και GYY4137 στην κυτταρική ανάπτυξη και η βιωσιμότητα

Η επίδραση της NaHS, GYY4137 και ZYJ1122 στην ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών τρεις καρκίνου, δηλαδή MCF-7 (αδενοκαρκίνωμα μαστού), MV4-11 (οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία) και HL-60 (μυελομονοκυτταρική λευχαιμία), παρακολουθήθηκε για 5 ημέρες. Σε κάθε ενδεικνυόμενη διάστημα, ο αριθμός των ζώντων κυττάρων από κάθε ομάδα αγωγής καταγράφηκε εις τριπλούν. GYY4137 (400 μΜ) μείωσαν σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και των τριών σειρών καρκίνου ενώ τόσο NaHS και ZYJ1122 ήταν ανενεργά (Σχήμα 1Β).

Για να προσδιοριστεί η επίδραση δύο διαφορετικών συγκεντρώσεων (400 μΜ και 800 μΜ) του GYY4137, NaHS και ZYJ1122 σε ευρύτερη ομάδα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών, κυττάρων επιβίωση των τεσσάρων επιπλέον καρκινικές κυτταρικές σειρές διαφορετικής προέλευσης, δηλαδή τραχηλικού καρκινώματος (HeLa), ορθοκολικό καρκίνωμα (HCT-116), ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (Hep G2) και οστεοσαρκώματος (U2OS κύτταρα) προσδιορίσθηκε σε σύγκριση με δύο κανονικά ανθρώπινα διπλοειδή ινοβλάστες (WI-38 και IMR90) (Σχήμα 2Α). Σε μία περίοδο καλλιέργειας 5 ημερών, NaHS (400 μΜ) απέτυχε να επηρεάσει την επιβίωση οποιασδήποτε από τις επτά σειρές καρκίνου δοκιμάστηκαν. Σε αντίθεση, η επίδραση του GYY4137 στην επιβίωση των κυττάρων ήταν πολύ πιο βαθιά με 30-70% (

P

& lt? 0,01) ποινή σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές στην ίδια συγκέντρωση. Μια υψηλότερη συγκέντρωση του NaHS (800 μΜ) οδήγησε σε μία περαιτέρω, αν και μικρή, μείωση HCT-116, Hep G2 και την επιβίωση των κυττάρων MCF-7 (περίπου 15-30%), αν και πάλι δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην επιβίωση των κυττάρων ήταν εμφανής σε HeLa , HL-60, U2OS και κύτταρα MV 4-11. Σε αντίθεση, GYY4137 στην ίδια συγκέντρωση, μείωσε σημαντικά την επιβίωση κατά περίπου 75-95% σε όλες τις καρκινικές κυτταρικές σειρές. Το απόλυτο βαθμό κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από GYY4137 ποικίλει μεταξύ των κυτταρικών σειρών καρκίνου με μεγαλύτερο αποτέλεσμα στην HepG2, HL-60, MV4-11, MCF-7 και κύτταρα και U2OS τουλάχιστον επίδραση σε κύτταρα ΗΟΤ-116 και HeLa. Για το λόγο αυτό, τα επόμενα πειράματα διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας μία ή περισσότερες από HL-60, MCF-7 και MV4-11 καρκινικά κύτταρα. Σημαντικά, ούτε NaHS ούτε GYY4137 άλλαξε σημαντικά την επιβίωση των ανθρώπινων μη καρκινικών WI-38 και IMR90 ινοβλαστών. Η ένωση ελέγχου του θείου-λείπει, ZYJ1122, ήταν χωρίς σημαντική επίδραση στην επιβίωση του κάθε κυτταρική σειρά, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι παρατηρούμενες επιδράσεις της GYY4137 σε καρκινικά κύτταρα είναι πιθανόν να οφείλεται σε H

απελευθέρωση 2S. Η σχέση συγκέντρωσης-απόκρισης για GYY4137 (100-1000 μΜ) για τη μείωση της επιβίωσης των κυττάρων εξετάστηκε επίσης σε MCF-7, HL-60 και κύτταρα MV 4-11. Το IC

50 τιμές για την ένωση αυτή ήταν 337,1 ± 15,4, 389,3 ± 16,8 και 341,8 ± 21,2 μΜ (όλα τα n = 3), αντίστοιχα (Σχήμα 2Β).

(Α) Η επίδραση της θεραπείας (5 ημέρα), μια σειρά από καρκίνο και μη καρκινικά κύτταρα με NaHS, GYY4137 και ZYJ1122 (400 μΜ ή 800 μΜ) όπως προσδιορίζεται με βαφή κυανούν τρυπανίου. Τα αποτελέσματα δείχνουν ποσοστό της βιωσιμότητας των κυττάρων σε μη αγωγή (ΝΤ) μετά από επώαση εν απουσία θεραπείας φαρμάκου και είναι μέσες ± s.e. σημαίνει, n = 3, (

#

P

& lt? 0,05? *

P

& lt? 0,01). (Β) Οι καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης που δείχνουν την επίδραση της θεραπείας GYY4137 για 5 ημέρες για την επιβίωση των MCF-7, HL-60 και κύτταρα MV 4-11. Τα αποτελέσματα δείχνουν μέση ± s.e. Δηλαδή, η = 3. (C) Αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες που δείχνουν κλωνογόνο δοκιμασίες επιβίωσης των κυττάρων MCF-7 μετά την έκθεση (5 ημέρες, 200-600 μΜ) είτε NaHS (άνω σειρά), GYY4137 (μεσαία σειρά) και ZYJ1122 (κάτω σειρά) . ΝΤ = μη-θεραπεία.

Η

Επίσης, αξιολογήθηκε η επίδραση της NaHS, GYY4137 και ZYJ1122 (200-600 μΜ) στην επιβίωση των κυττάρων MCF-7

in vitro

χρησιμοποιώντας ένα κλωνογονικού χημική δοκιμή. Οι αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες φαίνεται στο Σχήμα 2C. Για αυτά τα πειράματα, MCF-7 κύτταρα απλώθηκαν σε παρουσία ή απουσία φαρμάκων και καλλιεργήθηκαν επί μία περίοδο 10 ημερών. GYY4137 προκάλεσε εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση απώλεια του σχηματισμού αποικίας κυττάρου που ήταν κοντά στην μέγιστη σε συγκέντρωση 600 μΜ. απώλεια κυττάρων δεν ήταν εμφανής και στις δύο NaHS και δείγματα επεξεργασμένα ZYJ1122.

Η επίδραση της GYY4137 (400 μΜ, 5 ή 8 ημέρες) σε κύτταρα MCF-7 εξετάστηκε επίσης χρησιμοποιώντας ανάλυση κυτταρικού κύκλου. Ο πληθυσμός υπο-G1 των κυττάρων MCF-7 εκτέθηκαν σε GYY4137 ήταν σημαντικά υψηλότερη (

P

& lt? 0,05) σε σύγκριση είτε σε μη επεξεργασμένα κύτταρα ή κύτταρα που εκτέθηκαν στην ίδια συγκέντρωση του ZYJ1122 την ημέρα 5 (Σχήμα 3Α ). Έτσι, ο πληθυσμός υπο-G1 των κυττάρων σε επεξεργασία με GYY4137 αντιπροσωπεύεται 7,5% του συνολικού κυτταρικού πληθυσμού την ημέρα 5 και 14,8% την ημέρα 8 της θεραπείας σε σύγκριση με περίπου 1% των κυττάρων τα οποία είτε δεν έλαβαν αγωγή ή είχαν εκτεθεί σε ZYJ1122 ( Σχήμα 3Α). Επιπλέον, υπήρξε μια σημαντική συσσώρευση του πληθυσμού κυττάρου 4Ν-DNA σε κύτταρα κατεργασμένα με GYY4137 (έως 18,6% και 26,6% μετά από 5 και 8 ημέρες επώασης αντίστοιχα) σε σύγκριση με είτε χωρίς αγωγή (14.8%) ή ZYJ1122 φάρμακο (14 ) κύτταρα% (Σχήμα 3Α). Σε περαιτέρω πειράματα, η πιθανότητα ότι GYY4127 προκαλεί θάνατο των καρκινικών κυττάρων με την προώθηση της απόπτωσης μελετήθηκε επίσης. Ένα ισχυρό σήμα για την σχάση-PARP και ενεργοποιημένη κασπάση 9 ανιχνεύθηκε σε MCF 7-δείγματα που κατεργάζονται με GYY4137 (400 μΜ, 5 ημέρες) με ένα πολύ μειωμένο σήμα σε κύτταρα κατεργασμένα με ZYJ1122 (Σχήμα 3Β). Είναι ενδιαφέρον, καμία διάσπαση της PARP και καμία ενεργοποίηση της κασπάσης 9 παρατηρήθηκαν σε IMR90 κύτταρα επωάστηκαν είτε με GYY4137 ή ZYJ1122.

(Α) Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου των κυττάρων MCF-7 μετά από 5 ημέρες (NT και ZYJ1122) και 5 και 8 ημέρες (GYY4137) φαρμακευτική αγωγή. Ένθετα δείχνουν ποσοστιαία κατανομή των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι ενδεικτικές από 3 μεμονωμένα πειράματα. ΝΤ: μη-θεραπεία. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των δεικτών απόπτωσης (α-διασπασμένο-PARP, α-διασπάστηκε-κασπάση 9) του MCF-7 και IMR90 επεξεργασία (5 ημέρες) με GYY4137 ή ZYJ1122 (αμφότερα 400 μΜ). Το αντι-διασπασμένη κασπάση-9 αντίσωμα που χρησιμοποιείται ανιχνεύει το μεγάλο θραύσμα της κασπάσης-9 μετά τη διάσπαση, αλλά δεν αναγνωρίζει διασπασμένο procaspase-9. α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι ενδεικτικά των 3 ξεχωριστών πειραμάτων.

Η

Επίδραση των GYY4137 στην αύξηση του όγκου

in vivo

Η

Η υποδόρια μεταμόσχευση είτε HL-60 ή κύτταρα MV 4-11 είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη του όγκου εξαρτώμενο από το χρόνο στον SCID ποντικό (Εικόνα 4Α, Β). Ο όγκος του όγκου στο τέλος του πειράματος ήταν 3024 ± 220 mm

3 και 1166 ± 199 mm

3 (n = 4-6) σε ζώα που λαμβάνουν καθημερινά ένεση οχήματος και να χορηγηθούν HL-60 και κύτταρα MV 4-11 αντίστοιχα . Η χορήγηση GYY4137 σε καθημερινή βάση είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική (

P

& lt? 0,05) σχετίζεται με τη δόση αναστολή της ανάπτυξης του όγκου και στις δύο σειρές των ζώων. GYY4137 (στην υψηλότερη δόση που χρησιμοποιείται, δηλαδή 300 mg /kg) την ημέρα για 14 ημέρες μείωσε τον όγκο του όγκου κατά 52,5 ± 9,2% (n = 6) και 55.3 ± 5.7% (η = 4) σε HL-60 και MV4-11 εγχύθηκε ζώα. Αν και δεν μετρηθεί αντικειμενικά σε αυτά τα πειράματα, η θεραπεία GYY4137 δεν επηρέασε βάρους του ζώου ή μεικτό συμπεριφορά.

Οι αλλαγές στον όγκο των εγκατεστημένων όγκων σε, (Α) HL-60 ποντικούς ξενομοσχεύματος (Β) MV 4-11 ποντικούς ξενομοσχεύματος αγωγή ημερησίως είτε με GYY4137 (100, 200 και 300 mg /kg, ip) ή ελέγχου του οχήματος. Η θεραπεία με GYY4137 μείωσε σημαντικά τον όγκο του όγκου σε δύο ζωικά μοντέλα, με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Τα αποτελέσματα δείχνουν αλλαγές του όγκου του όγκου σε μέση ± s.e. σημαίνει (n = 4-6, #

P

& lt? 0,05? *

P

& lt? 0,01).

Η

Συζήτηση

έκθεση εδώ ότι, (i) GYY4137 (αλλά όχι NaHS) προκαλεί μία εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση μείωση στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, (ii) ούτε GYY4137 ούτε NaHS, χρησιμοποιώντας πανομοιότυπη συγκεντρώσεις και πειραματικές συνθήκες, επηρέασε την επιβίωση των κανονικών, δηλαδή μη καρκινικά κύτταρα, (iii) GYY4137 προωθείται καρκινικών κυττάρων (MCF-7), αλλά όχι κανονικό κύτταρο (IMR90) απόπτωσης όπως υποδεικνύεται από μετρήσεις του πληθυσμού υπο-G1 και με παρατήρηση της διασπασμένης ΡΑΚΡ και διασπασμένη κασπάση 9 και ενεργοποιείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων MCF-7 σε η G

2 /M φάση, (iv) το h

συγκέντρωση 2S ανιχνεύεται σε μέσο που περιέχει κύτταρα MCF-7 υπέρβαση των επιπέδων «βασική» για έως και 7 ημέρες μετά την έκθεση σε GYY4137 αλλά για λιγότερο από 2 ώρες μετά την έκθεση να NaHS, (v) ZYJ1122, ένας έλεγχος για GYY4137 έλλειψη θείου και επομένως ανίκανος να σχηματίσει H

2S, ήταν ανενεργά σε όλες τις περιπτώσεις και, (vi) GYY4137 χορηγείται καθημερινά σε ανοσοανεπάρκεια ποντικούς για 14 ημέρες προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση στον όγκο που προκαλείται από την ανάπτυξη πριν την έγχυση ενός από δύο ανθρώπινες κυτταρικές σειρές λευχαιμίας.

Έτσι, η παρούσα δεδομένων αποκαλύπτει, για πρώτη φορά, ένα αντικαρκινικό αποτέλεσμα της αργής απελευθέρωσης H

2S δότη , GYY4137. Όλα τα καρκινικά κύτταρα που δοκιμάστηκαν ήταν επιρρεπή σε αυτή την ένωση αν και σε διαφορετικό βαθμό. Είναι πλέον καλά τεκμηριωμένο ότι NaHS απελευθερώνει μεγάλες ποσότητες H

2S σε μικρό χρονικό διάστημα. Στα παρόντα πειράματα, δείχνουμε ότι GYY4137, όπως NaHS, απελευθερώνει επίσης H

2S μετά από επώαση σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει κύτταρα MCF-7 επιβεβαιώνοντας έτσι προηγούμενες παρατηρήσεις μας αυθόρμητης H

2S παραγωγή σε υδατικό [8] media. Από ZYJ1122 δεν παρουσίασαν αντικαρκινική δράση σε οποιοδήποτε από τα

in vitro

μοντέλα καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η αντικαρκινική δράση τόσο GYY4137 και NaHS (σε υψηλή συγκέντρωση) είναι πολύ πιθανό να είναι H

2S- εξαρτώμενος. Ίσως προκαλεί έκπληξη, GYY4137 εμφάνισαν μεγαλύτερη δραστικότητα θανάτωσης των καρκινικών κυττάρων από ό, τι NaHS

in vitro

μολονότι οδηγεί σε σημαντικά χαμηλότερες συγκεντρώσεις H

2S στο μέσο των κυττάρων. Έτσι, η βέλτιστη θανάτωση των καρκινικών κυττάρων από H

2S υπό αυτές τις πειραματικές συνθήκες φαίνεται να γίνεται σε χαμηλές συγκεντρώσεις της εξάπλωσης αερίου επί μία περίοδο αρκετών ημερών σε αντίθεση με μια πολύ υψηλότερη συγκέντρωση επιτυγχάνεται σε μικρότερο χρονικό διάστημα μετά την έκθεση του κύτταρα να NaHS. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ενώ σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις GYY4137 (δηλαδή 400-800 μΜ) που απαιτείται για το σκοπό αυτό, η αποτελεσματική συγκέντρωση του H

2S παράγεται είναι πολύ λιγότερο δηλαδή & lt? 20 μΜ με βάση τις μετρήσεις σε μέσο καλλιέργειας. Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι GYY4137 μπορεί να συσσωρευτεί στο εσωτερικό των καρκινικών κυττάρων και έτσι να απελευθερώνουν μεγαλύτερες ποσότητες H

2S ενδοκυτταρικά. Με αυτή την επιφύλαξη κατά νου, η παρούσα δεδομένα συνεπάγεται ότι ο ρυθμός με τον οποίο τα κύτταρα εκτίθενται σε H

2S, καθώς και η συγκέντρωση του H

2S συναντήσει είναι κρίσιμη για τον καθορισμό της ικανότητας αυτού του αερίου για την προώθηση της θανάτωσης των κυττάρων.

είναι ενδιαφέρον, ούτε GYY4137 ούτε NaHS προκάλεσε σημαντική θανάτωση της κανονικής δηλαδή μη καρκινικά κύτταρα που υποδηλώνει ότι η επίδραση των δύο H

2S δωρητές είναι ειδική για τα καρκινικά κύτταρα. Ο μηχανισμός δράσης της θανάτωσης επίδραση των καρκινικών κυττάρων του GYY4137 έχει επίσης διερευνηθεί. Η επεξεργασία των κυττάρων MCF-7 με GYY4137 οδήγησε σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G

2 /M φάση και προαγωγή της απόπτωσης όπως αποδεικνύεται από αύξηση του πληθυσμού υπο-G1, καθώς και η παρουσία τόσο διασπασμένη PARP και διασπασμένη κασπάση 9. Δεν σημαντική επίδραση είτε επί του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση σε ήταν εμφανής σε ZYJ1122-επεξεργασμένα κύτταρα υποδεικνύοντας και πάλι ότι και οι δύο αυτές ενέργειες ήταν δευτερογενείς προς την παρατεταμένη έκθεση των κυττάρων σε χαμηλά επίπεδα H

2S. Η ικανότητα του H

2S να προκαλέσει καρκίνο θανάτωσης κυττάρων με τον τρόπο αυτό δεν έχει προηγουμένως αναφερθεί. Ωστόσο, H

2S έχει προηγουμένως δειχθεί ότι επηρεάζουν τόσο του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Για παράδειγμα, Η

2S προωθεί την είσοδο του κυτταρικού κύκλου και τον πολλαπλασιασμό των εντερικών IEC-18 κυττάρων

in vitro

ενεργοποιώντας ΜΑΡΚ [13]. H

2S μπορούν επίσης να επιδεικνύουν τόσο προ- (π.χ. [14]) και αντι- (π.χ. [15]) αποπτωτική δραστικότητα, ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου μελετηθεί και τις πειραματικές συνθήκες, ιδιαίτερα η συγκέντρωση του H

2S χρησιμοποιούνται. Ένας αριθμός δυνητικών μοριακών στόχων έχουν εμπλακεί στην επίδραση του H

2S στην απόπτωση, συμπεριλαμβανομένων ρ38 και κασπάσης-3 [15], [16], άλλα ΜΑΡΚ όπως ΜΕΚ και JNK [17], καθώς και επαυξημένης παραγωγής πρωτεΐνη θερμικού σοκ (HSP-90) [18]. Ενώ η ακριβής κυτταρικός μηχανισμός δράσης των GYY4137 παραμένει ασαφής, δεν φαίνεται παράλογο ότι H

2S, απελευθερώνεται αργά επί μία περίοδο αρκετών ημερών, μπορεί να επηρεάσει οξειδοαναγωγής μηχανισμούς εντός του κυττάρου για να επιτευχθεί η αντικαρκινική δράση. Υπό αυτό το πρίσμα, θα μπορούσε να είναι ενδιαφέρον να αξιολογηθεί η επίδραση των GYY4137 στα επίπεδα του ενζύμου αντιδραστικά είδη οξυγόνου γενιάς και αντι-οξειδωτικό σε καρκινικά κύτταρα.

Εν κατακλείδι, GYY4137 εμφανίζει αντικαρκινική δράση των κυττάρων τόσο

in vitro

και

in vitro

. Προτείνουμε ότι GYY4137 καταρρέει αργά για να δώσει H

2S οποία, με ένα συνδυασμό διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την προώθηση της απόπτωσης, αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου. Αριθ κυτταρικού θανάτου ήταν εμφανής σε μη-καρκινικά κύτταρα. Είτε τέτοια κύτταρα απλά σπάσει H

2S με ταχύτερο ρυθμό ή αν τα καρκινικά κύτταρα είναι μοναδικά ευαίσθητα στην επίδραση δολοφονία του αερίου αυτού απαιτεί περαιτέρω μελέτη. Το εύρημα ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να θανατωθούν επιλεκτικά όταν εκτίθεται σε σχετικά μικρές ποσότητες H

2S σε σχετικά μεγάλο χρονικό διάστημα είναι το κλειδί. Η παρατήρηση αυτή θα πρέπει να ληφθεί υπόψη σε κάθε μελλοντική εργασία εξετάζει το ρόλο που διαδραματίζει η H

2S στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, αλλά και στην ανάπτυξη νέων H

2S-based αντι-καρκινικοί παράγοντες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

1 NMR φάσμα Gyy 4137.

doi: 10.1371 /journal.pone.0021077.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Μαζική φασματομετρία φάσμα Gyy 4137.

doi: 10.1371 /journal.pone.0021077.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

1 NMR φάσμα ZYJ1122.

doi: 10.1371 /journal.pone.0021077.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

Μαζική φασματομετρία φάσμα ZYJ1122.

doi: 10.1371 /journal.pone.0021077.s004

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Είμαστε ευγνώμονες στον Δρ Thilo Hagen για τις πολύτιμες υποδείξεις του σχετικά με την πειραματική σχέδια, και ο Δρ Zhao Yudong για τις συμβουλές του για

in vivo

ανάλυση των δεδομένων. Ευχαριστούμε τον Δρ Bert Vogelstein για την παροχή κυτταρική γραμμή HCT-116.