Αφηρημένο

Το ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι η δεύτερη πιο κοινή αιτία της θνησιμότητας από καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Οι περισσότερες περιπτώσεις του HCC σχετίζεται με κίρρωση σχετίζονται με χρόνιες μολύνσεις ιό της ηπατίτιδας Β ή του ιού της ηπατίτιδας C. Υπερμεθυλίωση των περιφερειών υποκινητής είναι ο κύριος επιγενετική μηχανισμό της γονιδιακής αποσιώπησης και έχει συμμετάσχει στην ανάπτυξη του HCC. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να καθοριστεί εάν παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του

RASSF1A

και

DOK1

υποκινητές γονιδίου σχετίζεται με την εξέλιξη της ηπατικής νόσου σε ασθενείς Βραζιλίας. επίπεδα μεθυλίωσης μετρήθηκαν με Pyrosequencing σε 41 (20 HCC, 9 ασθενείς με κίρρωση ήπατος και 12 μη κίρρωση) δείγματα ηπατικού ιστού. Οι μέσες τιμές της μεθυλίωσης στο

RASSF1A

και

DOK1

ήταν 16,2% και 12,0% σε μη κιρρωτικούς, 26,1% και 19,6% με κίρρωση, και το 59,1% και το 56,0% σε ιστούς HCC, αντίστοιχα , που δείχνει τη σταδιακή αύξηση, σύμφωνα με την εξέλιξη της νόσου, με σημαντικά υψηλότερα επίπεδα σε ιστούς όγκων. Επιπλέον, υπερμεθυλίωση

RASSF1A

και

DOK1

βρέθηκε στη συντριπτική πλειοψηφία (88%) των περιπτώσεων HCC. Είναι ενδιαφέρον,

DOK1

επίπεδα μεθυλίωσης σε δείγματα HCC ήταν σημαντικά υψηλότερη στην ομάδα των νεότερων (& lt? 40 έτη) των ασθενών, και τα υψηλότερα σε μέτρια διαφοροποιημένο σε σχέση με ελάχιστα διαφοροποιημένο όγκους (

σ

& lt? 0.05). Τα αποτελέσματά μας ενισχύουν την υπόθεση ότι η υπερμεθυλίωση του

RASSF1A

και

DOK1

συμβάλλει στην ηπατοκαρκινογένεσης και συνδέεται με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά.

RASSF1A

και

DOK1

υπερμεθυλίωση προαγωγός μπορεί να είναι μια πολύτιμη βιοδείκτη για την έγκαιρη διάγνωση του HCC και μια πιθανή μοριακό στόχο για θεραπεία επιγενετικές-based

Παράθεση:. Araújo OC, Rosa AS, Fernandes Α, Niel C, Villela-Nogueira CA, Pannain V, et al. (2016)

RASSF1A

και

DOK1

υποστηρικτής μεθυλίωση επίπεδα στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, Κιρρωτικοί και μη κιρρωτικό ήπαρ, και Συσχέτιση με καρκίνο του ήπατος σε ασθενείς Βραζιλίας. PLoS ONE 11 (4): e0153796. doi: 10.1371 /journal.pone.0153796

Επιμέλεια: Isabelle Α Chemin, CrCl-INSERM, Γαλλία

Ελήφθη: 11 Φεβ 2016? Αποδεκτές: 4 Απριλίου, 2016? Δημοσιεύθηκε: 14 Απρίλη του 2016

Copyright: © 2016 Araújo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Τεχνολογικό (https://cnpq.br/), χορηγεί αριθμό 444071/2014 έως 8, για να ΝΜΑ, και Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa μην Estado do Rio de Janeiro (https://www.faperj.br/), χορηγεί αριθμό Ε-26 /111,528 /2013, για να ΝΜΑ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του ήπατος είναι η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο, με κατ ‘εκτίμηση 700.000 θανάτους κάθε χρόνο σε όλο τον κόσμο [1]. Ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) είναι μακράν το πιο κοινό τύπο του πρωτογενούς καρκίνου του ήπατος και ένας από τους λίγους καρκίνους με σαφώς καθορισμένες σημαντικούς παράγοντες κινδύνου. Περίπου το 80% όλων των περιπτώσεων HCC σχετίζονται με τον ιό της χρόνιας ηπατίτιδας Β (HBV) ή τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) λοιμώξεις [2], αν και χρόνιο αλκοολισμό και μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα (NASH) είναι επίσης σημαντικές αιτίες [3, 4]. Αυτοί οι παράγοντες κινδύνου επάγουν χρόνια ηπατική βλάβη συχνά οδηγεί σε κίρρωση, η οποία είναι παρούσα στο 80-90% των ασθενών με HCC [4, 5]. Από HCC πρόγνωση εξαρτάται από το στάδιο του όγκου κατά τη διάγνωση, έχουν χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης έχουν παρατηρηθεί μεταξύ ασθενών σε προχωρημένο στάδιο [6], τονίζοντας τη σημασία της αναγνώρισης των βιολογικών δεικτών για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του ήπατος και θεραπευτικές παρεμβάσεις.

Η μοριακών μηχανισμών που διέπουν ηπατοκαρκινογένεσης παραμένουν ασαφείς. Παρόμοια με άλλους όγκους, η ανάπτυξη και η εξέλιξη της HCC οφείλονται σε μια μέθοδο πολλαπλών βαθμίδων συμπεριλαμβανομένης της συσσώρευσης γενετικών και επιγενετικών μεταβολές στην ρυθμιστικά γονίδια, τα οποία οδηγούν στην ενεργοποίηση των διαφόρων ογκογονιδίων και η απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Η υπερμεθυλίωση προαγωγού CpG νησίδων αποτελεί επιγενετική μηχανισμός γονιδιακής σίγησης που εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων HCC [7, 8]. Η ανώμαλη μεθυλίωση του DNA έχει επίσης καταδειχθεί σε προκαρκινικές καταστάσεις όπως οζίδια δυσπλαστικών ή με κίρρωση του ήπατος [9-11], υποδεικνύοντας ότι είναι ένα πρώιμο γεγονός στην ηπατοκαρκινογένεσης και ένα πολύτιμο δείκτη για την αξιολόγηση των κινδύνων. Το Ras ένωση οικογένεια τομέα 1Α (

RASSF1A

) και κατάντη των κινασών τυροσίνης 1 (

DOK1

) είναι γονίδια καταστολής όγκων συχνά σιγήσει μέσω επιγενετικών μηχανισμού σε μια ποικιλία ανθρώπινων κακοηθειών [12, 13] . Η ανώμαλη μεθυλίωση των γονιδίων αυτών έχει προταθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην κακοήθη μετασχηματισμό του ηπατοκυττάρων [10, 14]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, υπερμεθυλίωση αυτών των γονιδίων σε HCC έχει αναφερθεί να παρουσιάζουν γεωγραφικές διακυμάνσεις, γεγονός που υποδηλώνει ότι η εθνικότητα μπορεί να επηρεάσει τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA [10].

Βραζιλίας άνθρωποι είναι το αποτέλεσμα μιας έντονης πρόσμιξη μεταξύ ευρωπαϊκών αποικιοκράτες ή μετανάστες, αφρικανικής σκλάβοι, και οι αυτόχθονες Ινδιάνοι. Στη Βραζιλία, σχεδόν 9.000 θάνατοι αποδόθηκαν σε HCC το 2013 [15], και η χρόνια λοίμωξη HCV είναι ο κύριος παράγοντας κινδύνου, που αντιπροσωπεύουν περισσότερο από το 50% των περιπτώσεων [16]. Για τις γνώσεις μας, καμία έκθεση έχει δημοσιευθεί μέχρι σήμερα σχετικά με τις επιγενετικών παραγόντων που σχετίζονται με HCC στη Βραζιλία.

Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια ποσοτική ανάλυση μεθυλίωσης του DNA από Pyrosequencing στη βραζιλιάνικη ασθενείς με HCC, κίρρωση, και μη -cirrhotic στάδια, και αξιολόγησε τη σχέση μεταξύ των επιπέδων μεθυλίωσης και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά, με στόχο την εξέταση της σπουδαιότητας της υπερμεθυλίωσης του

RASSF1A

και

DOK1

ως μοριακό δείκτη του HCC.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας του Clementino Fraga Filho Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο (αριθμός έγκρισης 139/10) και εκτελείται σύμφωνα με η δήλωση του Ελσίνκι. Λόγω της αναδρομικής φύσης της μελέτης, η Επιτροπή Δεοντολογίας κατέληξε στο συμπέρασμα ότι δεν υπάρχει γραπτή συγκατάθεση απαιτήθηκε από τους ασθενείς.

Ασθενείς και δείγματα ιστών

Αρχείο μπλοκ ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη ήταν λαμβάνονται στο Τμήμα Παθολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Clementino Fraga Filho, το Ρίο ντε Τζανέιρο, Βραζιλία. δείγματα ήπατος από 20 ασθενείς με HCC, τέσσερα με κίρρωση χωρίς HCC, και 12 με χρόνια ηπατίτιδα (μη κιρρωτικοί) αναλύθηκαν (Πίνακας 1). Επιπλέον, ο περιβάλλων κίρρωση ιστού αναλύθηκε για πέντε ασθενείς HCC (σύνολο = 41 δείγματα). Η ιστολογική ανάλυση αποκάλυψε χαρακτηριστικά συμβατά με χρόνια ηπατίτιδα (φλεγμονή με ή χωρίς ίνωση) σε όλες τις μη κίρρωση του ήπατος ιστών. HCC και τα δείγματα με κίρρωση ιστού ελήφθησαν από εκφυτεύματα ήπαρ ή χειρουργική εκτομή, ενώ ιστούς από ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα ελήφθησαν με διαδερμική βιοψία ήπατος. Όλοι οι ασθενείς HCC που περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη είχαν κίρρωση συκώτια.

Η

Δημογραφικά και κλινικοπαθολογοανατομικές στοιχεία ελήφθησαν από ιατρικά αρχεία, προκειμένου να αξιολογηθεί η συσχέτιση της ηλικίας, του φύλου, της ιστολογίας και HBV και HCV μολύνσεις με μεθυλίωση του DNA . Η ιογενής κατάσταση των ασθενών διαμορφώθηκε ως εξής: HBV λοίμωξη, HBsAg θετικό? λοίμωξη HCV, αντι-HCV και HCV-RNA θετικό? κανένας ιός, HBsAg, αντι-HCV και HCV-RNA αρνητικοί.

Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 57 (εύρος 19-78) έτη, με 47% εκ των οποίων ηλικίας ≥ 60 ετών. Είκοσι έξι (72%) ασθενείς ήταν άνδρες. λοίμωξη HCV ήταν η κύρια αιτιολογικός παράγοντας της νόσου του ήπατος (56% των περιπτώσεων), που ακολουθείται από HBV (19%). Δεκατέσσερις (70%) ασθενείς HCC είχαν μετρίως διαφοροποιημένων όγκων, και δέκα (50%) είχαν μέγεθος του όγκου & gt? 5 εκ. (Πίνακας 1)

απομόνωσης DNA και νατρίου

θειώδους μετατροπής

Πέντε τμήματα 10 μm κόπηκαν από κάθε μπλοκ, αποπαραφινοποιήθηκαν σε 1 mL απόλυτης ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν και σε 1 mL 96% αιθανόλης. εκχύλιση Γονιδιωματικό DNA διεξήχθη με τη χρήση του QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Περίπου 500 ng του γονιδιωματικού DNA υποβλήθηκε σε κατεργασία όξινου θειώδους τροποποίηση για να μετατρέψει όλες τις μη μεθυλιωμένες κυτοσίνες σε θυμίνες. Αυτό πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του EZ μεθυλίωσης του DNA-Lightning Kit (Zymo Research, Irvine, CA). Το τροποποιημένο DNA αποθηκεύτηκε στους -20 ° C για περαιτέρω ανάλυση.

ανάλυση μεθυλίωσης του DNA από Pyrosequencing

επίπεδα μεθυλίωσης του DNA των

RASSF1A

και

DOK1

περιοχές υποκινητή μετρήθηκαν με την εξαιρετικά ευαίσθητη τεχνολογία Pyrosequencing (PyroMark Q96 ID, Qiagen) σε πολλαπλές θέσεις CpG. Κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA ενισχύθηκε με PCR σε όγκο 50 μΙ αντίδρασης, το οποίο περιείχε 1 U του λευκόχρυσου Taq DNA πολυμεράσης, High Fidelity (Invitrogen, Carlsbad, CA) και 0,2 μΜ του κάθε ολιγονουκλεοτιδικού εκκινητή [10], υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα? 35 κύκλους στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και 68 ° C για 1 λεπτό, που ακολουθείται από ένα τελικό στάδιο επιμήκυνσης στους 68 ° C για 7 λεπτά. Δέκα μικρολίτρα του PCR προϊόντος αναλύθηκε σε πήκτωμα αγαρόζης με ηλεκτροφόρηση. Τα υπόλοιπα 40 μΐ του βιοτινυλιωμένου PCR προϊόντος συνελήφθη σε σφαιρίδια επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη (GE Healthcare, Milwaukee, WI) και η αντίδραση Pyrosequencing στήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ PyroMark Gold Q96 (Qiagen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ομάδα εκκινητών προσδιορισμού αλληλουχίας έχουν προηγουμένως σχεδιαστεί [10]. Τα ποσοστά μεθυλίωσης μετρήθηκαν σε έξι και πέντε θέσεις CpG στο

RASSF1A

και

DOK1

προαγωγούς, αντιστοίχως, και εκφράζεται ως το μέσο του συνόλου των CpGs αναλύθηκαν σε ένα δεδομένο γονίδιο. Να αξιολογήσει τις συχνότητες υπερμεθυλίωση του DNA σε HCC και κίρρωση δείγματα, cut-off τιμές για

RASSF1A

και

DOK1

ελήφθησαν από το ποσοστημόριο που αντιπροσωπεύουν το ανώτερο 95% των επιπέδων μεθυλίωσης σε μη κιρρωτικούς δείγματα, όπως ορίζεται προηγουμένως [10]. Ως εκ τούτου, οι συχνότητες του DNA υπερμεθυλίωσης εκπροσωπήθηκαν ως ποσοστό του HCC και κίρρωση δείγματα με επίπεδα μεθυλίωσης πάνω από την τιμή αποκοπής για κάθε γονίδιο.

Η στατιστική ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση το λογισμικό SPSS 20.0 (ΙΒΜ, Armonk, NY). Το τεστ Kruskal-Wallis (ή Mann-Whitney U, ανάλογα με την περίπτωση) για να συγκρίνουν τα επίπεδα μεθυλίωσης στο HCC, κίρρωση, και τα δείγματα μη κίρρωση του ήπατος, καθώς και να δοκιμάσουν τις ενώσεις μεταξύ των επιπέδων μεθυλίωσης και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. Τύπου 1 λάθος ρυθμίστηκε για πολλαπλές συγκρίσεις. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές για

σ

τιμές μικρότερες από 0.05.

Αποτελέσματα

επίπεδα μεθυλίωσης του DNA σε μη κιρρωτικούς, δείγματα κίρρωση και ΗΚΚ ιστού

Pyrosequencing ανάλυση πραγματοποιήθηκε με επιτυχία σε 41 (20 HCC, 9 κίρρωση και 12 μη κιρρωτικούς) και 31 (17 HCC, 7 κίρρωση και 7 μη κιρρωτικούς) δείγματα ιστού για

RASSF1A

και

DOK1

, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα της ποσοτικής ανάλυσης της μεθυλίωσης του DNA, που εκφράζεται ως το μέσο ποσοστό του συνόλου των CpGs αναλύθηκαν σε μία δεδομένη γονιδίου, παρουσιάζονται στο Σχήμα 1. Σε γενικές γραμμές, τα επίπεδα μεθυλίωσης ήταν χαμηλότερα σε μη κιρρωτικούς, μέτρια σε κιρρωτικούς, και υψηλότερη σε ιστούς HCC και για τα δύο γονίδια. Οι μέσες τιμές της μεθυλίωσης στο

RASSF1A

και

DOK1

είχαν ως εξής: 16,2% και 12,0% σε μη κιρρωτικούς, 26,1% και 19,6% σε ασθενείς με κίρρωση ήπατος και 59,1% και 56,0% στο HCC ιστούς, αντίστοιχα (Πίνακας 2). Στατιστική διαφορά στα επίπεδα μεθυλίωσης ανιχνεύθηκε μεταξύ κίρρωση και μη κιρρωτικούς ιστούς (

RASSF1A

,

σ

= 0,165?

DOK1

,

p =

1.000). Ωστόσο, παρατηρήσαμε μια πολύ σημαντική διαφορά των επιπέδων μεθυλίωσης μεταξύ HCC και μη HCC ιστούς και για τα δύο γονίδια (Πίνακας 2). επίπεδα μεθυλίωσης σε κιρρωτικούς ιστούς από ασθενείς χωρίς HCC και των παρακείμενων ιστών με κίρρωση από ασθενείς με HCC συγκρίθηκαν επίσης. Οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων δεν ήταν στατιστικά σημαντική (

RASSF1A

,

σ

= 0,652?

DOK1

,

σ

= 0,231). Μια συσχέτιση του

DOK1

επίπεδα μεθυλίωσης παρατηρήθηκε μεταξύ HCC- και κίρρωση ζεύγη δειγμάτων, με HCC /κίρρωση σε συνδυασμό ιστούς εμφανίζοντας ταυτόχρονα τα υψηλότερα ή χαμηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης. Ωστόσο, μια τέτοια συσχέτιση δεν παρατηρήθηκε για το

RASSF1A

μεθυλίωση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

επίπεδα μεθυλίωσης μετρήθηκαν με Pyrosequencing σε διαφορετικές θέσεις CpG και εκφράζεται ως το μέσο ποσοστό του συνόλου CpGs αναλύθηκαν σε ένα δεδομένο γονίδιο. Η στατιστική σημαντικότητα για το επίπεδο της μεθυλίωσης του DNA σε μη κιρρωτικούς και κίρρωση ιστούς υπολογίστηκε σε σύγκριση με τα δείγματα HCC.

Η

κατάσταση μεθυλίωσης του DNA και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων

Οι συσχετίσεις μεταξύ κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά (ηλικία , το φύλο, και ιστολογία) και τους παράγοντες κινδύνου (επίπεδα HBV και λοιμώξεις HCV) από τη μια πλευρά, και μεθυλίωση σε HCC ιστούς από την άλλη πλευρά, παρουσιάζονται στον πίνακα 3. Συνολικά,

RASSF1A

και

DOK1

εμφάνισαν παρόμοια πρότυπα μεθυλίωσης σύμφωνα με τις παραμέτρους που αναλύθηκαν. Βρήκαμε μια στατιστικά σημαντική διαφορά στο

DOK1

επίπεδα μεθυλίωσης από μια ηλικιακή ομάδα στην άλλη (

σ

= 0,036), με υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης στην ομάδα των νεότερων (& lt? 40 έτη) ασθενών . Επιπλέον, σημαντικά υψηλότερα επίπεδα (

σ

= 0,005) του

DOK1

μεθυλίωση παρατηρήθηκαν σε μέτρια differentiated- ό, τι σε φτωχά διαφοροποιημένα HCCs. Παρά το γεγονός ότι

RASSF1A

και

DOK1

επίπεδα μεθυλίωσης ήταν υψηλότερα στις γυναίκες και HBV θετικές όγκους, μπορεί να παρατηρηθεί καμία στατιστικά σημαντική διαφορά. Επίσης, δεν διαπιστώθηκε καμία συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του μεγέθους του όγκου και μεθυλίωσης (Πίνακας 3).

Η

συχνότητες υπερμεθυλίωση του DNA σε κίρρωση και ΗΚΚ ιστούς

Η ανάλυση των συχνοτήτων υπερμεθυλίωση του DNA αποκάλυψε ότι

RASSF1A

και

DOK1

γονίδια υπερμεθυλίωση στη συντριπτική πλειοψηφία (15/17, 88%) των ιστών HCC (Πίνακας 4). Επιπλέον, η ταυτόχρονη υπερμεθυλίωση των δύο γονιδίων ανιχνεύθηκε σε ιστούς 14/17 (82%) HCC. Ωστόσο, χαμηλότερες συχνότητες της υπερμεθυλίωσης παρατηρήθηκαν μεταξύ κίρρωση ιστούς (2/7, 29% στο

RASSF1A

? 3/7, 43%

DOK1

? Και 2/7, 29% και τα δύο γονίδια ). Όσον αφορά την ιογενή κατάσταση, όλα τα θετικά ΕΑΣ HBV έδειξε υπερμεθυλίωση στο

DOK1

. Η ταυτόχρονη υπερμεθυλίωση αυτών των γονιδίων παρατηρήθηκε συχνότερα σε ασθενείς με HBV (3/4, 75%) και HCV (8/9, 89%) θετικούς όγκους από HBV και αρνητικές HCV (1/2, 50%). Ομοίως, η ταυτόχρονη υπερμεθυλίωση ανιχνεύθηκε σε 2/3 (67%) του HCV θετικός με κίρρωση ιστούς, αλλά σε κανένα (0/4) των αρνητικών HCV (Πίνακας 4). Οι συχνότητες των υπερμεθυλίωση ήταν παρόμοια μεταξύ κίρρωση ιστών από ασθενείς χωρίς HCC και γειτονικών κίρρωση ιστών από ασθενείς με HCC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε ποσοτικά το προφίλ μεθυλίωσης του

RASSF1A

και

DOK1

γονίδια υποκινητή σε μη κιρρωτικούς και κίρρωση συκώτια, χωρίς HCC, καθώς και σε HCC και κίρρωση ζεύγη δειγμάτων. Και τα δύο γονίδια έχουν ιδιότητες καταστολής όγκου και εμπλέκονται σε διάφορους βασικούς κυτταρικών διαδικασιών.

RASSF1A

εμπλέκεται στην οδό σηματοδότησης Ras, η οποία παίζει κεντρικό ρόλο στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων, κυτταρική προσκόλληση, κυτταρική κινητικότητα, και την απόπτωση [17].

DOK1

εκφράζεται σε κύτταρα Β- και Τ, καθώς και σε μυελοειδή κύτταρα (μακροφάγα και ουδετερόφιλα), και εμπλέκεται σε ένα ευρύ φάσμα των ανοσοϋποδοχέα μονοπατιών σηματοδότησης [18]. Εδώ,

RASSF1A

και

DOK1

επίπεδα μεθυλίωσης παρουσίασαν σταδιακή αύξηση, σύμφωνα με την εξέλιξη της νόσου, με σημαντικά υψηλότερα επίπεδα σε ιστούς όγκων. Επιπλέον, παρατηρήσαμε πολύ υψηλά ποσοστά

RASSF1A

(88%) και

DOK1

(88%) υπερμεθυλίωση σε δείγματα HCC, με ταυτόχρονη υπερμεθυλίωση του 82%. Προηγούμενες μελέτες με τη χρήση διαφορετικών μεθοδολογιών, καθώς και διαφορετικά σύνολα CpGs, έχουν βρεθεί επίσης υψηλή (76-100%) συχνότητες

RASSF1A

υπερμεθυλίωση στο HCC [10, 19-21]. Από την άλλη πλευρά, λίγοι υπάρχουν διαθέσιμα στοιχεία σχετικά με το προφίλ μεθυλίωση

DOK1

σε καρκίνο του ήπατος. Μια μελέτη ανέφερε την εμφάνιση υπερμεθυλίωση στην πλειοψηφία (62%) των ιστών HCC [10]. έτσι τα αποτελέσματά μας ενισχύουν την υπόθεση ότι υπάρχει συσχετισμός μεταξύ επιγενετική αποσιώπηση αυτών των βασικών κυτταρικών γονιδίων και ηπατοκαρκινογένεσης. Αξίζει να σημειωθεί ότι, βρήκαμε ταυτόχρονη

RASSF1A

και

DOK1

υπερμεθυλίωση σχεδόν το 30% των κίρρωση ιστούς που αναλύθηκαν. Η ανώμαλη μεθυλίωση βρέθηκε όχι μόνο σε κιρρωτικούς δείγματα ασθενών με HCC, αλλά και σε αυτούς χωρίς HCC, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αύξηση των επιπέδων μεθυλίωσης σε ένα υποσύνολο των κιρρωτικών ιστών λόγω της παρουσίας ορισμένων καρκινικών κυττάρων είναι απίθανο. Οι διαπιστώσεις αυτές είναι σύμφωνες με την ιδέα ότι η παρεκκλίνουσα μεθυλίωση σε μη μετασχηματισμένα ηπατοκύτταρα μπορεί να προηγείται ογκογόνο μετασχηματισμό τους και να προωθήσουν την ανάπτυξη του καρκίνου του ήπατος.

Η πιθανή επίδραση της εθνικότητας σε μεθυλίωσης του DNA δεν έχει μελετηθεί εκτενώς. Ωστόσο, προηγούμενες εκθέσεις έχουν περιγράψει σημαντικές διαφορές στην παγκόσμια μεθυλίωση γονιδιακό DNA, σύμφωνα με την εθνικότητα [22, 23]. Έχει προταθεί ότι ορισμένα γενετικούς πολυμορφισμούς, όπως αυτές των ενζύμων μεταβολισμού φολικού, μπορεί να συμβάλει στις εθνικές διαφορές στην μεθυλίωση του DNA [24]. Lambert et al. [10] έχουν δείξει μία συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων μεθυλίωσης σε πολλά γονίδια και γεωγραφική περιοχή, με την ΕΑΣ παρουσιάζουν

RASSF1A

και

DOK1

επίπεδα μεθυλίωσης χαμηλότερο στην Ταϊλάνδη από ό, τι στη Γαλλία. Η μελέτη μας στηρίχθηκε σε ένα σύνολο CpGs αναλύθηκαν προηγουμένως, και μετρήθηκαν τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA από την ποσοτική μεθοδολογία Pyrosequencing [10]. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε υψηλότερες

RASSF1A

και

DOK1

επίπεδα μεθυλίωσης στη βραζιλιάνικη δείγματα HCC σε σύγκριση με εκείνες από την Ταϊλάνδη (2.7 και 3.1 φορές) και η Γαλλία (1,9 και 1,8 φορές), αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν την αντίληψη ότι οι γενετικές ή /και περιβαλλοντικοί παράγοντες μπορούν να συμβάλλουν με τις εθνοτικές /γεωγραφικές διαφορές της μεθυλίωσης του DNA μεταξύ των περιπτώσεων ηπατοκυτταρικού καρκινώματος.

Αρκετές μελέτες έχουν διερευνήσει πιθανές συσχετίσεις μεταξύ των παραγόντων κινδύνου (HBV και HCV λοιμώξεις) ή κλινικά χαρακτηριστικά (ηλικία, φύλο, και ιστολογία) και μεθυλίωση του DNA σε HCC [9, 10, 19-21, 25]. Υποκινητή που σχετίζεται με CpG νησί μεθυλίωση έχει θεωρηθεί μία από τις πιο εξέχουσες μοριακές αλλαγές που μπορεί να παρατηρηθεί σε γήρανση [26]. Αξίζει να σημειωθεί, μια προηγούμενη μελέτη έχει δείξει ότι όλοι οι ασθενείς άνω των 40 ετών είχαν το

RASSF1A

υποστηρικτής μεθυλιώνονται σε μη νεοπλασματικά κύτταρα του ήπατος [27]. Ωστόσο, παρατηρήσαμε υψηλότερα επίπεδα

RASSF1A

και

DOK1

μεθυλίωσης στο HCC ιστούς της νεότερης ομάδας (& lt? 40 έτη), με στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των

DOK1

μεθυλίωση και την ηλικία (

σ

= 0,036). Στο παρόν, όλοι οι ασθενείς HCC κάτω των 40 ετών είχαν χρόνια λοίμωξη με HBV, και μπορεί κανείς να υποθέσει ότι αυτοί οι ασθενείς μολύνθηκαν πριν από πολύ καιρό, πιθανώς μέσω κάθετης μετάδοσης. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η HBV Χ πρωτεΐνη (HBx) αυξάνει το συνολικό DNA μεθυλοτρανσφεράση (DNMT) δραστηριότητες με προς τα πάνω ρύθμιση του DNMTs, προωθώντας υπερμεθυλίωση συγκεκριμένων γονιδίων καταστολής όγκου [28]. Ως εκ τούτου, το ιικό κατάσταση από τους νεότερους ασθενείς μπορεί να έχουν συμβάλει σε υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης που παρατηρήθηκαν στη μελέτη μας. Παρ ‘όλα αυτά, προηγούμενες μελέτες έχουν επίσης βρεθεί υψηλότερα επίπεδα

RASSF1A

και

DOK1

μεθυλίωσης σε δείγματα HCC στις νεότερες ομάδες, αν και οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές [9, 10]. Επιπλέον, σημαντικά υψηλότερα επίπεδα

DOK1

μεθυλίωση σε κιρρωτικούς ιστούς στην ηλικιακή ομάδα & lt? 40 χρόνια έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [10]. Τέλος, βρήκαμε ότι τα επίπεδα του

RASSF1A

και

DOK1

μεθυλίωση ήταν υψηλότερα σε μέτρια differentiated- ό, τι σε φτωχά διαφοροποιημένα HCCs, με μια σημαντική διαφορά στο

DOK1

(

σ

= 0,005). Κανένας από τους ασθενείς HCC που περιλαμβάνονται στη μελέτη μας είχε καλά διαφοροποιημένο όγκους, έτσι ώστε δεν θα μπορούσε να επιτευχθεί μια καλύτερη σύγκριση μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA και του βαθμού του όγκου της διαφοροποίησης. Σε προηγούμενη εργασία,

RASSF1A

μεθυλίωση ήταν σχεδόν ίση ανεξάρτητα από το HCC διαφοροποίησης [9], ενώ δεν υπάρχουν αναφορές για

DOK1

μεθυλίωση και HCC βαθμού διαφοροποίησης μέχρι σήμερα.

Εν κατακλείδι, αυτή είναι η πρώτη έκθεση σχετικά με τις επιγενετικών παραγόντων που σχετίζονται με HCC στη Βραζιλία. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν ότι η υπερμεθυλίωση

RASSF1A

και

DOK1

συμβάλλει στην ηπατοκαρκινογένεσης και είναι ένα πρώιμο γεγονός στην ανάπτυξη του καρκίνου, πιθανόν σχετίζεται με κλινικά χαρακτηριστικά, καθώς και σημαντικούς παράγοντες κινδύνου. Ως εκ τούτου,

RASSF1A

και

DOK1

παρεκκλίνουσα μεθυλίωση μπορεί να είναι μια πολύτιμη βιοδείκτη για την έγκαιρη διάγνωση του HCC και μια ελκυστική μοριακός στόχος για θεραπεία επιγενετικές-based. Μη επεμβατικές προσεγγίσεις, όπως αυτές μέτρηση υπερμεθυλίωση του κυκλοφορούντος ελεύθερου κυττάρων DNA στον ορό /πλάσμα, θα πρέπει να ενθαρρύνεται.