Αφηρημένο

Η μόλυνση από τον ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) μπορεί να προκαλέσει τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (CIN) και καρκίνου. Down-ρύθμιση της έκφρασης Ε6 και Ε7 μπορεί να είναι υπεύθυνη για τα θετικά κλινικά αποτελέσματα που παρατηρούνται με αγωγή IFN, αλλά η μοριακή βάση δεν έχει καλά προσδιορισθεί. Όπως miRNAs διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην επαγόμενη από HPV του τραχήλου της μήτρας καρκινογένεση, υποθέτουμε ότι η ΙΡΝ-β μπορεί να ρυθμίσει τις εκφράσεις των συγκεκριμένων miRNAs στην τραχηλική καρκινικά κύτταρα, και ότι αυτά τα miRNAs μπορούν να μεσολαβήσουν Ε6 και Ε7 έκφραση, έτσι να ρυθμίζουν ογκογόνο δυναμικό τους. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το miR-129-5p να είναι υποψήφιος IFN-β επαγώγιμων miRNA. επίπεδα MiR-129-5p μειώνεται σταδιακά με την ανάπτυξη της τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής βλάβες. Ο χειρισμός του miR-129-5p έκφραση σε κύτταρα Hela ρυθμίζει έκφραση γονιδίου ιού HPV-18 Ε6 και Ε7. Η εξωγενής miR-129-5p αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα HeLa, προάγει την απόπτωση και μπλοκ εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα HeLa. SP1 είναι ένα άμεσο στόχο του miR-129-5p σε κύτταρα HeLa. Η μελέτη αυτή είναι η πρώτη έκθεση ενός κυτταρικού miRNA με αντι-HPV δραστηριότητας και παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τους ρυθμιστικούς μηχανισμούς μεταξύ του HPV και του συστήματος IFN στα κύτταρα ξενιστές σε επίπεδο miRNA

Παράθεση:. Zhang J, Li S , Yan Q, ο Τσεν Χ, Γιανγκ Υ, Liu Χ, et al. (2013) Η ιντερφερόνη-β Induced

microRNA-129-5p

ρυθμίζει προς τα κάτω HPV-18 Ε6 και Ε7 του ιού Gene Expression από Στόχευση SP1 σε κύτταρα καρκίνου του τραχήλου. PLoS ONE 8 (12): e81366. doi: 10.1371 /journal.pone.0081366

Επιμέλεια: Junming Yue, Το Πανεπιστήμιο του Τενεσί Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Ιουλ 2013? Αποδεκτές: 11 Οκτ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η παρούσα μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Φυσικών Επιστημών ταμεία της Κίνας (αρ. 81072139 και 30872760) και το 2011 Shanghai δημοτικές ειδικό ίδρυμα για την υγειονομική περίθαλψη (No.201002013). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του τραχήλου και τραχηλική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (CIN) προκαλούνται από εμμένουσα λοίμωξη με ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων υψηλού κινδύνου (HPV) ορότυπους, πιο συχνά HPV16 και HPV18 [1]. Ως εκ τούτου, η θεραπεία της λοίμωξης από HPV είναι το κλειδί για την πρόληψη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και CIN. Δύο ογκοπρωτεΐνες, Ε6 και Ε7, τα οποία κωδικοποιούνται από HPV16 και HPV18, μπορούν να συνδέονται και να διεγείρουν την αποικοδόμηση του καταστολείς όγκων ρ53 και pRb [2] – [5]. IFN έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στη θεραπεία του CIN και καρκίνο του τραχήλου. Κάτω ρύθμιση των Ε6 και Ε7 έκφραση μπορεί να είναι υπεύθυνη για τα θετικά κλινικά αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν με τη θεραπεία με IFN, αλλά η μοριακή βάση δεν έχει προσδιοριστεί με ακρίβεια.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι 19-25 nt ρυθμιστικών RNAs που συμμετέχουν στη ρύθμιση των διαφόρων βιολογικών λειτουργιών, καθώς και στην άμυνα έναντι παθογόνων σε πολυάριθμες ευκαρυωτικά καταγωγές. Είναι γενικά πιστεύεται ότι δρουν με σύνδεση προς ατελώς συμπληρωματικές αλληλουχίες στην 3 ‘μη μεταφραζόμενης (UTR) περιοχή των γονιδίων στόχων, με αποτέλεσμα την μειωμένη μετάφραση ή αποικοδόμηση του μεταγραφής στόχου. Συγκεκριμένα, η αλληλουχία συμπληρωματικά στο ζεύγος 6-8 βάση «περιοχή σπόροι» στο 5 ‘άκρο του miRNA-mRNA ετεροδιπλό φαίνεται να προσδιοριστεί η ειδικότητα των αλληλεπιδράσεων miRNA-targetRNA. MiRNAs μπορούν να έχουν πλειοτροπικές επιδράσεις επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση και την κυτταρική διαφοροποίηση [6]. Μεταβολές στην κυτταρική μοτίβα miRNA σε τραχηλικό ιστό καρκίνου του τραχήλου της μήτρας ή καρκινικά κύτταρα έχουν αναφερθεί. Προς τα κάτω ρύθμιση της ανθρώπινης miR-218 [7], [8] και miR-34a [9] του τραχήλου της μήτρας καρκινικά κύτταρα που απευθύνεται στο HPV 16 Ε6 ογκογονίδιο, ενώ η αναστολή των miR-21 στο HPV 18 που περιέχουν Hela καρκίνου του τραχήλου της μήτρας κυττάρων προκαλεί ισχυρή καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων [10]. Φαίνεται συνεπώς ότι miRNAs διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση του τραχήλου της μήτρας από τον HPV.

miRNAs μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην ΙΡΝ-β επαγόμενη Ε6 και Ε7 καταστολή. Έχει 1shown miRNAs μπορεί να επαχθεί από την ΙΡΝ-β. Σε κύτταρα RSA, ΙΡΝ-β μπορεί να επάγει την έκφραση miR-431, το οποίο μπορεί μειορυθμίζουν έκφραση IGF1R και IRS2 και συνεπώς αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καταστέλλοντας την ΜΑΡΚ μονοπάτι [11]. Σε ηπατοκύτταρα, ΙΡΝ-β μεσολαβεί διαμόρφωση της έκφρασης πολυάριθμων κυτταρικών miRNAs με σχεδόν τέλεια συμπληρωματικότητα στις αλληλουχίες των σπόρων τους με το γονιδίωμα RNA του HCV που είναι ικανά να αναστέλλουν την αντιγραφή και τη μόλυνση [12] HCV. Όπως miRNAs διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην επαγόμενη από HPV του τραχήλου της μήτρας καρκινογένεση, υποθέτουμε ότι η ΙΡΝ-β μπορεί να ρυθμίσει τις εκφράσεις των συγκεκριμένων miRNAs στην τραχηλική καρκινικά κύτταρα, και ότι αυτά τα miRNAs μπορούν να μεσολαβήσουν Ε6 και Ε7 έκφραση, έτσι να ρυθμίζουν ογκογόνο δυναμικό τους. Προς επαλήθευση, εμείς διαλογή για miRNAs που εκφράζονται διαφορικά και ρυθμίζονται σε HPV 18-θετικά κύτταρα Hela μετά από έκθεση σε ΙΡΝ-β, και βρήκαμε ότι miR-129-5p να είναι υποψήφιος ΙΡΝ-β επαγώγιμη miRNA το οποίο μπορεί να ρυθμίζουν προς τα κάτω Ε6 και Ε7 έκφρασης.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και ανθρώπινους ιστούς

Το HPV 18-θετική κυτταρική σειρά HeLa [13], HPV 16-αρνητική κυτταρική σειρά Siha [13] , HPV-αρνητικό C33A τραχήλου κυτταρική σειρά καρκίνου [13] και καλά διαχωριζόμενες τραχηλικού πλακώδους HCC94 κυτταρική γραμμή καρκινώματος [14] χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Όλα αυτά τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ) με 10% FBS στους 37 ° C και 5% CO

2. Οι κυτταρικές σειρές συλλέχθηκαν μετά από IFN-β (3 × 10

5IU L

-1) θεραπεία για 2 ώρες.

Κανονική τραχήλου της μήτρας και του τραχήλου της μήτρας καρκινικούς ιστούς ελήφθησαν από τις γυναίκες ηλικίας από 28 έως 77 ετών. Τέσσερις φυσιολογικό τραχηλικό δείγματα ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε υστερεκτομή για τη θεραπεία άλλων τύπων ασθενειών, όπως μύωμα ή αδενομύωση. Κανένας από τους ασθενείς είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με αυξητική ορμόνη, ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν την επέμβαση. Τα στάδια και ιστολογική βαθμούς από αυτούς τους όγκους που καθορίζονται σύμφωνα με τα κριτήρια της Διεθνούς Ομοσπονδίας Γυναικολογίας και Μαιευτικής (FIGO). Κάθε δείγμα ιστού αμέσως συμπληρωματικό καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την εκχύλιση του RNA. Προηγούμενη γραπτή και εν επιγνώσει συναίνεση λήφθηκε από κάθε ασθενή, και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της Ιατρικής Σχολής της Σαγκάης Jiao Tong University. Τα κλινικά και παθολογικά στοιχεία που αφορούν τα κλινικά δείγματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.

Η

μικροσυστοιχιών προφίλ έκφρασης και ανάλυση δεδομένων

Το συνολικό RNA στα κύτταρα ή ιστούς απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας Tri-αντιδραστήριο (Molecular Research Center, Cincinnati, ΟΗ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά το πέρασμα μετρήσεις ποιότητας RNA σε ένα όργανο Nanodrop, τα δείγματα σημάνθηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ σήμανσης Ισχύς miRCURY ™ Hy3 ™ /hY5 ™ και υβριδοποιήθηκε στη συστοιχία miRCURY ™ LNA (v.11.0). Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε υβριδισμό σε ένα σταθμό υβριδοποίησης ακολουθώντας το πρωτόκολλο που περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Σάρωση διεξήχθη με το μικροσυστοιχία σαρωτή Αχοη GenePix 4000B. GenePix Pro V6.0 χρησιμοποιήθηκε για να διαβάσετε την πρώτη ένταση της εικόνας. Οι τιμές κατωφλίου που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο διαφορικά εκφρασμένων miRNAs ήταν φορές αλλάζει ≥1.5 ή ≤0.7, και

P

τιμές ≤0.05 σε t-τεστ θεωρήθηκαν σημαντικές.

Κρίσιμη σπόρων ανάλυση συμπληρωματικότητας ακολουθίας

επεξεργασία δεδομένων Array και κρίσιμη ανάλυση συμπληρωματικότητας ακολουθίας των σπόρων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση των δικτυακών τόπων (https://www.mirbase.org/, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db = PubMed και https://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/).

Ανάλυση των miRNA και mRNA από qPCR

Το συνολικό RNA εξήχθη από καλλιεργημένα κύτταρα και ιστούς χρησιμοποιώντας Tri-αντιδραστήριο. Για την ανάλυση miRNA, ώριμη miRNAs μεταγράφηκαν ανάστροφα από ολικό RNA χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές miRNA RT στα TaqMan microRNA Δοκιμασίες και αντιδραστηρίων στο κιτ TaqMan microRNA ανάστροφη μεταγραφή. qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA Δοκιμασία εκκινητές με το TaqMan καθολική PCR Master Mix και αναλύθηκαν με ΑΒΙ Prism 7000 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

U6B

ανιχνεύθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για ομαλοποίηση όλα τα δεδομένα. Τα ονόματα δοκιμασία για

miR-129-5p

και

U6B

ήταν HSA-mir-129-5p και RNU6B, αντίστοιχα (Applied Biosystems). Το cDNA δημιουργήθηκε με τη χρήση του σετ αντιδραστηρίων RT Prime Script (Takara, Dalian, ΛΔΚ). Για την ποσοτικοποίηση των HPV18

Ε6

, HPV18

Ε7

και

ISG54

, real-time PCR πραγματοποιήθηκε στο ΑΒΙ Prism Σύστημα Ανίχνευσης 7000 Ακολουθία με SYBR πρόμιγμα Ex Taq ( TaKaRa). Οι αλληλουχίες εκκινητών φαίνεται στον Πίνακα 2. Για όλες τις δοκιμασίες qPCR, εκφράσεις υπολογίστηκαν από τον τύπο 2

(- ΔΔCt), όπου ΔCt είναι η διαφορά μεταξύ γονίδιο Ct και Ct γονίδιο normalizer. Ct αντιπροσωπεύει τον κύκλο όριο στο οποίο ο φθορισμός αυξάνεται στατιστικά σημαντικά πάνω από τη βασική γραμμή. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

επιμολύνσεις κυττάρων

Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και να μεταφέρονται σε μέσο ανάπτυξης ελεύθερο από αντιβιοτικά για 24-48 ώρες πριν από την επιμόλυνση. Τα κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με

προ-miR-129-5p

, μη ειδικό έλεγχο miRNA (προ-miR-αρνητική) ή μάρτυρα (Applied Biosystems) σε Opti-ΜΕΜ (Invitrogen, Carlsbad, CA) χρησιμοποιώντας παράγων siPORT NeoFX Επιμόλυνσης (Applied Biosystems) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Μέσο αντικαταστάθηκε 8 ώρες αργότερα. Ίσοι αριθμοί αντιγράφων πλασμιδίων επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. διάνυσμα λουσιφεράσης που φέρουν τις θέσεις στόχους για το

miR-129-5p

του

SP1

3′-UTR περιοχή αγοράστηκε από κοινού Σαγκάη choseasy., Ltd. Η λεπτομερείς πληροφορίες σχετικά με τις κατασκευές που χρησιμοποιούνται σε αυτό το πείραμα παρουσιάζεται στον πίνακα 3.

Η

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού

τα κύτταρα (3000 ανά φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και αναπτύχθηκαν για 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (τελική συγκέντρωση miRNA 100 ηΜ) σε DMEM /F12 που περιέχει 10% FBS. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων τεκμηριώνεται κάθε 24 ώρες για 3 ημέρες με χρήση της ανάλυσης ΜΤΤ χρωματομετρική (Sigma, St. Louis, ΜΟ), και η απορρόφηση στα 490 nm αξιολογήθηκε από ένα Spectra Max 190 αναγνώστη μικροπλακός (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων επιμολυσμένα κύτταρα, στερήθηκαν τροφής για 24 ώρες με την αντικατάσταση του μέσου με άνευ ερυθρού φαινόλης και χωρίς ορό μέσο DMEM /F12 (HyClone Laboratories, Logan, UT), και κατάλληλο έλεγχο του οχήματος με ερυθρό φαινόλης-free μέσου που περιέχει 5% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FBS (HyClone Laboratories) για 48 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων τεκμηριώνεται κάθε 24 ώρες για 2 ημέρες. Εντός ενός ατόμου πείραμα, πολλαπλασιασμός υπό κάθε συνθήκη εξετάστηκε εις τριπλούν, και η συνολική πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 70% αιθανόλη σε 72 ώρες μετά διαμόλυνση και χρωματίστηκαν με 25 μg /mL ΡΙ (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, ΙΝ) σε ρυθμιστικό FACS (PBS που περιέχει 0.1% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA), 0,05% Triton Χ-100, και 50 μg /mL RNase Α) . Μετά από 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου προστατευμένο από το φως, τα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα Becton Dickinson FACScan, και τα κλάσματα των κυττάρων στην G0 /G1, S και G2 /M φάσεις αναλύθηκαν με τη χρήση Cell Quest Pro Software (BD βιοεπιστήμες, San Jose, CA). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

αννεξίνης V δοκιμασία

Τα δείγματα πλύθηκαν με PBS και χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-FITC και ΡΙ χρώση για τον προσδιορισμό της έκθεσης φωσφατιδυλοσερίνης επί της εξωτερικής μεμβράνης του πλάσματος . Μετά από επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου προστατευμένο από το φως, τα δείγματα ποσοτικά με κυτταρομετρία ροής, χρησιμοποιώντας ένα Becton Dickinson FACScan. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

δοκιμασίες λουσιφεράσης ανταποκριτή

Για τις δοκιμασίες λουσιφεράσης, τα κύτταρα (15.000 ανά φρεάτιο) επιστρώθηκαν 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση σε λευκό, διαυγούς πυθμένα των 96 φρεατίων πλακών. Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με 100 ng

SP1

3′-UTR πλασμίδιο ανταποκριτή με 50 ηΜ προ-miR κατασκεύασμα χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με τον Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI) και μετρήθηκε με ένα Envision Πλάκα-reader (Perkin Elmer Inc., Wellesley, ΜΑ). Τα δείγματα εξετάστηκαν εις τριπλούν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Western ανάλυση κηλίδος

Μετά τις υποδεικνυόμενες θεραπευτικές αγωγές, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και οι πρωτεΐνες που παρασκευάζονται με τη χρήση ΒΑ-PER Πυρηνικής και Αντιδραστήριο Cytoplasmic Extraction (Pierce, Rockford , IL) με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Diagnostics). Όλα τα εκχυλίσματα λύθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Συνολική περιεκτικότητα πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford πρωτεΐνη χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA (Pierce). Πρωτεΐνες (60 μα) φορτώθηκαν σε προκατασκευασμένα 4% στοιβάγματος, 10% πηκτώματα Τπδ γλυκίνη και διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα ακολουθούμενη από ηλεκτροφορητική στύπωση πάνω σε μία μεμβράνη PVDF. Μετά την πλύση με Tris ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα, οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% BSA /PBS για 1 ώρα. Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πολύκλωνα αντισώματα κουνελιού που κατευθύνονται έναντι SP1 και p21 (1:1000 αραίωση) (Abcam, UK). Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με ένα δευτερεύον αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού (1:1000? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) και οι πρωτεΐνες στυπώθηκαν οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Pierce), με προ-χρωματισμένο δείκτες (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ως πρότυπα μοριακού μεγέθους. Οι εντάσεις των ζωνών πρωτεΐνης ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού J εικόνας (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Η στατιστική ανάλυση

Όλες οι δοκιμές που πραγματοποιήθηκαν με το στατιστικό πακέτο για το λογισμικό Κοινωνικών Επιστημών έκδοση 17.0 (Chicago, IL, USA). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο με τυπική απόκλιση (SD). Η στατιστική σημασία προσδιορίστηκε με Student t-τεστ, και

P

τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων.

Αποτελέσματα

έκφραση miRNA προφίλ σε κύτταρα HeLa που επάγεται από IFN-β

Τα διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μεταξύ ανεπεξέργαστων και IFN-β προκαλείται από Hela κύτταρα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες. Οι εκφράσεις του

miR-129-5p

,

miR-637

,

miR-744

και

miR-943

βρέθηκαν να είναι πιο πολύ επάγεται σε κύτταρα Hela με ΙΡΝ-β και επιλέγονται για περαιτέρω ανάλυση (Πίνακας 4, και Σχ. S1). Η ακολουθία σπόρος του

miR-129-5p

εμφανίζεται τέλεια συμπληρωματικότητα με τον HPV-18 γονιδίωμα (Εικ. 1). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qPCR) ήταν τότε διενεργείται με την επικύρωση της ανάλυσης μικροσυστοιχιών, και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι εκφράσεις του

miRNA-744

,

miR-943

και

ΜΙΚ 129-5p

ήταν βασικά σύμφωνο με εκείνο της μικροσειράς? ανάλυση χρονικής πορείας της έκφρασης έδειξε ότι η επαγωγή της

miR-129-5p

συμβεί γρήγορα, κορυφώθηκε μέσα σε 48 ώρες. Παρόμοια με την επαγωγή του

ISG54

, καλώς χαρακτηρισμένης IFN-β ρυθμίζονται γονιδίου, ρύθμιση προς τα άνω του

miR-129-5p

ακολούθησε μια κλασική καμπύλη δόσης-απόκρισης μεταξύ 3 και 3000 IU

-1 ml της IFN-β (Εικ. 2).

η

(Α) Επικύρωση των δεδομένων μικροσυστοιχιών με qPCR. Εις τριπλούν προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν για κάθε δείγμα. Επαγωγές των γνωστών γονιδίων IFN-ρυθμίζονται

ISG54

και

Οι ISG56

εμφανίζονται για σύγκρισις. (Β) Χρονική πορεία της επαγωγής miRNA από την ΙΡΝ-β. HeLa κύτταρα διεγείρονται με 300 IU ml

-1 IFN-β για τους ενδεδειγμένους χρόνους, και

miR-129-5p

και

ISG54

/

ISG56

εκφράσεις προσδιορίστηκαν ποσοτικά με qPCR. (Γ) ανάλυση δόσης-απόκρισης της επαγωγής miRNA από την ΙΡΝ-β. κύτταρα Hela διεγέρθηκαν με τις υποδεικνυόμενες δόσεις IFN-β για 2 ώρες, και

miR-129-5p

και

ISG54

/

ISG56

εκφράσεις προσδιορίστηκαν ποσοτικά με qPCR.

η

MiR-129-5p επίπεδα

μειώνεται σταδιακά με την ανάπτυξη της τραχηλικής ενδοεπιθηλιακής βλάβες και συσχετίζονται με HPV-18 Ε6 και Ε7 έκφραση

με ανάλυση qPCR σε ανθρώπινα δείγματα τραχηλικού ενδοεπιθηλιακή βλάβη και φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς, η

miR-129-5p

επίπεδα έκφρασης ήταν πολύ χαμηλότερα από ό, τι στον καρκίνο σε CIN I-II και φυσιολογικό τραχηλικό δείγματα (Σχ. 3 Α). οι μέσες εκφράσεις του

miR-129-5p

ήταν 10,90 ± 4,01, 4,54 ± 3,12, 1,07 ± 0,65 και 0,57 ± 0,67, αντίστοιχα, στην κανονική του τραχήλου της μήτρας ιστούς (ελέγχου), ομάδα CIN I-II, CIN ομάδα ΙΙΙ, και οι ομάδες πλακώδες καρκίνωμα. Στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των

miR-129-5p

εκφράσεις βρέθηκαν κατά τη σύγκριση των τεσσάρων ομάδων (

P

& lt? 0,05). Τα κλινικά στάδια και παθολογικές βαθμών της ομάδας CIN I-II σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες επιβεβαιώθηκαν να είναι σημαντικά διαφορετική (

P

& lt? 0,05). HPV-18 Ε6 και Ε7 έκφραση ήταν σημαντικά αυξημένη από την κανονική τράχηλο ομάδα, CIN I-II, ομάδα CIN III, και ομάδα πλακώδες καρκίνωμα (Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 3 Β, Γ.). Οι μέσες εκφράσεις του HPV-18 Ε6 ήταν 1,67 ± 0,41, 3,55 ± 0,73, 4,70 ± 0,53 και 0,94 ± 0,33, αντίστοιχα, στα φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς (έλεγχος), ομάδα CIN I-II, ομάδα CIN III, και το καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων ομάδες, ενώ οι μέσες εκφράσεις του HPV-16 Ε7 ήταν 1,90 ± 0,35, 3,67 ± 0,55, 6,87 ± 1,33 και 1,23 ± 0,24 σε αυτά τα δείγματα. Αρνητική συσχέτιση έχει βρεθεί μεταξύ της έκφρασης του miR-129-5p και HPV-18 Ε6 /Ε7 σε δείγματα τραχηλικού ιστού (P & lt?. 0.05, Σχήμα 3 D, E).

(Α) Η έκφραση της miRNA-129-5p σε ανθρώπινα δείγματα του τραχήλου ενδοεπιθηλιακή αλλοίωση και η κανονική του τραχήλου της μήτρας ιστούς. (Β) Η έκφραση των HPV-18 Ε6 στα ίδια δείγματα. (Γ) Η έκφραση των HPV-18 Ε7 σε αυτά τα δείγματα. (D, E) Συσχέτιση μεταξύ των εκφράσεων του HPV-18 Ε6 /Ε7 και miR-129 σε αυτά τα δείγματα.

Η

Χειραγώγηση της

miR-129-5p

έκφρασης σε κύτταρα HeLa διαμορφώνει HPV-18

Ε6

και

Ε7

έκφραση του γονιδίου του ιού

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον

miR-129-5p

έχει ένα λειτουργικό ρόλο στην καθοδική ρύθμιση των HPV18

Ε6

και

Ε7

, έχουμε χειριστεί το επίπεδο έκφρασης του

miR-129-5p

σε κύτταρα HeLa. Οι τρεις ομάδες που περιλαμβάνονται κύτταρα ελέγχου (χωρίς θεραπεία), κύτταρα επιμολυσμένα με μη ειδικό έλεγχο miRNA

(προ-miR-αρνητικό)

, κύτταρα επιμολυσμένα με

προ-miR-129

. Στις 72 ώρες μετά την παροδική επιμόλυνση των προ-miRNAs, οι εκφράσεις mRNA του HPV-18

Ε6

και

Ε7

σε κύτταρα HeLa ανιχνεύθηκαν με qPCR. Επιμόλυνση του

προ-miR-129-5p

μειώθηκε σημαντικά HPV-18

Ε6

και

Ε7

mRNAs (Εικ. 4Β, Σχ. 4C και Εικ. S2), και αυτό το αποτέλεσμα ήταν πολύ ειδικά, ως

προ-miR-αρνητικών

διαμόλυνσης δεν έδειξε καμία επίδραση επί της έκφρασης HPV-18 Ε6 και Ε7.

σχ. (Α) έδειξε την αποτελεσματικότητα του miR-129 διαμόλυνση. Διπλώστε τις αλλαγές από τις εκφράσεις του (Β) του HPV-18

Ε6

και (C) HPV-18

Ε7

σε κύτταρα HeLa προσδιορίστηκε με qPCR. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές, κάθε μία με τρεις επαναλήψεις. Τα μέσα (μπάρες) και SDC (ράβδοι σφάλματος) εμφανίζονται. *

P

& lt?. 0.001

Η

Η εξωγενής

miR-129-5p

αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στα κύτταρα HeLa

Είμαστε δίπλα ελεγχθεί κατά πόσον οι αυξημένες επίπεδα

miR-129-5p

θα μπορούσε να μειώσει την πολλαπλασιαστικού δυναμικού των κυττάρων Hela όπως αναφέρεται σε καρκινικά κύτταρα κύστης. Μία δοκιμασία ΜΤΤ με βάση διεξήχθη για να αξιολογηθεί ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων Hela για έως και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με

miR-129-5p

. Η δοκιμασία πολλαπλασιασμού αποκάλυψε ότι

miR-129-5p

υπερέκφραση ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων (Εικ. 5), ενώ τα κύτταρα επιμολυσμένα με miRNA ελέγχου συνέχισε να αυξάνεται κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου.

Η ανάπτυξη των κυττάρων ήταν μετρήθηκε με μία δοκιμασία ΜΤΤ. Το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον δύο φορές, κάθε μία με τρεις επαναλήψεις, και τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση απορρόφηση με SD. *

P

& lt? 0.001? #

P

& lt?. 0.05

Η

Η εξωγενής

miR-129-5p

προάγει την απόπτωση και εμποδίζει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα HeLa

Όπως καθορίζεται από την επισήμανση αννεξίνη V, μη επεξεργασμένα κύτταρα και εκείνους που έλαβαν θεραπεία με

προ-miR-αρνητικούς μάρτυρες

παραμείνει βιώσιμη και ήταν κυρίως αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) αρνητική. Μια μετατόπιση προς τα δεξιά του ενεργοποιημένου κυττάρου φθορισμό (FACS) προφίλ, ενδεικτικό της απόπτωσης, παρατηρήθηκε για τα κύτταρα Hela επιμολυσμένα με

προ-miR-129-5p

(Εικ. 6).

ανάλυση αννεξίνης V έδειξε ότι τα κύτταρα Hela επιμολυσμένα με

προ-miR-129-5p

επέδειξαν σημαντικά μεγαλύτερο επίπεδο απόπτωσης από τις ομάδες ελέγχου. *

P

& lt? 0,01, #

P

& lt?. 0.05

Η

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής έδειξαν ότι οι αναλογίες των κυττάρων σε G0 /G1 και S φάσεις στους αρνητικούς μάρτυρες ήταν αμετάβλητη σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Η επιμόλυνση των κυττάρων Hela με

προ-miR-129-5p

οδήγησε σε συσσώρευση κυττάρων στην φάση Ο0 /Ο1 και μείωση των κυττάρων στη φάση S σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πρότεινε ότι

miR-129-5p

θα μπορούσε να συλλάβει κύτταρα Hela στο G1 /S σημείο ελέγχου και να καθυστερήσει την κυτταρικού κύκλου από την είσοδο στη φάση S. Κατά συνέπεια,

miR-129-5p

υπερέκφραση επιβράδυνε την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και προκάλεσε ένα μπλοκ φάση G1 του κυτταρικού κύκλου, αν και η διαφορά δεν ήταν στατιστικά σημαντική.

SP1

είναι ένας άμεσος στόχος του

miR-129-5p

σε κύτταρα HeLa

μια δοκιμασία διπλής λουσιφεράσης χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί εάν

miR-129-5p

θα μπορούσε συνδέονται με τις

miR-129-5p sites

στόχου εντός του

SP1 σε

3′-UTR. Χρησιμοποιήσαμε κατασκευάσματα που περιέχουν την προβλεπόμενη ακολουθία σπόρο για να δοκιμαστεί η ανασταλτική επίδραση του

miR-129-5p

. Η επιμόλυνση του

προ-miR-129-5p

σε κύτταρα HeLa επί 48 h μειωμένη δραστηριότητα λουσιφεράσης σε σχέση με τον αρνητικό έλεγχο. Παρόλο που δεν παρατηρήθηκε αλλαγή στην δραστηριότητα όταν επιμολυσμένα με τον έλεγχο (σχ. 7Β), ανάλυση στυπώματος Western επαλήθευσε ότι η εξωγενής

miR-129-5p

θα μπορούσε να μειώσει τα επίπεδα πρωτεΐνης του SP1 (Εικ. 7C).

χάρτης περιορισμού (Α) διάνυσμα. (Β) SP1 έγινε στόχος miR-129-5p μέσω 3’UTR της στα κύτταρα Hela όπως αξιολογείται χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία λουσιφεράσης. (Γ) αναλύσεις Western blot ρ21, SP1 και GAPDH σε κύτταρα HeLa μετά miR-129-5p υπερ-έκφραση. Τα μέσα (μπάρες) και SD (ράβδοι σφάλματος) που εμφανίζεται * P & lt?.. 0.05

Η

Συζήτηση

Στην έκθεση αυτή, εντοπίσαμε IFN-β επαγόμενη miRNAs στον HPV-18 θετικά κύτταρα Hela. ανάλυσης μικροσυστοιχιών miRNA έδειξε τις εκφράσεις του

miR-129-5p

,

miR-637

,

miR-744

και

miR-943

αυξήθηκαν , ενώ η

miR-526

* ρυθμίστηκαν προς τα κάτω μετά από διέγερση IFN-β.

miR-129-5p

πάρθηκε για περαιτέρω μελέτη, όπως βιοπληροφορική ανάλυση αποκάλυψε ότι

miR-129-5p

και οι αλληλουχίες γονιδίων του ιού HPV-18 είναι απολύτως συμπληρωματικά. Έχει δειχθεί ότι miR-129-5p είχε απελευθερωθεί σε αρκετούς τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του ενδομητρίου, του καρκίνου του οισοφάγου, ο καρκίνος του παχέος εντέρου και καρκίνο της ουροδόχου κύστης, και επαλήθευσε γονίδια στόχους του περιλαμβάνεται SOX4 [15] – [17], VCP /p97 [18] και CDK6 [19]. Υπερ-έκφραση του miR-129-5p μπορούν να αναστείλουν την ανάπτυξη των κυττάρων και προκαλεί κυτταρικό θάνατο σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης [17] και ηπατοκυτταρικό καρκίνο [18], ωστόσο, ο ρόλος του στον καρκίνο του τραχήλου δεν είναι σαφής.

Βρήκαμε ότι miR-129-5p υπερ-έκφραση θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων Hela έως περίπου 70,23% των κυττάρων ελέγχου. Εν τω μεταξύ, ο προ-επιμολυσμένα miR-129-5p αύξησε τη σύλληψη των κυττάρων Hela σε φάση G0-G1 (68,34%), ενώ τα κύτταρα φάσης S μειώθηκαν, υποδεικνύοντας ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ανεστάλη ως σύνθεση DNA επιβραδύνθηκε. Αυτά τα αποτελέσματα της επίδρασης του miR-129-5p στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου, μαζί με την ικανότητά της να αυξήσει την απόπτωση ήταν σύμφωνα με τις παρατηρήσεις του καρκίνου της ουροδόχου κύστης κύτταρα [17]. Η μελέτη μας έδειξε επίσης ότι miR-129-5p έκφραση προκλήθηκε με ΙΡΝ-β σε μία δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι το αντι-πολλαπλασιασμό και την απόπτωση επίδραση της IFN-στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας μπορεί να οφείλεται εν μέρει στην επαγωγή του miR-129-5p έκφρασης.

Ο καρκίνος του τραχήλου προκαλείται από λοίμωξη HPV συνδέεται κυρίως με την Ε6 και Ε7 ιικών ογκογονιδίων. Με ανάλυση qPCR, η επιμόλυνση των προ-miR-129-5p σε κύτταρα HeLa βρέθηκε μείωση τις εκφράσεις των Ε6 και Ε7 από 69,01% και 77,15%, αντίστοιχα. Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη αναφορά ότι μια επαγόμενη ΙΡΝ-β microRNA μπορεί μειορυθμίζουν HPV-18 Ε6 και έκφραση ιικού γονιδίου Ε7. περαιτέρω έρευνα μας διαπιστώθηκε ότι ο παράγοντας μεταγραφής SP1 είναι μια άμεση προς τα κάτω στόχος του miR-129-5p. SP1 είναι μια πρωτεΐνη σύνδεσης ειδικής αλληλουχίας DNA η οποία περιέχει μία θέση σύνδεσης miR-129-5p σε 3′-UTR της. Οι ανάντη ρυθμιστικές περιοχές του HPV-18 γονίδια περιέχουν την θέση πρόσδεσης SP1, και έχουν δειχθεί να προσδιοριστεί η έκφραση Ε6 και Ε7 γονίδιο [20] – [22]. Στην παρούσα μελέτη, βρήκαμε ότι η έκφραση SP1 μπορούσε να ρυθμίζεται προς τα κάτω σημαντικά με υπερ-εκφράζεται miR-129-5p. Επιπλέον, επιβεβαίωσε την ύπαρξη μιας σύνδεσης για miR-129-5p στο SP1 3’-UTR με δοκιμασία λουσιφεράσης δραστηριότητα. Λαμβανόμενα μαζί, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η επαγόμενη έκφραση του miR-129-5p με ΙΡΝ-β καταστέλλει την εξέλιξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας από τα κάτω ρύθμιση HPV-18 έκφραση Ε6 και Ε7, και SP1 είναι μια άμεση προς τα κάτω στόχος του miR-129- 5P. Ένα ενδιαφέρον αποτέλεσμα αποκαλύφθηκε από την έρευνα μας είναι ότι miR-129-5p έκφραση ήταν υψηλή σε όγκους CIN Ι, αλλά σταδιακά μειώθηκε κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου και την άνοδο των παθολογικών βαθμού. HPV λοίμωξη μπορεί να προκαλέσει μεταβολή της έκφρασης κυτταρικής miRNA κατά την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Προς τα κάτω ρύθμιση της ανθρώπινης miR-218 και miR-34a σε καρκίνο του τραχήλου κύτταρα που απευθύνεται στο HPV 16 Ε6 ογκογονίδιο. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι το 25 miRNAs έχουν διαφορικά ρυθμίζονται σε δύο ή τρεις τύπους HPV (HPV 16.11.45) [23]. Είναι λογικό ότι το miR-129-5p έκφραση μπορεί να κατασταλεί από λοίμωξη HPV, καθώς το ποσοστό μόλυνσης από HPV υψηλού κινδύνου αυξήθηκε με CIN Ι με τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Παρ ‘όλα αυτά, η περαιτέρω μελέτη είναι απαραίτητη για να καθοριστεί η ακριβής μηχανισμός της μειωμένης miR-129-5p έκφρασης κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Ο χάρτης θερμότητας για τα διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μεταξύ ανεπεξέργαστων και IFN-β επαγόμενη από κύτταρα Hela

doi:. 10.1371 /journal.pone.0081366.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

A Η έκφραση του HPV-18 Ε6 στα κύτταρα HeLa? S2B Η έκφραση του HPV-18 Ε7 στα κύτταρα HeLa

doi:. 10.1371 /journal.pone.0081366.s002

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Ένα μεγάλο ευχαριστώ στο Youji Feng και Φενγκ Γουάνγκ της Σαγκάης Πρώτη Λαϊκού Νοσοκομείου Συγγενείς στη Σαγκάη Πανεπιστήμιο Jiao Tong για την παροχή τεχνολογικών καθοδήγηση κατά μήκος της πορείας αυτής της μελέτης.