Αφηρημένο

Ιστορικό

Η τρέχουσα δείκτες για τον καρκίνο του προστάτη, όπως PSA έλλειψη ειδικότητας. Ως εκ τούτου, οι νέες βιοδείκτες απαιτείται. Δυστυχώς, η πολυπλοκότητα των υγρών του σώματος εμποδίζει συχνά ανακάλυψη βιοδεικτών. Μια ελκυστική εναλλακτική προσέγγιση είναι η απομόνωση των μικρών κυστιδίων, δηλαδή εξωσώματα, -100 nm, τα οποία περιέχουν πρωτεΐνες που είναι ειδικά για τον ιστό από τον οποίο προέρχονται και επομένως μπορεί να θεωρηθεί ως κασέλες θησαυρός για συγκεκριμένες ασθένειες βιοδεικτών ανακάλυψη.

Υλικά και Μέθοδοι

τα εξωσώματα απομονώθηκαν από 2 αθανατοποιημένα κύτταρα πρωτογενούς προστάτη επιθηλιακά (PNT2C2 και RWPE-1) και 2 κυτταρικές σειρές προστάτη (PC346C και VCAP) με υπερφυγοκέντρηση. Μετά τρυπτική πέψη, πρωτεομική αναλύσεις χρησιμοποίησε ένα nanoLC σε συνδυασμό με μια LTQ-Orbitrap λειτουργεί σε τρόπο tandem MS (MS /MS). Ακριβής Μάζα και προσέγγιση ετικέτα χρόνου (AMT) χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση πεπτιδίων και ποσοτικοποίηση. Υποψήφιος βιοδείκτες επικυρώθηκαν από κηλίδωση Western και ανοσοϊστοχημεία.

Αποτελέσματα

πρωτεομικής χαρακτηρισμό ως αποτέλεσμα την ταυτοποίηση των 248, 233, 169, και 216 πρωτεΐνες κατά τουλάχιστον 2 πεπτιδίων σε εξωσώματα από PNT2C2, RWPE -1, PC346C και vcap, αντίστοιχα. Στατιστικές αναλύσεις αποκάλυψαν 52 πρωτεΐνες με διαφορετικό τρόπο άφθονη μεταξύ του προστάτη και του ελέγχου των κυττάρων, 9 εκ των οποίων ήταν πιο πλούσια σε ΣΕΣΣ. Επικύρωση από κηλίδωση Western επιβεβαίωσε μεγαλύτερη αφθονία FASN, XPO1 και PDCD6IP (ALIX) σε προστάτη εξωσώματα.

Συμπεράσματα

Ταυτοποίηση πρωτεϊνών exosomal χρησιμοποιώντας υψηλής απόδοσης LC-FTMS οδήγησε στην ανακάλυψη της PDCD6IP , FASN, XPO1 και ΕΝΟ1 ως νέα υποψήφια βιοδείκτες για τον καρκίνο του προστάτη

Παράθεση:. Duijvesz D, Μπουρνούκ-Johnson ΚΕ, Gritsenko MA, Hoogland AM, Vredenbregt-van den Berg MS, Willemsen R, et al. (2013) πρωτεομικής προφίλ των Εξωσώματα οδηγεί στον εντοπισμό των νέων βιολογικών δεικτών για τον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (12): e82589. doi: 10.1371 /journal.pone.0082589

Επιμέλεια: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Αυστρία

Ελήφθη: 16 του Ιουλίου του 2013? Αποδεκτές: 25η Οκτωβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 31 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Duijvesz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

του ειδικού προστατικού αντιγόνου (PSA) είναι μια κλινικά χρήσιμη. πρωτεΐνη βιοδεικτών για τη διάγνωση και την παρακολούθηση μετά τη θεραπεία για τον καρκίνο του προστάτη (PCA). Παρ ‘όλα αυτά, η διαλογή PSA με βάση φάνηκε να έχουν υψηλό κίνδυνο υπερδιάγνωσης και υπερθεραπεία επειδή στερείται ειδικότητας [1], [2]. Για να διαφοροποιηθούν με μεγαλύτερη ακρίβεια μεταξύ καλοήθεις παθήσεις του προστάτη και (διάφορες μορφές) του προστάτη, αποφεύγονται οι άσκοπες βιοψίες του προστάτη, και να υποστηρίξει την ουρολόγο στο να προτείνουμε τη βέλτιστη θεραπεία, νέων μοριακών βιοδεικτών χρειάζονται επειγόντως.

Στη διάρκεια των τελευταίων δεκαετιών , ένα τεράστιο ποσό της έρευνας έχει πραγματοποιηθεί για να βρουν νέες και καλύτερες βιοδεικτών για την PCA, συχνά χρησιμοποιώντας state-of-the-art τεχνολογίες φασματομετρία μάζας, αλλά η ανακάλυψη νέων πρωτεϊνών χαμηλής αφθονίας έχει γενικά παρεμποδιστεί από την πολυπλοκότητα του ορού ή ούρων [3]. Απομόνωση εξωσωμάτων από τα υγρά του σώματος αποτελεί μια ελκυστική προσέγγιση για να παρακάμψει τους περιορισμούς αυτούς και να καταστεί δυνατή η ανίχνευση του υποψηφίου (χαμηλή αφθονία) βιοδείκτες.

Πρόσφατα ευρήματα στην αναζήτηση νέων βιολογικών δεικτών έχουν αποκαλύψει ότι οι μικρές εξωσώματα (50-150 nm) , είναι παρόντα στον ορό και στα ούρα [4]. Με την απομόνωση εξωσώματα από τα υγρά του σώματος θα πρέπει να είναι δυνατό να ξεπεραστεί το δυναμικό εύρος πρόκληση και να διευκολυνθεί ο χαρακτηρισμός των ιστών /λαμβάνεται από καρκίνο πρωτεΐνες που θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν ακριβέστερα κυτταρικές συνθήκες. Ως εκ τούτου, εξωσώματα θα μπορούσε να είναι χρήσιμη για τον καθορισμό των ατομικών χαρακτηριστικών των όγκων [5], [6].

Σε αυτή τη μελέτη, ο στόχος μας ήταν να προσδιορίσει την παρουσία και τη σημασία των πρωτεϊνών exosomal ως νέα υποψήφια βιοδείκτες για την PCA συγκρίνοντας εξωσώματα από μη καρκινικό κύτταρο του προστάτη γραμμές για να εξωσώματα από κυτταρικές σειρές του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και απομόνωση

Δύο ανθρώπινα αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές επιθηλιακού προστάτη (PNT2C2 [7] και δύο κυτταρικές σειρές προστάτη RWPE-1) και (PC346C [8] και vcap [9]) καλλιεργήθηκαν σε 10 Τ175 (175 εκατοστά

2) φιάλες καλλιέργειας (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Γερμανία) μέχρι 80- 100% συρροή. Η γραμμή PNT2C2 και vCap κυττάρων καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Lonza, Verviers, Βέλγιο) και συμπληρωμένο με 5% και 10% FCS, 500 U πενικιλλίνη και 500 U στρεπτομυκίνη (Lonza, Verviers, Βέλγιο). Η RWPE-1 κυτταρική γραμμή (ATCC-LGR, Wesel, Γερμανία) καλλιεργήθηκε σε κερατινοκυττάρων ορού Ελεύθερη Medium (Invitrogen, CA, USA) και συμπληρωμένο με 5 ml Pen-Strep και ένα εμπορικό κιτ που περιέχει εκχύλισμα υποφύσεως βοοειδούς (ΒΡΕ, 0,05 mg /ml) και επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF, 5 ng /ml). Η PC346C κυτταρική γραμμή καλλιεργήθηκε σε τροποποιημένο μέσο-Ham F-12 μέσο Dulbecco Eagle (Lonza), συμπληρωμένο με πολλαπλά πρόσθετα όπως περιγράφεται από τον Marques [10].

Μετά την επίτευξη 80-100% συρροή, τα κύτταρα επωάστηκαν με μέσο χωρίς ορό 25 ml. Μετά από 48 ώρες, το υπερκείμενο συλλέχθηκε και υποβλήθηκε σε στάδια φυγοκέντρησης 400 χ

g

(10 λεπτά), 3000 ×

g

(20 λεπτά), και 10000 ×

g

(30 λεπτά) για την απομάκρυνση κυτταρικών υπολειμμάτων. Τα εξωσώματα κατόπιν σφαιροποιήθηκαν στα 64,000

g

(110 λεπτά), και στα 100.000

g

(Σακχαρόζη κλίση) για 1 h [11]. Τουλάχιστον δύο ξεχωριστές εξωσώματα απομονώσεις από κάθε μία από τις τέσσερις κυτταρικές γραμμές συνενώθηκαν. Συνολικό ποσότητα και συγκέντρωση πρωτεϊνών exosomal των συνενωμένων δειγμάτων μετρήθηκε με ένα BCA-δοκιμασία (Pierce, Rockford, IL, USA).

Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας (ΕΜ)

5 μL εξωσωμάτων ήταν κηλίδα επί Formvar επικαλυμμένα πλέγματα (200 mesh) και σταθεροποιήθηκαν σε 2% παραφορμαλδεΰδη. Μετά τη σταθεροποίηση των εξωσώματα αρνητικά χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας 4% ουρανυλίου. Πλέγματα εξετάστηκαν με ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Philips CM100 στα 80 kV.

Η προετοιμασία των δειγμάτων για Φασματομετρίας Μάζας

TFE

(2,2,2-τριφθοροαιθανόλη) (Sigma-Aldrich) προστέθηκε στα δείγματα σε μία τελική συγκέντρωση 50%. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε υπερήχους σε ένα λουτρό πάγου-νερού (Branson 1510, Danbury, CT) για 2 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 60 ° C για 2 ώρες με συνεχή ανάδευση (300 rpm). Για πρωτεΐνη δισουλφιδική γέφυρα (S-S) αναγωγή, DTT (διθειοθρεϊτόλη) (Sigma-Aldrich) προστέθηκε σε τελική συγκέντρωση 2 mM, που ακολουθείται από κατεργασία με υπερήχους για 2 λεπτά. Τα δείγματα περιδινήθηκαν και επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 ώρα με ανακίνηση (300 rpm). Τα δείγματα αραιώθηκαν, 5-πλάσιο με 50 mM όξινου ανθρακικού αμμωνίου (ρΗ 7.8) πριν από την προσθήκη βαθμού αλληλούχιση τροποποιημένου θρυψίνη (Promega, Madison, WI) για την πέψη των πρωτεϊνών (1:50 β /β θρυψίνης προς πρωτεΐνη). Τα δείγματα ανακινήθηκαν (300 rpm) επί τη νύχτα (16 h). Ταχεία κατάψυξη των δειγμάτων σε υγρό άζωτο αποσβέστηκε την πέψη. Όλα τα δείγματα συμπυκνώθηκαν σε Speed-Vac SC 250 Express (Thermo Savant, Holbrook, NY).

Μαζική φασματομετρία

πρωτεομικής μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα nanoLC-MS στο Εργαστήριο Περιβαλλοντικών Μοριακής Επιστήμης (EMSL), Richland, WA, USA. Η αναλυτική πλατφόρμα αποτελείται από ένα on-line σταθερή πίεση (5000 psi) ανάστροφης φάσης (C

18) υγρής χρωματογραφίας σύστημα (RPLC) [150 μm id × 360 μm od × 65 εκατοστά τριχοειδών (Polymicro Technologies Inc., Phoenix , Α-Ω)] σε συνδυασμό με ένα LTQ-Orbitrap φασματογράφο μάζας (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) μέσω ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (ESI) πηγή κατασκευαστεί in-house [12]. Εν συντομία, η πλήρης MS αποκτήθηκαν πάνω από

m

/

z

φάσμα 400-2000 σε ανάλυση των 100.000, που ακολουθείται από τα δεδομένα που εξαρτώνται από LTQ MS /MS για τα κορυφαία έξι πιο άφθονα ιόντα σε κάθε πλήρη MS σάρωση, χρησιμοποιώντας μια ενέργεια σκηνικό σύγκρουσης του 35% και δυναμική χρόνο αποκλεισμού των 60 s. Μια εκθετική HPLC βαθμίδωση -100 λεπτά (από 0-70% Β) χρησιμοποιήθηκε για κάθε ανάλυση, με κινητές φάσεις που αποτελείται από 0.1% μυρμηκικό οξύ σε νερό (Α) και 0,1% μυρμηκικό οξύ σε ACN (Β). Κάθε δείγμα αναλύθηκε εις τριπλούν, με περίπου 5 μg του συνολικού πεπτιδίου που καταναλώνεται (δηλ, φορτώθηκε επί της στήλης) σε κάθε ανάλυση.

Φασματομετρίας Μάζας Ανάλυση Δεδομένων

Τα προκύπτοντα δεδομένα MS αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας η PNNL αναπτύχθηκε Ακριβής Μάζα και ώρα (AMT) αγωγού TAG [13]. λογισμικό SEQUEST [14] χρησιμοποιήθηκε για να ψάξετε φάσματα μάζας παράλληλα ενάντια στην ανθρώπινη βάση δεδομένων UniProt (download στις 5 Απριλίου 2011). Αυτοπεποίθηση προσδιορίζονται τα πεπτίδια (Πίνακας S1 στο αρχείο S1) συγκεντρώθηκαν σε μια AMT βάση δεδομένων ετικέτα εξωσωμάτων ειδικών. Για συγκριτικές αναλύσεις, τα χαρακτηριστικά LC-MS αντιστοιχήθηκαν κατά ΑΜΤ ετικέτες για την ταυτοποίηση και τις σχετικές εντάσεις MS-κορυφής χρησιμοποιήθηκαν για να αντλήσει αλλαγή σε αφθονία. AMT προσέγγιση ετικέτα διευκόλυνε ποσοτικοποίηση πολλά περισσότερα πεπτίδια από φασματική καταμέτρηση μόνο. Εφ ‘όσον ένα πεπτίδιο που εντοπίστηκε σε τουλάχιστον ένα δείγμα /ανάλυση (με tandem MS), θα μπορούσε να ποσοτικοποιηθεί σε όλα τα σύνολα δεδομένων όπου διεπιστώθη, ακόμη και αν η λειτουργία LC-MS δεν ήταν αρκετά πλούσια για να είναι κατακερματισμένη σε συγκεκριμένη ανάλυση . λογισμικό VIPER [15] χρησιμοποιήθηκε για τη συσχέτιση καταχωρήσεων AMT ετικέτας (προσδιορίζονται πεπτίδια) με LC-MS λειτουργιών που βασίζονται στην ακρίβεια των μετρήσεων υψηλής μάζας (ΜΜΑ & lt? 2 ppm) και ομαλοποιήθηκε η ακρίβεια του χρόνου έκλουσης (NET~2.5%). Κατά συνέπεια, κάθε χαρακτηριστικό LC-MS ταιριάζουν πίσω σε ένα μόνο πεπτίδιο (AMT ετικέτα) δίνοντας έτσι μια μέγιστη τιμή έντασης (ή σχετική αφθονία) για την εν λόγω πεπτιδίου. Για τους απολυμένους πεπτίδιο ταυτοποιήσεις στην περίπτωση ενός μόνο πεπτιδίου που ταιριάζουν πολλαπλές πρωτεΐνες (συνήθως ισομορφές της πρωτεΐνης) ένα αντιπροσωπευτικό πρωτεΐνη επιλέχθηκε? Ως εκ τούτου, κάθε αναφερθεί πεπτίδιο που ταιριάζει πίσω σε μία μόνο πρωτεΐνη. Δεν ταυτοποιήσεις πεπτίδιο έγιναν και μόνο μάζα.

Για τους 263 ταυτοποιημένες πρωτεΐνες, η βάση δεδομένων Ανθρώπινη πρωτεΐνη αναφοράς (HPRD) και την ευστροφία Pathway Analysis (ΙΡΑ) χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί υποκυτταρική τοποθεσία και η βιολογική λειτουργία [16].

επιλογή των πιθανών βιοδεικτών πρωτεΐνης για τον καρκίνο του προστάτη πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας δύο ανεξάρτητων προσεγγίσεων. Πρώτον, επελέγησαν πρωτεΐνες που ήταν παρούσες σε αμφότερες τις PCa κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται εξωσώματα και απουσιάζει στα δύο εξωσώματα μη PCa. Με τη δεύτερη προσέγγιση, το λογισμικό Dante [17] χρησιμοποιήθηκε για τη μετατροπή των τιμών έντασης πεπτίδιο αιχμής σε κλίμακα log2 και να αξιολογήσει τους σε επίπεδο πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας (κλιμάκωση πεπτίδιο αναφοράς με βάση) Rrollup παράμετροι όπου τα πεπτίδια είχαν αποκλειστεί από την κλιμάκωση εάν δεν παρατηρήθηκαν σε τουλάχιστον τρία σύνολα δεδομένων και ελάχιστη παρουσία πεπτίδιο που απαιτούνται. Πρωτεΐνες που παρουσιάζονται σε αυτό το χειρόγραφο ταυτοποιήθηκαν από τουλάχιστον δύο πεπτίδια. ANOVA συγκρίσεις κατά ζεύγη μεταξύ κάθε ΠΑΠ και κυτταρικής γραμμής ελέγχου πραγματοποιήθηκαν επίσης στο Δάντη, όπου ο ελάχιστος αριθμός των σημείων δεδομένων ανά επίπεδο παράγοντα ορίστηκε σε τρεις, έτσι για ότι για μια πρωτεΐνη για να δείξει στατιστικά σημαντικές αλλαγές που θα πρέπει να προσδιοριστεί σε όλα τρεις επαναλήψεις. Σημαντική διαφορά προσδιορίστηκε ως τιμή ρ και q-τιμή μικρότερη από 0.05. DANTE παράγει π-αξίες και εκτιμά q-αξίες τους. Η τιμή Q ενός τεστ μετρά το ποσοστό ψευδών θετικών πραγματοποιήθηκαν (που ονομάζεται ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη), όταν η συγκεκριμένη δοκιμή ονομάζεται σημαντική. επιλέχθηκαν μόνο τα σημαντικά διαφορετικές πρωτεΐνες για ανεξέλεγκτους ιεραρχική ομαδοποίηση. Cluster και TreeView λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για να συνδεθείτε μετατρέψει, σημαίνει κέντρο σχετικές τιμές έκφρασης, και στη συνέχεια ιεραρχική σύμπλεγμα όλες οι πρωτεΐνες με βάση την έκφρασή τους [18]. Για την επιλογή περαιτέρω τις πιο υποσχόμενες πρωτεΐνες, a≥1.5 log2 αποκοπής αλλαγή αναδίπλωσης εφαρμόσθηκε μαζί με μια απαίτηση ότι κάθε πρωτεΐνη έδειξε σημαντική αλλαγή σε τουλάχιστον δύο από τους τέσσερις συγκρίσεων απαριθμούνται στον Πίνακα 1. Ο Πίνακας 1 παραθέτει τα προκύπτοντα 52 πρωτεΐνες, 9 του η οποία έδειξε αυξημένη (και 43 μειωμένη) αφθονία σε εξωσώματα που προέρχονται από τα κύτταρα του προστάτη.

Η

για να επιλέξετε περαιτέρω τα πιο ελπιδοφόρα πρωτεϊνών από τις δύο προσεγγίσεις, πρωτεΐνες κλιμακώνονται με βάση preferentiality προστάτη. Πέντε διαφορετικές άτλαντες έκφραση ανθρώπινου γονιδίου [19] – [23] με βάση τα δεδομένα έκφρασης μικροσυστοιχίας συνενώθηκαν σε SRS [24], για να προσδιοριστεί η έκφραση του γονιδίου της πρωτεΐνης-αντίστοιχο. Τελικά, preferentiality προστάτη προσδιορίστηκε ως 1,5 φορές υψηλότερη έκφραση στον ιστό του προστάτη σε σύγκριση με τα νεφρά και την ουροδόχο κύστη ιστό χρησιμοποιώντας δεδομένα μικροσυστοιχιών γονιδιακής έκφρασης [25].

κηλίδωση Western

Από κάθε δείγμα εξωσωμάτων 5 μg πρωτεΐνη αναμίχθηκε με Laemmli ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος (1:01), θερμάνθηκε στους 95 ° C για δύο λεπτά και φορτώθηκαν σε 10% μονοδιάστατο πήγματα SDS-PAGE. Ακολούθως, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν πάνω σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης Protran (Whatman του Hertogenbosch, Ολλανδία) και αποκλείστηκαν (1 ώρα) σε θερμοκρασία δωματίου με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris με 0,1% Tween-20. Στη συνέχεια, οι πηκτές επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με αντισώματα έναντι: PDCD6IP (αραίωση 1:500, Sigma-Aldrich), FASN (αραίωση 1:500, Sigma-Aldrich), XPO1 (αραίωση 1:200, Santa Cruz Biotechnology, Χαϊδελβέργη, Γερμανία), ΕΝΟ1 (κλώνος H300, 1:1000 αραίωση, Santa Cruz Biotechnology), GAPDH (κλώνος 7Β, 1:500 αραίωση, Santa Cruz Biotechnology), CD9 (κλώνος 209306, 1:500 αραίωση, R & amp? D Systems, Abingdon, UK), PSA (κλώνος A0562, 1:500 αραίωση, DakoCytomation, Heverlee, Βέλγιο). Δευτερογενής αντισώματα (HRP-συζευγμένο κατσίκας αντι-ποντικού /κουνελιού, 1:10,000 αραιώσεις, DakoCytomation) επωάστηκαν για 1 ώρα. BM Χημειοφωταύγειας Blotting Substrate (POD, Roche Applied Science, Almere) χρησιμοποιήθηκε για να κινήσει την οξείδωση από HRP

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC)

ανάλυση της έκφρασης IHC υποψήφιων βιοδεικτών έγινε σε:. Φυσιολογικό προστάτη ιστού (ΕΣΚ, n = 2), προστάτη Gleason βαθμολογία: 3 + 3 = 6 (n = 2), και προστάτη Gleason score 5 + 4 = 9 (n = 2). Οι ιστοί πλάκες τοποθετημένα σε aminoacetylsilane επικαλυμμένο γυαλί slides (Starfrost, Βερολίνο, Γερμανία), αφαιρείται η παραφίνη με ξυλόλιο και αφυδατωμένη σε αιθανόλη. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,3% σε PBS για 20 λεπτά. Μικροκυμάτων προκατεργασία πραγματοποιήθηκε για 15 λεπτά σε τρις ​​(υδροξυμεθυλ) αμινομεθάνιο-EDTA (ρΗ 9.0). Μετά την προεπεξεργασία, τα πλακίδια επωάστηκαν με το PDCD6IP (1:400), FASN (1:50), και XPO1 (1:50) αντισώματα, όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Στη συνέχεια, το κιτ EnVision ϋΑΚΟ (ϋΑΚΟ, Glostrup, Denmark) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση χρωμογόνο. Μετά από χρώση τις διαφάνειες με αιματοξυλίνη, πλύθηκαν, αφυδατώθηκαν και τοποθετήθηκαν σε malinol (Chroma-Geselschaft, Korgen, Germany).

Αποτελέσματα

Απομόνωση και χαρακτηρισμός

Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας (ΕΜ) των καθαρισμένων δειγμάτων εξωσωμάτων αποκάλυψε ότι κυστίδια που προέρχονται από τέσσερις κυτταρικές σειρές είναι λογικά ομοιογενή σε μέγεθος, με μία κατά προσέγγιση διάμετρο 70-200 nm (Σχήμα 1).

Όλα τα δείγματα εξωσωμάτων περιέχουν πολλαπλά κυστίδια με ένα μέγεθος στην περιοχή από 70-200 nm. Το σκοτάδι των κυστιδίων αντικατοπτρίζει τη διαφορά στην πυκνότητα εξωσωμάτων μεταξύ των δειγμάτων.

Η

LC-MS /MS αναλύσεις μετά τρυπτική πέψη, εντοπίστηκαν 1494 μη απολυμένους πεπτίδια (Πίνακας S1 στο S1 αρχείο), που αντιστοιχεί σε 496 πρωτεΐνες κατά τουλάχιστον 1 πεπτίδιο (Πίνακας S2 σε αρχείο S1). 263 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με τουλάχιστον 2 πεπτίδια, και συγκεκριμένα 248, 233, 169, και 216 πρωτεΐνες εντοπίστηκαν στην PNT2C2, RWPE-1, PC346C και vCap κυτταρικές σειρές, αντίστοιχα (Πίνακας S3 σε αρχείο S1). Χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση αυτών των 263 πρωτεϊνών οδήγησε σε μια σαφή διάκριση μεταξύ του καρκίνου και κυτταρικές γραμμές ελέγχου (Σχήμα 2).

Κάθε δείγμα εξωσωμάτων αναλύθηκε εις τριπλούν. Τα αποτελέσματα σημαίνουν κέντρο και log-μετασχηματιστεί. Σχετική αφθονία πρωτεΐνης χρωματίζεται-κωδικοποιημένα με το κόκκινο αντιστοιχεί σε μια σχετικά μεγάλη αφθονία, πράσινο r αντιστοιχεί σε μια σχετικά χαμηλή αφθονία, και γκρι δείχνει τις τιμές που λείπουν αφθονία.

Η

Οι προσδιορίζονται πρωτεΐνες exosomal στις κυτταρικές γραμμές 4 έδειξαν παρόμοια πρότυπα υποκυτταρική εντόπιση (Σχήμα 3Α). Σε σύγκριση με όλες τις πρωτεΐνες που περιλαμβάνονται στη βάση δεδομένων ΙΡΑ, εξωσώματα περιέχουν, μιλώντας σχετικά, πιο κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες και σχεδόν καθόλου εξωκυτταρικές πρωτεΐνες. Η πλειοψηφία των πρωτεϊνών ανιχνεύθηκαν εντός εξωσώματα αφορούν ογκογένεση, κυτταρικό θάνατο, την πρωτεϊνική σύνθεση, κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό (Σχήμα 3Β).

Τα εξωσώματα από τις τέσσερις κυτταρικές γραμμές (PNT2C2, RWPE-1, PC346C, VCAP) περιείχε 60% των κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών και το 25% των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών. B. Οι κορυφαίοι επτά λειτουργίες των πρωτεϊνών exosomal σύμφωνα με Ingenuity Διαδρομή ανάλυση. ακριβής δοκιμασία του Fisher εφαρμόστηκε για τον υπολογισμό σημαντικότητας (p-value & lt? 0,05).

Η

Η επιλογή των πιθανών βιοδεικτών

Για να επιλέξετε πρωτεΐνες που παρουσιάζουν σημαντική μεταβολή στην αφθονία μεταξύ των εξωσώματα προστάτη και μη -PCa εξωσώματα χρησιμοποιήσαμε ANOVA συγκρίσεις κατά ζεύγη (δηλαδή, τιμή p και q-αξίας & lt? 0,05, παρουσία σε όλες τις αναλύσεις, ≥2 πεπτίδια) [17]. Πίνακας S4-8 στο αρχείο S1 περιέχει τα αποτελέσματα που λαμβάνονται για την PC346C (PCA) έναντι PNT2C2 (έλεγχος), PC346C (PCA) έναντι RWPE-1 (έλεγχος), vcap (PCA) έναντι PNT2C2 (έλεγχος), και vcap ( PCA) έναντι RWPE-1 (έλεγχος). Για την περαιτέρω βελτίωση της εμπιστοσύνης, που απαιτείται ώστε κάθε πρωτεΐνη προσδιορίστηκε να είναι σημαντικά αλλάζοντας σε αφθονία σε τουλάχιστον 2 συγκρίσεις? αυτό μειώνεται περαιτέρω λίστα μας με 52 πρωτεΐνες (Πίνακας 1 και Πίνακας S9 στο S1 αρχείο).

πρωτεομική ανάλυση μας έδειξε PDCD6IP, FASN, CD9 και ΕΝΟ1 να έχει σημαντική αλλαγή στην αφθονία ανάμεσα σε δύο όρους, ενώ XPO1 έκανε δεν περνούν αυστηρά κριτήρια φιλτραρίσματος μας και ως εκ τούτου θεωρείται αμετάβλητη σε αφθονία στο vcap εναντίον RWPE-1 σύγκρισης (Πίνακας S8 στο S1 αρχείο). Ακόμα κι έτσι, εμείς επιλέξαμε να επικυρώσει XPO1 λόγω των υψηλότερων αφθονία της σε vcap εξωσώματα σε σύγκριση με τον έλεγχο RWPE-1 και τη διαθεσιμότητα των υψηλής ποιότητας αντισωμάτων κατάλληλο για κηλίδωση Western και ανοσοϊστοχημεία.

Διερεύνηση νέων υποψήφιων βιοδεικτών

για FASN και XPO1, ισχυρά σήματα παρατηρήθηκαν σε προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου σε σύγκριση με τα εξωσώματα και φαίνεται να είναι σχετικά υψηλότερη αφθονία εντός του δείγματος εξωσωμάτων VCAP (Σχήμα 4) εκεί. Η PDCD6IP πρωτεΐνη είναι εμπλουτισμένο σε εξωσώματα και δείχνει υψηλότερη αφθονία στα δύο PCA-προερχόμενα δείγματα εξωσωμάτων όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 4 και στον Πίνακα 1. Με βάση τις αναλύσεις MS, FASN είναι σημαντικά υψηλότερη στα εξωσώματα PC346C σε σύγκριση με δύο ελέγχους και σε VCAP εξωσώματα σύγκριση να RWPE-1 ελέγχου. Αυτή η υψηλότερη αφθονία FASN σε PC346C επιβεβαιώνεται από το στύπωμα Western. CD9 είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένο σε εξωσώματα και δείχνει σχετικά υψηλό αφθονία στα εξωσώματα PC346C. XPO1 εμφάνισαν υψηλότερη αφθονία στα εξωσώματα vcap σύγκριση με τους μάρτυρες. MS δεδομένα που χαρακτηρίζεται ΕΝΟ1 να μειωθεί σημαντικά σε αφθονία σε PC346C σε σύγκριση με δύο ελέγχους και σε Vcap σύγκριση με τον έλεγχο PNT2C2. Western κηλίδωση του ΕΝΟ1 αποκάλυψε μια πρόσθετη ζώνη (περίπου 30 kDa) εντός των δύο PCA-προερχόμενα δείγματα εξωσωμάτων. Όπως αναμενόταν, με βάση την διαφορά σε PSA-έκκριση και σχηματισμός εξωσωμάτων, PSA είναι κυρίως παρόν στα δύο δείγματα καρκινικού κυττάρου και απούσα σε εξωσώματα. Υπερκείμενα που συλλέχθηκαν μετά εξωσώματα κατακρημνίστηκαν κατά τη διάρκεια υπερφυγοκέντρηση, δεν περιέχει καμία από τις πρωτεΐνες exosomal, εκτός ΕΝΟ1 και GAPDH μοναδικά σε μέσο vcap.

Όλα τα τέσσερα δείγματα εξωσωμάτων και οι αντίστοιχες κυτταρικές σειρές τους χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση. Επιπλέον, το υπερκείμενο από τα σφαιροποιήθηκαν εξωσώματα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Οι επιλεγμένες πρωτεΐνες FASN, XPO1, CD9 και PDCD6IP, ελέγχθηκαν με ΕΝΟ1 και GAPDH ως μάρτυρες. PSA ελέγχθηκε για να επιβεβαιωθεί ότι εκκρίνεται μέσω εναλλακτικής οδού εκκρίσεως και ως εκ τούτου δεν υποβάλλει εντός εξωσώματα. Το πλησιέστερο δείκτη πρωτεΐνη (kDa) ενδείκνυται για κάθε κηλίδα.

Η

Επαλήθευση της έκφρασης σε κλινικά δείγματα

PDCD6IP έδειξε ισχυρή αυλού και τα βασικά επιθηλιακά κυτταροπλασματική χρώση σε φυσιολογικό γειτονικό προστάτη (ΕΣΚ) , χωρίς μεταβολή στην έκφραση πρωτεΐνης σε προστάτη ιστού με διαφορετικές βαθμολογίες Gleason (Σχήμα 5). Στο ΕΣΔ, FASN είναι μέτρια έως πολύ πλούσια σε επιθηλιακά κύτταρα. Παρ ‘όλα αυτά, όταν Gleason σκορ αυξάνει, χρώση γίνεται ισχυρότερη. Όσον αφορά XPO1, υπάρχει μια ισχυρή πυρηνική αφθονία σε ΝΑΡ και μια αδύναμη κυτταροπλασματική χρώση. Μέσα στα κύτταρα του προστάτη, η κυτταροπλασματική αφθονία αυξάνει με Gleason σκορ. Πυρηνική χρώση είναι ίση μεταξύ όλων των ιστών του προστάτη.

Εκπρόσωπος εικόνες της χρώσης από 2 ανεξάρτητα δείγματα ανά ομάδα.

Η

Συζήτηση

Σύγκριση εξωσωμάτων που προέρχονται από καρκινικών κυττάρων γραμμές και αθανατοποιημένα προστάτη επιθηλιακά κύτταρα, παρέχει ένα ισχυρό εργαλείο για να ξεπεραστεί η δυναμική πρόκληση εύρος και την ταυτοποίηση νέων χαμηλής αφθονίας του καρκίνου που προέρχεται βιοδεικτών. Αυτή η μοναδική προσέγγιση στην έρευνα πρωτεΐνη exosomal, σε συνδυασμό με state-of-the-art LC-MS αναλύσεις διευκόλυνε ταυτοποίηση νέων υποψήφιων βιοδεικτών για την PCA. Αυτή η μελέτη περιγράφει exosomal έκφραση της πρωτεΐνης από πολλαπλές κυτταρικές σειρές προστάτη, αλλά εξετάζει επίσης το περιεχόμενο εξωσωμάτων από πολλαπλές αθάνατα κύτταρα επιθηλιακά φυσιολογικό προστάτη. Σε σύγκριση με προηγούμενες μελέτες, αυτό μας δίνει τη δυνατότητα να εντοπίζουν πιο αξιόπιστα PCA-ειδικό υποψήφιος βιοδεικτών και πρωτεΐνες κοινή exosomal. Χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western και IHC, επαληθεύουμε διαφορική έκφραση και δείχνουν ότι οι υποψήφιες δείκτες που εκφράζονται από κύτταρα καρκίνου προστάτη σε δείγματα ασθενών.

Ο συνολικός αριθμός των μοναδικών πρωτεϊνών που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη (496 από ≥1 πεπτίδιο, 263 από ≥2 πεπτίδια), είναι συγκρίσιμη με προηγουμένως δημοσιευθεί εξωσωμάτων πρωτεομική εκθέσεις. [26] – [30]. Εκχώρηση ενός υποκυτταρικού εντοπισμού αποκάλυψε ότι ένα μεγάλο ποσοστό των πρωτεϊνών exosomal κανονικά εντοπίσετε στο κυτταρόπλασμα ή στον πυρήνα των κυττάρων. Μετά από σύγκριση αυτό σε μια βάση δεδομένων που περιέχει μια μεγάλη πλειοψηφία όλων των πρωτεϊνών (~ 20.000), παρατηρήσαμε ότι εξωσώματα έχουν σχετικώς συγκρίσιμη αφθονία των πυρηνικών πρωτεϊνών, υψηλότερο αφθονία των κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών και μια ουσιαστικά χαμηλότερη αφθονία των εξωκυτταρικών πρωτεϊνών. Αυτό ταιριάζει με την τρέχουσα θεωρία του σχηματισμού εξωσωμάτων [4]. Τα εξωσώματα εμφανίζει μια υπερ-αντιπροσώπευση των διαμεμβρανικών και κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών, όπως CD9 και PDCD6IP, όπως φαίνεται από Western blots. Αυτό το εύρημα συμφωνεί με τη θεωρία ότι βιογένεση και η επιλογή του περιεχομένου exosomal δεν είναι μια τυχαία διαδικασία, αλλά τουλάχιστον εν μέρει το αποτέλεσμα μιας επιλεκτικής διαδικασίας διαλογής [4].

Δύο πρόσφατες μελέτες αποκάλυψαν πρωτεομική exosomal πρωτεΐνες που σχετίζονται με προστάτη καρκίνο [30], [31]? Sandvig

et al.

Πραγματοποιείται ανάλυση LC-MS σε μια κυτταρική γραμμή μόνο προστάτη (καρκίνος), ήταν Hosseini-Beheshti

et al.

Εξέτασε πέντε κυτταρικές σειρές προστάτη και ένα μη κακοήθη επιθηλιακά προστάτη κυτταρική σειρά. Και οι δύο αναφέρθηκαν 266 και 220 πρωτεΐνες, το οποίο είναι παρόμοιο με τον αριθμό που αποκαλύπτεται. Είναι ενδιαφέρον, Sandvig

et al.

Ανέφεραν μία διαφορετική πρωτεΐνη υποκυτταρική κατανομή και συσχέτιση με βιολογικές διαδικασίες σε σύγκριση με τα δεδομένα μας. Sandvig

et al.

Πρότεινε CDCP1 και CD151 ως υποψήφιος δείκτες, ήταν Hosseini-Beheshti πρότεινε ANXA2, CLSTN1, FLNC, FOLH1 και GDF15. Hosseini-Beheshti

et al.

Επίσης έδειξε FASN να είναι μια εξωσώματα που προέρχονται από τις υποψήφιες βιοδεικτών (σε συμφωνία με τα αποτελέσματά μας). Όταν συγκρίνουμε προσδιορίζονται οι πρωτεΐνες τους (από & gt? 2 πεπτίδια) παρατηρήσαμε μια επικάλυψη μόνο 9 πρωτεϊνών, αντίστοιχα CD9, ANXA1. ACTB, PGK1, RAN, EpCAM, HSPB1, PDCD6IP και PRDX1 (Σχήμα 6). Αυτές οι πρωτεΐνες έχουν δημοσιευθεί προηγουμένως σε πολλά άρθρα και θεωρούνται να είναι παρούσα σε όλα σχεδόν τα εξωσώματα. PDCD6IP έχει επίσης ταυτοποιηθεί από τις δύο ερευνητές, αλλά δεν έχει βρεθεί να είναι πιο άφθονο σε PCA-προερχόμενα εξωσώματα. Ένα σύνολο 199 πρωτεϊνών έχουν μοναδικά βρέθηκε στη μελέτη μας, συμπεριλαμβανομένης της XPO1 υποψήφιο βιοδείκτη. Η επικάλυψη μεταξύ των μελετών είναι μάλλον περιορισμένη. Ιδιαίτερα, η επικάλυψη μόνο 42 πρωτεΐνες μεταξύ της μελέτης μας και Hosseini-Beheshti

et al.

Δεν αναμένεται δεδομένου ότι χρησιμοποιήθηκαν κόμμα οι ίδιες κυτταρικές σειρές (VCAP και RWPE-1). Αυτή η στενή επικάλυψη θα μπορούσε να είναι το αποτέλεσμα των διαφορετικών καθαρισμού, τεχνολογίες MS-MS και αγωγών επεξεργασία των δεδομένων που χρησιμοποιούνται. Επιπλέον, εάν εξωσώματα περιέχουν μια μεγάλη συλλογή διαφορετικών πρωτεϊνών, επικαλύπτονται μεταξύ των βάσεων δεδομένων μπορεί να περιοριστεί αν μόνο ένα κλάσμα του συνόλου των πρωτεϊνών προσδιορίζεται σε κάθε μελέτη. Μια πρόσφατη έκθεση από Πρίνσιπε

et al.

Έδειξε την πρώτη αναγνώριση της περισσότερα από 900 πρωτεΐνες σε εξωσώματα που προέρχονται από ανθρώπινο υγρό του προστάτη από ασθενείς με χαμηλής ποιότητας προστάτη και υγιείς άνδρες [32]. Όταν συγκρίναμε μοναδική έκφραση τους σε πρωτεΐνες (παρουσία & gt? 2 πεπτίδια), μόνο 31 πρωτεΐνες επικαλύπτονται, συμπεριλαμβανομένων των πολλαπλών αννεξίνες (ANXA1-7), peroxiredoxins (PRDX1-6), PDCD6IP και γενικά διαμεμβρανικές πρωτεΐνες (CD9 /CD242 /CD44). Όλες αυτές οι πρωτεΐνες πιστεύεται ότι είναι παρούσα σε όλα σχεδόν τα εξωσώματα. Σε ποιο βαθμό η περιορισμένη επικάλυψη οφείλεται σε πραγματικές διαφορές μεταξύ εξωσώματα και κυστίδια από κλινικά δείγματα γραμμή που προέρχεται από κύτταρο, χρειάζεται ακόμη να αποδειχθεί.

Ο αριθμός των πρωτεϊνών που εντοπίζονται σε κάθε μελέτη είναι μια συλλογή της καρκινογόνες πρωτεΐνες που προέρχονται από exosomal προσδιορίζονται από το MS-MS.

η

Εντοπίσαμε PDCD6IP ως εμπλουτισμένο σε εξωσώματα, ειδικά σε προστάτη εξωσώματα. PDCD6IP, επίσης γνωστή ως ALIX, είναι μια κυτταροπλασματική πρωτεΐνη που είναι γνωστή για το ρόλο της στην απόπτωση και φαίνεται ότι εμπλέκεται στο μονοπάτι των επιλεγμένων διαλογή με ESCRT-σύμπλοκα [33]. PDCD6IP έχει χρησιμοποιηθεί ως γενικός δείκτης για να αποδείξει την παρουσία εξωσωμάτων [34]. Ωστόσο, καμία συσχέτιση έγινε με μεγαλύτερη αφθονία στον καρκίνο που προέρχεται εξωσώματα. Μια πιθανή εξήγηση για την υψηλή PDCD6IP αφθονία σε PCA-προερχόμενα εξωσώματα θα μπορούσε να είναι ότι τα κύτταρα του προστάτη έχουν μια αλλαγμένη παραγωγή εξωσωμάτων, όπου δεν είναι σε θέση να ρυθμίζουν την διαλογή των exosomal περιεχόμενο σωστά πια. Είναι επίσης πιθανό ότι τα καρκινικά κύτταρα προσπαθήσουν να αφαιρέσουν την πρωτεΐνη PDCD6IP με έκκριση εξωσωμάτων έως (εν μέρει) καταστέλλουν την απόπτωση. Για να συμπληρώσει αυτή τη θεωρία, άλλα μη PCa σχετικές μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση του PDCD6IP συσχετίζεται με το κυτταρικό θάνατο [35]. Χρησιμοποιώντας IHC, δεν βρήκαμε καμία διαφορά στην PDCD6IP αφθονία μεταξύ του φυσιολογικού επιθηλίου του προστάτη και του προστάτη ιστό.

Τόσο FASN και XPO1 έχουν μεγαλύτερη αφθονία στο προστάτη εξωσώματα που προέρχεται από τα κύτταρα vcap. FASN καταλύει τον σχηματισμό μακράς αλυσίδας λιπαρά από ακετυλο-ΟοΑ, το μηλονυλο-συνένζυμο και NADPH και έχει ήδη προταθεί ως δείκτης για την PCA [36], [37]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι FASN εκφράζεται κυρίως σε ορμόνη ευαίσθητα κύτταρα, προάγουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ότι η αναστολή της FASN σκοτώνει αποτελεσματικά και επιλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα [36]. Ωστόσο, αυτές οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν όλες

in vitro

. Η κυτταρική σειρά vcap χρησιμοποιείται εδώ είναι ορμόνη-ευαίσθητη, πράγμα που θα μπορούσε να εξηγήσει την υψηλότερη αφθονία των FASN σε vcap που προέρχονται εξωσώματα. Τα καρκινικά κύτταρα παράγουν περισσότερο FASN, πιθανότατα επειδή προωθεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, η οποία θα μπορούσε να οδηγήσει σε υψηλότερα ενσωμάτωση στα εξωσώματα. Σε συμφωνία με προηγούμενα αποτελέσματα [38], παρατηρήσαμε επίσης μια αυξημένη αφθονία σε προστάτη σε σύγκριση με το ΝΑΡ.

XPO1 έχει προταθεί ως προγνωστικός δείκτης για άλλους τύπους καρκίνου [39]. XPO1 είναι μια πυρηνική πρωτεΐνη που είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην πυρηνική-κυτταροπλασματική εξαγωγή των πρωτεϊνών (NES) σήμα που φέρει, η οποία παίζει ρόλο στην σχετική όγκου μονοπατιών σηματοδότησης, όπως Ρ53, ΑΚΤ1, HDAC5, ο υποδοχέας ανδρογόνων (AR) και ο EGFR [40] – [42]. Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι XPO1 θα μπορούσε να είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης για την PCA. Όταν αυτή η πρωτεΐνη έχει επικυρωθεί σε ολόκληρη την ενότητα δείγματα προστάτη με IHC, παρατηρούμε μια ισχυρή πυρηνική έκφραση και μια πολύ αδύναμη κυτταροπλασματική έκφραση. Είναι ενδιαφέρον ότι, εντός των καρκινικών κυττάρων, αυτή η πρωτεΐνη φαίνεται να μετατοπίζεται στο κυτταρόπλασμα. Με την αύξηση σκορ Gleason, κυτταροπλασματική έκφραση XPO1 γίνεται όλο και πιο έντονη. Γιατί συμβαίνει αυτή η διαδικασία παραμένει ασαφής. Σε ένα κανονικό κύτταρο, XPO1 πρέπει να μεταφερθεί από το κυτταρόπλασμα πίσω στον πυρήνα για να λειτουργήσει ως μια πρωτεΐνη συνοδός. Εάν αυτή η διαδικασία μετεγκατάστασης αναστέλλεται στον καρκίνο, κυτταροπλασματική XPO1 θα συσσωρεύονται και περισσότερο XPO1 θα μπορούσε να πάρει ενσωματώνονται σε εξωσώματα.

Όπως δημοσιεύθηκε προηγουμένως, ένα επιπλέον ζώνη πρωτεΐνης (περίπου 30 kDa) εμφανίζεται με κηλίδωση Western κατά τη χρήση ενός αντισώματος που κατευθύνεται κατά ΕΝΟ1 στο PC346C κυτταρική γραμμή [43]. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η ζώνη αυτή είναι επίσης παρούσα σε εξωσώματα VCAP και απούσα σε εξωσώματα από δύο μη PCa κυτταρικές σειρές. Η προέλευση του πρόσθετου ζώνη θα μπορούσε να είναι ένα μη-ειδικό αντίσωμα διασταυρούμενη αντίδραση σε μια άλλη πρωτεΐνη, ένα εναλλακτικό ματισμένο ΕΝΟ1, ένα μεταφρασμένο θραύσμα ή ένα προϊόν διάσπασης από την αρχική πρωτεΐνη. Ένα γνωστό ισομορφή πρωτεΐνη που ονομάζεται MBP-1 (c-myc προαγωγό πρωτεΐνη δέσμευσης-1) παράγεται το γονίδιο μορφή ΕΝΟ1 [44]. ΜΒΡ-1 είναι ταυτόσημη προς την αλληλουχία με ΕΝΟ1 αλλά στερείται τα πρώτα 93 ή 96 αμινοξέα. Με μια υπολογισμένη μοριακή μάζα 36 kDa, ΜΒΡ-1 είναι απίθανο η εκτιμώμενη 30 kDa επιπλέον ζώνη. Η παρατήρηση ότι η πρόσθετη αυτή μπάντα εμφανίζεται μόνο σε δύο καρκινικά δείγματα θα μπορούσε να δείξει ότι μπορεί να έχουν σχέση με την ΣΕΣΣ.

Οι νέοι δείκτες που προσδιορίζονται ήρθε από εξωσώματα γραμμή που προέρχεται από κύτταρο. Παρά το γεγονός ότι exosomal παρουσία και έκφραση καρκινικού ιστού από ένα επιλεγμένο σύνολο των υποψηφίων βιοδεικτών επιβεβαιώθηκε με τη χρήση Western και IHC, ανεξάρτητη επικύρωση των υποψήφιων δεικτών εξακολουθεί να είναι αναγκαία σε μια μεγάλη συλλογή των δειγμάτων, όπως η ασθενής ουροποιητικού εξωσώματα ή τα δείγματα ιστού. Αυτό θα αποσαφηνίσει το ρόλο τους ως βιοδείκτη για την PCA.

Για να δοκιμαστεί η παρουσία των πρωτεϊνών exosomal σε μεγάλες ομάδες των δειγμάτων των ασθενών, μπορεί κανείς να καταφύγει σε πρότυπο IHC υποψήφιων δεικτών στις μικροσυστοιχίες ιστού και βιοψίες του προστάτη. Εναλλακτικά, ακέραια εξωσώματα μπορούν να απομονωθούν από τα ούρα ή το πλάσμα χρησιμοποιώντας καθίζηση, διήθηση ή πρωτόκολλα ανοσοσύλληψης μετά την οποία το περιεχόμενο του εξωσώματα μπορεί να μετρηθεί με δοκιμές ELISA, ειδική για τις πρωτεΐνες του ενδιαφέροντος. ELISAs αναπτύσσονται σήμερα για την ανίχνευση των άθικτων εξωσωμάτων προστάτη προερχόμενα χρησιμοποιώντας αντισώματα σύλληψης ή ανίχνευσης που κατευθύνεται έναντι γνωστών ειδικού προστατικού διαμεμβρανικές πρωτεΐνες. Μια τέτοια δοκιμασία επιτρέπει σε κάποιον να προσδιορίσει έκφραση διαμεμβρανικών πρωτεϊνών, αλλά επίσης να υπολογίζουν τον αριθμό των εξωσωμάτων.

Συμπέρασμα

προστάτη (καρκίνος) κύτταρα εκκρίνουν εξωσώματα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταυτοποίηση νέων υποψήφιων βιοδείκτες για την PCA . Ταυτοποίηση των πρωτεϊνών exosomal από υψηλής απόδοσης LC-FTMS οδήγησε στην ανακάλυψη της PDCD6IP, FASN, XPO1 και ΕΝΟ1 ως νέα υποψήφια βιοδείκτες για την PCA. Στην επόμενη φάση, όλες οι προτεινόμενες υποψήφιος βιοδείκτες θα αξιολογηθεί σε δείγματα ασθενών (ιστό, ορό ή ούρα) να αποσαφηνιστεί πλήρως το δυναμικό κλινική αξία τους.

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1.

Συμπληρωματικές πληροφορίες που περιέχει 9 αρχεία υποστήριξης πληροφοριών. Πίνακας S1 στο S1 αρχείο: Σιγουριά προσδιορίζονται πεπτίδια (n = 1494) συγκεντρώθηκαν σε μια AMT βάση δεδομένων ετικέτα εξωσωμάτων ειδικών. Πίνακας S2 σε S1 αρχείου: 1494 μη απολυμένους πεπτίδια αντιστοιχεί σε 496 πρωτεΐνες κατά τουλάχιστον 1 πεπτίδιο.