Αφηρημένο

Το εναλλακτικό μάτισμα περιλαμβάνει διαφορικό επιλογής εξόνιο ενός αντιγράφου του γονιδίου για να δημιουργήσει mRNA και πρωτεΐνης ισομορφών με δομικές και λειτουργικές διαφορές. Ανώμαλη εναλλακτικό μάτισμα έχει αποδειχθεί ότι συνδέεται με κακοήθη φαινοτύπους των καρκινικών κυττάρων, όπως χημειο-αντίσταση και επεμβατική δραστηριότητα. Διαλογή μικρά μόρια και φάρμακα για τη ρύθμιση του RNA splicing σε ανθρώπινες κυτταρικές ηπατοκυτταρικού καρκινώματος γραμμή Huh-7, ανακαλύψαμε ότι αμιλορίδη, διακριτή από τέσσερα ανάλογα αμιλορίδης ρΗ επηρεάζει, θα μπορούσε να «ομαλοποίηση» την μάτισμα

BCL-X, HIPK3

και

RON /MISTR1

μεταγραφές. πρωτεομική αναλύσεις μας των κυττάρων αμιλορίδης επεξεργασμένα ανιχνεύεται υπο-φωσφορυλίωση του παράγοντα ματίσματος SF2 /ASF, και μειωμένα επίπεδα SRp20 και δύο πρωτεΐνες un-προσδιορισμένες SR. Έχουμε περαιτέρω παρατηρηθεί μειωμένη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, ERK1 /2 και ΡΡ1, και αυξημένη φωσφορυλίωση της ρ38 και ΙΝΚ, υποδηλώνοντας ότι η αγωγή αμιλορίδη ρυθμίζει προς τα κάτω κινάσες και up-ρυθμίζει φωσφατασών στις οδούς σήματος που είναι γνωστό ότι επηρεάζουν μάτισμα φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών παράγοντας. Αυτές αμιλορίδη επιπτώσεις της «ομαλοποιηθεί» ογκογόνο μάτισμα RNA και παράγοντας μάτισμα υπο-φωσφορυλίωση και οι δύο καταργήθηκε με προ-θεραπεία με έναν αναστολέα της ΡΡ1. Παγκόσμια συστοιχία εξόνιο κυττάρων αμιλορίδης επεξεργασμένου Huh-7 ανιχνεύεται μοτίβο μάτισμα αλλαγές που περιλαμβάνουν 584 εξώνια σε 551 μεταγραφές γονιδίων, πολλά από τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες που παίζουν βασικούς ρόλους στην μεταφορά ιόντων, σχηματισμός κυτταρική μήτρα, κυτταροσκελετού αναδιαμόρφωση, και συντήρηση γονιδιώματος. Cellular λειτουργικές αναλύσεις αποκάλυψαν μετέπειτα εισβολή και τα ελαττώματα της μετανάστευσης, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, την απομείωση κυτταροκίνηση, και θανατηφόρα αποδόμηση του DNA σε κύτταρα αμιλορίδη επεξεργασμένα Huh-7. Άλλοι ανθρώπινοι στερεού όγκου και λευχαιμικά κύτταρα, αλλά όχι μερικές φυσιολογικά κύτταρα, έδειξε παρόμοια αμιλορίδη αναλλοίωτα μάτισμα RNA με εξουθενωμένες συνέπεια. Η μελέτη αυτή παρέχει έτσι μηχανιστική βάσεις για την εκμετάλλευση μικρών διαμόρφωση μόριο του RNA ματίσματος για θεραπευτικά του καρκίνου

Παράθεση:. Chang J-G, Yang D-M, Chang W-H, Chow Ε-Ρ, Chan W-L, Lin Η-Η, et al. (2011) μικρό μόριο αμιλορίδη διαμορφώνει ογκογόνος RNA εναλλακτικό μάτισμα προς αφαίρεση της ζωτικότητας ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 6 (6): e18643. doi: 10.1371 /journal.pone.0018643

Συντάκτης: John D. Minna, Πολυτεχνείου της Texas Southwestern Medical Center στο Ντάλας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Οκτωβρίου, 2010? Αποδεκτές: 11, Μάρ του 2011? Δημοσιεύθηκε: 9 Ιουνίου, 2011

Copyright: © 2011 Chang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την έρευνα χορηγεί NSC-95 – 2320-B-037-049 (JGC), NSC 95-2311-Β-009-004-my3 (HDH) και NSC 97 με 2.627-B-009-007 (HDH) από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο της Ταϊβάν και από DOH95-B-11-TM007 (λ ¥ ΚΥ) και DOH96-TD-Ι-111-TM003 (λ ¥ ΚΥ) από το Υπουργείο Υγείας της Ταϊβάν. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Proteome πολυπλοκότητα διαστέλλεται από εναλλακτικό μάτισμα (AS), μια διαδικασία που περιλαμβάνει απόκλιση έγκλεισης εξωνίου ή τον αποκλεισμό των ίδιων μορίων προ-mRNA για την παραγωγή διαφόρων ισομορφών mRNA και η πρωτεΐνη [1], [2]. Η διαδικασία όπως ελέγχεται από δύο εξαιρετικά διατηρημένη οικογένειες πρωτεϊνών: επαναλήψεις αργινίνης /σερίνης διπεπτίδιο (SR)-σχετικών πρωτεϊνών και το ετερογενές πυρηνικό ριβονουκλεοπρωτεΐνες (hnRNP)-σχετικών πρωτεϊνών [3], [4]. πρωτεΐνες SR περιέχουν μια αρθρωτή δομή διμερούς μεταξύ των οποίων μία ή δύο μοτίβα αναγνώρισης RNA στο Ν άκρο και μια περιοχή πλούσια σε RS επαναλήψεις διπεπτίδιο αργινίνης /σερίνης στο Ο-άκρο [5], [6]. Η λειτουργία των Ν-τερματικών μοτίβα σε πρωτεΐνες SR περιλαμβάνει τη δέσμευση να εξωνίου exhancers μάτισμα αλληλουχίας-ειδική. Το Ο-τερματικό πεδίο RS χρησιμεύει ως γενική περιοχή ενεργοποίησης για μάτισμα με τη σύνδεση σε ένα ετερογενές σύνδεσης RNA μοτίβο [6]. πρωτεΐνες SR ρυθμίζουν την επιλογή των τόπων, τα οποία αποκλίνουν από τις περιοχές κανονικής ματίσματος, ως εκ τούτου, την προώθηση της ένταξης ή αποκλεισμού των εναλλακτικών εξώνια. Από την άλλη πλευρά, ορισμένοι hnRNPs, όπως hnRNPA1, μπορεί να ανταγωνίζονται τη λειτουργία των πρωτεϊνών AS SR μέσω σύνδεσης προς εξωνίου στοιχεία μάτισμα σιγαστήρας [7].

AS επομένως ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου δια δημιουργίας διακεκριμένων ισομορφές πρωτεΐνης που εμπλέκεται σε διακριτά λειτουργίες των κυτταρικών γεγονότων, όπως απόπτωση, τον προσδιορισμό του φύλου, καθοδήγηση άξονα, η διέγερση των κυττάρων, και τη συστολή των κυττάρων [8], [9]. AS παίζει επίσης καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη των ανθρώπινων κληρονομικών διαταραχών και του καρκίνου [10], [11], [12], [13], [14]. Η ανώμαλη AS του πρωτο-ογκογονιδίων ή /και ογκοκατασταλτικά γονίδια μπορεί να συνεισφέρει στην κυτταρική κακοήθεις φαινοτύπους, όπως αντοχή σε απόπτωση, την προώθηση της εισβολής και της μετάστασης, και διέγερση της αγγειογένεσης όγκου [11], [12], [13], [14 ]. Ως δεδομένο ότι η ρύθμιση αυτών των γονιδίων του καρκίνου που σχετίζονται θα μπορούσε να έχει σοβαρές επιπτώσεις στην παθογόνων δραστηριότητές τους, έχουμε ψάξει για μικρά μόρια ή φάρμακα με διαμόρφωση επιπτώσεις στην AS. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε βρει ότι η αμιλορίδη, ένα πολύ γνωστό διουρητικό, μπορεί να αλλάξει ογκογόνο AS σε κύτταρα ανθρώπινου ηπατοκυτταρικού καρκινώματος Huh-7, καθώς και σε διάφορες άλλες σειρές ανθρώπινου καρκίνου και των λευχαιμικών κυττάρων, και ως εκ τούτου να διερευνήσει τις υποκείμενες μοριακών και κυτταρικών μηχανισμών για πιθανές θεραπευτικές επιπτώσεις.

Αποτελέσματα

αμιλορίδη «ομαλοποιεί» η ισομορφή RNA μάτισμα του

BCL-X, HIPK3

και

RON /MISTR1

σε Huh -7 κύτταρα

έχει γίνει πρόσφατα σαφές ότι ανισόρροπη RNA splicing ορισμένων γονιδίων σχετίζεται με κακοήθεις ιδιότητες των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων [11], [12], [13], π.χ., αντίσταση στη χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία με

BCL-X,

ογκο-αναπτυξιακά αδιαφοροποίητη κατάσταση με

HIPK3,

και επεμβατική μεταστατικό δυναμικό με

RON /MISTR1

. Σε κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος Huh-7,

BCL-X

εναλλακτικά συγκολλημένα σε αντι-αποπτωτικών μεγάλο RNA ισομορφή,

BCL-XL,

περισσότερο από ό, τι προ-αποπτωτικών μικρά RNA ισομορφή,

BCL-XS

[15]?

HIPK3

ματίζεται σε εξώνιο 11-αποκλείονται U (-), καθώς και το εξόνιο 11-συμπεριλαμβάνεται U (+) ισομορφών για αλληλεπίδραση με Ραδ /FADD να διαμορφώνει απόπτωση στην αναπτυξιακή διαδικασία [16]? και

RON /MISTR1

είναι συγκολλημένα σε 5-kb πλήρους μήκους (

flRON

) RNA και 2-kb εξόνιο 11-αποκλείονται

RON

(

sfRON

) ισομορφών του RNA, τα τελευταία των οποίων έχει συσχετισθεί με επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση σε καρκινικές κυτταρικές εισβολή και τη μετάσταση [17], [18]. Μετά από διαλογή περισσότερο από 500 μικρά μόρια και φάρμακα, συμπεριλαμβανομένων εκείνων σε κλινική χρήση, βρήκαμε ότι η αμιλορίδη ασκείται έντονη επίδραση επί της AS αυτών των μεταγραφημάτων του γονιδίου (Σχήμα 1Α). Huh-7 κύτταρα σε επεξεργασία με αμιλορίδη έδειξαν: (α) σχετική μείωση του

BCL-XL

και αύξηση του

BCL-XS ισομορφών

RNA? (Β) σε σχέση συντήρηση του

HIPK3

U (-) και μείωση

HIPK3

U (+) ισομορφές? και (γ) μείωση και των δύο εξωνίου 11 (+)

flRON

και εξόνιο 11 (-)

sfRON

RNA ισομορφών. Τέτοια αποτελέσματα της αμιλορίδης ήταν δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη, όντας ανιχνεύσιμη με 2 ώρες και επισημαίνονται μετά από 24 ώρες επώασης με 0,5 mM της αμιλορίδης. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν αυξημένη χρήση της εναλλακτικής ιστοσελίδα 5′-ματίσματος ανοδικά στο εξόνιο 2 του

BCL-X

, αυξημένη εξόνιο 11 (U) αποκλεισμός του

HIPK3

, και μειωμένη συγκροτήματα μάτισμα σχηματίζονται για παραγωγή και των δύο

RON /MISTR1

εξόνιο 11 (+) και το εξόνιο 11 (-) ισομορφών. Έτσι, αμιλορίδη μπορεί να διαμορφώσει τις ΩΣ από αυτές τις τρεις μεταγραφές γονίδιο προς λιγότερο κακοήθη «ομαλοποιηθεί» μοτίβα, παρόμοια με τα κανονικά και σε προηγούμενες εκθέσεις [15], [16], [17], [18].

RNA εκχυλίστηκε από Huh-7 κύτταρα εκτέθηκαν σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει αμιλορίδη ή άλλα παράγωγα διαμορφωτή αμιλορίδη pHi και εξετάστηκαν για την ογκογόνο RNA εναλλακτικό μάτισμα με RT-PCR, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Πάνελ (Α) δείχνει ότι αμιλορίδη αυξήσει τη χρήση του ανάντη εναλλακτική θέση 5′-ματίσματος στο εξώνιο 2 που παράγει την αποπτωτική ισομορφή BCL-XS (άνω σειρά), αύξησε την εξόνιο 11 (U εξόνιο) παρακάμπτοντας του HIPK3 που αυξάνει την αποπτωτική ισομορφή (μεσαία σειρά), και αυξήθηκε ελαφρά το εξώνιο 11 παράκαμψη του RON κατά 0,5 mM συγκέντρωση (κάτω σειρά). Το πλαίσιο (Β) δείχνει ότι τα πρότυπα ματίσματος των δοκιμαζόμενων γονίδια δεν επηρεάστηκαν σημαντικά από τέσσερα παράγωγα αμιλορίδη, συμπεριλαμβανομένων 5- (Ν-αιθυλ-Ν-ισοπροπυλ) -amiloride ή ΕΙΔΔ? 5- (Ν-μεθυλ-Ν-ισοβουτυλ) αμιλορίδη ή MIBA? 5- (Ν, Ν-διμεθυλο) αμιλορίδη ή DMA? και 5- (Ν, Ν-εξαμεθυλενο) αμιλορίδη ή ΕΕΔΕ, σε ισοδύναμες συγκεντρώσεις του φ διαφοροποίησης.

Η

Επειδή αμιλορίδη είναι ένα πρωτότυπο ενδοκυτταρικού pH (pHi) διαμορφωτή ναρκωτικών, εξετάσαμε τέσσερα παράγωγα αμιλορίδη σε ισοδύναμα ή μεγαλύτερη pHi που επηρεάζουν δόσεις. Παρατηρήσαμε ότι τα παράγωγα αυτά δεν προκάλεσε παρόμοια «ομαλοποίηση» επιπτώσεις στο

BCL-X

,

HIPK3,

και

RON /MISTR1

Όπως μοτίβα σε κύτταρα Huh-7 (Σχήμα 1Β). Αντίθετα, σε μια προηγούμενη μελέτη [19] παρατηρήσαμε ότι 5- (Ν-ehyl-Ν-ισοπροπυλ) αμιλορίδη (EIPA), αλλά όχι αμιλορίδη διαμορφώνεται με μείωση του παθογόνου exon7 αποκλεισμό του

SMN2

μεταγραφές της κληρονομικής νωτιαία μυϊκή ατροφία κύτταρα. Αυτά τα παράδοξα παρατηρήσεις καταδεικνύουν την πολυπλοκότητα των μηχανισμών AS και δείχνουν επίσης ότι η επιλογή του τόπου ματίσματος στο

BCL-X

,

HIPK3,

και

RON /MISTR1

μεταγραφές στην amiloride- επεξεργασμένα κύτταρα Huh-7 προκαλείται μέσω μηχανισμού ματίσματος κυττάρου-ειδική (ες) και όχι απλά ενδοκυτταρική μεταβολή του ρΗ.

πρωτεομικής ανίχνευσης ως επί το πλείστον υπο-φωσφορυλιωμένη παράγοντας ματίσματος SF2 /ASF στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα της αμιλορίδης επεξεργασμένου κύτταρα

Ως κατάσταση φωσφορυλίωσης του SR πρωτεϊνικών συστατικών στο ως σύμπλοκα είναι γνωστό ότι επηρεάζει την αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-πρωτεΐνης για την λειτουργία ματίσματος, χρησιμοποιήσαμε την επόμενη ηλεκτροφόρηση 2D-γέλης για την ανάλυση διαφορική έκφραση του σερίνης-φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών. Βρήκαμε περισσότερο από δέκα πρωτεΐνες με ποσοτικές αλλαγές μετά τη θεραπεία αμιλορίδη (Σχήμα 2). Επιλέγοντας επτά από αυτά τα σημεία πρωτεΐνης για πρωτεομική ταυτοποίηση με φασματομετρία μάζας (Πίνακας 1), βρήκαμε ένα από αυτά να είναι ASF /SF2, έναν παράγοντα μάτισμα είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην AS από το

RON

μεταγραφή [20] . Για να επαληθευθεί αυτή η διαπίστωση, εκτελέσαμε στυπώματα western των ASF /SF2 και βρέθηκε σημαντικά μειωμένη ASF /SF2 φωσφορυλίωση τόσο στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των κυττάρων αμιλορίδης επεξεργασμένου Huh-7 (Σχήμα 3Α). Ανάλυση των άλλων συστατικών πρωτεΐνης των συμπλοκών ματίσματος (όπως SRp20, hnRNPA1, hnRNPA2 /B1, SAM68 και κοινών πρωτεϊνών SR) έδειξαν ότι SRp20 και δύο φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών SR un-εντοπίστηκαν μειώθηκαν επίσης στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα μετά τη θεραπεία αμιλορίδη (Εικόνα 3Β). Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι η αμιλορίδη ρυθμίζει την από

BCL-X

,

HIPK3,

και

RON /MISTR1

μέσω υπο-φωσφορυλίωση της ASF /SF2 και μειωμένη έκφραση της SRp20 και κάποιες άλλες πρωτεΐνες SR.

ανάλυση ηλεκτροφόρησης 2D-γέλης των πρωτεϊνών που προέρχονται από τα κύτταρα Huh-7 χωρίς (αριστερά) και με (δεξιά) θεραπεία 0.5mM αμιλορίδη επί 24 ώρες έδειξε σημαντικές αλλαγές για τουλάχιστον δέκα σημεία, εκ των οποίων επτά (υποδεικνύεται από τα βέλη) απομονώθηκαν για ανάλυση φασματομετρίας νανο-LC-MS /MS και ταυτοποίηση πρωτεϊνών, όπως φαίνεται στον πίνακα 1.

η

ανάλυση στυπώματος Western των υποκυτταρικών κλασμάτων των κυττάρων Huh-7 με και χωρίς 0,5 mM αμιλορίδη θεραπείας 24 ωρών πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα κατά διαφόρων πρωτεϊνικών παραγόντων ματίσματος και β-τουμπουλίνης. (Πίνακας Α) Η αμιλορίδη κατεργασία αύξησε την αποφωσφορυλιωμένο μορφές SF2 /ASF σε αμφότερες τις κυτταροπλασματικές και πυρηνικών κλάσματα. (Πίνακας Β) Η θεραπεία αμιλορίδη μείωσε την έκφραση της SRp20 και δύο φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών un-προσδιορίζονται SR και στις δύο C (κυτταροπλασματική) και Ν (πυρηνικό) κυτταρικά κλάσματα.

Η

αμιλορίδη ρυθμίζει προς τα κάτω φωσφορυλίωση κινάσης ΑΚΤ και ΡΡ1 φωσφατάση

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το αμιλορίδιο αναστέλλει τη φωσφορυλίωση των κινασών και φωσφατασών που συνδέονται με την ΡΙ3Κ-ΑΚΤ οδός [21], [22], [23], και ότι ΑΚΤ κινάση και ΡΡ1 φωσφατάση μπορούν να ρυθμίζουν τη δραστηριότητα των πρωτεϊνών SR [23], [24], [25], [26], [27], [28]. Ως εκ τούτου, καθορίζονται οι επιδράσεις της αμιλορίδης στις φωσφορυλιωμένες μορφές της Akt κινάσης και συναφών φωσφατάσες σε κύτταρα Huh-7. Μειωμένα επίπεδα της Ser (473) p-ΑΚΤ και την Thr (320) p-ΡΡ1 παρατηρήθηκαν στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα, γεγονός που υποδηλώνει την αναστολή της δραστηριότητας κινάσης ΑΚΤ και την ενεργοποίηση της δραστικότητας ΡΡ1 φωσφατάσης (Σχήμα 4Α). Για να καθοριστεί εάν η αδρανοποίηση του Akt κινάσης per se θα παίζουν ένα ρόλο στη ρύθμιση της εναλλακτικό μάτισμα, τα κύτταρα Huh7 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αναστολείς της οδού ΡΙ3Κ-ΑΚΤ, συμπεριλαμβανομένων LY294002, wortmannin και triciribine? 1 μΜ triciribine αλλά όχι LY294002 ή wortmannin μείωσε το επίπεδο της ρ-Akt. Ωστόσο, triciribine σε αυτή τη συγκέντρωση που ασκείται καμία επίδραση στην εναλλακτική συρραφή του

BCL-X

και

HIPK3

μεταγραφές (Σχήμα S1). Είναι ενδιαφέρον ότι, προ-κατεργασία των κυττάρων με οκαδαϊκό οξύ για να αναστέλλουν δραστικότητα ΡΡ1 φωσφατάσης ακύρωσε τις επιδράσεις της αμιλορίδης επί

BCL-X

και

HIPK3

ματίσματος, καθώς και τα αποτελέσματα της αμιλορίδης επί της αποφωσφορυλίωσης του SF2 /ASF και μειώνοντας το επίπεδο SRp20, αλλά οκαδαϊκό οξύ που ασκείται καμία συγκεκριμένη επίδραση στην έκφραση του hnRNP Α1 και hnRNP A2B1 (Σχήμα 4Β). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ΡΡ1 παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση φωσφορυλίωση του SR παράγοντες ματίσματος και επομένως η διαμόρφωση του ογκογόνο AS σε κύτταρα Huh-7 μετά αμιλορίδη θεραπεία.

(Πίνακας Α). Western blots δείχνουν σημαντικές μειώσεις της κυτταροπλασματικής ρ-Ακί, πυρηνική ρ-Ακί και πυρηνική ρ-ΡΡ1 στα κύτταρα Huh-7 σε επεξεργασία με αμιλορίδη σε 0,3 mm και άνω. (Πίνακας Β) RT-PCR και στύπωμα Western αναλύσεις δείχνουν ότι η προ-θεραπεία με έναν αναστολέα ΡΡ1, οκαδαϊκό οξύ, κατήργησε την αμιλορίδη επιδράσεις στην BCL-X και HIPK3 ογκογόνο μάτισμα RNA, την φωσφορυλίωση του ASF2 /παράγοντα ματίσματος ASF και το επίπεδο του SRp20 σε κύτταρα Huh-7.

η

Genome κλίμακα ανίχνευση εξονίου-συστοιχία αλλαγμένο μάτισμα RNA πολλών λειτουργικών γονιδίων σε κύτταρα αμιλορίδη επεξεργασμένα

είναι πιθανό ότι τα αποτελέσματα της αμιλορίδη για την φωσφορυλίωση και ενδοκυτταρικό εντοπισμό των παραγόντων ματίσματος και του mRNA των εξαγωγών [29] θα μπορούσε να επηρεάσει το μάτισμα των άλλων μεταγραφές γονιδίου εκτός από

BCL-X, HIPK3

και

RON /MISTR1

. Που χρησιμοποιούν τα τσιπ συστοιχίας γονιδίων (Affymetrix GeneChip® Ανθρωπίνων εξόνιο 1.0 ST Array της & gt? 518000 εξώνια των 42.974 γονίδια) για την ανάλυση της σειράς εξόνιο (σύνολο παραμέτρων του συντελεστή συσχέτισης ≥0.7, ο δείκτης μάτισμα ≤-1.585, και συνδεθείτε

2 αναλογία ≤- 1.585), βρήκαμε ότι η αμιλορίδη επηρέασαν τα πρότυπα μάτισμα 551 γονιδίων που περιλαμβάνουν τουλάχιστον 584 εξώνια, η οποία περιελάμβανε 495 γνωστά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που περιλαμβάνουν 526 εξώνια (Πίνακας S1? MIAME αριθμός πρόσβασης # GSE24581). Αυτά τα 495 γνωστά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες θα μπορούσαν να ταξινομηθούν σε λειτουργικές κατηγορίες αφορούν κυτταροσκελετού αναδιαμόρφωση, κυτταρική προσκόλληση, η μεταφορά ιόντων, παράγοντες μεταγραφής, ανοσοαπόκριση, και τη σύσπαση των μυών (Σχήμα 5Α-C και Πίνακας S2). Για να επαληθεύσετε αυτά τα αποτελέσματα σειρά εξόνιο, επιλέξαμε επτά (

APF-1, CRK, MBNL2, MIZF, ΠΑΣ, PAPDS

και

survivin

) για ανάλυση με RT-PCR και μάλιστα επιβεβαιώνεται ξεχωριστές AS μοτίβο μεταβολές αυτών των μεταγραφών γονιδίων σε αμιλορίδη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 5D).

Bioinformatic αναλύσεις των 495 γονιδίων μεταγραφές με αμιλορίδη-τροποποιημένο εναλλακτικό μάτισμα, ανιχνεύεται από τις μετρήσεις εξόνιο-array γονιδίωμα-ευρεία, πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα σε κατηγορίες γονιδίων οντολογίας της βιολογικής διαδικασίας (Α), Μοριακή Λειτουργία (Β) και κυτταρικού συστατικού (C). Αμιλορίδη-τροποποιείται ως πρότυπα της

APAF1, CRK, MBNL2, MIZF, ΠΑΣ, PAPD5

και

SU

R

VIVIN

συγκεκριμένες μεταγραφές γονίδιο που κωδικοποιεί πρωτεΐνη που ανιχνεύεται από τον exon- ανάλυση της σειράς επικυρώθηκαν με RT-PCR από συγκολλημένα ισομορφών του RNA (Πίνακας Δ)

η

σε λεπτομερή επίπεδα γονιδιακής οντολογίας (GO), οι μεταγραφές RNA που δείχνει αμιλορίδη-επηρεαστεί περιλαμβάνονται: α.). 4 5 γονίδια (80,0%) της «κινητικής δραστηριότητας μικρονηματίων» (GO 0000146), και 28/132 (21,2%) των γονιδίων της «κινητικής δραστηριότητας» (GO 0003774)? σι). 5 από 7 (71,4%) των «κατιόντος: δραστηριότητα χλωριούχο συμμεταφορέα» (GO 0015377), 5/18 (27,8%) των «ανιόντων κατιόντων συμμεταφορέα» (GO 0015296), 3/10 (30,0%) των «καλίου νατρίου ανταλλαγή ΑΤΡάσης «(GO 0005391), και 2/8 (25,0%) των ανόργανων δραστηριότητα ανταλλαγής ανιόντων» (GO 0005452)? ντο). 2 από 3 (66,7%) nitric- δραστηριότητα συνθάσης οξειδίου (GO 0004517)? δ) 16/29 γονίδια (62,1%) των «εξωκυττάριας ουσίας διαρθρωτική συνιστώσα που προσδίδει αντοχή σε εφελκυσμό» (GO 0030020), 38/346 γονίδια (11,0%) των «κυτταροσκελετού δεσμευτική πρωτεΐνη» (GO 0030020), 2/7 (28,6% ) του κολλαγόνου δεσμευτική (GO 0005518)? 2/8 (25,0%) των «μυοσίνης δέσμευσης» (GO 0017022), και άλλα. Από 213 γονίδια που σχετίζονται με την απόπτωση, 6 (

CCAR1, EP3000, KIAA1967, PRKDC και PRPF8

) έδειξε αλλαγμένη εναλλακτικό μάτισμα από αμιλορίδη. Από 608 γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο, 32 συμπεριλαμβανομένων των

RON /MISTR1, ATM

(αταξία teleangiectasis μεταλλαγμένα) και

FANCM

(Fanconi πρωτεΐνη αναιμία Μ) επηρεάστηκαν από αμιλορίδη. Ως

ATM

παίζει σημαντικό ρόλο στην επιδιόρθωση βλαβών του DNA, ενώ

FANCM

εμπλέκεται στην συναρμολόγηση των συμπλόκων Fanc πρωτεΐνης που διατηρούν την ακεραιότητα και τη σταθερότητα [30] γονιδιώματος, μεταβάλλεται από αυτές τις δύο μεταγραφές γονίδιο με αμιλορίδη μπορεί να οδηγήσει σε χρωματίνη αποικοδόμηση, όπως επαληθεύεται σε μετέπειτα πειράματα μας. Ωστόσο,

RON /MISTR1

, αλλά όχι

BCL-X

και

HIPK3

, ήταν μεταξύ των 495 γονιδίων που ανιχνεύθηκαν να έχουν αμιλορίδη-μεταβληθεί πρότυπα ματίσματος από ανάλυση της σειράς εξόνιο, προφανώς λόγω των αυστηρών ποσοτικών κριτηρίων, ή /και σύντομη συγκολλημένα ακολουθίες

BCL-X

.

Χρησιμοποιώντας γνωστές συναινετικές αλληλουχίες νουκλεοτιδίων του ματίσματος ρυθμιστικά στοιχεία, έχουμε ακόμη εντοπιστεί πιθανή ενισχυτή μάτισμα και σιγαστήρα στοιχεία επικουρικώς εξόνιο ματίσματος, 5′-πλευρικές ιντρόνιο και 3′-πλευρικές περιοχές εσωνίου των 495 γονιδίων που επηρεάζονται από αμιλορίδη (Πίνακας S3). Αυτά μάτισμα cis-στοιχεία είναι οι θέσεις πρόσδεσης των ASF /SF2, SRp55 και άλλα άγνωστα ρυθμιστικούς παράγοντες. Κατά τη διάρκεια των αλληλεπιδράσεων του SF2 /ASF και άλλων SR πρωτεϊνικών παραγόντων με cis-στοιχεία στα σύμπλοκα ματίσματος, η λειτουργική κατάσταση των συμπλοκών δέσμευσης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης μπορεί να ρυθμίζεται με την κατάσταση φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών [21], [23], [31] , [32]. Αυτό συνεπάγεται ότι η αλλαγμένη μάτισμα αυτών μετεγγραφής γονιδίου προκαλείται μέσω αμιλορίδη επαγόμενη υπο-φωσφορυλίωση του SF2 /ASF και άλλων πρωτεϊνών SR.

Μειωμένη κινητικότητα κυττάρου δραστηριότητες /εισβολή και απεμπλουτισμένο κυτταροσκελετική δομές εξής ως μεταβολές των εμπλεκόμενων γονιδίων μετά αμιλορίδη έκθεση

Επειδή μεταβληθεί

RON /MISTR1

ματίσματος που προκαλείται από SF2 /ASF έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί σε αύξηση της κινητικότητας και της εισβολής των δραστηριοτήτων των κυττάρων [20], εξετάσαμε τη λειτουργική επίδραση της αμιλορίδης επαγόμενη μείωση των εξόνιο 11 (+) fl

RON

και εξόνιο 11 (-) SF

RON

ισομορφές (Σχήμα 1C) και μείωση των εξόνιο 13 και εξόνιο 20 ένταξης ανιχνεύεται από ανάλυση της σειράς εξόνιο (Πίνακας S1). Η μετανάστευση των κυττάρων από ένα ξύνεται άκρη μονοστιβάδα ήταν μειωμένη κατά 0,4 mM αμιλορίδη (Σχήμα 6Α). δεσμευτικός απέδειξαν μεταβολή του F-ακτίνης ικριώματα κυτταροσκελετική από ένα περι-πυρηνική δομή του δικτύου σε κύτταρα ελέγχου σε μία κατανομή κυτταρικής επιφάνειας με ένα φαινομενικά άκαμπτο περίβλημα πολλαπλών πυρήνων σε κύτταρα αμιλορίδη επεξεργασμένα φθορισμού φαλλοϊδίνη, και επίσης σοβαρή εξάντληση των κυτταροπλασματικών περιεχόμενα, συμπεριλαμβανομένων F-ακτίνη, μετά από έκθεση σε 0,4 mM ή υψηλότερες συγκεντρώσεις αμιλορίδης (Σχήμα 6Β). Αυτές οι παρατηρήσεις των απομειωμένων κινητικότητας των κυττάρων και ανώμαλη κυτταροπλασματική οργάνωση της F-ακτίνης είναι συνεπής με τα ευρήματα σειρά εξόνιο μας αλλαγμένο μάτισμα RNA από τα πολλά βασικά συστατικά που αλληλεπιδρούν πρωτεΐνη της εξωκυττάριας μήτρας, συμπεριλαμβανομένων των οικογενειών κολλαγόνο για δίκτυα κυτταροσκελετού, καθώς και των οικογενειών μυοσίνη και δεσμευτική τους πρωτεΐνες (Πίνακας S1), εκτός από

RON /MSTIR

και των συναφών ρυθμιστικών μορίων.

(Πίνακας Α). Η κυτταρική μετανάστευση προσδιορίστηκε σε συρρέουσες Huh-7 κυτταρικές μονοστιβάδες αποξέστηκαν με μία πλαστική ξύστρα, εκτίθεται σε μέσο ανάπτυξης με ή χωρίς 0,45 mM αμιλορίδη για 48 ώρες, ξεπλένεται 2χ με PBS και μετέπειτα τροφοδοτείται το μέσο ανάπτυξης χωρίς αμιλορίδη. Serial μικροσκοπική φωτογραφίες ίδιες περιοχές (σημειωμένο πράσινη ή κόκκινη στην κάτω πλευρά του πιάτα) που λαμβάνονται σε 48 και 96 ώρες εμφάνιση πλήρη αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης από το ύψος της αμιλορίδης επεξεργασμένου μονοστιβάδας. (Πίνακας Β) τα κύτταρα εκτίθενται στο υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις αμιλορίδης σε μέσο ανάπτυξης για 36 ώρες μονιμοποιήθηκαν με παραφορμαλδεϋδη, permealized και χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ και ΡΙΤΟ-φαλλοϊδίνη για παρατήρηση με συνεστιακή μικροσκόπηση. DAPI-βάφονται πυρήνες είναι ματζέντα-pseudocolored στη συγχωνευμένη ομοεστιακό φωτογραφίες. (Πίνακας C) Ανασταλτικό αποτέλεσμα της αμιλορίδης επί κυτταροκίνηση παρατηρήθηκε με μιτωτικά κύτταρα Huh-7 τιναχτεί από τον δίσκο, επανα-επιστρώθηκαν σε μέσο ανάπτυξης που περιείχε διαφορετικές συγκεντρώσεις αμιλορίδης. Τα θυγατρικά κύτταρα διαχωριστική είχαν καθοριστεί σε 24, 48 και 72 ώρες, βάφονται και φωτογραφήθηκαν με μικροσκόπιο. (Panel Α) Μέτρηση αποστάσεων μεταξύ των δύο πυρήνων της διαίρεσης ή να διαιρεθεί θυγατρικά κύτταρα δείχνει ότι η αμιλορίδη αναστέλλει μετα-μιτωτικά κυτταροκίνηση και ο διαχωρισμός των θυγατρικών κυττάρων. Η διάμετρος του πυρήνα του κυττάρου ορίζεται ως 10. Η μέση και την τυπική απόκλιση για κάθε σημείο δείγματος είναι 15 έως 20 ζεύγη κόρη κύτταρο.

Η

διατάραξη της προόδου του κυτταρικού κύκλου και μιτωτικό κυτταροκίνηση με αμιλορίδη

εξόνιο μας ανάλυση της σειράς των κυττάρων αμιλορίδης επεξεργασμένα Huh-7 (πίνακες S1 & amp? S2) ανιχνεύθηκαν αλλοιώσεις του RNA splicing κυρίως των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην κυτταροκίνηση, που συνδέονται με την διαλυμένη ουσία των μεταφορών, και τις λειτουργίες της ακτίνης, μικροσωληνίσκους, και cytokinesis- σχετίζονται κινάσες [33]. Επιπλέον, το τροποποιημένο RNA μάτισμα του

CENPE

(πρωτεΐνη κεντρομερίδιο Ε 312kDa),

CEP250

(centrosomal πρωτεΐνη 250kDa) και

CEP192

(centrosomal πρωτεΐνη 192kDa) θα πρέπει να αναμένεται να οδηγήσει σε αναποτελεσματική διαχωρισμό χρωματίδων κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Πράγματι, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων Huh-7 ανεστάλη με 0.3 mM αμιλορίδη ή υψηλότερη στο μέσο ανάπτυξης (Σχήμα 7Α). Περαιτέρω, υπήρχε μια συσσώρευση των G2 /M κυττάρων τετραπλοειδών αρχίζοντας στις 24 ώρες, και έγινε έντονη σε 48 ώρες (Σχήμα 7Β). Με το φως μικροσκοπική εξέταση, υπήρχαν πολλά κύτταρα ανάφαση bi-πυρηνοποιημένα και προχωρημένου σταδίου που ήταν πιθανώς η G2 /M τετραπλοειδούς πληθυσμό κυττάρων παρατηρήθηκε από φθορισμοκυτταρομετρία. Κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικού διαχωρισμού κόρη στην παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων της αμιλορίδης, μιτωτικά κύτταρα εκτίθενται σε αμιλορίδη σε 0,3 mm ή υψηλότερο εξελιχθεί σε bi-εμπύρηνο μορφές στις 24 ώρες, αλλά στη συνέχεια απέτυχε να δημιουργήσει διαχωρίζεται θυγατρικά κύτταρα (Σχήμα 6C και 6D) . Αυτές οι τρεις παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι μεταβάλλοντας την RNA AS των γονιδίων, η αμιλορίδη προκαλεί διαταραχή της κυτταροκίνηση με αναστολή μιτωτικών κυττάρων από διέρχεται αργά διεργασίες ανάφαση του αποκοπή, διαίρεση, και ο διαχωρισμός των θυγατρικών κυττάρων. Τέλος, επιβεβαίωσε προηγούμενη έκθεση ότι τα κύτταρα Huh-7 εκφράζουν προμινίνη /AC133 /CD133, ένα ανοσολογικό δείκτη των κυττάρων »καρκινικά βλαστικά-όπως» [34], και την περαιτέρω διαπίστωσε ότι αμιλορίδη σε 0,3 mm ή περισσότερο κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση CD133 κύτταρα huh-7 (Σχήμα S2-Α), με αποτέλεσμα την καταστολή του αριθμού και του μεγέθους των σχηματισμών αποικίας κυττάρου (Σχήμα S2-Β).

(Πίνακας Α) κύτταρα huh-7 επιστρώθηκαν σε 6-φρεατίων στα 3 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο επί μία νύκτα αλλάχθηκαν σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει διάφορες συγκεντρώσεις αμιλορίδης? οι αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν μια και τρεις ημέρες αργότερα. Οι αριθμοί κυττάρων στις 24 ώρες παρουσιάζουν αναστολή της ανάπτυξης από την αμιλορίδη σε 0,4 mM και πάνω. Περαιτέρω μειώσεις αριθμός των κυττάρων ήταν εμφανείς στις 72 ώρες, λόγω κυτταρικό θάνατο και απόσπαση σε μέσο που περιέχει αμιλορίδη σε 0,3 mm και άνω. (Πίνακας Β) ανάλυση κυτοφθορομετρικής δείχνει αναστολή αμιλορίδη της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου με τη συσσώρευση του G2 κύτταρα φάσης /M. (Πίνακας C) Η απόπτωση είναι εμφανές από κυτοφθορομετρικής ανίχνευση Αηηβχίην δέσμευσης σε κύτταρα Huh-7 σε επεξεργασία με 0.5 mM της αμιλορίδης. (Πίνακας Δ) Marked αποικοδόμηση πυρηνικό DNA παρατηρήθηκε σε κύτταρα Huh-7 σε επεξεργασία με 0.4 mM αμιλορίδη αλλά όχι με 0,2 mM αμιλορίδη, σημειώνεται ιδιαίτερα στις 48 και 72 ώρες.

Η

Ο κυτταρικός θάνατος με σοβαρή υποβάθμιση του DNA μετά την αμιλορίδη που προκαλείται από αλλαγμένη μάτισμα των λειτουργικών μορίων στην απόπτωση και την επιδιόρθωση του DNA μονοπάτια

στα κύτταρα αμιλορίδη-θεραπεία, οι αλλαγές μάτισμα του

BCL-X

και

HIPK3

RNAs ( Εικόνα 1Α) θα προβλέψει αλλαγμένη κυτταρικούς μηχανισμούς απόπτωσης, και τα ποσοστά που του

ATM

και

FANCM

RNAs (Πίνακας S1) θα αλλάξει την επιδιόρθωση του DNA και την κυτταρική μηχανισμούς προστασίας γονιδιώματος. Huh-7 κύτταρα καλλιέργειας με την παρουσία από 0,3 έως 0,5 mM αμιλορίδη αποδεικνύεται όχι μόνο η έλλειψη κυτταρικής ανάπτυξης, αλλά και την επακόλουθη απώλεια του αρχικώς επιστρώθηκαν κύτταρα Huh-7 (Σχήμα 7Α). Η απόπτωση ήταν εμφανής με αυξημένα ποσοστά Αηηβχίην κύτταρα που συνδέονται μετά από έκθεση σε 0,3-0,5 mM αμιλορίδη για 24 ή 46 ώρες (Σχήμα 7C). Επιπλέον, fluorocytometric ανάλυση του κυτταρικού DNA έδειξε εκτεταμένη κατάτμηση πυρηνικό DNA και την υποβάθμιση σε περισσότερα κύτταρα από εκείνα που αποδεικνύεται να υποβάλλονται σε απόπτωση? μετά από έκθεση σε 0,4 mM αμιλορίδη, μόνο 48,2%, 6,5% και 1,2% των κυττάρων Huh-7 είχαν άθικτο προφίλ κυτταρικού DNA μετά από 24, 48 και 72 ώρες αντίστοιχα (Σχήμα 7D).

Παρόμοιες επιδράσεις διαμόρφωσης της αμιλορίδης για oncognic RNA splicing σε άλλες γραμμές ανθρώπινων στερεών όγκων και των λευχαιμικών κυττάρων

για να προσδιοριστεί η γενικότητα της αμιλορίδης επιδράσεις που παρατηρούνται σε κύτταρα Huh-7, χρησιμοποιήσαμε επιπλέον 10 ιδρύθηκε ανθρώπινου καρκίνου και κυτταρικές σειρές λευχαιμίας, μεταξύ των οποίων 2 ηπάτωμα HepG2 και Hep3B? ραβδομυοσάρκωμα ΤΕ671? 3 πολύμορφο γλοιοβλάστωμα 8401, ASCG13T1xm και ASCG7T (4)? καρκίνο του παχέος εντέρου 2 επεμβατική κυτταρικές σειρές ΗΤ29 και COH? και 3 λευχαιμίες Κ562, κύτταρα HL60 και Molt4, και μια κανονική μυελό οστών γραμμή μεσεγχυματικά στρωματικά KP-hMSC καθώς και μερικές κανονικές καλλιέργειες λεμφοκυττάρων του αίματος, για την εκτέλεση διαφόρων πειραμάτων προαναφερόμενους. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι σε γενικές γραμμές αμιλορίδη έτεινε να επηρεάσει το κακοήθη φαινότυπο που σχετίζεται με AS περισσότερο από το κανονικό AS στο κύτταρο. Πρώτον, ουσιαστικά όπως σε κύτταρα Huh-7 (Σχήμα 1), βρήκαμε αμιλορίδη διαμορφωμένου «ομαλοποίηση» του abornal

BCL-X

και

μοτίβα HIPK3

ματίσματος σε ηπατώματος Hep G2, ραβδομυοσάρκωμα ΤΕ671, γλοιοβλάστωμα 8401, λευχαιμίες Κ562, HL60 και Molt4 (π.χ. συμπληρωματικά στοιχεία [35]). Πιο σημαντικά, αμιλορίδη θα μπορούσε να ρυθμίζουν τη μεταγραφή /μάτισμα του

BCR-ABL

γονίδιο σύντηξης και την εκ νέου ευαισθητοποιήσει την χημειοθεραπεία

Bcr-Abl

T3151 μεταλλαγμένα κύτταρα σε imatinib [35]. Αντιθέτως, με τη χρήση αμιλορίδης έως 2 mm στο μέσο ανάπτυξης, ανιχνεύσαμε καμία μεταβολή στο

BCL-X

και

HIPK3

μοτίβα ματίσματος σε καλλιεργημένα ενεργοποιημένα φυσιολογικά μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (συμπληρωματική δεδομένα του [35]), ούτε σε αθανατοποιημένα στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών KP-hMSC. Σταθερά, αμιλορίδη στην περιοχή από 0,02 mM-0,5 mM ήταν κυτταροτοξική σε καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα σε καλλιέργεια (Σχήμα S3 Α & amp? Β). Χρησιμοποιώντας ένα 72-ωρών

in vitro

δοκιμασία καλλιέργειας, βρήκαμε ότι η ανασταλτική δόσεις αμιλορίδης αύξηση κατά 50% ήταν περίπου 0,02 mM για ΤΕ671, 0.10 mM για Κ562, 0.20 mM για Huh-7, 0.3 mM για δύο άλλες HCC Hep-G2 και Hep-3Β, και 0.2-0.4 mm για τις τρεις γραμμές πολύμορφο γλοιοβλάστωμα, αλλά & gt? (. Σχήμα S3-Β) 3 χιλιοστών ή μη ανιχνεύσιμα για τις φυσιολογικές κυτταρικές σειρές. Περαιτέρω, εκτελέσαμε συνολική ανάλυση συστοιχίας εξώνιο επί μυελοειδών βλαστών λευχαιμία Κ562 και γλοιοβλαστώματος 8401, με και χωρίς θεραπεία αμιλορίδη, για σύγκριση με Huh-7 (Πίνακες S1, S2 και S3). Cross-ταίριασμα των 200 top-άνοιξε αμιλορίδη-διαμορφωμένο γονίδια του καθενός από τα τρία κυτταρικών σειρών αποκάλυψε μια μάλλον κοινό χαρακτηριστικό αμιλορίδης διαμορφωμένου ματίσματος, δηλαδή 187 γονίδια ή 93,5% αυτών των 200 ήταν τα ίδια για τις τρεις κύτταρα? 188 (187 συν

DNAH8

) για Huh-7 και 8401? 189 (187 συν

LRP2 /RYR2

) για Huh-7 και Κ562? και 190 (187 συν

ABL1, ColSA2, NAALAD2

) για 8401 και Α549 (Εικόνα S4-Α). Η ανάλυση GO των 187 κοινά γονίδια σύμφωνα με τις βιολογικές διαδικασίες (Σχήμα S4-Β), μοριακό λειτουργίες (Σχήμα S4-C) και συστατικά των κυττάρων (Σχήμα S4-D) κατηγορίες έδειξε ποσοστιαία κατανομή παρόμοια με τα αμιλορίδη διαμορφωμένα 495 γονίδια huh-7 κύτταρα (Σχήμα 5), υπονοώντας ότι, Κ562 και 8401 κύτταρα και σε κύτταρα huh-7, η αμιλορίδη διαμορφωμένο ως αιτίες παρόμοια αποτελέσματα στην κυτταροσκελετική δομή, την κυτοκίνηση και την επιδιόρθωση του DNA, καθώς και σχετικά με το μηχανισμό της απόπτωσης και το σύστημα διαλυμένης ουσίας μεταφορών.

Συζήτηση

η μελέτη αυτή βασίζεται στην αρχική μας διαπίστωση ότι αμιλορίδη άλλαξε το εναλλακτικό μάτισμα RNA

BCL-X, HIPK3

και

RON /MISTR1

μεταγραφές από ογκογόνο πρότυπα προς τα φυσιολογικά μοτίβα σε ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα κυττάρων Huh-7. Σε πειράματα παρακολούθησης, παρατηρήσαμε υπο-φωσφορυλίωση του SR παράγοντες ματίσματος, ειδικά SF2 /ASF, καθώς και σε ανάντη πρωτεϊνικές κινάσες και φωσφατάσες, υποδηλώνοντας ότι η αμιλορίδη μπορεί να επηρεάσει την λειτουργική κατάσταση των συμπλοκών συμπερίληψης /αποκλεισμού εξωνίου. Σφαιρική ανάλυση εξόνιο μάλιστα αποκάλυψε μεταβολές Όπως και σε πολλές γονίδιο μεταγραφές των κινητών δικτύων. Κατά συνέπεια, η αμιλορίδη επεξεργασμένο Huh-7 κύτταρα έδειξαν μειωμένη μετανάστευση /εισβολή κυτοκινητικής δυνατοτήτων, καθυστερημένος εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου με μιτωτική ελαττώματα, αυξημένη αποπτωτική πινακίδες, σοβαρές ζημιές κυτταρικό DNA και τελικό κυτταρικό θάνατο. Διερεύνηση συνέχεια, έχουμε λάβει τώρα αποτελέσματα ότι αμιλορίδη θεραπεία μπορούν να παράγουν παρόμοια AS διαφοροποίησης και νευρώσεως επιδράσεις σε διάφορες άλλες ανθρώπινες κακοήθεις στερεών καρκίνων και των λευχαιμικών κυτταρικών σειρών εκτός από ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα Huh-7, αλλά προφανώς όχι σε μερικά καλλιεργημένα φυσιολογικά κύτταρα που εξετάσαμε (Σχήματα S3 και S4).

Μια ξεχωριστή ιδιότητα της αμιλορίδης στη ρύθμιση AS μεσολάβηση κακοήθεις φαινότυποι

αμιλορίδη, 3,5-διαμινο-6-χλωρο-Ν- (διαμινομεθυλενο) πυραζινοκαρβοξαμιδίου μονοϋδροχλωρική , αναπτύχθηκε στη δεκαετία του 1960 [36] και έχει ένα φάρμακο που χρησιμοποιείται κλινικώς για τη θεραπεία της υπέρτασης και οιδήματος που βασίζεται στη μεταφορά νατρίου και τα αποτελέσματά ρευστό ομοιόσταση [37]. Ως εκ τούτου, αρχικά πίστευαν ότι τα αποτελέσματά της επί ογκογόνο μάτισμα RNA θα διαμεσολαβείται από μεταβολές στο ενδοκυτταρικό ρΗ και την κίνηση ιόντων. Ωστόσο, δεν υπάρχει παρόμοια AS αλλαγές ανιχνεύθηκαν σε κύτταρα Huh-7 αντιμετωπίζονται με τέσσερις πιο ισχυρό pHi που επηρεάζουν ανάλογα αμιλορίδης, συμπεριλαμβανομένων EIPA, το οποίο προηγουμένως έδειξε να διαμορφώνει το παθογόνο

SMN2

μεταγραφή στα κύτταρα των ασθενών με νωτιαία μυϊκή ατροφία . Έτσι, η ικανότητα να μεταβάλει AS ογκογόνων RNAs φαίνεται να είναι μια ξεχωριστή ιδιότητα της αμιλορίδης.

Όπως AS ελέγχεται από εξαιρετικά συντηρημένη SR οικογένεια πρωτεϊνών [1], [3], [5] και παίζει ένα σημαντικό