Αφηρημένο

πλουμπαγκίνη, ένα quinonoid που βρέθηκαν στις εγκαταστάσεις της Plumbaginaceae, έχει θεραπευτικές ιδιότητες. Σε αυτή τη μελέτη διερευνήσαμε την αντι-πολλαπλασιαστική και αποπτωτική δραστικότητα πλουμπαγκίνη χρησιμοποιώντας δύο ανθρώπινες κολονικού καρκινικές κυτταρικές σειρές, ΗΤ29 και HCT15. IC50 του πλουμπαγκίνη για HCT15 και ΗΤ29 κύτταρα (22,5 μΜ και 62,5 μΜ, αντίστοιχα) ήταν σημαντικά διαφορετικές. Για να μελετηθεί η απόκριση των καρκινικών κυττάρων κατά την διάρκεια στρατηγικές θεραπείας, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις, 15 μΜ, 30 μΜ για HCT15 και 50 μΜ, 75 μΜ για τα κύτταρα ΗΤ29. Αν και η ενεργοποίηση του ΝΡκΒ, κασπάσες-3, αυξημένα επίπεδα του

ΤΝΡ-α

, κυτοσολικό Κυτοχρώματος C παρατηρήθηκαν σε αμφότερες τις HCT15 κύτταρα ΗΤ29 σε επεξεργασία με plumbagin, έκτροπη απόπτωση με μειωμένο επίπεδο pEGFR, pAkt, pGsk-3β, PCNA και Κυκλίνη D1was παρατηρήθηκε μόνο σε 15 μΜ και 30 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται HCT15 και 75 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται ΗΤ29 κύτταρα. Αυτό υποδηλώνει ότι πλουμπαγκίνη προκαλεί απόπτωση στα δύο HCT15 κύτταρα και ΗΤ29 αγωγή, ενώ, ο πολλαπλασιασμός ανεστάλη μόνο σε 15 μΜ και 30 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται HCT15 και 75 μΜ πλουμπαγκίνη αγωγή ΗΤ29 κύτταρα, αλλά όχι σε 50 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται ΗΤ29 κύτταρα. Η έκφραση της COX-2 μειώθηκε σε 75 μΜ πλουμπαγκίνη κατεργασμένων κυττάρων ΗΤ29 όταν σε σύγκριση με 50 μΜ πλουμπαγκίνη αγωγή ΗΤ29 κύτταρα, ενώ HCT15 κύτταρα στερούνται COX. Ως εκ τούτου, η παρατηρηθείσα αντίσταση στην επαγωγή της απόπτωσης σε 50 μΜ πλουμπαγκίνη επεξεργασμένα κύτταρα ΗΤ29 αποδίδονται στην έκφραση της COX-2. Εν κατακλείδι, πλουμπαγκίνη προκαλεί απόπτωση στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου μέσω του TNF-α μονοπάτι με τη μεσολάβηση ανάλογα με την έκφραση της έκφρασης της COX-2

Παράθεση:. Subramaniya BR, Srinivasan G, Μοχάμεντ Σαντουλάχ SS, Davis Ν, Baddi Reddi Subhadara L , Halagowder D, et al. (2011) Apoptosis επαγωγική δράση του πλουμπαγκίνη για καρκινικά κύτταρα του κόλου Εξαρτάται από έκφραση της COX-2. PLoS ONE 6 (4): e18695. doi: 10.1371 /journal.pone.0018695

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: 17 του Δεκέμβρη του 2010? Αποδεκτές: 9 του Μαρτίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 29 Απριλίου 2011

Copyright: © 2011 Subaramaniya et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Φαρμακευτικά Φυτά Διοικητικό συμβούλιο, η κυβέρνηση της Ινδίας, με τον Δρ Σ Niranjali Devaraj. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια πρωταρχική ανησυχία για τη δημόσια υγεία στην ανθρωπότητα και είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου στις Ηνωμένες Πολιτείες [1]. Πρόσφατα στοιχεία σχετικά με καρκίνο του παχέος εντέρου είναι ανησυχητικό με περίπου 153.760 περιπτώσεις CRC συμπεριλαμβανομένων 52.180 θανάτους το 2007 [1], [2]. Εξέλιξη από φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του κόλου σε ορθοκολικό καρκίνωμα είναι μια διαδικασία πολλών σταδίων. Ακόμα κι αν υπάρχουν πολλοί παράγοντες, όπως, απώλεια ή μετάλλαξη σε γονίδια καταστολής όγκων, επιγενετικές μεταβολές που ελέγχει την κυτταρική επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αγγειογένεση, φλεγμονή διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και την πρόοδο CRC [3] – [8].

ΝΡ-κΒ είναι βασικός φλεγμονώδους μεσολαβητή που εμπλέκονται στην έναρξη, την εξέλιξη και τη μετάσταση του CRC [9]. Μια ποικιλία των καρκινογόνων και προαγωγών όγκου έχουν δειχθεί ότι ενεργοποιούν ΝΡ-κΒ και συστατική έκφραση του ΝΡ-κΒ συναντάται συχνά σε καρκινικά κύτταρα. Αρκετά γονίδια που εμπλέκονται στην έναρξη του όγκου, την προώθηση, και μετάσταση ρυθμίζονται από ΝΡ-κΒ καθώς και την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ καταστέλλει την απόπτωση και προωθεί τον πολλαπλασιασμό. Ως εκ τούτου, οι παράγοντες που μπορούν να ρυθμίζουν προς τα κάτω την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ ως εκ τούτου, θα έχουν τη δυνατότητα να αναστέλλουν την ανάπτυξη του καρκίνου.

πλουμπαγκίνη (5-υδροξυ-2-μεθυλο-1,4-ναφθοκινόνη), ένα quinonoid, που βρέθηκαν στα φυτά των οικογενειών Plumbaginaceae, Droseraceae, Ancestrocladaceae και Dioncophyllaceae. Η κύρια πηγή της πλουμπαγκίνη είναι η ρίζα του

Plumbago zeylanica

L. (επίσης γνωστή ως «Chitrak»). Πλουμπαγκίνη έχει αποδειχθεί ότι ασκεί αντικαρκινικές, αντιαθηροσκληρωτική και αντιμικροβιακές επιδράσεις [10] – [13]. Η ρίζα του

P. zeylanica

L. έχει χρησιμοποιηθεί στην ινδική ιατρική για ~2,750 χρόνια και συστατικό της έχουν αντιαθερογενητικά, καρδιοτονωτικές, το συκώτι και έχει νευροπροστατευτικές ιδιότητες [11].

Sugie et al. [14] έχουν δείξει ότι η πλουμπαγκίνη ανέστειλε σημαντικά αζοξυμεθάνιο επαγόμενη εντερική καρκινογένεση σε αρουραίους, υποδεικνύοντας χημειοπροληπτική δραστικότητα της. Πλουμπαγκίνη έχει επίσης δειχθεί ότι επάγει S-G2 /M διακοπή του κυτταρικού κύκλου μέσω της επαγωγής ρ21 (ένας αναστολέας του εξαρτάται από κυκλίνη κινάση) [15]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι πλουμπαγκίνη προκαλεί απόπτωση μέσω αναστολής του ΝΡ-κΒ σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπινων χρόνια μυελοειδή λευχαιμία, την ανθρώπινη πολλαπλό μυέλωμα, ανθρώπινα εμβρυονικά κύτταρα καρκινώματος νεφρού και καρκίνος του μαστού [16], [17]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την αντι-πολλαπλασιαστική και αποπτωτική δραστικότητα πλουμπαγκίνη από

in vitro

πειραματικά μοντέλα με τη χρήση δύο ανθρώπινα κολικά καρκινικές κυτταρικές σειρές, ΗΤ29 και HCT15. Περαιτέρω, ο μηχανισμός της αντικαρκινικής δράσης της πλουμπαγκίνη καθιερώθηκε με ανάλυση ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και μόρια σηματοδότησης που σχετίζονται με την κυτταρική επιβίωση και την απόπτωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια και συντήρηση

κόλου ανθρώπου κυτταρικές γραμμές όγκου ΗΤ29 και HCT15 ελήφθησαν από NCCS Pune. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Dulbeccos Modified Eagle Medium (ϋΜΕΜ, GIBCO BRL, Germany) συμπληρωμένο με 10% FBS (Sigma, USA), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, 10-20 μg /ml μαΛτΗ φουγκιζόνη (HIMEDIA, Ινδία ), pH 7,4 σε 25 εκατοστά

2, φιάλες καλλιέργειας ιστού (HIMEDIA, Ινδία) στους 37 ° C υπό 5% CO

2 και 95% αέρα.

Θεραπεία

πλουμπαγκίνη αγοράστηκε από τη Sigma. Ένα 100 mM διάλυμα πλουμπαγκίνη παρασκευάστηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO), αποθηκεύονται ως μικρές ποσότητες στους -20 ° C και στη συνέχεια αραιώθηκε όπως απαιτείται σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας. Μελέτες δόσης-απόκρισης διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η κατάλληλη δόση για την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων και την επαγωγή της απόπτωσης.

ΜΤΤ δοκιμασία

Ευαισθησία ΗΤ29 και HCT15 κυττάρων σε πλουμπαγκίνη προσδιορίστηκε με τη ΜΤΤ χρωματομετρική δοκιμασία [18]. Κύτταρα (1 χ 10

3 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκα επίπεδου πυθμένα των 96 φρεατίων και επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C και σε 5% CO2. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές εκτέθηκαν σε πλουμπαγκίνη (1, 2,5, και 5 μΜ για 24 ώρες). Οι διαλύτη DMSO επεξεργασμένα κύτταρα χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντιδραστήριο ΜΤΤ (10 μΙ /φρεάτιο) για 4 ώρες στους 37 ° C και στη συνέχεια ισοπροπανόλη (100 μΙ) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για να διαλυθούν οι κρύσταλλοι φορμαζάνης. Η οπτική πυκνότητα (OD) καταγράφηκε στα 570 nm σε έναν αναγνώστη μικροπλάκας. Ποσοστό της υπολειμματικής κυτταρικής βιωσιμότητας προσδιορίστηκε ως [1- (OD επεξεργασμένων κυττάρων /OD κυττάρων ελέγχου)] χ 100.

Επίδραση της πλουμπαγκίνη επί PBMC

PBMC απομονώνεται από ηπαρινωμένο φλεβικό αίμα ελήφθη από έναν υγιή άνθρωπο εθελοντή με Ficoll-Paque (Histopaque 1077, Sigma Aldrich Inc., USA) φυγοκέντρηση κλίσης πυκνότητας σύμφωνα με τη συνήθη διαδικασία [19]. PBMC (1 χ 105 κύτταρα /φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν σε πλήρες RPMI-1640 ως συνήθως και επωάστηκαν με πλουμπαγκίνη για 48 ώρες που ακολουθείται από δοκιμασία ΜΤΤ.

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής

Τόσο ΗΤ29 και HCT15 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση σε 1700

g

. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής του κυτταρικού κύκλου έγινε με χρώση των διαπερατών κυττάρων με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) για την περιεκτικότητα σε DNA. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε PBS, μονιμοποιήθηκαν με 70% αιθανόλη, χρωματίστηκαν με διάλυμα ΡΙ (0,05 mg /ml ΡΙ, 2 mg /ml RNase Α, 0,1% TritonX-100 σε PBS) και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (RT) σε σκοτάδι. Η ένταση φθορισμού μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής (Becton-Dickinso) χρησιμοποιώντας διέγερσης και εκπομπής μήκη κύματος 488 και 525 nm, αντίστοιχα. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

Comet δοκιμασία

Η δοκιμασία κομήτη διεξήχθη σύμφωνα με τη μέθοδο των Singh et al. (1988) [20] με μικρές τροποποιήσεις. ΗΤ29 και HCT15 κύτταρα (5 × 10

5) σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και εκτίθενται στις επιθυμητές συγκεντρώσεις plumbagin (η τελική συγκέντρωση του DMSO να μην υπερβαίνει το 0,1%, έλεγχοι ταυτόχρονα σε επεξεργασία με 0,1% DMSO) για συγκεκριμένες περιόδους του χρόνου. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση στις 1500 rpm. Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε 60 μΙ PBS (ρΗ 7.4). 10 μΐ κυτταρικού εναιωρήματος αναμίχθηκαν με 100 μΐ 1% χαμηλής τήξης αγαρόζη και 75 μΙ αυτού του κυτταρικού-αγαρόζη μίγμα απλώθηκε επί μικροσκοπικών διαφανειών προεπικαλυμμένα με 1% αγαρόζης. Μια τρίτη στρώση του 0,5% αγαρόζης χαμηλής τήξεως (75 ml) εφαρμόζεται πάνω από το στρώμα του αγαρόζης με το κυτταρικό εναιώρημα. Τα πλακίδια επωάστηκαν για 1 ώρα σε ένα διάλυμα λύσης (2.5 Μ NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton Χ-100, 1% SDS, ρΗ 10). Ακολούθως τα κύτταρα εκτέθηκαν σε ένα αλκαλικό ρυθμιστικό διάλυμα (300 mM NaOH, 1 mM δινάτριο EDTA) για 30 λεπτά. Οι μικροσκοπικές πλάκες υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε 0,8 V /cm-1 για 30 λεπτά μετά το οποίο ολισθαίνει εμβαπτίζονται σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα εξουδετέρωσης (0.4 Μ Tris, ρΗ 7.5) για 15 λεπτά. Μετά από χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο (20 μg /ml) ολισθαίνει αναλύθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon PCM-2000). Εικόνες τουλάχιστον 50 κύτταρα από τρεις διαφάνειες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Cometscore ™. Για επιλέχθηκαν καθένα κομήτη δύο τομείς: το σύνολο του κυτταρικού DNA και μια περιοχή που περιέχει μόνο την περιοχή της κεφαλής του κομήτη. Σε κάθε επιλογή οι πυκνότητες μετρήθηκαν και τα αποτελέσματα παρουσιάστηκαν ως στιγμή ουρά ορίζεται ως το αποτέλεσμα του ποσοστού του DNA στην ουρά πολλαπλασιασμένο επί το μήκος της ουράς.

Απομόνωση RNA

Για την παρασκευή του συνολικού RNA, η φαινόλη – χρησιμοποιήθηκε θειοκυανικό γουανιδίνιο βάση Αντιδραστήριο Tri (GeNei ™, Bangalore). Σε 10

7 κύτταρα, 1 ml αντιδραστηρίου Tri προστέθηκε και λύθηκαν με επαναλαμβανόμενη χρήση πιπέτας και αφέθηκε να παραμείνει για 5 λεπτά και ακολούθησε προσθήκη 200 μΐ χλωροφορμίου για διαχωρισμό φάσεων .Vigorously στροβιλίστηκε για 15 δευτερόλεπτα και αφήνεται σε ηρεμία επί 15 λεπτά που ακολουθείται από φυγοκέντρηση στα 12.000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C. Η ανώτερη υδατική στιβάδα που περιέχει RNA μεταφέρθηκε σε ένα φρέσκο ​​στείρο σωληνάριο μικροφυγοκέντρου αγωγή DEPC. Σε αυτό, προστέθηκαν 500 μΙ παγωμένου ισοπροπανόλης, αναμιγνύεται ήπια και αφέθηκε σε ηρεμία για 10 λεπτά και φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και το σφαιρίδιο του RNA πλύθηκε με 1 ml 75% αιθανόλης σε DEPC επεξεργασμένου νερού και πάλι σε φυγοκέντρηση σε 14,000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C για να πάρετε ολικού RNA. Αυτό το σφαιρίδιο διαλύθηκε σε 25 μΐ αποστειρωμένου RNase ελεύθερο νερό με θέρμανση στους 55 ° C για 20 λεπτά και αποθηκεύτηκε στους -20 ° C μέχρι τη χρήση.

Αντίστροφη μεταγραφάση αντίδραση αλύσου πολυμεράσης (RT-PCR)

για τη σύνθεση cDNA, ενός αντίστροφου διαλύματος αντίδρασης μεταγραφής που περιέχει 1,0 μg ολικού RNA σε RNase /άνευ ϋΝάσης ύδωρ και 1,5 μΙ τυχαίων εκκινητή εξαμερούς (GeNeiTM, Bangalore) επωάστηκαν για 10 λεπτά στους 72 ° C και ψύχθηκαν αμέσως. Σε αυτό, 5,0 μΙ προαναμιγνύονται 10 mM διαλύματος dNTP (GeNeiTM, Bangalore), 3.0 μΐ 10 χ Μ-ΜΕν αντίστροφη ρυθμιστικό μεταγραφάσης (GeNeiTM, Bangalore), 1,0 μΐ (200 μονάδες /μΙ) M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (GeNeiTM, Bangalore) , προστέθηκαν και συμπληρώνεται έως 50 μl χρησιμοποιώντας αποστειρωμένο RNase /άνευ ϋΝάσης ύδωρ.

για να ενισχυθεί το cDNA, αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) έτοιμο μίγμα (GeNeiTM, Bangalore) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα δείγματα PCR μετουσιώθηκαν στους 94 ° C για 5 λεπτά πριν από την ποδηλασία και παρατάθηκε για 10 λεπτά στους 72 ° C μετά την ποδηλασία. Η δοκιμασία PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές διεξήχθη για 39 κύκλους στους 94 ° C για 60 s, 60 ° C για 60 s, και 72 ° C για 60 s. Εκκινητές για GAPDH, COX-2, οι ΤΝΡ-α φαίνεται στον Πίνακα 1. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Primer3 διατίθεται δωρεάν στο https://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm και αλληλουχία νουκλεϊκών οξέων που είχε πρόσβαση από https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fci?val=Reference ID πίνακα. Οι εκκινητές αγοράστηκαν από την Integrated DNA τεχνολογίες, ΗΠΑ. Περαιτέρω, η έκφραση της COX-2 και TNF-α αναλύθηκε ημι ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού πληροφορικής SCAN ΟΗΕ.

Η

Απομόνωση της πρωτεΐνης

Σε 0,5 ml υπερκείμενου φαινόλης-αιθανόλης, 3 όγκων ακετόνη προστέθηκαν για να καθιζάνουν οι πρωτεΐνες. Τα δείγματα αναμίχθηκαν με αναστροφή για 10-15 δευτερόλεπτα για να ληφθεί ένα ομογενές διάλυμα και αφέθηκε να παραμείνει για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η πρωτεΐνη καταβυθίστηκε με φυγοκέντρηση στα 12.000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και σφαιρίδιο διασπείρεται σε 0.5 ml υδροχλωρικής 0,3 Μ γουανιδίνη σε 95% αιθανόλη με 2.5% γλυκερίνη (V:V). Μετά από διασπορά του ιζήματος, ένα άλλο 0,5 ml από το διάλυμα πλύσεως υδροχλωρικής γουανιδίνης /αιθανόλη /γλυκερίνη προστέθηκε στο δείγμα και αποθηκεύεται για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η πρωτεΐνη κατακρημνίσθηκε υπό 8000 g για 5 λεπτά στους 4 ° C. Το διάλυμα πλύσεως απομακρύνθηκε και δύο ακόμη πλύσεις εκτελέστηκαν σε 1 ml το καθένα από το διάλυμα πλύσεως γουανιδίνης /αιθανόλης /γλυκερόλης. Τελική πλύση πραγματοποιήθηκε με 1 ml αιθανόλης που περιέχει 2,5% γλυκερίνη (V:V). Η πρωτεΐνη ιζηματοποιήθηκε από φυγοκέντρηση στα 8000 g για 10 λεπτά στους 4 ° C και ξηραίνεται στον αέρα για 5 λεπτά. Μετά ξήρανση στον αέρα για λίγο, το σφαιρίδιο πρωτεΐνη διαλύθηκε σε 1% SDS. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης των κυτταρολυμάτων εκτιμήθηκαν σύμφωνα με Lowry et al., 1951 [21] και ίσες συγκεντρώσεις του πρωτεϊνικού κλάσματος έτρεξαν σε ηλεκτροφόρηση πηκτής δωδεκυλ θειικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και immunobloted με ειδικά αντισώματα.

siRNA επιμόλυνση

γονίδιο COX-2 σίγησε με επιμόλυνση COX-2 siRNA. Σε ένα πλακίδιο καλλιέργειας έξι φρεατίων, 2 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε 2 ml αντιβιοτικού μέσου ελεύθερου φυσιολογική ανάπτυξη συμπληρωμένο με FBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε CO

2 επωαστήρα έως ότου τα κύτταρα ήταν 60-80% συρροή. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε πριν από την επιμόλυνση. Τα ακόλουθα διαλύματα παρασκευάστηκαν: Διάλυμα Α: Για κάθε διαμόλυνση, αραιώνονται 6 μΙ siRNA διπλής όψης (δηλαδή, 0,25-1 μg ή 20-80 pmols siRNA) σε 100 μλ siRNA Μορφομετατροπή Medium (Santa Cruz, USA). Διάλυμα Β: Για κάθε διαμόλυνση, αραιώνονται 6 μΐ αντιδραστηρίου Transfection siRNA (Santa Cruz, USA) σε 100 μλ siRNA Επιμόλυνση Medium. siRNA duplex διάλυμα (Διάλυμα Α) αναμίχθηκε με το αντιδραστήριο αραιώνεται Transfection (διάλυμα Β) και επωάστε το μείγμα 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Για κάθε επιμόλυνση, 0,8 ml siRNA Επιμόλυνση Medium προστέθηκε σε κάθε σωλήνα που περιέχει το μίγμα αντιδραστηρίου επιμόλυνσης siRNA (Διάλυμα Α + Διάλυμα Β), αναμίχθηκαν ήπια, επικαλύφθηκαν επάνω σε πλυμένα κύτταρα και επωάστηκαν για 5-7 ώρες στους 37 ° C σε CO

2 θερμοκοιτίδα. Μετά την επώαση, 1 ml κανονικού μέσου ανάπτυξης που περιέχει 2 φορές το φυσιολογικό ορό και η συγκέντρωση αντιβιοτικά (2 χ κανονικό μέσο ανάπτυξης) προστέθηκαν χωρίς αφαίρεση του μείγματος μετεμβολιασμού. Τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 18-24 ώρες. Το μέσο αντικαταστάθηκε με 1 ml φρέσκου 1 × κανονικό μέσο ανάπτυξης και χρησιμοποιούνται για περαιτέρω δοκιμασία.

Στατιστική ανάλυση

Οι τιμές καταγράφηκαν ως μέση τιμή ± SD χ τριών πειραμάτων. Πειραματικά αποτελέσματα αναλύθηκαν με t-test σπουδαστή. P & lt? 0.00 θεωρήθηκε ως το επίπεδο της υψηλής σημασίας και P & lt?. 0.05 θεωρήθηκε ως σημαντική για τις τιμές που λαμβάνονται για τις ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Αποτελέσματα

πλουμπαγκίνη προκαλεί κυτταροτοξικότητα σε HCT15 και ΗΤ29 καρκινικά κύτταρα κόλου

Χρησιμοποιώντας καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές HCT15 και ΗΤ29, αξιολογήσαμε πρώτα την επίδραση της κυτταροτοξικότητας των πλουμπαγκίνη με δοκιμασία ΜΤΤ. Εκτός από την παρεκκλίνουσα σηματοδότηση Wnt σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, τα κύτταρα ΗΤ29 γνωστό ότι εκφράζουν COX2, ενώ HCT15 κύτταρα στερούνται έκφρασης COX2. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές ήταν ευαίσθητα σε plumbagin, υποδεικνύοντας ότι η πλουμπαγκίνη θα μπορούσε να επάγει κυτταροτοξικότητα των δύο καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου ανεξάρτητα από την κατάσταση COX2 (Σχ. 1α και 1β). Ωστόσο, HCT15 κύτταρα ήταν περισσότερο ευαίσθητα σε πλουμπαγκίνη ως IC

50 σε 24 ώρες ήταν 22,5 μΜ, η οποία είναι σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη του IC

50 πλουμπαγκίνη αγωγή ΗΤ29, το οποίο είναι 62,5 μΜ. Μόνο μη σημαντικές αλλαγές στη βιωσιμότητα του (φυσιολογικά κύτταρα) ΡΒΜΟ’δ παρατηρήθηκαν ακόμη ΙΝ100 μΜ πλουμπαγκίνη επωάζονται κύτταρα (Εικ. 1γ)

ένα. Κυτταροτοξικότητα επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων των πλουμπαγκίνη για HCT15 κύτταρα

. εξαρτώμενη από τη δόση αποτελέσματα κυτταροτοξικότητα της πλουμπαγκίνη στα κύτταρα HCT15 εκπροσωπήθηκαν στο παραπάνω γράφημα. HCT15 κύτταρα πιο ευαίσθητα στην πλουμπαγκίνη ως IC

50 στις 24 ώρες ήταν 22,5 μΜ. Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν και εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. Σημασία υποδεικνύεται ως *

p & lt? 0.001

.

b. Η κυτταροτοξικότητα επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων πλουμπαγκίνη επί κυττάρων ΗΤ29

. εξαρτώμενη από τη δόση αποτελέσματα κυτταροτοξικότητα της πλουμπαγκίνη στα κύτταρα ΗΤ29 εκπροσωπήθηκαν στο παραπάνω γράφημα. κύτταρα ΗΤ29 ήταν πιο ευαίσθητα σε πλουμπαγκίνη ως IC

50 στις 24 ώρες ήταν 62,5 μΜ. Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν και εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. Σημασία υποδεικνύεται ως *

p & lt? 0.001

.

c. Η κυτταροτοξικότητα επίδραση διαφόρων συγκεντρώσεων πλουμπαγκίνη επί PBMC κύτταρα

. εξαρτώμενη από τη δόση αποτελέσματα κυτταροτοξικότητα της πλουμπαγκίνη στα κύτταρα PBMC εκπροσωπήθηκαν στο παραπάνω γράφημα. κύτταρα PBMC ήταν αντίσταση σε πλουμπαγκίνη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα ακόμη και σε 100 μΜ συγκέντρωση. Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν και εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. Σημασία υποδεικνύεται ως *

p & lt?. 0.001

Η

πλουμπαγκίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των HCT15 και ΗΤ29 παχέος καρκινικά κύτταρα

Ο πολλαπλασιασμός των HCT15 κύτταρα επεξεργασμένα με 15 μΜ και 30 μΜ του πλουμπαγκίνη αυξήθηκε ελαφρά σε 24 ώρες και μειώθηκε σημαντικά στις 48 ώρες και 72 ώρες, ενώ μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου διατηρήθηκαν φάση εκθετικής ανάπτυξης. Σε αντίθεση, τα κύτταρα ΗΤ29 σε επεξεργασία με 50 μΜ πλουμπαγκίνη έδειξε εκθετική ανάπτυξη, παρόμοια με εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων ελέγχου, ενώ η ανάπτυξη των κυττάρων ΗΤ29 σε επεξεργασία με 75 μΜ πλουμπαγκίνη αυξήθηκε ελαφρά σε 24 ώρες και μειώθηκε σημαντικά στις 48 ώρες και 72 ώρες (Εικ . 2α και 2β).

α. HCT15 κύτταρα. σι. κύτταρα ΗΤ29

. Πολλαπλασιασμό των HCT15 κύτταρα επεξεργασμένα με 15 μΜ και 30 μΜ πλουμπαγκίνη και ΗΤ29 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 75 μΜ πλουμπαγκίνη αυξήθηκε σημαντικά σε 48 ώρες και 72 ώρες, ενώ 50 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται ΗΤ29 κύτταρα τείνουν να πολλαπλασιάζονται. Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν και εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. Σημασία υποδεικνύεται ως *

p & lt?. 0.001

Η

πλουμπαγκίνη επάγει την απόπτωση σε HCT15 και τον καρκίνο του παχέος εντέρου ΗΤ29 κύτταρα

Για τον προσδιορισμό του DNA βλάπτουν τις ιδιότητες του πλουμπαγκίνη, HCT15 τα κύτταρα επωάστηκαν με 15 μΜ και 30 μΜ πλουμπαγκίνη για 24 ώρες, ενώ, ΗΤ29 κύτταρα επωάστηκαν με 50 μΜ και 75 μΜ πλουμπαγκίνη για 24 ώρες. Η εμφάνιση του κομήτη ουρές που αντιστοιχεί με την επαγωγή της βλάβης του DNA ήταν ορατές (Σχ. 3). κύτταρα HCT15 αντιμετωπίζονται με πλουμπαγκίνη και ΗΤ29 κύτταρα 30 μΜ σε επεξεργασία με 75 μΜ πλουμπαγκίνη έδειξαν αυξημένη σωζόμενα της βλάβης του DNA. Η διάρκεια του κομήτη ουρά ήταν δέκα και έξι φορές μεγαλύτερη από αυτή των HCT15 κύτταρα ελέγχου και 15 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται HCT15, αντίστοιχα, ενώ, 50 μΜ και 75 μΜ πλουμπαγκίνη – επεξεργασμένα κύτταρα ΗΤ29 δείχνει τέσσερις και δύο φορές της διάρκειας της ουράς, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου ΗΤ29. βλάβη στο DNA δεν παρατηρήθηκε, όπως το φωτοστέφανο γύρω από τους πυρήνες των κυττάρων ήταν σαφώς ορατή στα κύτταρα ελέγχου.

HCT15 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με πλουμπαγκίνη και ΗΤ29 κύτταρα 30 μΜ σε επεξεργασία με 75 μΜ πλουμπαγκίνη έδειξαν αυξημένη σωζόμενα της βλάβης του DNA. Το μήκος του κομήτη ουρά ήταν δέκα και έξι φορές αυτή του μάρτυρα και 15 μΜ πλουμπαγκίνη αγωγή HCT15, αντίστοιχα, ενώ, 50 μΜ και 75 μΜ πλουμπαγκίνη – επεξεργασμένα κύτταρα ΗΤ29 δείχνει τέσσερις και δύο φορές της διάρκειας της ουράς, αντίστοιχα, σε σύγκριση με κύτταρα ΗΤ29 ελέγχου. βλάβη στο DNA δεν παρατηρήθηκε, όπως το φωτοστέφανο γύρω από τους πυρήνες των κυττάρων ήταν σαφώς ορατή στα κύτταρα ελέγχου.

Η

Ανάλυση των ΝΡκΒ, κασπάσης-3 ενεργοποίησης και κυτόχρωμα απελευθέρωση C σε πλουμπαγκίνη επωάζεται HCT15 και ΗΤ29 κύτταρα

η ενεργοποίηση της κασπάσης-3, ΝΡκΒ (ρ65) και κυτοσολικού απελευθέρωση του κυτοχρώματος C αναλύθηκαν με κηλίδωση Western (Εικ. 4α). Η ενεργοποίηση του ΝΡκΒ (p65) ήταν σημαντικά αυξημένη στις δύο 15 μΜ και 30 μΜ πλουμπαγκίνη – αντιμετωπίζονται HCT15, καθώς και σε 50 μΜ και 75 μΜ πλουμπαγκίνη – επεξεργασμένα κύτταρα ΗΤ29, σε σύγκριση με τον έλεγχο HCT15 και ΗΤ29 κύτταρα. Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και τα επίπεδα κυτοσολικού κυτοχρώματος C ήταν σημαντικά υψηλό, σε αμφότερες τις 15 μΜ και 30 μΜ πλουμπαγκίνη – επεξεργασμένα κύτταρα HCT15, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα HCT15. Ωστόσο η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και τα επίπεδα κυτοσολικού κυτοχρώματος C ήταν υψηλά μόνο σε 75 μΜ πλουμπαγκίνη αγωγή ΗΤ29 κύτταρα, αλλά όχι σε κύτταρα ΗΤ29 σε επεξεργασία με 50 μΜ plumbagin.

a. Ανοσοαποτύπωση ανάλυση της ενεργοποίησης ΝΡκΒ, κασπάσης-3 ενεργοποίησης και κυτόχρωμα C απελευθέρωση

. Lane 1- Ελέγχου HCT15? Lane 2- 15 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται HCT15? Lane 3- 30 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται HCT15? Λωρίδα 4 Έλεγχος ΗΤ29? Lane 5- 50 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται ΗΤ29? Λωρίδα 6- 75 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται ΗΤ29.

b.i. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου των κυττάρων ελέγχου και HCT15 θεραπεία πλουμπαγκίνη και ΗΤ29 με κυτταρομετρία ροής

. Σε σύγκριση με HCT15 ελέγχου, HCT15 κατεργάζεται με πλουμπαγκίνη δείχνει αξιοσημείωτη αύξηση στο κλάσμα υπο-G1 υποδηλώνοντας ότι αυτά τα κύτταρα που υφίστανται απόπτωση. ΗΤ29 κύτταρα που εκτίθενται σε 75 μΜ πλουμπαγκίνη μόνος εμφάνισαν αύξηση στο κλάσμα υπο-G1 ενώ ΗΤ29 κύτταρα εκτίθενται σε 50 μΜ πλουμπαγκίνη κλάσμα υπο-G1 ήταν πολύ μικρότερο.

Β.ΙΙ. Ποσοτικά στοιχεία του κυτταρικού κύκλου ανάλυσης

. Όλα τα πειράματα έγιναν εις τριπλούν και εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD. Σημασία υποδεικνύεται ως *

p & lt?. 0.001

Η

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου ελέγχου και πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται HCT15 και ΗΤ29 κύτταρα

HCT15 κύτταρα που εκτίθενται σε 15 και 30 μΜ του πλουμπαγκίνη εμφάνισαν συνεχή αύξηση στο κλάσμα υπο-G1 η οποία μπορεί να περιλαμβάνει τόσο αποπτωτικών και συντρίμμια κλάσμα υπονοώντας μαζί την έκταση του θανάτου των κυττάρων. Η ζημιά ήταν περισσότερο εμφανής με 30 μΜ πλουμπαγκίνη. Το κλάσμα υπο-G1 για τον έλεγχο ήταν 6,8%, ενώ την ίδια ήταν 24.52 και 37.87% για τις 15 και 30 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται HCT15 κύτταρα αντίστοιχα (Εικ. 4b.i). Αυτό δείχνει μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση στην απόπτωση σε HCT15 κύτταρα από πλουμπαγκίνη. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται επίσης συνδέεται συσσώρευση των κυττάρων στο G0 /G1 φάση, υποδεικνύοντας αναστολή της κυκλοφορίας των κυττάρων από G0 /G1 φάση στην φάση S, καθυστερώντας έτσι ή αναστέλλοντας την είσοδο της κόρης κυττάρων σε μιτωτική κύκλο.

Σε περίπτωση ΗΤ29 κύτταρα που εκτίθενται σε 75 μΜ πλουμπαγκίνη μόνος εμφάνισαν αύξηση στο κλάσμα υπο-G1 ενώ ΗΤ29 κύτταρα εκτίθενται σε 50 μΜ πλουμπαγκίνη κλάσμα υπο-G1 ήταν πολύ μικρότερο. Το κλάσμα υπο-G1 για τον έλεγχο ήταν 4,39%, ενώ το ίδιο ήταν 6,14 και 26,76% για 50 και 75 μΜ πλουμπαγκίνη αγωγή Η29 κύτταρα αντίστοιχα, υποδεικνύοντας εμφάνιση εκτεταμένης απόπτωση μόνο σε 75 μΜ πλουμπαγκίνη αγωγή Η29 κύτταρα, σε σύγκριση με 50 μΜ της πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται Η29 κύτταρα και τον έλεγχο ΗΤ29 κύτταρα. Αποτελέσματα δείχνουν επίσης ότι η συσσώρευση των κυττάρων σε Ο0 /Ο1 φάση μόνο σε 75 μΜ πλουμπαγκίνη αγωγή Η29 κύτταρα, προκαλώντας σημαντική μείωση του πληθυσμού των S και G2 /M φάση, πράγμα που δείχνει καθυστέρηση ή αναστολή της εισόδου αυτών των κυττάρων σε φάση σύνθεση και μιτωτική κύκλος. Σημαντικά αυξημένες κυτταρικό πληθυσμό παρατηρήθηκαν σε S και G2 /M φάση σε 50 μΜ πλουμπαγκίνη αγωγή Η29 κύτταρα υποδεικνύοντας πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Εικ. 4.b.ii)

Ανάλυση φωσφορυλιωμένου Akt, φωσφορυλιωμένη EGFR, PCNA και κυκλίνη D1 σε πλουμπαγκίνη επωάζεται HCT15 και ΗΤ29 κύτταρα

η έκφραση του PCNA, κυκλίνη D1 μαζί με φωσφορυλίωση της Akt και EGFR αναλύθηκε με κηλίδωση Western (Εικ. 5). Έκφραση του PCNA ήταν σημαντικά μειωμένη σε 15 μΜ και 30 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται – κύτταρα HCT15, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Σημαντική μείωση στα επίπεδα του PCNA παρατηρήθηκε μόνο σε 75 μΜ πλουμπαγκίνη επεξεργασμένα κύτταρα ΗΤ29, αλλά όχι σε 50 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται ΗΤ29 κύτταρα. Σημαντικά μειωμένα επίπεδα φωσφορυλιωμένου EGFR, Akt και GSK-3β παρατηρήθηκαν σε 15 μΜ και 30 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται HCT15 και σε 75 μΜ πλουμπαγκίνη κατεργασία ΗΤ29 κυττάρων όταν συγκρίθηκαν με τα κύτταρα ελέγχου. Σε 50 μΜ πλουμπαγκίνη αγωγή ΗΤ29 κύτταρα, τα επίπεδα φωσφορυλιωμένου EGFR, Akt και GSK-3β έδειξαν ασήμαντες αλλαγές. . Β – ακτίνης χρησίμευσε ως εσωτερικός έλεγχος

Lane 1- Ελέγχου HCT15? Lane 2- 15 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται HCT15? Lane 3- 30 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται HCT15? Λωρίδα 4 Έλεγχος ΗΤ29? Lane 5- 50 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται ΗΤ29? Λωρίδα 6- 75 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται ΗΤ29. Έκφραση των PCNA, κυκλίνη D1 μαζί με φωσφορυλίωση της Akt και EGFR ήταν σημαντικά μειωμένη σε 15 μΜ και 30 μΜ πλουμπαγκίνη αντιμετωπίζονται HCT15 και σε 75 μΜ πλουμπαγκίνη σε σύγκριση με τον έλεγχο HCT15, ΗΤ29 Ελέγχου και κυττάρων ΗΤ29 σε επεξεργασία με 75 μΜ plumbagin. β-ακτίνης χρησίμευσε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

Ανάλυση του

TNF-α

και

COX-2

έκφραση σε HCT15 και ΗΤ29 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με πλουμπαγκίνη

ένα. σι. ντο. ρε.