Αφηρημένο

Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι Riccardin D (RD) ήταν σε θέση να επάγει απόπτωση από στόχευση Topo II. Εδώ, βρήκαμε ότι επάγεται RD διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε φάση G2 /M σε PC-3 κύτταρα, και προκάλεσε αξιοσημείωτη βλάβη του DNA, όπως αποδεικνύεται από την επαγωγή της γH2AX εστιών, μικροπυρήνων, και κατάτμηση του DNA σε Comet δοκιμασίας. Χρόνος μελέτες κινητικής και εξαρτάται από τη δόση έδειξε ότι η ATM /Chk2 και ATR /Chk1 οδών σηματοδότησης διαδοχικά ενεργοποιούνται σε απάντηση RD. Απόφραξη του ATM /ΑΤΚ σηματοδότηση οδήγησε στην εξασθένηση της RD-επαγόμενης γH2AX, καθώς και τη μερική ανάκτηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Επιπλέον, η έκθεση RD είχε ως αποτέλεσμα την αδρανοποίηση του BRCA1, η καταστολή της δραστηριότητας ΥΕ και επισκευή NHEJ, και προς τα κάτω ρύθμιση των εκφράσεων και δραστηριότητες δέσμευσης DNA τέλος του Κυ70 /86. Σύμφωνα με τις παρατηρήσεις, τα δεδομένα μικροσυστοιχιών εμφανίζεται ότι RD προκάλεσε τις αλλαγές στα γονίδια υπεύθυνα για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου, βλάβη του DNA και την επισκευή, και την απόπτωση. Η χορήγηση του RD ξενομοσχεύματος ποντικούς μειωμένη ανάπτυξη του όγκου, και συντονισμένα προκάλεσε αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται σε βλάβη του DNA και επιδιόρθωση, μαζί με κυτταρική απόπτωση. Έτσι, η διαπίστωση αυτή προσδιορίζεται ένα νέο μηχανισμό με τον οποίο RD επηρεάζει την επιδιόρθωση του DNA και δρα ως παράγοντας βλάβης του DNA στον καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Hu Z, F-Κονγκ, Si Μ, Tian Κ, Yu LX, Νέοι CYF , et al. (2013) Riccardin D Ασκεί Αντικαρκινική δράση του επάγοντας βλάβη στο DNA σε κύτταρα PC-3 καρκίνου του προστάτη

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 8 (9): e74387. doi: 10.1371 /journal.pone.0074387

Συντάκτης: Stephanie Filleur, Texas Tech University Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 23, 2013? Αποδεκτές: 31 Ιουλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 17 του Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Hu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (30772594, 30973551, 30925038) και το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Shandong (2009ZRB01346). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθεις όγκους σε άντρες και ορμονική θεραπεία στέρησης παραμένει αποτελεσματική για προχωρημένους ΣΕΣΣ. Ωστόσο, η ανάπτυξη των ορμονο-ανθεκτικό καρκίνο προστάτη (HRPC) συμβαίνει αναπόφευκτα μετά ορμονική θεραπεία στέρησης [1,2]. Υπάρχουν περιορισμένες επιλογές για την επιτυχή διαχείριση της HRPC. Πρόσφατα, docetaxel, ένα παράγωγο φυτό αλκαλοειδές, έχει αναδύεται ως ένα δραστικό παράγοντα για τη βελτίωση της ποιότητας των συνθηκών ζωής και την επιβίωση σε ασθενείς με μεταστατικό HRPC [3,4]. Η επιτυχία της docetaxel έχει οδηγήσει σε πολλές προσπάθειες που γίνονται για την απομόνωση διαφόρων φυσικές χημικές ουσίες και να διερευνήσουν τους μηχανισμούς δράσης των βιοδραστικών ενώσεων για την ανάπτυξη των χημειοπροληπτική ή /και θεραπευτικοί παράγοντες για τη θεραπεία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων HRPC [5].

ένα από τα πιο αποτελεσματικά χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται στη χημειοθεραπεία του καρκίνου είναι επαγωγείς βλάβη του DNA, το οποίο μπορεί να προκαλέσει μια ποικιλία από βλάβες του DNA μέσω πολλαπλών μηχανισμών. Για παράδειγμα, καμπτοθεκίνη και ετοποσίδη μπορεί να προκαλέσει μονής αλυσίδας (SSB,) ή δίκλωνα σπασίματα ΟΝΑ (DSBs) με την παγίδευση ομοιοπολικά σύμπλοκα τοποϊσομεράση-ΟΝΑ, στη συνέχεια οδηγεί στην κυτταρικό θάνατο [6,7]. Έτσι, το DNA topo I και II, ιδιαίτερα της τόπο II, πιστεύεται ότι είναι καλά εδραιωμένη στόχους στη θεραπεία του καρκίνου.

Ανάλογα με τον τύπο των βλαβών του DNA, ειδικές σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό καταρράκτες ενεργοποιούνται από DNA- βλαπτικούς παράγοντες. Όπως είναι ευρέως αποδεκτό, αταξία τηλαγγειεκτασία μεταλλαγμένη (ΑΤΜ) και αταξία τηλαγγειεκτασία και Rad3 σχετίζονται (ATR) οδούς σηματοδότησης παίζουν σημαντικό ρόλο σε απόκριση σε βλάβη του DNA. ATM ανταποκρίνεται κυρίως σε DSBs, και εκκινεί φωσφορυλίωση κατάντη στόχων όπως Chk2, BRCA1, και NBS1 πρωτεΐνες στην θέση της βλάβης του DNA [8]. Αυτοί οι παράγοντες δρουν από κοινού για να επάγουν G1, S, G2 και συλλήψεις του κυτταρικού κύκλου, την επιδιόρθωση του DNA, και /ή ενεργοποίηση οδών κυτταρικού θανάτου [9]. Ενώ ATR ενεργοποιείται σε απόκριση προς αντιγραφή στρες, αυτό πυροδοτεί την ενεργοποίηση του Chk1, η οποία με τη σειρά της οδηγεί στην φωσφορυλίωση των Cdc25 και αποτρέπει την ενεργοποίηση των CDK1 /κυκλίνης Β και μιτωτική είσοδο [10]. Κατά DSBs, η διαδικασία της DSBs τέλος ενώνει περιλαμβάνει πολυάριθμες πρωτεΐνες και ένζυμα, μέσω μη ομόλογης άκρο σύνδεσης (NHEJ) και μηχανισμούς ομόλογου ανασυνδυασμού (HR) επισκευή [11,12]. Για παράδειγμα, η Κυ70 /86 ετεροδιμερές είναι κρίσιμη σε NHEJ, δεδομένου ότι συνδέεται με τα σπασμένα άκρα του DNA και στρατολογεί πρωτεΐνες που σχετίζονται με την επισκευή συμπεριλαμβανομένου του DNA εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση, XRCC4 και της DNA λιγάσης IV [13]. Έχει αποδειχθεί ότι η βλάβη του DNA εμπλέκεται για να εκμαιεύσει τόσο ATM και ΑΤΚ σηματοδότηση [14]. Η ενεργοποίηση αυτών των δύο οδών με πιθανά ελαττώματα στα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και την απόκριση επιδιόρθωσης του DNA μπορεί να είναι χρήσιμες για τον προσδιορισμό της ισχύος και της αποτελεσματικότητας των επαγωγέων βλάβες στο DNA.

Έχουμε πρόσφατα ανέφερε ότι Riccardin D (RD), ένα μακροκυκλικό bisbibenzyl ένωση από την κινεζική μονάδα ηπατήτις

Dumortiera τριχωτός

[15], ήταν σε θέση να προκαλέσει την απόπτωση των ανθρώπινων κυττάρων λευχαιμίας με τη στόχευση topo II [16]. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι η θεραπεία RD οδήγησε στην επαγωγή της βλάβης του DNA και την αναστολή των προϊόντων αντίδρασης που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και θεραπείες

Ανθρώπινα LNCaP, κύτταρα DU145 PC-3 και (την American Type Culture Collection (ATCC)) καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Hyclone) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 5% CO

2 στους 37 ° C μέχρι να φτάσει περίπου 50-70% συρροή, στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με χημικά. RD απομονώθηκε και καθαρίστηκε στα εργαστήριά μας όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. RD και ετοποσίδη (VP-16) παρασκευάστηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και αποθηκεύονται ως μικρές ποσότητες στους -20 ° C.

ανοσοαποτύπωσης

Μετά την επεξεργασία όπως υποδεικνύεται, κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA. Πρωτεΐνες (80 μα) διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνες φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (Millipore). Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα κατάλληλα πρωτεύοντα αντισώματα: αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH), κυκλίνη Ε, πολυ (ADP-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP), Bcl-2, Βαχ και νουκλεολίνης (Santa Cruz) , Ku70 και Ku86 (Active Modif), Cdc25B (BD Biosciences), κυκλίνη Α (Anbo Biotechnology), κυκλίνη Β1 (Novus Biologicals), Cdc25C, Ser

1981-φωσφορυλιωμένη-ATM, Tyr

15-φωσφορυλιωμένη-Οάο2 , Ser

428-φωσφορυλιωμένη-ATR, Ser

296-φωσφορυλιωμένη-Chk1, Thr

68-φωσφορυλιωμένη-Chk2, Ser

1524-φωσφορυλιωμένη-BRCA1, Ser

139 φωσφορυλιωμένο Η2ΑΧ ιστόνης (γH2AX), PP2AA, PP2AB και PP2Ac (Cell Signaling), PPP4C (Bethyl, Montgomery, TX, USA), IgG-TRITC (Abcam) και ακολούθησε αποκλεισμός με 5% χωρίς λιπαρά ξηρό γάλα. Κατά την απομάκρυνση των πρωτογενών αντισωμάτων, οι μεμβράνες πλύθηκαν με TBST και επωάστηκαν με υπεροξειδάση IgG-χράνου (HRP) δευτερεύοντα αντισώματα, τότε ορατά με ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Millipore).

Δοκιμασία

Η κυτταρική ανάπτυξη και η βιωσιμότητα των κυττάρων

τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 4000 κύτταρα /φρεάτιο σε μικροπλάκες (Roche), και εκτέθηκαν σε RD ή όχημα. καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων ελήφθησαν από την Real-Time Analyzer κυττάρων SP μέσο (Roche). Δείκτης τιμές κυττάρων (CI) κανονικοποιήθηκαν σε σχέση με την τιμή της CI χρονικό σημείο στο οποίο η χημική πρόσθεσε. Για την ανάλυση βιωσιμότητας κυττάρων, PC-3 κύτταρα προκατεργάστηκαν με 10 mmol /L καφεΐνη για 1 ώρα, και εκτέθηκαν σε RD ή όχημα για 24 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εξετάστηκε στη συνέχεια με 3- (4, 5–2-υλ διμεθυλθειαζολ) -2, 5-διφαινυλ-2Η-τετραζολίου (ΜΤΤ, Sigma) χρωματομετρική δοκιμασία.

δοκιμασία

κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης

Μετά την επεξεργασία με RD επί 24 ώρες, τα κύτταρα fi σταθερού και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) (Sigma) για 30 λεπτά στο σκοτάδι. κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με ένα FACS (Becton Dickinson, USA). Η απόπτωση μελετήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αννεξίνης V-FITC /ΡΙ Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences) με κυτταρομετρία ροής.

Μικροπυρήνων δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RD, DMSO ή VP-16 (10 μmol /L) για 24 ώρες. Μετά τον καθορισμό και διαπερατότητας, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (Sigma). Μικροπυρήνων σε κύτταρα σκόραρε κάτω από ένα μικροσκόπιο uorescence σταδιακής fl (Nikon). Τουλάχιστον 1000 κύτταρα ανά δείγμα μετρήθηκαν για ανάλυση.

Ουδέτερη κομήτη δοκιμασία

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με χημικές ουσίες όπως αναφέρεται ανωτέρω. DSBs DNA ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το Trevigen Comet, ανάλυση ενός κυττάρου Δοκιμασία Gel Electrophoresis (Trevigen). Κομήτης ουρές απεικονίστηκαν από ένα μικροσκόπιο φάσης-φθορισμού (Nikon) και ποσοτικοποιείται από το λογισμικό Casp. Ένα ελάχιστο 100 κύτταρα βαθμολογήθηκαν ανά θεραπεία

Immuno fl uorescence χρώση γH2AX και ρ-BRCA1

κύτταρα αναπτύσσονται σε καλυπτρίδες στερεώθηκαν με παγωμένη μεθανόλη /ακετόνη. (1: 1) και επωάζονται με 3% BSA σε PBS με 0.1% Triton Χ-100. Μετά την επώαση με πρωτογενή αντισώματα και έκπλυση με PBS, τα κύτταρα ανοσοχρώση με δευτερογενή αντισώματα και αντίθετα με DAPI. εικόνες φθορισμού συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο (CarlZeiss).

μικροσυστοιχιών και σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση

Το συνολικό RNA εξήχθη από κύτταρα που είχαν εκτεθεί σε χημικά χρησιμοποιώντας ένα RNAiso συν κιτ (Takara Bio ). ανάλυση μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε σε Genetimes Technology, Inc (Κίνα) σχετικά με την Affymetrix HG-U133 συν 2 τσιπ, και τα αρχικά δεδομένα υποβλήθηκε στο GEO (Σειρά GSE37812). Για την ποσοτική PCR (qPCR) δοκιμασίες, cDNA συντέθηκε χρησιμοποιώντας ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo). qPCR διεξήχθη με SYBR Green αντίδραση κύριο μείγμα σε ένα σύστημα πραγματικού χρόνου PCR (Eppendorf International). Μεταγραφική επίπεδα επιθυμητών γονιδίων κανονικοποιήθηκαν στο επίπεδο του GAPDH. Αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το ΔΔC

t μέθοδο. Οι αλληλουχίες των εκκινητών φαίνονται στον Πίνακα 1.

Η Forward εκκινητή (5 ‘- 3’)

Cdc25BGGCTGAGGAACCTAAAGCCCTCGATCTCATCGTGACACAGTCdc25CAGGAACCCCAAAATGTTGCCTGCAGAAGTGGTAAGCTGAGTGcyclin ETCCAAGAGTTTGCTTACGTCACGCCAGGAGATGATTGTTACAGGcyclin AGATGGTAGTTTTGAGTCACCACACACGAGGATAGCTCTCATACTGTcyclin B1ATAAGGCGAAGATCAACATGGCTTTGTTACCAATGTCCCCAAGAGcdc2ACACAAAACTACAGGTCAAGTGGGGAATCCTGCATAAGCACATCCRPA1CTCGGGAATGGGTTCTACTGTCACTTGGACTGGTAAGGAGTGARPA2TGGTAGCCTTTAAGATCATGCCCCTGGATTGCTGATAGGTGCTCRPA3TGATGGAACCCCTTGATGAAGACATGTTGCACAATCCCTAAAGGAXRCC5GACGTGGGCTTTACCATGAGTTCAGTGCCATCTGTACCAAACXRCC6AGTCATATTACAAAACCGAGGGCCCTTGGAGGCATCAACCAAAAAMSH6AGCTTAAAGGATCACGCCATCAAGCACACAATAGGCTTTGCCGAPDHTGGTCACCAGGGCTGCTTAGCTTCCCGTTCTCAGCCTTTable 1. Q-PCR εμπρόσθιοι και αντίστροφοι εκκινητές.

CSV Λήψη CSV

συνανοσοκαθίζησης

Δείγματα πρωτεϊνών (1,2 mg) από τον έλεγχο και RD-επεξεργασμένα κύτταρα προκαταρκτική διαύγαση με πρωτεΐνη Α /G Plus -αγαρόζης (Santa Cruz) με την παρουσία μη-ειδικής IgG (Santa Cruz), στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα και σφαιρίδια αγαρόζης 20 μΐ με συνεχή ανάμιξη επί μία νύκτα στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν και θερμάνθηκε στους 75 ° C για 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης πριν από προσδιορισμούς ανοσοστυπώματος.

Ανάλυση της δραστηριότητας τέλος δέσμευσης DNA του Κυ70 /Ku86

πυρηνικά εκχυλίσματα από τον έλεγχο ή RD κύτταρα κατεργασμένα παρασκευάστηκαν, και υποβλήθηκαν σε ανίχνευση DNA τέλος δέσμευσης δραστικότητα των Κιι70 και Ku86 χρησιμοποιώντας ένα κιτ επισκευής Κυ70 /Ku86 DNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Active μοτίβο).

DNA τελικού ενώνει δοκιμασίας

για τον προσδιορισμό των επιπτώσεων της RD για ϋδΒδ επισκευής, έχουμε αναπτύξει μια δοκιμασία στο τέλος ενώνει DNA ελεύθερου κυττάρων όπως περιγράφεται από Shao C, et al. [17]. Το πλασμίδιο pUC19 υπέστη πέψη με HincII, με αποτέλεσμα ένα με αμβλέα άκρα γραμμικό μόριο. Το ευθυγραμμισμένο DNA επωάστηκε με πυρηνικό εκχύλισμα (2 μg) εντός 50 mmol /L Tris-HCl (ρΗ 7.6), 10 mmol /L MgCl

2, 1 mmol /L διθειοθρεϊτόλης, 1 mmol /L ΑΤΡ, και 25% (w /ν) πολυαιθυλενογλυκόλη 8000 στους 14 ° C για 6 ώρες ή 24 ώρες. Πυρηνικό εκχύλισμα κυττάρων Raji αγοράστηκαν από μοτίβου δραστικής χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος. Η ΝΗΕΙ προσδιορίστηκε με PCR ενίσχυση του κόμβου του επανασυνδεθούν άκρων με Μ13 εκκινητές. PCR προϊόντα αμπικιλλίνης διεξήχθησαν ως εσωτερικός έλεγχος. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

ΝΗΕΙ και επισκευή HR δοκιμασία

Η ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με RD αξιολογήθηκε με ΥΕ και ΝΗΕΙ δημοσιογράφους που ευγενώς από το Δρ Gorbunova ( Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο του Ρότσεστερ) [25,26]. Η κασέτα δημοσιογράφος για την ανίχνευση ΝΗΕΙ ή ΥΕ υπέστη πέψη με το I-δοβΙ να προκαλέσει ϋδΒδ. Το ευθυγραμμισμένο κασέτα ανταποκριτής του NHEJ ή ΥΕ και DsRed συν-επιμολύνθηκαν σε κύτταρα PC-3 μετά την αγωγή με RD ή όχημα για 24 ώρες. Τα κύτταρα αναλύθηκαν σε μηχάνημα FACScalibur (Becton Dickinson, USA) χρησιμοποιώντας ένα πράσινο-έναντι-κόκκινη φθορίζουσα οικόπεδο. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το λογισμικό Cell Quest (BD Biosciences).

Η αξιολόγηση του αποτελέσματος κατά του όγκου των RD

in vivo

Η

Για να αξιολογηθεί η

in vivo

επίδραση της RD για προστάτη, χρησιμοποιήθηκαν 6-εβδομάδων αρσενικούς BALB /c-ηυ (Vital River Laboratories, Πεκίνο, Κίνα). Τα ποντίκια αφέθηκαν να εγκλιματιστούν για 1 εβδομάδα μετά την άφιξή τους. ξενομοσχεύματα όγκου καθορίστηκαν με έγχυση 5 × 10

6 PC-3 κύτταρα στα δεξιά λαγόνες των ποντικών. Όταν οι όγκοι ήταν ανιχνεύσιμα, οι ποντικοί τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδες θεραπείας και ελέγχου. Η αρχική δοσολογία δόθηκε κατά το χρόνο της προσαρμογής ζεύγους (ημέρα 1). RD (30 mg /kg) ή εικονικό φάρμακο (ισοδύναμες ποσότητες του διαλύτη) χορηγήθηκε κάθε δεύτερη ημέρα με ε.π. ένεση. Οι ποντικοί παρακολουθήθηκαν καθημερινά ακόλουθες επεξεργασίες, και οι όγκοι μετρήθηκαν κάθε δεύτερη ημέρα με προσδιορισμό δύο κάθετες διαστάσεις [μήκος (L) και το πλάτος (W)] χρησιμοποιώντας παχύμετρο και υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο V = L × W

2/2. Μετά τη θεραπεία 20 ημέρες, όλοι οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία με αέρα αναισθησία με αιθέρα και οι όγκοι τους εκτομή για τη μέτρηση της μάζας του όγκου. ιστοί όγκου μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη και χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση TUNEL (Calbiochem), ανοσοκηλίδωση, και ανοσοφθορισμό. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας της Shandong University School of Medicine (Αριθμός Άδειας: 2.010.038) και διεξάγεται αναλόγως

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± Τ.Α.. τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Η στατιστική σημαντικότητα της μέσης διαφοράς μεταξύ της ομάδες ελέγχου και αγωγής προσδιορίστηκε με ένα αντιστοιχισμένο t-test όπου

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

RD επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε κύτταρα PC-3

Από RD έχει βρεθεί ότι διεγείρει απόπτωση σε κύτταρα λευχαιμίας και των πνευμόνων καρκινικά κύτταρα [16,18], ξεκινήσαμε τη μελέτη μας για να προσδιοριστεί αν RD εξασκείται επίσης κυτταροτοξική δράση επί των κυττάρων του προστάτη με τη συνεχή παρακολούθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η έκθεση των PC-3 κύτταρα για να RD προκάλεσε αξιοσημείωτα καταστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε μια δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο.

A

, κυτταρικός πολλαπλασιασμός σε απόκριση σε RD παρακολουθήθηκε από τις τιμές του δείκτη κυττάρων (CI) χρησιμοποιώντας xCELLigence συστήματος.

B

, Μετά την έκθεση του PC 3-κυττάρων σε RD για 24 ώρες, κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με fl ow κυτταρομετρία.

C

, ανοσοκηλίδας ανάλυση των ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με RD.

D

, τα επίπεδα mRNA του G2 /M φάση που σχετίζονται με ρυθμιστές κύκλου RD-επεξεργασμένα κύτταρα προσδιορίστηκαν με PCR πραγματικού χρόνου. συμπεριλήφθηκαν επίσης αλλαγές έκφραση αυτών των γονιδίων μετά από θεραπεία RD (10 μmοl /L).

E

, το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αναλύθηκε με fl ow κυτταρομετρία.

F

,

μια

, ανάλυση των σχηματισμών μικροπυρήνων σε κύτταρα PC-3 που έλαβαν θεραπεία με RD.

b

, η συχνότητα των κυττάρων PC-3 που περιέχει μικροπυρήνων σε επεξεργασία με RD ή VP-16 για 24 ώρες. μπαρ, SD. *, P & lt? 0.05, σημαντική διαφορά από την ομάδα χωρίς αγωγή.

Η

Μετά τη θεραπεία 24 ώρες με RD, του κυτταρικού κύκλου ήταν σημαντικά συνελήφθη στη φάση G2 /M με αυξανόμενες συγκεντρώσεις. Κατά συνέπεια, η θεραπεία RD είχε σαν αποτέλεσμα εξαρτώμενη από τη δόση μειώσεις στην έκφραση της κυκλίνης Ε, Α και Β, οι οποίες είναι οι μοριακοί δείκτες συσχετίζονται με G2 /M φάση. Η οικογένεια του Cdc25 φωσφατασών και ο μεταγενέστερος στόχος Cdc2 παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της S και G2-M. Παρατηρήσαμε επίσης μειώσεις στις εκφράσεις του Cdc25B, Cdc25C, και φώσφορο-Cdc2

Tyr15 (ενεργός μορφή) σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 1 C). προσδιορισμοί qPCR έδειξαν ότι η έκφραση της Cdc2 σε επίπεδο μεταγραφής ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα RD-αγωγή (Σχήμα 1 D), υποδηλώνοντας ότι RD κατέστειλε την έκφραση του Cdc2 στο επίπεδο mRNA, το οποίο με τη σειρά του οδήγησε σε μείωση του φωσφόρου Cdc2. Εν τω μεταξύ, οι αλλαγές στην έκφραση του mRNA της κυκλίνης Ε, Α, Β, Cdc25B, και Cdc25C από RD (Σχήμα 1 D) ήταν παρόμοια με τις παρατηρήσεις στο Σχήμα 1 C, υποδεικνύοντας ότι το πρότυπο κυτταρικών αποκρίσεων ήταν συνεπής με την RD-επαγόμενη διατάραξη του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα PC-3. Εκτός από την παρεμβολή με την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, RD ήταν σε θέση να επάγει αισθητά την απόπτωση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1 Ε).

ανάλυση μικροσυστοιχιών απεκάλυψε ότι γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο δέσμευσης καταστραφεί-DNA, την επιδιόρθωση του DNA, , και την απόπτωση μεταβλήθηκαν σημαντικά σε κύτταρα RD-αγωγή σε σύγκριση με τον μάρτυρα, όπως συνοψίζονται στον πίνακα S1. Από αυτά τα γονίδια, παρατηρήσαμε ότι η κυκλίνη Ε, Α, Β, Cdc2, Cdc25B, και Cdc25C ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω δραματικά στα κύτταρα RD-θεραπεία, συνεπής με τα αποτελέσματα στην Εικόνα 1ϋ.

RD πυροδοτεί βλάβη του DNA σε κύτταρα προστάτη

συνέχεια προσδιορίζεται εάν η έκθεση σε RD σε συγκεντρώσεις οι οποίες ήταν επαρκείς για την επαγωγή αναστολή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης οδήγησε σε βλάβη του DNA, επειδή RD ήταν ικανή να αναστείλει τόπο II σε κύτταρα λευχαιμίας [16]. Όπως ήταν αναμενόμενο, ο σχηματισμός μικροπυρήνων ήταν εμφανής σε κύτταρα κατεργασμένα με 5 μmol /L RD για 24 ώρες, και εμφάνισε μια δοσο-εξαρτώμενη αύξηση (πίνακας Α στο Σχήμα 1 F), παρόμοια με VP-16, ένα καλά τεκμηριωμένο παράγοντα βλάβη του DNA. Ο αριθμός των μικροπυρήνων σε κύτταρα που εκτίθενται σε RD συνοψίστηκε στο πάνελ Β στο Σχήμα 1F. Ως εκ τούτου, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι RD προκαλείται από βλάβη στο DNA που σχετίζονται με την προώθηση της σύλληψης του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης σε κύτταρα PC-3.

Για να επιβεβαιωθεί η ικανότητα του RD στην πρόκληση βλάβης του DNA σε κύτταρα προστάτη, εξετάσαμε οι αλλαγές των δεικτών βλάβης του DNA με κηλίδωση Western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, RD προκάλεσαν σημαντικές αυξήσεις στη φωσφορυλίωση ιστόνης Η2ΑΧ

Ser139 (γH2AX), ένας γνωστός δείκτης DNA απόκριση βλάβη, σε 2 ώρες και διατηρήθηκαν μέχρι την 24 ώρες μετά τη θεραπεία, τόσο εξαρτώμενη από ανδρογόνο (LNCaP) και ανδρογόνο-ανεξάρτητων προστάτη (PC-3 και DU145) κύτταρα. Σε όρους πρωτεϊνών απόκριση βλάβης του DNA, οι εκφράσεις του φωσφόρου BRCA1 με RD προφέρονταν σε πρώιμα χρονικά σημεία και έπεσε κάτω στα κύτταρα μετά από παρατεταμένη αγωγές (Σχήμα 2Α), προτείνοντας ότι η προκαλούμενη RD απόκριση βλάβης DNA σε κύτταρα PCa.

A

, ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του ρ-BRCA1, και γH2AX σε LNCaP, PC-3, και τα κύτταρα DU145 εκτίθενται σε RD, αντίστοιχα.

B

,

ένα

, Ουδέτερο κομήτη δοκιμασία εκτελέστηκε για να προσδιοριστεί το θραύσμα DNA σε κύτταρα RD-θεραπεία.

β

, Κατανομή της μέσης κομήτη μήκους (100 κύτταρα ανά δείγμα) υπολογίστηκε από το πλαίσιο και την πλοκή μουστακιού. Οι διάμεσοι υποδεικνύεται με σταυρό? διατεταρτημοριακό εύρος (25-75%? IQRs) υποδεικνύονται με ανοιχτά παράθυρα. Τα μουστάκια είναι 1,5 φορές η διανομή IQR.

Η

Επιπλέον, ουδέτερο κομήτη δοκιμασία έγινε για να ελεγχθεί αν RD μπορεί να προκαλέσει DSBs στα κύτταρα του προστάτη. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 2Β έδειξαν ότι στιγμές ουρά DNA σε απόκριση σε RD ήταν ανιχνεύσιμα σε κύτταρα ήδη από θεραπεία 2 ώρες, και έγινε πιο έντονη με παρατεταμένη θεραπεία. Έτσι, τα δεδομένα έδειξαν ότι RD προκάλεσε σημαντικά DSBs στα κύτταρα του προστάτη.

RD επηρεάζει ATM /ATR-εξαρτώμενη μονοπάτια Chk1 /Chk2 σε κύτταρα PC-3

Για να προσδιορίσετε αν ATM /ATR-Chk1 οι /2 οδών σηματοδότησης, οι οποίες είναι καλά ταυτοποιηθεί ως ενεργοποιημένα μετά από βλάβη του DNA, που εμπλέκονται στην RD-προκαλούμενη απόκριση βλάβης του DNA, εξετάσαμε πρώτες αλλαγές των παραγόντων που είναι γνωστό ότι είναι σημαντικό για την διαμεσολάβηση μονοπάτια /ATR ΑΤΜ. Κινητικές μελέτες εμφανίζεται αυξημένη φωσφορυλίωση του ΑΤΜ και Chk2 (Thr

68) προκλήθηκε από RD συντομότερο 30 λεπτά, αλλά αυτό το επίπεδο φωσφορυλίωσης απότομα μειώθηκαν μετά. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η ενεργοποίηση του ATR /Chk1 παρατηρήθηκε σε επεξεργασία 2 ώρες και συνεχίστηκε μέχρι και 24 ώρες, όπως αποδεικνύεται από τη συσσώρευση του φωσφόρου-ATR και φωσφόρου-Chk1 (Ser

296) σε απόκριση σε RD (Εικόνα 3Α). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι ATR /Chk1 ενεργοποιήθηκε σημαντικά από RD κατά τη θεραπεία 2h, όπου ήταν μειωμένη ενεργοποίηση του ATM /Chk2. Μετατόπιση ενεργοποίηση του ATM για να ATR πρότεινε ότι άλλα είδη DNA βλαβών συμπεριλαμβανομένων και των παρεμβολών αντιγραφής και ογκώδη τραύματα μπορούν επίσης να προκύψει εκτός από την ϋδΒδ. Αρνητική ρύθμιση των μελών της οικογένειας Cdc25, κατάντη του Chk1 /Chk2, είναι ένας σημαντικός μηχανισμός που είναι υπεύθυνος για τον αποκλεισμό μιτωτική είσοδο μετά από βλάβη του DNA [19]. Όπως ήταν αναμενόμενο, μειωτικά Cdc25B /C και μια έντονη επαγωγή μιτωτικής Cdc25C στο 4h, η οποία επέμεινε μετά την αγωγή, παρατηρήθηκαν σε κύτταρα RD-αγωγή σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 3Α). Μία αύξηση στην διάσπαση της PARP παρατηρήθηκε επίσης (Σχήμα 3Α).

A

, Μεταβολές των πρωτεϊνών βλάβη του DNA σε κύτταρα RD-κατεργασία αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

B

, μετά από επεξεργασία με χημικά για 4 ώρες ή 12 ώρες, τα επίπεδα πρωτεΐνης των πρωτεϊνών βλάβης του DNA ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western.

C

, με ανοσοποιητικά fl uorescence χρώση γH2AX εστίες και p-BRCA1 εστίες σε κύτταρα PC-3.

D

,

ένα

, Neutral κομήτη δοκιμασία PC-3 κύτταρα που κατεργάζονται με RD για 4 ώρες και 12 ώρες.

β

, μήκους Comet αναλύθηκε με κουτί και τη μέθοδο οικόπεδο μουστακιού (100 κύτταρα ανά δείγμα).

E

, Ενώσεις γH2AX, PP2Ac και PPP4C προσδιορίστηκαν από Συνανοσοκατακρήμνιση χρησιμοποιώντας αντι-γH2AX, αντι-PP2Ac, αντι-PPP4C, ή κανονική IgG.

F

, PC-3 κύτταρα προκατεργάστηκαν με 10 mmol /L καφεΐνη για 1 ώρα, και εκτέθηκαν σε RD για 4 ώρες και 12 ώρες,

ένα

, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ? μπαρ, SD. *,

#, P & lt? 0.05, σημαντική διαφορά από τον έλεγχο.

β

, αλλαγές γH2AX ανιχνεύθηκαν με κηλίδωση Western.

Η

βλάβες στο DNA πυροδοτεί μια σειρά σηματοδότησης που οδηγεί στο σχηματισμό ενός πολύπλοκου επισκευής στα διαλείμματα. Εμείς επόμενη αξιολογείται αλλαγές πρωτεΐνης BRCA1, ένα κρίσιμο μόριο στην αρχική πρόσληψη άλλων επισκευή πρωτεΐνες /ένζυμα στις διαλείμματα [20]. Η ενεργοποίηση του BRCA1 (φωσφορυλίωσης σε Ser

1524) με RD σημειώθηκε μέχρι 4 ώρες και μειώθηκε μετά τη θεραπεία, η οποία συσχετίζεται καλά με την σχήμα ενεργοποίησης του Chk2, προτείνοντας Chk2 μπορεί στην πραγματικότητα να φωσφορυλιώνει BRCA1 σε απόκριση προς τη ζημία (Σχήμα 3Α). Με βάση τις παραπάνω παρατηρήσεις, βρήκαμε ότι έχουν σημειωθεί σημαντικές μεταβολές στις 4 ώρες και 12 ώρες θεραπείες, δύο εκ των οποίων θα μπορούσε να είναι κρίσιμη χρονικά σημεία για RD-προκαλούμενη απόκριση βλάβης DNA. Περαιτέρω μελέτες (Σχήμα 3Β) που εμφανίζονται ότι, το πρότυπο της απόκρισης που περιλαμβάνουν γH2AX, φωσφόρου Chk1 /2 και φωσφόρου BRCA1 εις 4h και 12h ήταν σύμφωνη με τις παρατηρήσεις στο Σχήμα 3Α. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίχθηκαν περαιτέρω από την παρατήρηση στο Σχήμα 3C. Ως μάρτυρας, VP-16 ήταν σε θέση να διατηρήσει υψηλές φωσφόρου Chk1 /2, φώσφορο-BRCA1, και τα επίπεδα γH2AX μετά μακρύτερη έκθεση σε σύγκριση με εκείνες στις θεραπείες RD (Σχήμα 3Β και 3C), υποδεικνύοντας ότι διαφορετικοί μηχανισμοί συνέβαλαν με τις απαντήσεις των RD και VP-16 θεραπείες. Σύμφωνα με τις μεταβολές των πρωτεϊνών απόκριση βλάβης του DNA, προφέρεται κομήτη ουρές δείχθηκαν να υπάρχει στα κύτταρα που εκτίθενται σε RD (πλαίσια Α και Β στο Σχήμα 3D). Αξίζει να σημειωθεί, αυξημένα γH2AX που μπορεί να φωσφορυλιωθεί από κινάσες ATM /ΑΤΚ [21,22] ήταν εμφανής σε 4 ώρες και διατηρήθηκε μέχρι την 48η μετά τη θεραπεία RD, όπου το ενεργοποιημένο-ATM /ΑΤΚ με RD καταργήθηκε (Σχήμα 3Α). Αναλύσαμε επίσης αλλαγές της πρωτεϊνικής φωσφατάσης 2Α (ΡΡ2Α) και πρωτεϊνική φωσφατάση 4 (ΔΜΠ4), τα οποία εμπλέκονται στην αποφωσφορυλίωση γH2AX [23,24]. Μετά τη θεραπεία 24 ώρες, RD προκάλεσε αυξημένη PP2Ac (καταλυτική υπομονάδα της ΡΡ2Α), και PPP4C (καταλυτική υπομονάδα της ΔΜΠ4) (Σχήμα 3Ε), υποδεικνύοντας ότι Η2ΑΧ παρέμεινε φωσφορυλιωμένη με την παρουσία αυξημένων PP2Ac και PPP4C. Αποτελέσματα συνανοσοκαθίζησης έδειξε ότι γH2AX ήταν εμφανώς αισθητή με προοδευτικά μειωμένη PP2Ac ή PPP4C σε σύμπλοκα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-γH2AX, αντι-PP2Ac ή αντισώματα αντι-PPP4C (Σχήμα 3Ε), υποδηλώνοντας ότι η εξασθενημένη ενώσεις γH2AX /PP2Ac /PPP4C με RD δύναται , τουλάχιστον εν μέρει, να συμβάλει στην σημαντική συσσώρευση γH2AX.

Επιπλέον, η καφεΐνη, ένας αναστολέας της ΑΤΜ /ΑΤΚ σηματοδότηση, κατήργησε σχεδόν εντελώς την ικανότητα του RD για την προώθηση φωσφορυλίωση Η2ΑΧ τη διάρκεια της θεραπείας, η οποία συνοδεύθηκε με η σημαντική αντιστροφή της RD-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 3F). Μαζί, τα στοιχεία έδειξαν σαφώς ότι η ATM /ATR-μεσολάβηση μονοπάτια καταρράκτη έπαιξε καθοριστικό ρόλο στην αντιμετώπιση RD-που προκαλείται από βλάβη στο DNA, που οδηγεί στην προώθηση των κυττάρων να εισέλθουν θανατηφόρο μίτωση.

RD αναστέλλει ΝΗΕΙ και HR στην PC-3 κύτταρα

για να καθοριστούν τα αποτελέσματα της RD επί DSBs επισκευή, έχουμε αναπτύξει μια ένωση άκρων DNA δοκιμασία άνευ κυττάρου για την αξιολόγηση της σχετικής συνεισφοράς του NHEJ στο DNA των τελικών ενώνει [17]. Το ευθυγραμμισμένο πλασμιδικό DNA pUC19 με ένζυμο HincII επωάστηκε με εκχυλίσματα πυρηνική πρωτεΐνη, και η δραστηριότητα των τελικών ενώνει αντικατοπτρίστηκε από την εμφάνιση των γραμμικών διμερή και πολυμερή τα οποία ενισχύθηκαν με PCR με M13 εναρκτήρες που πλευρίζουν το άκρο-ενώνονται διασταύρωση (Σχήμα 4Α, 4Β). Μετά τη θεραπεία με RD για 6 ώρες ή 24 ώρες, η δραστικότητα NHEJ του πυρηνικού εκχυλίσματος αξιοσημείωτα κατέστειλε όπως υποδεικνύεται από την εμφάνιση ενός ισχυρού μονομερούς μπάντα και αντίστοιχα μειωμένη πολυμερές προϊόντων, ενώ διμερές, τριμερές, και συγκροτήματα τετραμερούς ήταν εμφανείς στην ομάδα ελέγχου (Σχήμα 4Β ). Ως θετικός έλεγχος, δραστικότητα NHEJ επίσης παρεμποδίζεται από RD κατά την επώαση του υποστρώματος DNA με πυρηνικό εκχύλισμα κυττάρων Raji (Active Motif) υπό τις ίδιες συνθήκες (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, η επώαση του γραμμικού DNA με δεσμευτικά αντισώματα που κατευθύνονται έναντι Κιι70 και Ku86 στον πυρηνικό πρωτεΐνες οδηγούν σε μειωμένη πολυμερές συγκροτήματα, παρόμοια με την παρατήρηση σε θεραπεία RD (Σχήμα 4Β), παρέχοντας απόδειξη ότι Ku ετεροδιμερές Κυ70 /Ku86 είναι δύο από τις σημαντικές πρωτεΐνες σε RD-μεσολάβηση επισκευής ϋδΒδ.

Μια

, Σχηματικό διάγραμμα της αρχής του DNA End-ενώνει Δοκιμασία.

Β

, μετά από επεξεργασία με RD, ή με δεσμευτικά αντισώματα Ku 70/86, προσδιορίστηκαν η σχετική ικανότητα της NHEJ.

C

,

μια

, Σχηματικό διάγραμμα της αρχής της προσδιορισμούς NHEJ.

β

, Σχηματικό διάγραμμα στην αρχή της προσδιορισμούς ΥΕ.

D

, Οι αριθμοί της GFP

+ και DsRed

+ κυττάρων προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής, και τα τυπικά ίχνη FACS φαίνεται στα αριστερά. Η αναλογία της GFP

+ για να DsRed

+ κυττάρων χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο της αποτελεσματικότητας επισκευής.

Η

Πήγαμε ένα περαιτέρω βήμα για την αξιολόγηση των επιδράσεων της RD για ΝΗΕΙ και HR χρησιμοποιώντας

in vivo δοκιμασίες

όπως περιγράφεται από τον Dr. Gorbunova [25,26]. Για την ανίχνευση της δραστηριότητας NHEJ, θα παραχθεί η GFP ρεπόρτερ όταν NHEJ είναι ενεργή για την επισκευή των DSBs που προκαλούνται από πέψη ενζύμου (Σχήμα 4C, α). Για την ανίχνευση του ανθρώπινου δυναμικού, επιτυχημένες εκδηλώσεις μετατροπή του γονιδίου μπορεί να ανασυστήσει ενεργό γονίδιο GFP από την επισκευή ένζυμα που παράγονται ϋδΒδ (Σχήμα 4C, β). Αφού υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RD για 24h, PC-3 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με ένζυμο Ι-δοβΙ χωνεμένο κασέτα ανταποκριτής του NHEJ ή ΥΕ και DsRed πλασμίδιο για να ομαλοποιήσει την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Επισκευή I-δοβΙ που προκαλείται από τα διαλείμματα θα έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση του GFP

+ κύτταρα [26]. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής, και η αναλογία μεταξύ GFP

+ και DsRed

+ κύτταρα χρησιμοποιήθηκε ως ένα μέτρο της HR ή την αποτελεσματικότητα NHEJ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4D, το σήμα GFP μειώθηκε σημαντικά είτε σε NHEJ ή συστήματα επισκευής HR σε κύτταρα επεξεργασμένα με RD, υποδεικνύοντας ότι DSBs επισκευή ήταν μειωμένη σε απόκριση RD. Μαζί, τα δεδομένα κατέδειξαν ότι η RD ήταν ικανή να αναστείλει NHEJ και HR, και κατέστειλε την επισκευή DSBs σε PC-3 κύτταρα.

RD ρυθμίζει προς τα κάτω πρωτεΐνες επιδιόρθωσης του DNA σε κύτταρα PC-3

Με βάση τα παρατηρήσεις παραπάνω, διευκρινιστεί περαιτέρω ο ρόλος των Κιι70 /Ku86 σε απόκριση προς RD-προκαλούμενη βλάβη του DNA. Μετά την επώαση των κυττάρων με RD για διαφορετικές χρονικές περιόδους, Ku86 αυξηθεί και κορυφώθηκε σε 4 ώρες, στη συνέχεια μειώθηκε γρήγορα μέχρι 48 ώρες, ενώ Ku70 παρέμεινε αμετάβλητη μέχρι 12 ώρες και υποχώρησαν μετά από αυτή (Σχήμα 5Α). DNA τέλος δέσμευσης δραστικότητα του Κυ70 /Ku86 εμφανίζεται ότι, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, οι δεσμευτικές δραστηριότητες τόσο Κυ70 /Ku86 σε αγωγή κύτταρα σταθερά ενισχυμένη έως 4 ώρες και στη συνέχεια μειώθηκε κατά το υπόλοιπο της περιόδου έκθεσης (Σχήμα 5Β), σύμφωνα με τα αποτελέσματα στο Σχήμα 5Α. Επιπλέον, έχουμε επιβεβαιώσει την εξαρτώμενη από τη δόση ανασταλτική δράση του RD επί της έκφρασης και δεσμευτική δραστικότητα των Κιι70 /Ku86 σε 4 ώρες και 12 ώρες αγωγές (Σχήμα 5C, 5D). Επιπλέον, αναλύσεις qPCR απέδειξε ότι επιδιόρθωσης του DNA που σχετίζονται

RPA1-3

,

XRCC5

,

XRCC6

, και

MSH6

ρυθμίστηκαν προς τα κάτω από RD (Σχήμα 5Ε ). Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις έδειξαν ότι η RD μειωμένη επιδιόρθωση του DNA σε απόκριση σε βλάβη του DNA.

Μια

και

C

, ανάλυση των εκφράσεων του Ku70 και Ku86 στις πυρηνικές πρωτεΐνες από δυτική δοκιμασία κηλίδος.

B

και

D

, ανάλυση της δραστηριότητας τέλος δέσμευσης DNA των Κιι70 ή Ku86 σε PC-3 κύτταρα που εκτέθηκαν σε RD. *, P & lt? 0.05, σημαντική διαφορά από τον έλεγχο.

E

, Heatmap για τα επίπεδα mRNA των γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA σε κύτταρα RD-αγωγή που προσδιορίστηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR. Κόκκινο: υπερ-έκφραση, πράσινο: υπο-έκφραση, μαύρο: αμετάβλητη έκφραση, γκρι: όχι ανίχνευσης

Η

RD προκαλεί απόπτωση που σχετίζεται με την επαγωγή της βλάβης του DNA σε PC-3 ξενομοσχεύματος

Για να προσδιοριστεί εάν θα μπορούσε να επάγει RD κυττάρων του όγκου απόπτωση μέσω επαγωγής της βλάβης του DNA

in vivo

, όπως παρατηρήθηκε σε καλλιεργημένα κύτταρα, τα ανθρώπινα PC-3 ξενομοσχεύματα αναπτύχθηκαν σε αρσενικούς γυμνούς ποντικούς. Η χορήγηση RD δεν είχε καμία σημαντική επίδραση ούτε αρχική ή τελικό βάρος σώματος σε ποντικούς που φέρουν όγκο σε σύγκριση με ομάδα του εικονικού φαρμάκου (Σχήμα 6Α). Μετά 20δ θεραπείες, οι όγκοι που προκύπτουν από ζώα ελέγχου είχαν ως αποτέλεσμα τη θανάτωση των δύο ζώα κατά τη διάρκεια της πειραματικής περιόδου, ενώ οι όγκοι από ποντικούς που έλαβαν RD είχε σημαντικά μικρότερο μέγεθος (Σχήμα 6Β), υποδεικνύοντας σημαντική αναστολή της ανάπτυξης του όγκου με RD. Μείωση της μάζας του όγκου σε RD αγωγή ποντίκια παρατηρήθηκε επίσης (Σχήμα 6C). Αλλαγές των μοριακών δεικτών που σχετίζονται με βλάβες στο DNA σε ποντίκια που έλαβαν αγωγή εμφανίζεται ότι RD προκάλεσε απόκριση βλάβη του DNA μέσω ATM /ATR-μεσολάβηση σηματοδότησης, όπως αποδεικνύεται από την σημαντική συσσώρευση γH2AX, κατάργηση του φωσφόρου-BRCA1 και Ku70 /Ku86 αφθονία (Σχήμα 6D και 6Ε ), σύμφωνα με τα αποτελέσματα σε κύτταρα καλλιέργειας. Εν τω μεταξύ, RD-μεσολάβηση μεταβολές στις εκφράσεις των μελών της οικογένειας ΡΡ2Α ήταν παρόμοιες με τις παρατηρήσεις που φαίνονται σε κύτταρα καλλιέργειας. Επιπλέον, σε σύγκριση με τον έλεγχο placebo, κατάργηση της Bcl-2, η συσσώρευση του Βαχ, και διάσπαση της PARP δεν ήταν εμφανής στις RD-αγωγή ποντικούς (Σχήμα 6D). δοκιμασία TUNEL υποστήριξε επίσης τις παρατηρήσεις ότι αποπτωτικά κύτταρα προφέρονται σε ποντίκια RD-αγωγή (Σχήμα 6F α και β). Τα δεδομένα έδειξαν ότι RD προκάλεσε βλάβες στο DNA και διαταραχή πρωτεΐνες επισκευής, που οδηγεί σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, η οποία συνέβαλε στην αντικαρκινική δράση της

A

-.

C

, Επίδραση της RD επί της ανάπτυξης όγκου και το σωματικό βάρος γυμνών ποντικών.