Αφηρημένο

Ιστορικό

Αξιόπιστες-όπως ομοπεδίου 2 (PITX2) είναι ένας παράγοντας μεταγραφής bicoid ομοπεδίου που διαδραματίζει ουσιαστικό ρόλο στη διατήρηση της εμβρυϊκής αριστερά-δεξιά ασυμμετρία κατά τη διάρκεια των σπονδυλωτών εμβρυογένεσης. Ωστόσο, οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι η παρεκκλίνουσα ρύθμιση προς τα άνω των PITX2 μπορεί να σχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου, αλλά το λειτουργικό ρόλο που παίζει PITX2 στην ογκογένεση παραμένει άγνωστη.

Κύρια Ευρήματα

Χρήση πραγματικού χρόνου ποσοτική RT -PCR (Q-PCR), στύπωμα Western και η ανοσοϊστοχημική (IHC) αναλύσεις, αποδείξαμε ότι PITX2 ήταν συχνά υπερεκφράζεται σε δείγματα καρκίνου των ωοθηκών και κυτταρικές σειρές. Κλινικοπαθολογοανατομικές συσχέτιση έδειξε ότι η απορυθμίζεται PITX2 συσχετίστηκε σημαντικά με υψηλής ποιότητας (

P

= 0,023) και σαφή κυττάρου υποτύπου (

P

= 0,011) με τη χρήση Q-PCR και υψηλής ποιότητας (

P

& lt? 0.001) καρκίνου των ωοθηκών με ανάλυση IHC. Λειτουργικά, εκτελούνται έκφραση PITX2 θα μπορούσε να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, ανεξάρτητη από προσκόλληση ικανότητα ανάπτυξης, μετανάστευση /την εισβολή και την ανάπτυξη του όγκου σε ποντικούς μοντέλο ξενομοσχεύματος. Επιπλέον, επιβάλλεται η έκφραση του PITX2 αυξημένα των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου, όπως κυκλίνη-D1 και C-myc. Αντίθετα, RNAi μεσολάβηση νοκ ντάουν της PITX2 σε PITX2-υψηλής καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν ωοθηκών είχε το αντίθετο αποτέλεσμα.

Συμπέρασμα

Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η αυξημένη PITX2 έκφραση εμπλέκεται στην εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών, μέσω της προώθησης των κυττάρων την ανάπτυξη και την κυτταρική μετανάστευση /εισβολή. Έτσι, με στόχο PITX2 μπορεί να χρησιμεύσει ως μια πιθανή θεραπευτική τροπικότητα στη διαχείριση της υψηλής ποιότητας των όγκων των ωοθηκών

Παράθεση:. Fung FKC, Chan DW, Liu VWS, Leung THY, Cheung ΟΠΟΙΑΔΗΠΟΤΕ, Ngan HYS (2012) Αυξημένη έκφραση των PITX2 Μεταγραφή Factor Συμβάλλει στην Καρκίνος των ωοθηκών εξέλιξη. PLoS ONE 7 (5): e37076. doi: 10.1371 /journal.pone.0037076

Επιμέλεια: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 29 Ιαν, 2012? Αποδεκτές: 13 Απριλίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: May 15, 2012 |

Copyright: © 2012 Fung et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Φιλανθρωπικό Ίδρυμα Wong Ελέγξτε Εκείνη. Η υποστήριξη αυτή είναι από ιδιωτικές δωρεές, και την ιστοσελίδα κανενός χρηματοδότη είναι διαθέσιμο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι ένα από τα πιο κοινή μορφή καρκίνου μεταξύ του γυναικείου πληθυσμού σε όλο τον κόσμο [1] .Η υψηλό ποσοστό θνησιμότητας του καρκίνου των ωοθηκών οφείλεται στην καθυστερημένη διάγνωση και η κακή θεραπευτική ανταπόκριση, επειδή η νόσος είναι συχνά εκδηλώνεται με μικρή ή μη ειδικά συμπτώματα στο πρώιμο στάδιο [2], [3], [4]. Ο καρκίνος των ωοθηκών μπορούν να ταξινομηθούν σε τέσσερις υποτύπους? ορώδης, ενδομητριοειδές, βλεννώδες και σαφής κύτταρο, με βάση την ιστολογική διαφοροποίηση των ωοθηκών επιθηλίου και των υποκείμενων γενετικών αλλοιώσεων [3], [5], [6]. Η κατάταξη των όγκων των ωοθηκών κατηγοριοποιείται σύμφωνα με τα Διεθνή Ομοσπονδία Γυναικολογίας και το σύστημα Μαιευτικής (FIGO), αποκαλύπτοντας ότι εμφανίζουν υψηλής ποιότητας όγκου το χαρακτηριστικό της ταχύτερης ανάπτυξης των κυττάρων και κακή πρόγνωση, καθώς και χημειοαντίσταση σε σύγκριση με χαμηλής ποιότητας όγκου [7], [8].

Αξιόπιστες-όπως ομοπεδίου 2 (PITX2) μεταγραφικός παράγοντας είναι το μέλος της οικογένειας bicoid ομοπεδίου και παίζει σημαντικό ρόλο στην εμβρυογένεση σπονδυλωτών [9]. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι η μετάλλαξη του PITX2 σχετίζεται με την παθογένεση του συνδρόμου Axenfeld-Rieger (ARS), η οποία είναι ένα αυτοσωματικό κυρίαρχο ανθρώπινη ασθένεια που χαρακτηρίζεται από αναπτυξιακές ανωμαλίες του οφθαλμού, των δοντιών και την καρδιά [6]. Πρόσφατες εκθέσεις έχουν τεκμηριώσει ότι PITX2 υπερεκφράζεται σε μη λειτουργική αδενώματα της υπόφυσης [10], με θετικούς λεμφαδένες καρκίνο του παχέος εντέρου [11] και ο καρκίνος του θυρεοειδούς [12]. Επιπλέον, η αναστολή της έκφρασης PITX2 με shRNA σε καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς μείωσε σημαντικά την ικανότητα της κυτταρικής ανάπτυξης σε μαλακό άγαρ δοκιμασίας, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να έχουν PITX2 ογκογόνο δυναμικό και μπορεί να εμπλέκεται στην πρόοδο του όγκου [12].

η παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι PITX2 ήταν συχνά ρυθμίζεται αυξητικά και ήταν σημαντικά σχετίζονται με τον καρκίνο των ωοθηκών υψηλής ποιότητας. Χρησιμοποιώντας μοντέλα καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, αποκαλύψαμε ότι η προς τα πάνω ρυθμισμένη PITX2 μπορούσε να ανυψώσει ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, όπως CyclinD1 και C-myc, και προάγουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή, καθώς και την ανάπτυξη του όγκου σε ποντικούς μοντέλο ξενομοσχεύματος. Τα ευρήματά μας παρέχουν περαιτέρω γνώση για το ογκογόνο ρόλο της PITX2 στη διαμεσολάβηση ογκογένεση του καρκίνου των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα και κυτταρικές σειρές

Η χειρουργική εκτομή των 97 δείγματα όγκων από πρωταρχικός ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών και φυσιολογικές ωοθήκες δείγματα από καλοήθεις ασθένεια επελέγησαν τυχαία για ανάλυση Q-PCR. Η ιστολογική υποτύπου και το στάδιο των όγκων κατηγοριοποιήθηκαν σύμφωνα με τη Διεθνή Ομοσπονδία Γυναικολογίας και Μαιευτικής (FIGO) ταξινόμηση. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τους παραπάνω συμμετέχοντες και η χρήση αυτών των κλινικών δειγμάτων εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ /Νοσοκομείο Αρχής του Χονγκ Κονγκ West Cluster (HKU /ΗΑ HKW IRB) (αριθμός Institutional Review Board: UW05- 143 T1806). Δύο απαθανάτισε ανθρώπινα κύτταρα επιθηλιακά επιφάνεια των ωοθηκών χρησιμοποιήθηκαν: ΣΩΛΗΝΑ 10-2 και 17-1 ΣΩΛΗΝΑ (ευγενική προσφορά του καθηγητή Γιώργου Τσάο, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ) [13]. Ένα αθανατοποιημένο ανθρώπινο σαλπίγγων επιθηλιακή κυτταρική γραμμή, OE-Ε6 /Ε7, ελήφθη από τον Dr. Lee Calvin (του Πανεπιστημίου του Χονγκ Κονγκ) [14]. Εννέα κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών χρησιμοποιήθηκαν: OV2008, C13 *, τα A2780S, A2780cp (ευγενική προσφορά από τον καθηγητή Benjamin Tsang, Το Πανεπιστήμιο της Οτάβα) [13], [15], OV420, OV429, OV433, OVCAR3, SKOV-3, TOV21G , ινοβλαστών ποντικού κύτταρα Wnt3A L και τα κύτταρα ανθρώπινου εμβρυϊκού νεφρού 293 (ΗΕΚ 293) (America Type Culture Collection, Rockville, MD, USA). Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε είτε ελάχιστο βασικό μέσο ή τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco με 10% ορό εμβρύου μόσχου και 1% πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη σε 75 cm

2 φιάλες και επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2.

πλασμίδια και κυττάρων επιμόλυνσης

ρΟΙ-

HA-PITX2A

εκφράζει πλασμίδιο (δώρο από τον Dr. Kathy Kozlowski, University of Michigan) χρησιμοποιήθηκε για την έκτοπη έκφραση της ΗΑ-ετικέτα PITX2A. Το πλασμίδιο περιέχει πλήρους μήκους ανθρώπινο

PITX2A

cDNA και η έκφραση αυτού οδηγήθηκε από τον προαγωγό CMV. Ο φορέας ρΟΙ χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Ο φορέας HuSHpGFP-V-RS πλασμίδιο και η παρεμβολή RNA μικρή φουρκέτα (shRNA) στόχευσης

PITX2

σε φορέα pGFP-V-RS (pGFP-V-RS-

PITX2

) αγοράστηκαν από ΟηΟεηε τεχνολογίες (ΟηΟεηε Technologies, Inc, Rockville, MD, USA). Η ακολουθία shRNA στόχευσης

PITX2

ήταν 5 ‘GCC GTT GAA TGT CTC TTC TCC ΑΑΑ GAC TC 3’.Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση των κυττάρων σύμφωνα με τον κατασκευαστή του οδηγίες. Σταθερό κύτταρα που υπερεκφράζουν PITX2A ή knockdown του PITX2 συλλέχθηκαν μετά από 14 ημέρες πουρομυκίνης (1 μg /ml) επιλογή και επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western.

εκχύλιση RNA και αντίστροφη μεταγραφάση-ΡΟΚ

Ολικό RNA από τα κλινικά δείγματα και τα καλλιεργημένα κύτταρα απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen). Το cDNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας αντίστροφη μεταγραφή κιτ αντιδραστηρίου (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Η ποσοτική ανάστροφης μεταγραφάσης-PCR (Q-PCR) που χρησιμοποιούνται για την αξιολόγηση των εκφράσεων του

PITX2

,

κυκλίνη D1

και

C-myc

διεξήχθη από TaqMan® Gene Αναλύσεις της έκφρασης? ανθρώπινα

PITX2

(Δοκιμασία ID: Hs00165626_m1), ανθρώπινη

κυκλίνη D1

(Δοκιμασία ID: Hs00765553_m1) και τα ανθρώπινα

C-myc

(Δοκιμασία ID: Hs00153408_m1), σε ένα ABI PRISM σύστημα ™ 7500 (Applied Biosystems). Το ανθρώπινο

18S rRNA

(Δοκιμασία ID: Hs99999901_m1) χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Cell Signaling Technology) που περιέχει. αναστολέα πρωτεάσης (Sigma) και φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF) (Sigma Chemical Co., St Louis, ΜΟ, USA). Τα δείγματα πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και ηλεκτροστυπώθηκαν σε μεμβράνες Hybond-P (Amersham Pharmacia Biotech, Cleveland, ΟΗ, USA). Τα στυπώματα φράχθηκαν με 5% αποβουτυρωμένο γάλα, που ακολουθείται από επώαση με PITX2 (C16) και c-myc (N262) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), κυκλίνη D1 και β-κατενίνης (Cell Signaling ), Anti-ΗΑ και β-ακτίνης (Sigma) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα στυπώματα στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-ποντικού, αντι-κουνελιού (Amersham Pharmacia Biotechnology) και αντι-κατσίκα (Santa Cruz) δευτερεύοντα αντισώματα συζευχθεί με υπεροξειδάση κρένου επί 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και οπτικοποιούνται χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ECL ™ Western Blotting Detection (Amersham).

Για την ανοσοϊστοχημική ανάλυση, δύο εμπορικές σειρές καρκίνου του ιστού των ωοθηκών (OVC1021 και OVC481, Pantomics Inc, San Francisco, CA) ανοσοχρώση με πολυκλωνικό πρωτεύον αντι-PITX2 αντίσωμα (AbcamInc, Cambridge, MA, USA) σε 1 :200 αραίωση. Το χρωματισμένο τμήμα ταυτοποιήθηκε ως θετικές ή αρνητικές. Για τις ανοσο-θετικά δείγματα, η ένταση της χρώσης (1, λιποθυμία, 2 μέτρια, 3 και 4 ισχυρές πολύ ισχυρή) και το ποσοστό των λεκιασμένη περιοχή (0-100%) βαθμολογήθηκαν. Η ανοσοαντιδραστικότητα του κάθε δείγματος προσδιορίζεται πολλαπλασιάζοντας την ένταση και το ποσοστό των λεκιασμένη περιοχή. Η μέση τιμή του ανοσοαντιδραστικότητας των φυσιολογικών και οριακές περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει όλες τις περιπτώσεις. Όλα τμήμα του ιστού εξετάστηκε και βαθμολογήθηκε ανεξάρτητα από δύο ερευνητές.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με κιτ κυτταρικού πολλαπλασιασμού (ΧΤΤ) (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) σύμφωνα με με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε δείγμα έγινε εις τριπλούν και τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν.

Soft-άγαρ

δοκιμασία

Ένα σύνολο 1 × 10

4 κύτταρα παρασκευάστηκαν σε 1,5 ml πλήρους μέσου που περιέχει 0.6% αγαρόζης. Τα μίγματα προστέθηκαν επάνω στο στερεοποιημένο στρώμα πυθμένα που περιέχει 1% άγαρ σε 2 ml πλήρους μέσου. Βιώσιμες αποικίες μετρήθηκαν και φωτογραφήθηκαν μετά 14-36 ημέρες. Το πείραμα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και διεξάγεται τρεις φορές ανεξάρτητα.

Επούλωσης Τραύματος δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα έξι μέχρι να φτάσει σε πλήρη συρροή σε μια μονοστοιβάδα. Στη συνέχεια, μέσο σε κάθε φρεάτιο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιείχε Μιτομυκίνη Ο (10 μg /ml) (Sigma) και επωάστηκαν για 3 ώρες στους 37 ° C.A ενιαίο τραύμα δημιουργήθηκε στα μέσα της κάθε πηγάδι χρησιμοποιώντας μια άκρη μικρο-πιπέτας. Η πλάκα επωάστηκε στους 37 ° C σε 5% CO

2. Η εικόνα του κλεισίματος του τραύματος ελήφθη σε διαφορετικές χρονικές πορείες. Ο ρυθμός σχετική μετανάστευση εκφράστηκε ως το σχετικό πλάτος των πληγών /ώρα. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν.

μετανάστευση των κυττάρων Transwell και δοκιμασία εισβολής

Ποσοτικοποίηση της κυτταρικής μετανάστευσης και εισβολής διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία μετανάστευσης QCM ™ 24 φρεατίων Χρωματομετρική Κυττάρων (Millipore Corporation, Billerica, ΜΑ, USA) και κυτταρική διείσδυση Assay Kit (Chemicon International, Temecula, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τρία διαφορετικά πεδία των χρωματισμένων κυττάρων φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκαν για κάθε φρεάτια. Τα πειράματα εκτελέστηκαν τρεις φορές ανεξάρτητα.

In vivo

μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου

Για να διερευνηθεί αν PITX2 υπερέκφραση προωθεί την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

, PITX2 σταθερά υπερεκφράζεται SKOV-3 κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς. Διάμετρος του όγκου μετρήθηκαν κάθε τρεις ημέρες και τα ποντίκια scarified ένα μήνα μετά την ένεση. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε σαν (μέσος όρος των διαμέτρων)

3 χ π /6. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο της επιτροπής του Χονγκ Κονγκ για τη χρήση ζώντων ζώων στη διδασκαλία και την έρευνα (CULATR Νο 2053-09).

Η ανάλυση των δεδομένων

Τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση ± SD. Μαθητή

t-test

χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων παραμετρικές. Ένα

P

-τιμή του & lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική σε όλα τα πειράματα

Αποτελέσματα

UpregulatedPITX2 παρατηρείται σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

Παρά τις λειτουργίες του PITX2 κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης έχουν μελετηθεί εκτενώς, οι λειτουργικές ρόλοι των PITX2 σε ανθρώπινους καρκίνους παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Εδώ, θα αξιολογηθεί η κατάσταση έκφρασης του

PITX2

σε δείγματα καρκίνου των ωοθηκών (n = 97), φυσιολογικές ωοθήκες (n = 54), η κανονική κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, συμπεριλαμβανομένων δύο σωλήνες (ΣΩΛΗΝΑ 10-2 και 17-1 ΣΩΛΗΝΑ ) και μία αθανατοποιημένα ανθρώπινα σαλπίγγων επιθηλιακή κυτταρική σειρά (OE-Ε6 /Ε7) με Q-PCR. Βρήκαμε ότι

PITX2

ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω σε δείγματα καρκίνου των ωοθηκών (-15 πτυχώσεις) σε σύγκριση με φυσιολογικές ωοθήκες και κυτταρικές γραμμές ωοθηκών (

P

& lt? 0.001) (Σχήμα 1Α). Κλινικοπαθολογοανατομικές συσχέτιση έδειξε ότι η υπερεκφράζεται

PITX2

ήταν εντυπωσιακά σχετίζεται με υψηλού βαθμού (βαθμός 3) (

P

= 0,023) και του καρκίνου των ωοθηκών σαφές κύτταρο υποτύπου (

P

= 0.011) (Πίνακας 1). Ωστόσο, δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της υπερεκφράζεται

PITX2

και άλλες παραμέτρους, όπως η ηλικία, το στάδιο και υποτροπής (Πίνακας 1). Εκτός αυτού, ανάλυση κηλίδος Western διεξήχθη επίσης να συγκριθεί η έκφραση του PITX2 σε ένα πάνελ ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών ωοθηκών και φυσιολογικά κύτταρα επιφάνεια επιθήλιο των ωοθηκών (μάνικες). Σε σύγκριση με σωλήνες κυτταρικές γραμμές, μια ευρέως διαδεδομένη αύξηση στην έκφραση PITX2 παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών (Εικόνα 1Β). Επιπλέον, τα δεδομένα μας κηλίδα Western έδειξε επίσης ότι PITX2 προφανώς ρυθμίζεται αυξητικά σε ένα σαφές κύτταρο υποτύπου κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών (TOV21G) σε σύγκριση με την OE-Ε6 /Ε7 (Σχήμα S1A), την αθανατοποιημένη κανονική σάλπιγγα επιθηλιακή κυτταρική γραμμή. Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώνει περαιτέρω τα παραπάνω κλινικοπαθολογοανατομικές ευρήματα. Για να αξιολογηθεί περαιτέρω το επίπεδο πρωτεΐνης PITX2 σε δείγματα καρκίνου των ωοθηκών, ανοσοϊστοχημική χρώση PITX2 διεξήχθη σε μία συστοιχία με καρκίνο των ωοθηκών ιστού (OVC481), το οποίο περιλαμβάνει 16 περιπτώσεις των δειγμάτων καρκίνου των ωοθηκών σε συνδυασμό με φυσιολογικές ωοθήκες. Σύμφωνα με τις Q-PCR ευρήματα, αυξημένη έκφραση του PITX2 συνήθως παρατηρείται σε δείγματα καρκίνου των ωοθηκών ιδιαίτερα σε υψηλής ποιότητας ή μη διαφοροποιημένα καρκινώματα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα μη εμπλεκόμενο φυσιολογικούς ιστούς τους ωοθηκών (Εικόνα S1B). Επιπλέον, εξετάσαμε την έκφραση του PITX2 σε ένα μεγαλύτερο σύνολο δειγμάτων καρκίνου των ωοθηκών χρησιμοποιώντας κάποια άλλη εμπορική συστοιχίας ωοθηκών ιστού (OVC1021), η οποία περιλαμβάνει 2 κανονικό, 2 καλοήθη, 1 οριακά cystademoma και 97 δείγματα κακοήθους όγκου. εύρημα μας έδειξε ότι η απορυθμίζεται PITX2 συσχετίστηκε σημαντικά με υψηλής ποιότητας όγκου των ωοθηκών μόνο (

P

& lt? 0.001). και ήταν σύμφωνο με το αποτέλεσμα της ανάλυσης Q-PCR (Πίνακας 2)

(Α) Ποσοτική ανάλυση RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε φυσιολογικές ωοθήκες (n = 54) και τα δείγματα καρκίνου των ωοθηκών (n = 97) χρησιμοποιώντας τα

PITX2

ειδικό αρχικό τεμάχιο. 18S και δεσμευτική πρωτεΐνη (ΤΒΡ) ΤΑΤΑ-κουτί χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι φόρτωσης. *

P

& lt? 0.001. (Β) ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-PITX2 για την αξιολόγηση του επιπέδου έκφρασης PITX2 (ισομορφών Α, Β και C)) (35 kDa) σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών (n = 9) και τον εύκαμπτο σωλήνα κυτταρικές γραμμές (n = 2) . β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης PITX2 (πυρηνική χρώση) σε οριακά κυσταδένωμα προδιαγραφών και υψηλής ποιότητας (3) ορώδες κυσταδενοκαρκινώματος σε μια σειρά καρκίνου των ωοθηκών ιστού (OVC1021). Μεγέθυνση:. 20 ×

Η

Η

PITX2 αυξάνει την κυτταρική ανάπτυξη των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

Δεδομένου ότι η απορυθμίζεται PITX2 συνδέθηκε με καρκίνο των ωοθηκών υψηλής ποιότητας, PITX2 μπορεί κατέχουν ογκογόνο λειτουργίες στη μεσολάβηση επιθετικό φαινότυπο στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Για να δοκιμαστεί αυτή η ιδέα, δημιουργήσαμε πρώτα PITX2 σταθερή έκφραση κλώνους από δύο καρκίνου των ωοθηκών κυτταρικές σειρές υψηλής ποιότητας (SKOV3 και OVCA433) (Σχήμα 2Α). Από την άλλη πλευρά, ένα άλλο υψηλής ποιότητας κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών με PITX2-υψηλή έκφραση (Ον2008), καθώς και OVCA433 επιλέχθηκαν για σταθερή knockdown του PITX2 χρησιμοποιώντας φορέα με βάση προσέγγιση RNAi. Τέσσερις shRNA κατασκευές στόχευσης σε διαφορετικές θέσεις του PITX2 ανοιχτού πλαισίου ανάγνωσης επιμολύνθηκαν παροδικά στα κύτταρα, αντίστοιχα, και δύο από αυτούς (Κ1 και Κ2) απέδωσε μείωση 50-70% της ενδογενούς PITX2 επιλέχθηκε για σταθερή επιμόλυνση (Σχήμα 2Β). Με δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρου ΧΤΤ, το σχετικό ρυθμό ανάπτυξης της PITX2 εκφράζουν σταθερά κλώνους σε SKOV3 και OVCA433 κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη (1,5 έως 3 φορές) από τους ελέγχους φορέα τους (Σχήμα 2C). Στην αντίστροφη, εξάντληση των PITX2 στην Ον2008 και OVCA433 κύτταρα απομειωθεί σημαντικά το ποσοστό τους πολλαπλασιασμό των κυττάρων από 2 έως 3 φορές σε σύγκριση με τα ανακατωμένα ελέγχους τους (Σχήμα 2D).

ιδρύθηκαν (Α) PITX2A σταθερή έκφραση κλώνων στα κύτταρα SKOV3 και OVCA433. ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-ΗΑ αντίσωμα έδειξε τα επίπεδα έκφρασης του ΗΑ-tagged PITX2A σε C4 και C5 κλώνους του SKOV-3, και C33 και C34 κλώνοι OVCA 433. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-PITX2 αντίσωμα έδειξε τις μειωμένες εκφράσεις των ενδογενών PITX2 σε σταθερούς κλώνους knockdown που παράγεται από 2 shRNA κατασκευάσματα (Κ1 και Κ2). Κωδικοποιημένα είναι η μη-ειδικό έλεγχο shRNA. Οι αριθμητικές μονάδες παριστάνουν τα σχετικά εκφράσεις μείωση PITX2 σε κάθε σταθερός κλώνος σε σύγκριση με τα κωδικοποιημένα στοιχεία ελέγχου. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Γ) Η έκτοπη έκφραση του PITX2A πολλαπλασιασμού κυττάρων που διεγείρεται σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Τόσο C4 και C5 του SKOV-3 κύτταρα απέδειξαν 1,5- πλάσια αύξηση της κυτταρικής ανάπτυξης (*

P

& lt? 0,05), C33 και C34 του OVCA 433 κυττάρων είχαν 3- φορές αύξηση της κυτταρικής ανάπτυξης (**

P

& lt? 0,01) σε σχέση με τον έλεγχο των φορέων τους. (D) Εξάντληση των ενδογενών PITX2 μειωμένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Μια 3- έως 4- φορές μείωσης στην βιωσιμότητα των κυττάρων σε τόσο knockdown κλώνους (Κ1 και Κ2) των κυττάρων Ον2008 (**

P

& lt? 0,01) και 2- σε 3- φορές μείωση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε νοκ ντάουν κλώνους (Κ1 και Κ2) των OVCA 433 κύτταρα (*

P

& lt? 0,05). παρατηρήθηκαν

η

Επιπλέον, επιβάλλεται η έκφραση της PITX2 αυξήθηκαν όχι μόνο το μέγεθος αλλά και το αριθμός των αποικιών σε κύτταρα OVCA433 και SKOV3 κατά 2 φορές (

P

& lt? 0,05) και 8-φορές (Ρ & lt? 0,01) αντιστοίχως (Σχήμα 3Α). Σε αντίθεση, η εξάντληση του PITX2 μειωμένου μεγέθους και του αριθμού των αποικιών σε Ον2008 και OVCA433 κύτταρα με 2,6-πλάσια έως 5-φορές (

P

& lt? 0,01) αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα ανακατωμένα ελέγχου τους (Σχήμα 3Β). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ρύθμιση προς τα πάνω του PITX2 θα μπορούσε να προωθήσει την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του κυττάρων των ωοθηκών και να υποστηρίξει τις ογκογόνες ρόλους των PITX2 σε υψηλής ποιότητας όγκου ωοθηκών.

(α) Η αναγκαστική έκφραση του PITX2A ενισχυμένη αγκύρωση ανεξάρτητη ικανότητα ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Το ιστόγραμμα δείχνει ότι PITX2A που εκφράζει σταθερά κλώνους (C33 και C34) της OVCA 433 (**

P

= 0.05) και (C4 και C5) της SKOV-3 (*

P

= 0.01) είχαν αυξημένο αριθμό των αποικιών σε μαλακό άγαρ σύγκριση με τους μάρτυρες φορέα τους. Εκπρόσωπος εικόνες δείχνουν μεγαλύτερο μέγεθος αποικία στην PITX2A σταθερή έκφραση κλώνων κάτω από μικροσκόπιο. (Β) Εξάντληση PITX2 με shRNA ανέστειλε αγκύρωση ανεξάρτητη ικανότητα ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Ο αριθμός των αποικιών σε κλώνους PITX2stable knockdown (Κ1 και Κ2) των OVCA 433 και Ον2008 έδειξαν σημαντικά μείωση σε σύγκριση με τα κωδικοποιημένα ελέγχους (*

P

& lt? 0,01). Εκπρόσωπος εικόνες δείχνει ότι το μειωμένο μέγεθος αποικίας των κλώνων PITX2stableknockdown και κωδικοποιημένα τους ελέγχους τους. Το παραπάνω πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές ανεξάρτητα και τα δεδομένα υπολογίστηκε με μέση τιμή ± SD.

Η

PITX2 ενισχύει κυτταρική μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η PITX2 θα μπορούσε να προκαλέσει νευρωνική μετανάστευση των κυττάρων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του υποθαλάμου ποντικού [16], υποδεικνύοντας ότι PITX2 κατέχει κυττάρων μεταναστευτικών προώθηση της ικανότητας. Εδώ, θα επιχειρήσει να διερευνήσει κατά πόσον PITX2 προσδίδει ένα ρόλο στην προώθηση της μετανάστευσης των κυττάρων και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Διενεργήσαμε την πρώτη πληγή δοκιμασία επούλωσης να εξετάσει κατά πόσον PITX2 θα μπορούσε να προωθήσει τη μετανάστευση των κυττάρων. Κατά την επεξεργασία των Μιτομυκίνη C για να αποκλείσει τον παράγοντα της αυξημένης κυτταρικής ανάπτυξης, παρατηρήσαμε ότι εκτελείται η έκφραση των κυττάρων PITX2in SKOV3 παρουσίασαν ταχύτερη τραύματος ρυθμό κλεισίματος από τον έλεγχο φορέα (Σχήμα 4Α). Αντιστρόφως, knockdown του ενδογενούς PITX2 σε OVCA433 κύτταρα μειώνονται σημαντικά το ρυθμό μετανάστευσης των κυττάρων που παρατηρήθηκαν σε δοκιμασία επούλωσης πληγών (

P

& lt? 0,05) (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, από τη μετανάστευση και την εισβολή δοκιμασίες Transwell, αποδείξαμε υπήρχαν 2- έως 3-φορές (

P

& lt? 0,01) και 0.8- έως 1.5-φορές (

P

= 0.04 και 0.01 ) αύξηση στο ρυθμό μετανάστευσης κυττάρων και ο ρυθμός εισβολής αντίστοιχα σε PITX2 σταθερούς κλώνους που εκφράζουν (C4 και C5) σε σύγκριση με τον έλεγχο φορέα των κυττάρων SKOV3 (Σχήμα 4C). Σε αντίθεση, οι αριθμοί των κυτταρικών διαπέρασε μεμβράνης σε δοκιμασία μετανάστευσης Transwell και εισέβαλαν μέσω Matrigel σε προσδιορισμό εισβολής Transwell μειώθηκαν σημαντικά στην PITX2 κλώνους σταθερή knockdown (Κ1 και Κ2) σε σύγκριση με τα ανακατωμένα έλεγχο του OVCA433 (

P

& lt? 0,01) (Σχήμα 4D). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι PITX2 διαθέτει χωρητικότητα για την προώθηση της μετανάστευσης των κυττάρων και εισβολή σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών.

(Α) Οι επουλωτικές των πληγών δοκιμασία έδειξε ότι PITX2 σταθερώς εκφράζοντα κύτταρα (C4 του SKOV-3) εμφάνισαν ταχύτερα τραύματος ρυθμό κλεισίματος από το φορέα ελέγχου στην χρονική πορεία των 8 ωρών (**

P

& lt? 0,05). (Β) PITX2 σταθερούς κλώνους νοκ ντάουν (Κ1 και Κ2 του OVCA 433) έδειξε σημαντική μείωση στην πληγή ποσοστό κλεισίματος σε σχέση με το φορέα ελέγχου στο χρόνο διάρκεια των 12 ωρών (*

P

& lt? 0,05). Τα βέλη υποδεικνύουν το πλάτος του τραύματος και το ποσοστό σχετικής κυτταρική μετανάστευση εκφράζεται ως το σχετικό πλάτος των πληγών /ώρα. Η δοκιμασία επανελήφθη τρεις φορές ανεξάρτητα. (C) μετανάστευση Transwell και δοκιμασία εισβολής απέδειξε ότι PITX2 που εκφράζουν σταθερά κλώνους σε SKOV3 (C4 και C5) κύτταρα μεταναστεύουν ταχύτερα μέσω της μεμβράνης (*

P & lt? 0,01

) και να εισβάλουν πιο γρήγορα μέσω του matrigel (C4, *

P

= 0.04 και C5, **

P

= 0,01) σε σύγκριση με τον φορέα ελέγχου. (D) PITX2 σταθερός κλώνος knockdown (Κ2 του OVCA 433) εμφάνισαν αξιοσημείωτη μείωση στην κυτταρική διείσδυση μέσω των μεμβρανών και κυτταρικές διεισδυτικότητα σε σύγκριση με τα κωδικοποιημένα στοιχεία ελέγχου (**

P

= 0,01). Τρεις απόψεις επιλέχθηκαν τυχαία σε κάθε ένθετα και μετρήθηκαν οι αριθμοί των εισέβαλε κυττάρων. Τα αποτελέσματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων χαράχθηκαν με μπάρα σφάλματος.

Η

PITX2 ρυθμίζει Κυκλίνη D1-και C-myc σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

Κυκλίνη D1-και C-myc είναι δύο κρίσιμα ρυθμιστικών αρχών στην προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων [17]. Για την αντιμετώπιση είτε PITX2 ρυθμίζει αυτά τα γονίδια στην προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων του καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων, μπορούμε κατ ‘αρχάς εκτελείται ανάλυση Q-PCR και έδειξε ότι δεν υπήρχε 2-12 διπλώνει αύξηση στην έκφραση του

Κυκλίνη D1-

και

C Myc έχει

σε PITX2 εκφράζουν σταθερά ωοθηκών καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 5Α). Επιπλέον, η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε επίσης ότι τόσο Κυκλίνη D1-και C-myc αυξημένα τουλάχιστον κατά 60% σε PITX2 σταθερώς εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (Εικόνα 5Β). Αντιστρόφως, knockdown του PITX2 μειωθεί εντυπωσιακά τις εκφράσεις Κυκλίνης D1-και C-myc τουλάχιστον 20% σε σύγκριση με τους ελέγχους τους κωδικοποιημένα σε OVCA 433 και τα κύτταρα Ον2008 (Σχήμα 5C) .Οι ευρήματα δείχνουν ότι θα μπορούσε να PITX2 upregulate κυκλίνη D1 και C- myc στην προώθηση της ανάπτυξης των κυττάρων των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

(Α) ανάλυση Q-PCR αποκάλυψε ότι τα επίπεδα του

Κυκλίνη D1-

και

C-myc

ήταν αυξημένα σε PITX2A εκφράζουν σταθερά κλώνους (C4, C5 του SKOV-3 και C33, C34 του OVCA 433). (Β) Ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης Κυκλίνης D1-και C-myc αυξήθηκαν κατά PITX2 σε PITX2A σταθερώς εκφράζουν τους κλώνους (C4, C5 του SKOV-3 και C33, C34 του OVCA 433). (Γ) εξόντωση PITX2 μείωσε σημαντικά τα επίπεδα της κυκλίνης-D1 και C-myc σε PITX2 knockdown σταθερών κλώνων (C6, C8 του OVCA 433 και C1, C4 του Ον2008). Τα επίπεδα του ΗΑ-tagged PITX2A ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντι-ΗΑ αντίσωμα, ενώ η ενδογενής έκφραση PITX2 εξετάστηκε με αντίσωμα αντι-PITX2, β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η αριθμητική τιμή κάτω από κάθε πίνακα αντιπροσωπεύει την σχετική έκφραση της κυκλίνης-D1 και C-myc σε ελέγχους φορέα τους.

Η

PITX2 προωθεί

in vivo

ανάπτυξης όγκου των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

Εκτός από

in vitro

ογκογόνο μελέτες για PITX2, προσπαθήσαμε να καθοριστεί αν η υπερέκφραση του PITX2 θα μπορούσε να ενισχύσει την ικανότητα της ανάπτυξης του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού. Δύο PITX2 σταθεροί κλώνοι που εκφράζουν (C4 και C5) και ένα διάνυσμα ελέγχου του SKOV3 εμβολιάσθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς. Μετά από 36 ημέρες, παρατηρήσαμε ότι και οι δύο σταθεροί κλώνοι με PITX2 υπερέκφραση είχε 2,5-3 φορές αύξηση intumor ρυθμό ανάπτυξης σε σύγκριση με τον μάρτυρα φορέα (

P

& lt? 0,01) (Σχήμα 6Α & amp? 6Β). Η ανάλυση στυπώματος Western για τα ανατομή καρκινικούς ιστούς που συλλέγονται κατά την Ημέρα 36 έδειξε ότι και οι δύο PITX2 σταθερούς κλώνους που εκφράζουν (C4 και C5) από SKOV3 εξέφρασαν υψηλά επίπεδα PITX2 και ταυτόχρονα με αυξημένη έκφραση του Κυκλίνη D1-και C-myc (Σχήμα 6C). Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με το

in vitro

ογκογόνο δεδομένων και την περαιτέρω υποστηρίζει ότι PITX2 θα μπορούσε να προωθήσει την ανάπτυξη του όγκου μέσω της προς τα πάνω ρύθμιση της κυκλίνης-D1 και C-myc.

(Α) PITX2 που εκφράζουν σταθερά κλώνων σε SKOV3 (C4 και C5) έδειξαν ταχύτερη στην ανάπτυξη όγκου σε γυμνά ποντίκια, σε σύγκριση με τον μάρτυρα φορέα. Το μέγεθος του όγκου εκπροσωπήθηκε από τη μέση τιμή ± SE από πέντε ποντίκια και μετρήθηκε για 36 ημέρες *,

P

& lt?. 0.01, σημαντικά διαφορετική από την ομάδα ελέγχου φορέα. (Β) Η φωτογραφία απεικονίζει τα τεμαχίζεται όγκους που λαμβάνονται από γυμνούς ποντικούς υποδόρια ένεση με δύο PITX2 σταθερή έκφραση κλώνων σε SKOV3 (C4 και C5) και τον έλεγχο των φορέων για την Ημέρα 36. (Γ) ανάλυση Western blot έδειξε τις εκφράσεις του PITX2, κυκλίνη D1 και C-myc από τους ποντικούς ιστούς υποδόριου όγκου. Η αριθμητική τιμή κάτω από κάθε πίνακα αντιπροσωπεύει την σχετική έκφραση της κυκλίνης-D1 και C-myc σε ελέγχους φορέα τους.

Η

PITX2 ρυθμίζεται από Wnt /β-κατενίνης ανεξάρτητα σε ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

Προηγούμενες μελέτες έχουν τεκμηριώσει ότι PITX2 είναι η κατάντη μεσολαβητής της Wnt /β-κατενίνης οδού [12], [18]. Ως εκ τούτου, ήταν ενδιαφέρον να εξεταστεί αν η ρύθμιση προς τα πάνω του PITX2 οφείλεται στο ενεργοποιημένο Wnt /β-κατενίνης. Κατά την κατεργασία του αναστολέα ΟδΚ3β (χλωριούχο λίθιο), βρήκαμε ότι η δραστικότητα /β-κατενίνης Wnt ενεργοποιήθηκε μέσω της αυξημένης έκφρασης του β-κατενίνης σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα OVCA433 και A2780cp. Ωστόσο, υπήρχε μόνο ελαφρά ή ακόμη και καμία αλλαγή της έκφρασης PITX2 στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα S2A). Ομοίως, κατά την επεξεργασία του μέσου κατάσταση Wnt3A, τόσο A2780cp και OVCA 433 κύτταρα έδειξαν μη προφανή απάντηση στην αυξημένη δραστηριότητα Wnt /β-κατενίνης (Σχήμα S2B). Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η αύξηση της έκφρασης PITX2 στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών δεν ρυθμίζεται κυρίως από σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης αλλά ίσως από άλλους μοριακούς μηχανισμούς.

Συζήτηση

την εξέλιξη του όγκου είναι ένα πολυ- βήμα διαδικασία που προωθεί ο καρκίνος να είναι πιο κακοήθεις και επιθετικό φαινότυπο [19]. Υψηλής ποιότητας όγκου αντιπροσωπεύει μια πιο προηγμένη εξέλιξη η οποία διαθέτει υψηλότερη κυτταρικού πολλαπλασιασμού και τις ικανότητες εισβολής [20]. Σε αυτή τη μελέτη, πρώτον απέδειξε ότι PITX2 ήταν συχνά ρυθμίζεται αυξητικά σε καρκίνους των ωοθηκών ιδιαίτερα σε υψηλής ποιότητας και σαφείς κυττάρου υποτύπου του καρκίνου των ωοθηκών με τη χρήση Q-PCR, στύπωμα Western και αναλύσεις IHC. Το πιο σημαντικό, ασχοληθήκαμε με τις ογκογόνο ρόλο των PITX2 κατέχει στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ανεξάρτητη από προσκόλληση ικανότητα ανάπτυξης, κυτταρική μετανάστευση /εισβολή, καθώς επίσης και την ανάπτυξη του όγκου σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος όγκου ποντικούς.

Σύμφωνα με ΦΥΓΩ ταξινόμηση ταξινόμησης, υψηλής ποιότητας κύτταρα των ωοθηκών των όγκων είναι συνήθως ανεπαρκώς ιστολογικές διαφοροποιούνται [20], μεγαλώνουν γρηγορότερα και πολύ μεταστατικός [7]. Επιπλέον, πρόγνωση της υψηλής ποιότητας των όγκων των ωοθηκών είναι φτωχή στη συνέχεια το συσχετίζει συχνά με κακή ποσοστό επιβίωσης [21], [22] .Οι σαφής κύτταρο υποτύπου λογαριασμούς των ωοθηκών για περίπου 6% του συνόλου των επιθηλιακών όγκων των ωοθηκών και οι περισσότερες περιπτώσεις αυτού του υποτύπου είναι υψηλής ποιότητας όγκου εμφανίζουν μια επιθετική φαινότυπο [3], [22], [23]. Η μελέτη μας έδειξε ότι αμφότερα τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης PITX2 ήταν συχνά ρυθμίζεται αυξητικά στον καρκίνο των ωοθηκών ιδιαίτερα στα υψηλής ποιότητας και σαφείς κύτταρο υποτύπους, υποδεικνύοντας ότι PITX2may παίζουν σημαντικό ρόλο στην προώθηση επιθετικό φαινοτύπων σε καρκίνο των ωοθηκών.

PITX2 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής ομοπεδίου η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, όπως το ήπαρ, την αιμοποίηση, οι γονάδες, και νευρωνική διαφοροποίηση κλπ [24], [25], [26]. Πρόσφατα, έχουν υπάρξει αυξανόμενες αναφορές που δείχνουν ότι PITX2 υπερεκφράζεται σε ανθρώπινους καρκίνους όπως μη λειτουργικό αδενώματα της υπόφυσης [10], όγκο Wilms [27] και θετικούς λεμφαδένες καρκίνο του παχέος εντέρου [11]. Ωστόσο, οι λειτουργικές ρόλοι των PITX2 σε ανθρώπινους καρκίνους, όπως ο καρκίνος των ωοθηκών παραμένουν άγνωστα. Προκειμένου να παρουσιάσει τις λειτουργικές τους ρόλους των PITX2 στον καρκίνο των ωοθηκών, που παράγεται κέρδος ή απώλεια της λειτουργίας των PITX2 σε υψηλής ποιότητας πρότυπα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών και εκτέλεσε μια σειρά από

in vitro

και

in vivo

ογκογόνο δοκιμασίες σε σχέση με την επίδραση της PITX2 στην ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων και της μετάστασης. Η μελέτη μας έδειξε ότι επιβάλλεται η έκφραση της PITX2 θα μπορούσε να ενισχύσει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αγκυροβόλιο ανεξάρτητη ικανότητα ανάπτυξης, κυτταρική μετανάστευση /την εισβολή και την ανάπτυξη του όγκου των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα στο μοντέλο όγκου ξενομοσχεύματος ποντικού. Αντίθετα, η εξάντληση των PITX2 από shRNA απομείωση των παραπάνω ογκογόνο φαινοτύπων σε μοντέλα καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων υψηλής ποιότητας. Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι οι ογκογόνων λειτουργίες διακατέχεται από PITX2 βρίσκεται αποκλειστικά στον καρκίνο των ωοθηκών υψηλής ποιότητας και είναι σύμφωνες με την κλινικοπαθολογοανατομικές ανάλυση ότι η υπερεκφρασμένης PITX2 συσχετίζεται στενά με καρκίνο των ωοθηκών υψηλής ποιότητας.

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι PITX2 ανυψώνει κυτταρικού κύκλου ρυθμιστικούς παράγοντες όπως κυκλίνη D1,-D2 και C-myc προώθηση τύπου κυττάρου ειδικό πολλαπλασιασμό σε υπόφυση και μυοβλαστών κυτταρικές σειρές ποντικού [18], [28], [29], [30 ]. Επιπλέον, βιοχημικές μελέτες που απεικονίζονται ότι οι θέσεις σύνδεσης PITX2 βρίσκονται κατά μήκος των περιοχών προαγωγού του

Κυκλίνη D1-

, –

D2

και

C-myc

, υποδεικνύοντας ότι αυτά τα γονίδια είναι άμεσοι στόχοι μεταγραφή του PITX2 [18], [28], [29], [30], [31], [32]. Επιπλέον, η ενεργοποίηση των ογκογονιδίων όπως Κυκλίνη D1-και C-myc μπορεί να ενισχύσει την ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη σε μαστικά επιθηλιακά κύτταρα ποντικού επάνω και την ανάπτυξη του όγκου σε σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) [17].