Αφηρημένο

Ο καρκίνος του προστάτη βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (PCSCs) γίνονται έντονα ερευνήθηκαν κυρίως λόγω των εισφορών τους προς την ογκογένεση του προστάτη ωστόσο, η κατανόηση της βιολογίας PCSC, συμπεριλαμβανομένων των κρίσιμων διαδρομών τους, παραμένει μη πλήρως κατανοητή. Ενώ επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) χρησιμοποιείται ευρέως για τη διατήρηση της PCSC κύτταρα in vitro, η σημασία των εξαρτώμενων από τον EGF σηματοδότηση και καθοδικά μονοπάτια του σε PCSC αυτο-ανανέωση δεν είναι καλά χαρακτηρισμένες. Με τη διερεύνηση κύτταρα σφαίρα DU145, ένας πληθυσμός κυττάρων καρκίνου του προστάτη με ιδιότητες στέλεχος-όπως, αναφέρουμε εδώ ότι ο υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) σηματοδότηση διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην διάδοση του DU145 PCSCs. Η ενεργοποίηση της σηματοδότησης EGFR μέσω προσθήκης EGF και έκτοπη έκφραση ενός ιδιοσυστατικά ενεργού μεταλλάγματος EGFR (EGFRvIII) αυξημένο σχηματισμό σφαίρας. Αντιστρόφως, η αναστολή της σηματοδότησης EGFR με τη χρήση αναστολέων EGFR (AG1478 και PD168393) και νοκ ντάουν του EGFR ανέστειλε σημαντικά PCSC αυτο-ανανέωση. Συνεπής με το μονοπάτι ΜΕΚ-ΕΚΚ είναι ένας μείζων στόχος της σηματοδότησης EGFR, ενεργοποίηση του μονοπατιού ΜΕΚ-ΕΚΚ συνέβαλαν στην EGFR-διευκολύνεται διάδοση PCSC. Διαμόρφωση του EGFR σηματοδότηση επηρεάζονται εξωκυτταρικό σήμα που σχετίζονται με (ΕΚΚ) ενεργοποίηση της κινάσης. Η αναστολή της ενεργοποίησης ERK μέσω πολλαπλών προσεγγίσεων, συμπεριλαμβανομένης της θεραπείας με τον αναστολέα U0126 ΜΕΚ, έκτοπη έκφραση της κυρίαρχης αρνητικής-ΜΕΚ1 (K97M), και knockdown είτε ERK1 ή ERK2 είχε ως αποτέλεσμα μια ισχυρή μείωση της διάδοσης PCSC. Συλλογικά, η παρούσα μελέτη παρέχει αποδείξεις ότι η σηματοδότηση EGFR προάγει PCSC αυτο-ανανέωση, εν μέρει, με την ενεργοποίηση της οδού ΜΕΚ-ΕΚΚ

Παράθεση:. Rybak AP, Ingram AJ, Tang D (2013) Διάδοση των Ανθρωπίνων προστάτη καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν εμφανίζεται μέσω του EGFR που διαμεσολαβείται ΕΚΚ ενεργοποίησης. PLoS ONE 8 (4): e61716. doi: 10.1371 /journal.pone.0061716

Συντάκτης: Dean G. Τανγκ, το Πανεπιστήμιο του Τέξας ΜΌ Anderson Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22 Νοεμβρίου 2012? Αποδεκτές: 17 Μάρτη, 2013? Δημοσιεύθηκε: 19 Απρ., 2013

Copyright: © 2013 Rybak et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση (RMS 79-71) από τις καναδικές Ινστιτούτα Υγείας Έρευνας στην DT και με οικονομική στήριξη από την υγειονομική περίθαλψη του Αγίου Ιωσήφ στο Hamilton, ON, Καναδάς, στο Χάμιλτον Κέντρο Νεφρού Ερευνών (HCKR). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη είναι η πιο συχνή κακοήθεια αρσενικό και η δεύτερη κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με τους άνδρες στις δυτικές χώρες [1], [2]. Κατά τη διαδικασία της ογκογένεσης του προστάτη, ογκογόνο μονοπάτια σηματοδότησης προώθηση της προόδου της ορμονικά εξαρτώμενης καρκινώματα να ορμονοάντοχο καρκίνο του προστάτη (HRPC), ο σημαντικός παράγοντας που συμβάλλει σε θανάτους του καρκίνου του προστάτη [3], [4]. Αν και οι ακριβείς μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για την έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου του προστάτη παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες, κύτταρα καρκίνου του προστάτη βλαστικά-σαν (PCSCs) θεωρούνται ευρέως ως κρίσιμη στην ογκογένεση του προστάτη και την ανάπτυξη της προς ασθένεια HRPC [5] – [7].

Παρά την αυξανόμενες ενδείξεις υποδηλώνουν την ύπαρξη PCSCs, ταυτοποίησης των ανθρώπινων PCSCs in vivo έχει εμφανιστεί να είναι ένα δύσκολο έργο. Αυτή η πρόκληση οφείλεται στην ετερογενή φύση του καρκίνου του προστάτη και των περιορισμένων δειγμάτων διαθέσιμα από κλινικές πηγές σε μεγάλο βαθμό. περιορισμένη κατανόηση μας για PCSCs συνέβαλε επίσης στην αδυναμία να απομονώσει και να διαδώσει PCSCs από ανθρώπινα πρωτογενή καρκινώματα. Να προωθήσει τη γνώση μας για PCSCs, διάφορες ερευνητικές ομάδες, συμπεριλαμβανομένων δική μας, έχουν εμπλουτιστεί για PCSCs από ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές προστάτη. Αυτό οφείλεται στην επίδειξη σε μεγάλο βαθμό ότι καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) μπορεί να μελετηθεί χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία καλλιέργειας σφαίρα κάτω από συνθήκες (SF) μέσο χωρίς ορό. Αυτή η δοκιμασία έχει χρησιμοποιηθεί για να αντλήσει και να διαδώσει ΚΕΠ από εγκέφαλο [8], του μαστού [9], του παχέος εντέρου [10] και του καρκίνου του προστάτη κύτταρα [11] – [16] in vitro. Το πιο σημαντικό, η προσέγγιση σφαίρα καλλιέργεια έχει επιτρέψει την διάδοση του καρκίνου του προστάτη βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν που εμφανίζουν CSC ιδιότητες της αυτο-ανανέωσης και την ικανότητα να κινήσει σχηματισμό όγκων in vivo [11], [12], [15], [17] .

Σφαίρα καλλιέργεια συνήθως εμπλέκει πολλαπλασιαστικού βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν σε SF μέσο συμπληρωμένο με επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF) και βασικού αυξητικού παράγοντα ινοβλαστών (bFGF) [8] – [13]. Αν και η παρουσία και των δύο EGF και bFGF επιτρέπει την παραγωγή των σφαιρών από κύτταρα DU145 [11], [12], [17], αν αυτή είναι η ιδανική κατάσταση για την παραγωγή και τη συντήρηση σφαίρα PCSC για μια παρατεταμένη χρονική περίοδο παραμένει ασαφής. Σε πρόσφατη έρευνα μας, έχουμε δείξει ότι EGF διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη μακροπρόθεσμη διάδοση των DU145 PCSCs, και ότι αυτά τα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν ήταν ικανό να εκκινήσει όγκους με σημαντικά ενισχυμένη ικανότητα σε μη παχύσαρκους διαβητικούς /σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (NOD /SCID) [11]. Ωστόσο, ο ρόλος της σηματοδότησης EGFR, μαζί με κατάντη μονοπάτια της, που απαιτούνται για DU145 PCSC διάδοσης παραμένει να χαρακτηριστεί.

Στην προσπάθεια μας να προωθήσουμε αυτή τη γνώση, έχουμε αποδείξει εδώ ότι η σύνδεση EGFR-ERK παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην διάδοση του DU145 PCSCs. Αν και αυτές οι PCSCs είναι σε θέση να πολλαπλασιάζονται σε απουσία εξωγενών EGF, ενεργοποίηση της σηματοδότησης EGFR είναι κρίσιμης σημασίας για τη διατήρηση της DU145 PCSCs ως πειραματικός χειρισμός του EGFR σηματοδότησης προσβεβλημένων πολλαπλασιασμού DU145 PCSC. Επιπλέον, η ρύθμιση της σηματοδότησης EGFR σε PCSCs DU145 επηρεαστεί βαθιά ενεργοποίηση ERK. Επιπλέον, η αναστολή της ενεργοποίησης ERK μέσω της χρήσης ενός αναστολέα ΜΕΚ, έκτοπη έκφραση της κυρίαρχης αρνητικής-ΜΕΚ1 (K97M), και knockdown ενδογενούς ERK1 ή ERK2, μείωσε συλλογικά τη διάδοση των DU145 PCSCs. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν τη συμβολή της σηματοδότησης ΜΕΚ-ΕΚΚ για EGFR μεσολάβηση PCSCs αυτο-ανανέωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και Διάδοση των DU145 PCSCs

DU145 ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη και κυττάρων 293Τ ανθρώπινου εμβρυϊκού νεφρού ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), και καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες ATCC.

DU145 ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν απομονώθηκαν και πολλαπλασιάστηκαν όπως προηγουμένως δημοσιευθεί [11]. Εν συντομία, τα κύτταρα μονοστιβάδας DU145 ενζυματικώς-διάσταση σε μεμονωμένα κύτταρα με τη χρήση φαινόλης διάλυμα άνευ ερυθρού TrypLE Express (Life Technologies, Calsbad, CA, USA) και τα πλέγματα 40 μm κύτταρο (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), και στη συνέχεια επαναιωρήθηκαν σε μια υπο-κλωνικών (5 κύτταρα /μl) πυκνότητα σε μέσα άνευ ορού (SF) (DMEM /F12 σε ένα μίγμα 3:01) (Life Technologies) που περιέχει 0.4% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) (BioShop Canada Inc., Burlington, ΟΝ, Canada) και 0,2 × Β27 λείπει βιταμίνη Α (Life Technologies) σε φιάλες Τ75 (15 ml ολικός όγκος) που ορίζονται για καλλιέργεια κυτταρικού εναιωρήματος (Sarstedt Inc., Newton, NC, USA). Κατά την εξέταση της επίδρασης της θεραπείας EGF επί του σχηματισμού σφαίρας, ανασυνδυασμένο EGF (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) προστέθηκε σε μια συγκέντρωση 10 ή 20 ng /ml. Τυπικό σφαίρες που σχηματίζονται σε 10 έως 12 ημέρες. κύτταρα Σφαίρα υπο-καλλιεργήθηκαν με ενζυματική διάσταση, τεταμένες, και μετά επαναιωρήθηκαν στο παραπάνω μέσο σε υπο-κλωνική πυκνότητα.

Σφαίρα Δοκιμασίες Σχηματισμού

Για να αξιολογηθεί ο σχηματισμός των πρωτογενών σφαίρες, τα κύτταρα DU145 από υπο-συρροή (~ 80%) καλλιέργειες μονοστοιβάδας επαναιωρήθηκαν στο παραπάνω SF μέσο σε μια πυκνότητα 2,5 χ 10

3 κύτταρα σε ατομικά φρεάτια μιας πλάκας καλλιέργειας 24-φρεατίων (3 φρεάτια ανά αγωγή) (Corning, Corning , ΝΥ, USA). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε έναν όγκο 0.5 κ.εκ. /φρεάτιο, σε αντίθεση με 1 ml /φρέαρ όπως προηγουμένως δημοσιευθεί [11]. Οι σφαίρες που σχηματίστηκαν μετά από 12 ημέρες καλλιέργειας μετρήθηκαν. Για τη μέτρηση της ικανότητας σχηματισμού σφαίρας της δευτεροβάθμιας ή εγκατεστημένος σφαίρες, σφαιρίδια κύτταρα εξατομικεύεται με ενζυματική διάσταση, τεταμένες, και στη συνέχεια απλώθηκαν σε μια πυκνότητα 5 χ 10

2 ή 1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο σε 24 -Καλά πλάκες (3 φρεάτια ανά θεραπεία), εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Οι σφαίρες που σχηματίζονται μετρήθηκαν μετά από 12 ημέρες καλλιέργειας.

πλασμίδια και

Virus Παραγωγής

ΕΟΡΚνΙΠ /pLNCX παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Khalid Al-Nedawi (Hamilton Κέντρο Νεφρού Research, Hamilton, ON, Canada). EGFR (Κ721Α) /pLHCX παρασχέθηκε ευγενώς από το Δρ Joan Krepinsky (Hamilton Κέντρο Νεφρού Ερευνών). Κατασκευή του ΜΕΚ1 (K97M) /pLHCX έχει περιγραφεί προηγουμένως [18]. Short-φουρκέτα ERK1 και ERK2 στόχευσης (shERK1 και shERK2, αντίστοιχα) οι φορείς κατασκευάστηκαν με ανόπτηση και υποκλωνοποίηση των προηγουμένως δημοσιευθέντα αλληλουχίες στόχευσης (ERK1: GCCATGAGAGATGTCTACA? ΕΚΚ2: GAGGATTGAAGTAGAACAG) [19] ως φουρκέτα εντός του φορέα ρετροϊικής pRIH, σύμφωνα με μας δημοσιεύθηκε συνθήκες [18]. Ο φορέας βραχείας φουρκέτας ελέγχου (shLacZ) περιέχει μια αλληλουχία στόχευσης

Escherichia coli

β-γαλακτοσιδάσης (shLacZ αλληλουχία στόχος: GCAGTTATCTGGAAGATCA). Υψηλούς τίτλους κενό φορέα (EV) /pLNCX, ΕΟΡΡνΙΙΙ /pLNCX, EV /pLHCX, EGFR (Κ721Α) /pLHCX, ΜΕΚ1 (K97M) /pLHCX, shLacZ /pRIH, shERK1 /pRIH και shERK2 /pRIH ρετροϊό παρήχθησαν χρησιμοποιώντας κύτταρα 293Τ , όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. κύτταρα DU145 στη συνέχεια μολύνθηκαν με τον συγκεκριμένο ρετροϊό, και μολυσμένα κύτταρα επιλέχθηκαν σε υγρομυκίνη (0,5 mg /ml? Life Technologies) για pLHCX και λοιμώξεις pRIH που βασίζονται, ή G418 (1 mg /ml? Sigma-Aldrich) για pLNCX-based λοιμώξεις. Έκτοπη EGFRvIII και ΜΕΚ1 (K97M) έκφραση, ή knockdown ενδογενούς ERK1 ή ERK2, επαληθεύτηκαν με ανάλυση κηλίδος Western.

Short-φουρκέτα EGFR στόχευση φορείς λεντοϊών αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich, με τις αλληλουχίες στόχευσης (shEGFR1 : GCTGCTCTGAAATCTCCTTTA? shEGFR2: GCCACAAAGCAGTGAATTTAT) κλωνοποιήθηκε ως ένα φουρκέτα στον φορέα pLKO.1, ενώ ένας μη ειδικός shRNA (πλασμίδιο 1864? Addgene, Cambridge, ΜΑ, USA) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος (shCTRL). Παραγωγή shEGFR και shCTRL φακοϊό διεξήχθη με συν-επιμόλυνση κάθε πλασμίδιο shRNA (10 μg) με πλασμίδια (10 μg έκαστο) που είναι αναγκαία για την παραγωγή λεντοϊού τρίτης γενιάς (pRSV-REV, pCMV-VSV-G, pMDLg /pRRE) [ ,,,0],20], παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Bryan E. Strauss (Πανεπιστήμιο του Σάο Πάολο της Ιατρικής Σχολής του Σάο Πάολο, Βραζιλία), σε κύτταρα 293Τ χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου. Εξήντα ώρες (h) μετά την επιμόλυνση, τα υπερκείμενα που περιέχουν VSV-G ψευδότυπου, λεντοϊού σωματίδια ανίκανος αναδιπλασιασμού συλλέχθηκαν, διηθήθηκαν μέσω ενός φίλτρου 0,45 μm και φυγοκεντρήθηκε για 2 ώρες στις 48.000 g. Viral ιζήματα επαναιωρήθηκαν σε 1 ml μέσου που περιέχει 10 μg /ml polybrene (Sigma-Aldrich) και προστέθηκε σε μονοστοιβάδας κυττάρων για 2 ώρες σε υγροποιημένο επωαστή 37 ° C με περιοδική ανάμιξη σε διαστήματα 20 λεπτών, για να καταστεί δυνατή η μόλυνση των κυττάρων. Η μόλυνση επιλέχθηκε με πουρομυκίνη. (1 μg /ml? Sigma-Aldrich)

Για τη μόλυνση των κυττάρων σφαίρας, τα σφαιρίδια φακοϊού shEGFR2 και shCTRL επαναιωρήθηκαν σε 2 ml μέσου χωρίς ορό που περιέχει 0,4% BSA, 0,2 × Β27 (χωρίς βιταμίνη Α) και 10 μg /ml polybrene και προστέθηκε σε εξατομικευμένη (3 χ 10

5) κύτταρα για 2 ώρες σε υγροποιημένο ° C επωαστήρα 37, με περιοδική ανάμειξη σε διαστήματα 20 λεπτών, για να καταστεί δυνατή η κυτταρική μόλυνση. κύτταρα Σφαίρα στη συνέχεια σπείρονται σε πυκνότητα 10

4 κύτταρα /ml σε φιάλες Τ75 που ορίζονται για κυτταρικό εναιώρημα καλλιέργειας (Sarstedt Inc.). Πουρομυκίνη (1 μg /ml) προστίθεται στις καλλιέργειες σφαίρα στις 48 ώρες μετά τη μόλυνση.

Anchorage-Ανεξάρτητοι Δοκιμασία Ανάπτυξης

κυτταρικές καλλιέργειες σφαίρα DU145 απλώθηκαν σε ανεξάρτητα φρεάτια έξι φρεατίων πλάκες σε πυκνότητα 10

4 κύτταρα /φρεάτιο όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Μετά από 8 εβδομάδες, οι εικόνες αντίθεσης φάσης ελήφθησαν σε 5 τυχαία πεδία ανά φρεάτιο χρησιμοποιώντας την Zeiss Axiovert 200 Μ μικροσκόπιο (AxioVision 3.1 software) σε 25Χ μεγέθυνση, και οι αποικίες που αποτελούνται από ≥50 κύτταρα μετρήθηκαν. εικόνες αντίθεσης φάσης στη συνέχεια επεξεργασία με τη χρήση του λογισμικού X4 CorelDRAW Graphics Suite (Corel, Ottawa, ON, Καναδάς).

EGFR και ΜΕΚ Αναστολή Σπουδών

Οι αναστολείς EGFR AG1478 και PD168393 (Calbiochem, Darmstadt, Hesse, Germany) και ο αναστολέας ΜΕΚ U0126 (Promega, Madison, WI, USA) διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO? Sigma-Aldrich) και χρησιμοποιήθηκαν στις συγκεντρώσεις που υποδεικνύονται. DMSO χορηγήθηκε σε ένα ταυτόσημο όγκο ως έλεγχος (mock θεραπεία). αναστολέα EGFR (AG1478 ή PD168393), ΜΕΚ (U0126) ή DMSO (ψευδο) αγωγή χορηγήθηκε κατά το χρόνο της σποράς κυττάρων σφαίρας. σχηματισμός Σφαίρα ποσοτικοποιήθηκε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως. Η αναστολή της EGFR και ΜΕΚ1 δραστικότητα κινάσης (όπως προσδιορίζεται με EGFR και /2 κατάσταση φωσφορυλίωσης ERK1, αντίστοιχα) επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδας Western.

Antibody-based λειτουργία EGFR αποκλεισμού πειράματα επί κυττάρων σφαίρα διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εν συντομία, αζίδιο χωρίς EGFR αποκλεισμού μονοκλωνικού ποντικού (Ab-1, την κλωνοποίηση 528) αντίσωμα (Thermo Fisher Scientific, Waltham, ΜΑ, USA) ή αντίσωμα ελέγχου ισοτύπου IgG2a ποντικού (R &? D Systems, Minneapolis, ΜΝ, USA) προστέθηκαν σε κύτταρα σφαίρα (κατά το χρόνο της σποράς) σε συγκέντρωση 4 μg /ml παρουσία ή απουσία ανασυνδυασμένης EGF (10 ng /ml). Σφαίρες αφέθηκαν να σχηματίσουν και ποσοτικοποιήθηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως.

Ανάλυση Western Blot

ολόκληρου κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν σε ένα ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 20 mM Tris (ρΗ 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton Χ-100, 25 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 1 mM NaF, 1 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 0,1 mM ορθοβαναδικό νάτριο, 1 mM PMSF, 2 μg /ml λευπεπτίνη και 10 μg /ml απροτινίνη. Για κάθε δείγμα, συνολικά 50 μα κυτταρολύματος πλήρους κυττάρου χρησιμοποιήθηκε εκτός αν ορίζεται διαφορετικά. Αποφασισμένοι λύματα (10% SDS-πολυακρυλαμιδίου) μεταφέρθηκαν σε Amersham Hybond-ECL μεμβράνες (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Ηνωμένο Βασίλειο). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% β /ο άπαχο ξηρό αποβουτυρωμένο γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, και στη συνέχεια επωάστηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα σε 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος αραίωσης αντισώματος (1 χ Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα που περιέχει 0.1% Tween- 20 (TBST) και 5% BSA) με ήπια ανακίνηση στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανίχνευση ήταν τα εξής: αντι-ανθρώπινο φωσφο-EGFR (Tyr1068) (Sigma-Aldrich, E6154, 1:1000), κουνέλι αντι-ανθρώπινο EGFR (# 4267, 1:1000), αντι-ανθρώπινο φωσφο κουνελιού -Akt (Ser473) (# 4058, 1:1000), κουνέλι αντι-ανθρώπινο φωσφο-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) (# 9101, 1:1000), κουνέλι αντι-ανθρώπινο ERK1 /2 (# 9102, 1: 1000), αντι-ανθρώπινο φωσφο-STAT3 (Tyr705) (# 9145, 1:2000), ποντικού αντι-ανθρώπινης STAT3 κουνελιού (# 9139, 1:1000) από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA), κατσίκα αντι- ανθρώπινη ΑΚΤ (C-20, 1:1000), αντι-ανθρώπινο ΜΕΚ1 ποντικού (Η-8, 1:1000) και αντι-ανθρώπινη α-τουμπουλίνης ποντικού (TU-02, 1:500) από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz , CA, USA). Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλένονται με 1 χ διάλυμα TBST και επωάστηκαν (1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου) είτε με γαϊδάρου αντι-κατσίκα IgG–υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) (Santa Cruz Biotechnology, sc-2033, 1:3000), γάιδαρο αντι- ποντίκι-IgG-HRP (GE Healthcare, NA931V, 1:3000) ή γαϊδάρου αντι-κουνελιού-IgG-HRP (GE Healthcare, NA934V, 1:3000) συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα. σήματα ανοσοστυπώματος ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια κηλίδωση ανίχνευσης Amersham ECL Western (GE Healthcare) και μετά εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ (Thermo Fisher Scientific). Η ποσοτικοποίηση των πυκνοτήτων μπάντα ανοσοστυπώματος προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ. (Έκδοση 1.43u? W. Rasband, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας)

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα ποσοτικά στοιχεία που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± S.E.M. και οι συγκρίσεις έγιναν με τη χρήση δύο-ουρά ανεξάρτητη Μαθητή

t

-ΜΕΛΕΤΕΣ. Ένα

σ

-τιμή & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

DU145 Σφαίρες Πολλαπλασιάζονται με την απουσία εξωγενών μιτογόνα Προβολή EGFR σήμα ενεργοποίησης

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι ενώ EGF συμπλήρωση προώθησε σημαντικά την παραγωγή και τη διάδοση των σφαιρών DU145, ο σχηματισμός των σφαιρών δεν απαιτούν την προσθήκη εξωγενούς EGF [11] που υποδηλώνει ότι η σηματοδότηση EGFR μπορεί να ενεργοποιηθεί απουσία εξωγενούς EGF. Για να διερευνηθεί αυτή η πιθανότητα, έχουμε δημιουργήσει σφαίρες από κύτταρα DU145 απουσία (-EGF) και παρουσία EGF (10 ή 20 ng /ml EGF? 10EGF ή 20EGF, αντίστοιχα) και στη συνέχεια πολλαπλασιάζονται αυτές καθορίζονται σφαίρες για τρία περάσματα, υπό το πανομοιότυπες συνθήκες στις οποίες παρήχθησαν πρωτογενή σφαίρες, πριν από την αξιολόγηση της ικανότητας σχηματισμού σφαίρας τους. Σφαίρες που παράγεται στο -EGF κατάσταση των μέσων ενημέρωσης μπορεί να διατηρηθεί με συνεπή τρόπο για τουλάχιστον τρία περάσματα. Επιπλέον, η ικανότητα να παράγουν και να διατηρούν σφαίρες στην κατάσταση -EGF (Σχήμα 1Α) υποδηλώνει ότι εξάπλωσης υπό συνθήκες μέσων άνευ EGF (επίσης χωρίς την προσθήκη άλλων εξωτερικών παραγόντων ανάπτυξης) είναι μια εγγενής ιδιότητα των DU145 PCSCs. Αυτή η δυνατότητα υποστηρίζεται από το γεγονός ότι ο αριθμός των σφαιρών διατηρείται μετά την σπορά 5 × 10

2 κύτταρα /φρεάτιο ήταν περίπου το ήμισυ του ότι πολλαπλασιάζονται μετά την σπορά 1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο (Σχήμα 1Α). Επιπλέον, η δυνατότητα αυτή είναι επίσης σύμφωνη με την πρόσφατη παρατήρηση μας ότι -EGF έχουν σφαίρες έχουν διαδοθεί σε -EGF μέσα μαζικής ενημέρωσης για περισσότερα από 15 συνεχόμενα περάσματα, με σκοπό τη συνεπή τρόπο, όπως φαίνεται στο σχήμα 1Α, από τη στιγμή που αυτό το χειρόγραφο παρασκευάστηκε (τα δεδομένα δεν απεικονίζεται). Αν και EGF ενισχυμένη διάδοση σφαίρα σε σύγκριση με κύτταρα που αναπτύσσονται σε σφαίρα -EGF μέσα (10EGF και 20EGF σύγκριση με -EGF), 20EGF δεν περαιτέρω διεγείρουν σφαίρα αριθμός σε σύγκριση με την θεραπεία 10EGF. Αυτό υποδηλώνει ότι ένα όριο EGF επαγόμενη υπάρχει (Σχήμα 1Α).

Α) EGF ενισχύει σφαίρα ανεξάρτητος σχηματισμός της κυτταρικής πυκνότητας σποράς. DU145 σφαίρες παρήχθησαν και διατηρήθηκαν σε μέσα άνευ ορού που περιέχει 0.4% BSA και 0.2 × Β27 (SF), και συμπληρώνεται με ή χωρίς EGF (10 ή 20 ng /ml? 10EGF ή 20EGF, αντίστοιχα) για τρία περάσματα για τη δημιουργία ΕΟΡ- δωρεάν (-EGF) και EGF-διεγερμένες καλλιέργειες σφαίρα πριν τον πειραματισμό. κύτταρα Σφαίρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 χ 10

2 και 1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο (1 × 10

3 και 2 × 10

3 κύτταρα /ml, αντίστοιχα) σε 24 -Καλά πλάκες (τρεις επαναλήψεις ανά αγωγή). Έξι πειράματα. Σφαίρες διατηρούνται σε EGF-συμπληρώνονται SF οθόνη μέσα ενημέρωσης ενισχυμένη αριθμούς σφαίρα σε σύγκριση με -EGF πολιτισμούς σφαίρα. Σφαίρες διατηρήθηκαν σε μέσα SF περιέχουν & gt? 10 ng /ml EGF δεν εμφανίζονται πρόσθετες αυξήσεις της παραγωγικής ικανότητας σχηματισμού σφαίρας. Β) Επεξεργασία των -EGF σφαίρες με αυξανόμενες συγκεντρώσεις EGF (+ 10EGF ή + 20EGF, αντίστοιχα) αυξημένο σχηματισμό σφαίρας, και Γ) αυξημένη ενεργοποίηση του σηματοδότηση EGFR (EGFR φωσφορυλίωση στο Tyr1068? EGFR-P). Οι αριθμοί Sphere εμφανίζονται ως μέσος ± S.E.M. . (

t-test

δύο ουρά ανεξάρτητη Μαθητή *

σ

& lt?? 0,05 σε σύγκριση με την αντίστοιχη κατάσταση -EGF media)

Η

για να εξεταστεί αν σφαίρες που δημιουργούνται και διατηρούνται στην κατάσταση που -EGF μέσα ενημέρωσης ανταποκρίνονται στην ενεργοποίηση του σήματος EGFR, έχουμε καλλιεργημένα ιδρύθηκε, EGF χωρίς σφαίρες παρουσία εξωγενούς ΕΤΠ. Όχι μόνο αυτοί οι άνευ EGF κύτταρα σφαίρα ανταποκρίνονται στην εξωγενή θεραπεία EGF όταν σπέρνεται σε υπο-κλωνική πυκνότητες των 5 × 10

2 και 1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο (1 × 10

3 και 2 × 10

3 κύτταρα /ml, αντίστοιχα) (Εικόνα 1Β), αλλά επίσης να ανταποκρίνεται προς EGF στο ίδιο επίπεδο με εκείνες σφαίρες που δημιουργούνται και διατηρούνται σε μέσα που περιέχουν EGF (σύγκριση Σχήμα 1Β με το Σχήμα 1Α). Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι στην απουσία εξωγενών EGF, σφαίρες μπορεί να είναι σε θέση να ενεργοποιήσουν τη σηματοδότηση EGFR. Προς υποστήριξη αυτής της δυνατότητας, η φωσφορυλίωση του EGFR σε τυροσίνη (Υ) 1068 (EGFR-P), ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο υποκατάστατος δείκτης της ενεργοποίησης του σήματος EGFR [22], ανιχνεύεται εύκολα σε -EGF και + EGF (10EGF και 20EGF) κύτταρα σφαίρα (Σχήμα 1 C). Στο σύνολό τους, οι παραπάνω παρατηρήσεις υποστηρίζουν την ιδέα ότι η σηματοδότηση EGFR διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διάδοση της DU145 PCSCs.

Αναγκαστικές EGFR σήμα ενεργοποίησης Αποδίδει DU145 PCSCs μη ανταποκρίνονται σε EGF Θεραπεία

Για την περαιτέρω εξακριβωθεί ο ρόλος της ενεργοποίησης του σήματος EGFR σε DU145 PCSCs, την ιδιοσυστατικά ενεργό μεταλλαγμένο EGFR, EGFR παραλλαγή III (EGFRvIII) [23], υπερεκφράστηκε σε κύτταρα μονοστοιβάδας DU145 (Σχήμα 2Α). κύτταρα ΕΟΡΚνΙΙΙ εκφράζουν εμφανίζονται αυξημένα επίπεδα φωσφορυλίωσης Tyr1068 (EGFR-Ρ) και την ενεργοποίηση ERK (φωσφορυλίωση Thr202 /Tyr204 για ERK1 /2? ERK1 /2-P) σε SF μέσο (Σχήμα 2Α), καταδεικνύοντας ότι η έκτοπη EGFRvIII έκφραση είχε ως αποτέλεσμα ιδιοσυστατική σηματοδότηση EGFR. Σε σύγκριση με κενό φορέα (EV) σε μεταγωγή κύτταρα DU145, DU145 ΕΟΡΚνΙΙΙ κύτταρα που εκφράζουν δημιουργούνται περισσότερα πρωτεύοντα τομείς στους -EGF μέσο (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, EGF συμπλήρωση προώθησε την παραγωγή πρωτογενών σφαίρες από κύτταρα EV DU145 αλλά όχι ΕΟΡΚνΙΙΙ κύτταρα που εκφράζουν (Σχήμα 2Β). Ωστόσο, ΕΟΡΚνΙΙΙ κύτταρα που εκφράζουν σφαίρα μπορούν να σχηματίσουν πρωτογενή σφαίρες σε -EGF media σε παρόμοιο επίπεδο με κύτταρα DU145 σφαίρα EV πολλαπλασιάζονται υπό την παρουσία εξωγενούς EGF (Σχήμα 2Β). Ως εκ τούτου, DU145 ΕΟΡΚνΙΙΙ κύτταρα που εκφράζουν διαθέτουν ένα συγκρίσιμο ικανότητα για την πρωτογενή παραγωγή σφαίρα ως κύτταρα EV DU145 διεγείρονται με ανασυνδυασμένο EGF (Σχήμα 2Β). Παρόμοιες παρατηρήσεις ελήφθησαν επίσης σε πολλαπλασιασμό σφαίρα (δηλαδή η παραγωγή του δευτερογενούς σφαιρών κατά την σπορά 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) (Σχήμα 2C). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεση μας ότι η σηματοδότηση EGFR συμβάλλει στην διάδοση του DU145 PCSCs

Α) ανάλυση κηλίδας Western των EGFRvIII έκφραση και ενεργοποίηση (Tyr1068 φωσφορυλίωση?. EGFR-Ρ) σε DU145 γονέα (μονοστιβάδα κύτταρα) αναπτύχθηκαν σε μέσα άνευ ορού συμπληρωμένο (10% FBS) και άνευ ορού (SF). EGFRvIII έκφραση σε κύτταρα DU145 ενεργοποιεί σηματοδότηση ΕΚΚ. ενεργοποίηση ERK προσδιορίστηκε με την εξέταση της φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών ERK1 και ERK2 σε Thr202 και Tyr204 υπολείμματα, αντίστοιχα (ERK1 /2-P). Β) Πρωτογενής (1 °) και C) (2 °) σχηματισμός δευτερογενών σφαίρα εξής EGFRvIII έκφραση σε κύτταρα DU145 συγκριτικά με κύτταρα κενό φορέα (EV) έλεγχος. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μέσο χωρίς ορό που περιέχει 0,4% BSA, 0,2 × Β27 και στερούνται εξωγενών παραγόντων ανάπτυξης (-EGF), ή με EGF συμπληρωμένο (10 ng /ml? 10EGF), σε μια πυκνότητα 2,5 χ 10

3 (1 ° σχηματισμός σφαίρα) ή 1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο (2 ° σχηματισμός σφαίρα) σε πλάκες 24 φρεατίων (0.5 κ.εκ. /φρεάτιο? τρεις επαναλήψεις ανά θεραπεία). Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. Οι αριθμοί Sphere εμφανίζονται ως μέσος ± S.E.M. (Η

αξίες σ

για τις υποδεικνυόμενες συγκρίσεις ελήφθησαν από

t-test

δύο ουρά ανεξάρτητη Μαθητή).

Η

EGFR αποκλεισμός Μειώνει την αυτο-ανανέωση Χωρητικότητα της DU145 PCSCs

για να διερευνήσει περαιτέρω την απαίτηση της σηματοδότησης EGFR στη διάδοση (αυτο-ανανέωση) της DU145 PCSCs, εξετάσαμε την επίδραση της αναστολής σήματος EGFR για τη συντήρηση σφαίρα. κύτταρα Sphere υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις AG1478 (Tyrphostin), ένας επιλεκτικός αναστολέας της δραστηριότητας κινάσης του EGFR (ErbB1) που λειτουργεί με διαχωριστικούς το σε αδρανή μορφή της [24]. θεραπεία AG1478 εξετάστηκε στις 24 ώρες μετά τη θεραπεία, η θεραπεία EGF επιτευχθούν τα υψηλότερα επίπεδα σε EGFR-Ρ σε κύτταρα σφαίρα σε αυτό το χρονικό σημείο (Σχήμα S1). θεραπεία AG1478 μειωμένη ενεργοποίηση του EGFR σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα σφαίρα, με και χωρίς την προσθήκη εξωγενούς EGF (Σχήμα 3Α). Επιπλέον, AG1478 εξαρτώμενο από τη δόση μειώνεται διάδοση σφαίρα, καθώς ο αριθμός των σφαιρών που παράγονται από καθιερωμένες κυτταρικές καλλιέργειες σφαίρα μειώθηκε με κατεργασία AG1478, ανεξάρτητα από το αν εξωγενούς EGF ήταν παρούσα (Σχήμα 3Β). Παρόμοιες παρατηρήσεις ελήφθησαν επίσης με τη χρήση του PD168393 αναστολέα EGFR [25] (Εικόνα 3C). Αυτό αποδεικνύει ότι η αναστολή του EGFR σηματοδότησης δεσμεύει την ικανότητα αυτο-ανανέωσης των DU145 PCSCs.

Α) ανάλυση κηλίδας Western των προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου κατόπιν 24ώρου θεραπεία σφαιρών DU145 με DMSO (D) ή αύξουσες συγκεντρώσεις AG1478 ( 0,1-20 μΜ φάσμα συγκέντρωσης), με την παρουσία ή απουσία εξωγενούς EGF (10 ng /ml? 10EGF). σχηματισμός Σφαίρα κυττάρων σφαίρας άνευ EGF ανεστάλη μετά τη θεραπεία με αναστολείς του EGFR Β) AG1478 ή Γ) PD168393 σε διάφορες δόσεις παρουσία (10EGF) ή απουσία (-EGF) εξωγενών EGF (10 ng /ml). κύτταρα Σφαίρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο (0.5 ml /φρεάτιο? τρεις επαναλήψεις ανά θεραπεία). αναστολέα EGFR (AG1478 ή PD168393) ή DMSO (ψευδο) αγωγή χορηγήθηκε κατά το χρόνο της σποράς. Σφαίρες που σχηματίστηκαν μετρήθηκαν 12 ημέρες μετά την σπορά. Οι αριθμοί Sphere εμφανίζονται ως μέσος ± S.E.M. (Η

αξίες σ

για τις υποδεικνυόμενες συγκρίσεις ελήφθησαν από δύο-ουρά ανεξάρτητη Μαθητή

t

-τεστ).

Η

Για την αντιμετώπιση των περαιτέρω αν η απώλεια της σηματοδότησης EGFR επηρεάζει την ικανότητα της DU145 PCSCs να διατηρούν τον εαυτό τους, τα κύτταρα μονοστιβάδας DU145 μολύνθηκαν με shRNA κατασκευές στόχευσης EGFR. Αυτά τα κατασκευάσματα αποτελεσματικά νοκ-κάτω EGFR, με ελαφρώς διακυμάνσεων στα επίπεδα του EGFR knockdown εντός των αντίστοιχων σταθερές κυτταρικές σειρές (Σχήμα 4Α). Η shEGFR κατασκεύασμα # 2 (shEGFR2) επιτυγχάνεται μια μεγαλύτερη knockdown από shEGFR1 (95% έναντι 70%, αντίστοιχα) (Σχήμα 4Α). Σταθερό EGFR νοκ ντάουν κυτταρικές σειρές θα μπορούσαν να διατηρηθούν σε πλήρη μέσα. Ωστόσο, έκτοπη έκφραση του EGFR (Κ721Α), ενός μεταλλάκτη του EGFR με έλλειψη δραστηριότητας κινάσης τυροσίνης πρωτεΐνης [26], είχε ως αποτέλεσμα τον κυτταρικό θάνατο και εμπόδισε την παραγωγή μίας σταθερής κυτταρικής γραμμής (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Με τη χρήση αυτών σταθερό EGFR knockdown κυτταρικές γραμμές, ήμασταν σε θέση να δείξουμε ότι knockdown EGFR σε κύτταρα DU145 μειωμένη ικανότητα τους να παράγουν πρωτογενή σφαίρες σε σύγκριση με κύτταρα shCTRL (Σχήμα 4Β). Εξετάστηκε επίσης η δυνατότητα των νοκ ντάουν EGFR να επηρεάσουν σφαίρα συντήρησης. Σταθερό knockdown EGFR σε κύτταρα σφαίρα (Σχήμα 4C) μείωσε τον αριθμό των μεταγενέστερων σφαίρες σχηματίζονται στην κατάσταση -EGF μέσων (Εικόνα 4D).

Α) κύτταρα DU145 μονοστιβάδα μολύνθηκαν με EGFR shRNA λεντοϊού κατασκευάσματα και επιλέγονται με πουρομυκίνη προκειμένου να δημιουργηθούν σταθερές κυτταρικές σειρές. Η ανάλυση στυπώματος Western διαφόρων κυττάρων EGFR knockdown (shEGFR) διεξήχθη για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα EGFR knockdown σε σχέση με την κυτταρική γραμμή μη ειδική ελέγχου shRNA (shCTRL). Β) Σταθερό EGFR νοκ ντάουν κύτταρα σχηματίζουν λιγότερες πρωτογενή (1 °) σφαίρες σε σύγκριση με τα κύτταρα shCTRL. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2,5 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο (0.5 ml /φρεάτιο? Τρεις επαναλήψεις ανά θεραπεία). Οι αριθμοί Sphere εμφανίζονται ως μέσος ± S.E.M. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (*

σ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την αντίστοιχη κατάσταση -EGF μέσα μαζικής ενημέρωσης για κάθε κυτταρική σειρά? δίπλευρη ανεξάρτητη Μαθητή

t

-τεστ). C) Η αποτελεσματική knockdown EGFR σε καθιερωμένες σφαίρες DU145 μπορεί επίσης να επιτευχθεί. Κύτταρα από EGF-free (-EGF) σφαίρες μολύνθηκαν με shCTRL και shEGFR2 λεντοϊού. Απώλεια της έκφρασης πρωτεΐνης EGFR μειώνει σημαντικά τον αριθμό D) των DU145 σφαιρών που καλλιεργούνται υπό άνευ EGF συνθήκες μέσων. knockdown EGFR (shEGFR2) και τα κύτταρα σφαίρα shCTRL σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο (τρεις επαναλήψεις ανά κυτταρική σειρά). Ο αριθμός των σφαιρών που σχηματίστηκε μετρήθηκε 12 ημέρες μετά την σπορά. αριθμός σφαίρα εμφανίζεται ως μέση τιμή ± S.E.M. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (**

σ

& lt? 0,01? δίπλευρη ανεξάρτητη Μαθητή

t

-τεστ). Ε) knockdown EGFR σε κύτταρα σφαίρα DU145 μείωσε σημαντικά in vitro ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη τους. Ο συνολικός αριθμός των αποικιών σε 5 τυχαία πεδία (σε 25Χ μεγέθυνση) μετρήθηκε και παριστάνεται ως μέση ± S.E.M. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (**

σ

& lt? 0,01? δίπλευρη ανεξάρτητη Μαθητή

t

-τεστ). Αντιπροσωπευτικές εικόνες αντίθεσης φάσης των αποικιών που φαίνεται σε 50Χ μεγέθυνση (ένθετο). Κλίμακα ράβδου είναι ίσο με 100 μm

Η

Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του κυτταρικού μετασχηματισμού in vitro, η οποία συσχετίζεται στενά με in vivo ογκογονικότητα σε ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς [27] – [29]., είναι η ικανότητα των ογκογόνων κυττάρων να διαδώσει υπό ανεξάρτητο από αγκύρωση συνθήκες. Για την αντιμετώπιση κατά πόσο η απώλεια της έκφρασης EGFR επηρεάζει την ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των DU145 PCSCs, εγκατεστημένος EGFR knockdown κυττάρων σφαίρα σπάρθηκαν σε μαλακά μέσα άγαρ που περιέχει ορό συμπληρωμένο. EGFR νοκ ντάουν στα κύτταρα σφαίρα είχε ως αποτέλεσμα λιγότερες μαλακό αποικίες άγαρ σε σύγκριση με τα κύτταρα shCTRL σφαίρα κάτω από τη διαφοροποίηση (δηλ. Έχει συμπληρωθεί με ορό) συνθήκες (Σχήμα 4Ε). Στο σύνολό τους, αποδείξαμε ότι η σηματοδότηση EGFR είναι κρίσιμης σημασίας για τη διατήρηση της DU145 PCSC διάδοσης, η οποία είναι συνεπής με την παρατηρούμενη μείωση σε μαλακό άγαρ αριθμούς αποικίας μετά από νοκ ντάουν EGFR.

MEK-ERK Σηματοδοσίας Ρυθμίζει τις ιδιότητες αυτο-ανανέωση των DU145 PCSCs

Μετά την απόδειξη ότι η σηματοδότηση EGFR είναι κρίσιμης σημασίας για την παραγωγή και τη συντήρηση των PCSCs, εξετάσαμε περαιτέρω τις κατάντη μηχανισμών που ευθύνονται για την παρατηρούμενη δραστηριότητα EGFR. σηματοδότηση EGFR είναι πολύ γνωστή για την κίνηση γεγονότα σηματοδότησης που περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ-ΑΚΤ και Raf-ΜΕΚ-ΕΚΚ (ενεργοποιημένης από μιτογόνο κινασών πρωτεΐνης? ΜΑΡΚ) οδών [30]. Επιπλέον, σηματοδότηση EGFR έχει δειχθεί ότι ενεργοποιούν μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής των πρωτεϊνών μεταγραφής (STAT) [31], ιδίως STAT3 με τη μεσολάβηση σηματοδότηση [32]. Η ενεργοποίηση της STAT3 περιλαμβάνει φωσφορυλίωσης στο Tyr705 [33], και STAT3 έχει δειχθεί ότι ενεργοποιείται σε καρκίνους του προστάτη [34], [35]. προηγούμενη εργασία μας έχει προτείνει ότι στο σύστημά μας, άλλους μεταγενέστερους πρωτεΐνες σηματοδότησης, παρά ΑΚΤ, πρέπει να είναι κρίσιμη για την υπόθεση EGF-ενισχυμένο σχηματισμό σφαίρα DU145 [11]. Ενώ ΑΚΤ μπορεί να συμβάλει στη διάδοση σφαίρα DU145, έχουμε επεκταθεί περαιτέρω στην προηγούμενη έκθεσή μας για να εξετάσει τις εισφορές του μονοπατιού ERK προς EGFR-εξαρτώμενο πολλαπλασιασμό των DU145 PCSCs.

Σε αυτή την προσπάθεια, ήμασταν σε θέση να αποδείξει ότι EGF διέγερση των κυττάρων σφαίρας DU145 άνευ EGF οδήγησε σε ενεργοποίηση ERK, αλλά όχι STAT3 ενεργοποίηση, σε ένα χρονοεξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα S1). Επιπλέον, ο αναστολέας ΜΕΚ, U0126 [36], εξαρτώμενο από τη δόση μείωσε την ικανότητα αυτο-ανανέωσης των DU145 PCSCs (Σχήμα 5Α). Όπως ήταν αναμενόμενο, U0126 ανέστειλε την ενεργοποίηση της ERK σε DU145 PCSCs (Εικόνα S2). Να παγιώσει τα αποτελέσματα εμπλέκουν σηματοδότησης ΜΕΚ-ΕΚΚ στο DU145 PCSC διάδοσης, έχουμε εκφράσει την κυρίαρχη-αρνητική ΜΕΚ1 (K97M) [37] σε κύτταρα DU145 (Εικόνα 5Β). κύτταρα ΜΕΚ1 (K97M) εμφανίζεται μειωμένη ενεργοποίηση ERK σε σύγκριση με τα κενά κελιά φορέα (EV) του ελέγχου μετά από FBS-διέγερση (10%) των κυττάρων ορού στερούνται (Σχήμα 5Β). Σε σύγκριση με τα κύτταρα EV, κύτταρα ΜΕΚ1 (K97M) παρουσίασαν σημαντική μείωση στην παραγωγή πρωτογενών σφαίρες (Σχήμα 5C). Προς στήριξη της σηματοδότησης ΜΕΚ-ΕΚΚ είναι κρίσιμη για EGFR μεσολάβηση γενιά DU145 PCSCs, εξωγενές EGF ήταν ανίκανος περαιτέρω ενίσχυση της πρωτοβάθμιας σχηματισμό σφαίρα των κυττάρων ΜΕΚ1 (K97M) (Σχήμα 5C).

Α) Αναστολή της ERK