Αφηρημένο

Ιστορικό

Η βιταμίνη δεσμευτικό παράγοντα ενεργοποίησης της πρωτεΐνης-μακροφάγων (DBP-MAF) D είναι ένας ισχυρός αναστολέας της ανάπτυξης του όγκου. δραστηριότητα της, ωστόσο, έχει αποδοθεί σε έμμεσους μηχανισμούς, όπως η αύξηση της ανοσολογικής απόκρισης με την ενεργοποίηση των μακροφάγων και την αναστολή της ανάπτυξης των αιμοφόρων αγγείων είναι αναγκαία για την ανάπτυξη των όγκων.

Μέθοδοι και Εκτίμηση

Σε αυτό μελέτη δείχνουμε για πρώτη φορά ότι DBP-MAF εκθέματα άμεση και ισχυρή επίδραση στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη απουσία μακροφάγων. DBP-MAF καταδεικνύεται ανασταλτική δραστικότητα σε μελέτες του πολλαπλασιασμού των δύο LNCaP και κυτταρικές γραμμές καρκίνου προστάτη PC3 καθώς και μεταστατική κλώνοι αυτών των κυττάρων. Η κυτταρομετρία ροής μελέτες με αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο έδειξε ότι αυτή η ανασταλτική δράση δεν οφείλεται σε απόπτωση ή κυτταρικό θάνατο. DBP-MAF επίσης είχε την ικανότητα να αναστέλλει μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του προστάτη

in vitro

. Τέλος, DBP-MAF δείχθηκε να προκαλέσει μείωση της ουροκινάσης υποδοχέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου (uPAR) έκφραση σε κύτταρα όγκου προστάτη. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η ενεργοποίηση αυτού του υποδοχέα συσχετίζεται με μετάσταση όγκου.

Συμπεράσματα

Αυτές οι μελέτες δείχνουν ισχυρή ανασταλτική δραστικότητα του DBP-MAF σε κύτταρα όγκου του προστάτη ανεξάρτητη από την ενεργοποίηση των μακροφάγων του.

Παράθεση: Γρηγόρης KJ, Zhao Β, Bielenberg DR, Dridi S, Wu J, Jiang W, et al. Πρωτεΐνη-μακροφάγων (2010) Η βιταμίνη D βιβλιοδεσίας παράγοντα ενεργοποίησης αναστέλλει άμεσα πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, και uPAR Έκφραση κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 5 (10): e13428. doi: 10.1371 /journal.pone.0013428

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, City of Hope Εθνικό Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Ιαν 2010? Αποδεκτές: 10η Σεπτεμβρίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 18 Οκτ 2010

Copyright: © 2010 Gregory et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Department of Defense (DOD) PC030286 επιχορήγηση και Έρευνας για την πρόληψη της τύφλωσης Challenge Grant. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πρωτεΐνη δέσμευσης βιταμίνης D (DBP) είναι ο κύριος μεταφορέας της βιταμίνης D στο αίμα. Έχει ένα μοριακό βάρος μεταξύ 52-59 kDa και βρίσκεται στην κυκλοφορία του αίματος σε ένα επίπεδο μεταξύ 300-600 μg /mL [1], [2]. DBP είναι το γονικό μόριο του DBP-MAF [3]. DBP-MAF είναι το προϊόν της επιλεκτικής απογλυκοσυλίωση του DBP και έχει δειχθεί ότι είναι ένας ισχυρός αντι-αγγειογόνου και αντιογκογένεσης μόριο [4] – [6]. Αποδείξαμε προηγουμένως σε ένα μοντέλο ποντικού ξενομοσχεύματος που DBP-MAF είναι ένας ισχυρός αναστολέας της ανθρώπινης παγκρεατικής όγκων και ότι η ικανότητά της να αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

οφείλεται, εν μέρει, να αντιαγγειογενετικές ιδιότητες του [4] . Σε αυτή την μελέτη δείχθηκε ότι DBP-MAF είναι αντιαγγειογενετικές βασίζεται στη μείωση των σκαφών του νεοσσού χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης, και με βάση την μειωμένη πυκνότητα μικροαγγείων σε όγκους. Έχει προταθεί σε άλλες μελέτες ότι πρωταρχικός αντικαρκινική μηχανισμοί της είναι ανοσολογικές, λόγω της ενεργοποίησης της μακροφάγων. Πρόσφατες κλινικές μελέτες με Yamamoto

κ.ά.

έδειξαν ισχυρή δραστικότητα κατά του όγκου, καθώς επίσης και δράσιν έναντι του HIV [7] – [10]. Αυτή η δραστηριότητα μετρήθηκε ως συνάρτηση του μειωμένα επίπεδα του ενζύμου α-Ν-ακετυλγαλακτοζαμινιδάση (nagalase) στον ορό. Nagalase απογλυκοζυλίωση του DBP την εμποδίζει την ενεργοποίηση των μακροφάγων και επομένως καταστέλλει την ανοσολογική απόκριση [11]. Ο βασικός μηχανισμός που προτείνεται σε όλες τις περιπτώσεις είναι σε μεγάλο βαθμό η ενεργοποίηση των μακροφάγων και την επακόλουθη ανοσοαποκρίσεις. Σε HIV έχει προταθεί ότι ελαττωματική παρουσίαση αντιγόνου είναι ένας παράγοντας στην ανοσοποιητική ανεπάρκεια [12]. Η παρουσία υψηλών nagalase στο πλάσμα των ασθενών με HIV υποδηλώνει ότι ενεργοποίηση των μακροφάγων μπορεί να ανασταλεί σε αυτούς τους ασθενείς [13]. Επιπλέον, nagalase έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα εγγενές συστατικό ενός φακέλου πρωτεΐνη σύντηξης προώθηση για την έναρξη της μόλυνσης [11]. Η συγκέντρωση του nagalase σε ασθενείς με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο πλάσμα βρέθηκε επίσης να είναι αυξημένα. Σε λύκο, αυτοαντισώματα σχηματίζουν παθογόνος ανοσοσύμπλοκα και αποτίθενται στους ιστούς. Η κάθαρση αυτών των συμπλοκών από τα μακροφάγα αναστέλλεται εάν η ενεργοποίηση των μακροφάγων διαταράσσεται [14]. Τα καρκινικά κύτταρα έχουν αποδειχθεί ότι παράγουν nagalase [15] και έχουν αυξημένες συγκεντρώσεις στον ορό έχουν καταγραφεί σε έναν αριθμό ασθενών με καρκίνο που πάσχουν από μελάνωμα [16], του προστάτη, του παχέος εντέρου, και μεταστατικό καρκίνο του μαστού [7] – [9]. Μια λεπτομερής κατανόηση της ΔΑΠ-MAF δραστηριότητα είναι ακόμα να επιτευχθεί, αλλά το δυναμικό της ως αντιαγγειογενετικές και ανοσοποιητικές θεραπεία είναι σαφές

Τέσσερις καρκίνου του προστάτη κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, ώστε να συμπεριληφθούν.? το ευαίσθητο των ανδρογόνων (LNCaP) και αναίσθητη γραμμές (PC3M), καθώς και εξαιρετικά μεταστατικό γραμμές (LNCaPLN3 και PC3MLN4) που προέρχονται από κάθε γονική γραμμή, αντίστοιχα.

Η ικανότητα της ΔΑΠ-MAF για να έχουν μια άμεση επίδραση στην καρκινικά κύτταρα δεν έχει αναφερθεί. Αυτή η μελέτη ερεύνησε το ρόλο του DBP-MAF σε άμεση αναστολή δραστηριοτήτων, όπως ο πολλαπλασιασμός, η μετανάστευση, και η έκφραση του uPAR που σχετίζονται με την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση.

Υλικά και Μέθοδοι

Σύνθεση DBP-MAF

(α) Παρασκευή σφαιριδίων (1-3) β-D-γαλακτοσιδάση-αγαρόζης.

Παρασκευή σφαιριδίων έγινε χρησιμοποιώντας μια τροποποίηση της μεθόδου του Yamamoto

et al

[17]. σφαιρίδια ενεργοποιημένη με βρωμιούχο κυάνιο (0.5 g) πλύθηκαν με 1 mM HCl (3Χ, 10 mL ανά πλύση) χρησιμοποιώντας διήθηση αναρρόφησης. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν με νερό DDI και επαναιωρήθηκε σε 2 ml ρυθμιστικό σύζευξης (0,1 Μ NaHCO

3, 0.5 Μ NaCl, ρΗ 8,3). (1-3) β-D-γαλακτοσιδάσης (1000 μονάδες) προστέθηκε στο χάντρες /ρυθμιστικό σύζευξης και στη συνέχεια ανακινήθηκε με πάνω και κάτω από αναμικτήρα επί 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν με ρυθμιστικό σύζευξης και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φραγμού (ρυθμιστικό σύζευξης συν 0,2 Μ γλυκίνη). Το εναιώρημα ανακινήθηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν με ρυθμιστικό σύζευξης που ακολουθείται από 0,1 Μ οξικό νάτριο, 0.5 Μ NaCl, ρΗ 4.0, και τα εκπλύματα επαναλήφθηκαν για συνολικά τέσσερις φορές. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν με μία τελική πλύση ρυθμιστικού σύζευξης στη συνέχεια φυγοκέντρηση και επαναιωρήθηκε σε 1.0 Μ NaCl.

(β) Προσδιορισμός της (1-3) β αγαρόζης-D-γαλακτοσιδάσης-δραστικότητα χάντρα.

Προσδιορισμός δραστικότητας σφαιρίδιο έγινε χρησιμοποιώντας μια τροποποίηση της μεθόδου του Yamamoto

κ.ά.

[17]. Προκειμένου να προσδιοριστεί η δραστικότητα των σφαιριδίων (1-3) β-D-γαλακτοσιδάση-αγαρόζη, 50 μL του εναιωρήματος σφαιριδίων προστέθηκαν σε 0.95 mL ρυθμιστικού διαλύματος δοκιμασίας /χρωμογόνου υποστρώματος (PBS, 3 mM 2-νιτροφαινυλ-β- D-γαλακτοπυρανοσίδη, 10 mM MgCl

2, 0,1 mM β-μερκαπτοαιθανόλη), και το εναιώρημα ανακινήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Η αντίδραση σταμάτησε με 33 μΙ 1 Μ ανθρακικού νατρίου, και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 405 nm. Η δραστικότητα εκφράζεται ως μονάδες /mL εναιωρήματος σφαιριδίου, όπου 1 μονάδα ορίζεται ως ο αριθμός των μπιοί ρ-νιτροφαινόλης που σχηματίζεται ανά λεπτό. Μια μοριακή απορροφητικότητα του 18380 L /mol cm, και ένα μήκος διαδρομής του 0,25 cm που αντιστοιχεί σε ένα όγκο 200 μι σε μια πλάκα 96 φρεατίων χρησιμοποιήθηκαν για να υπολογιστεί η συγκέντρωση του ρ-νιτροφαινόλης.

(γ) Απογλυκοζυλίωση του DBP με σφαιρίδια (1-3) β-D-γαλακτοσιδάση-αγαρόζης.

Απογλυκοζυλίωση της DBP έγινε χρησιμοποιώντας μια τροποποίηση της μεθόδου του Yamamoto

κ.ά.

[17]. DBP (Calbiochem, San Diego, CA) προστέθηκε σε τελική συγκέντρωση 0,05 mg /ml σε PBS ρΗ 6,0, 10 mM MgCl

2, με 0.007 U του (1-3) β-D-γαλακτοσιδάση-αγαρόζη και 0.004 U νευραμινιδάσης-αγαρόζη (Sigma, St. Louis) και ανακινήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 4 ώρες. Ο συνολικός όγκος της αντίδρασης ήταν 1 ml. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια καθιζάνουν με φυγοκέντρηση και απομακρύνθηκε. ΔΑΠ-MAF αποθηκεύτηκε σε κλάσματα στους -20 ° C.

ΔΑΠ-MAF πεπτίδιο

Ένα 14 αμινοξέων ΔΑΠ-MAF πεπτίδιο συντέθηκε (Ana Spec, Fremont, CA) με το αμινο οξύ ακολουθία: Ac-TPTELAKLVNKRSE. Καθαρότητα ήταν & gt?. 90%

καλλιέργειας κυττάρων

PC3M, PC3MLN4, τα κύτταρα LNCaP, και LNCaPLN3 ευγενικά από τον Dr. Curtis Pettaway και ο Δρ Ησαΐας J. Fidler (MD Anderson Cancer Κέντρο ). Η PC3M κυτταρική γραμμή απομονώθηκε από ηπατικές μεταστάσεις που παράγεται σε γυμνούς ποντικούς μετά από ενδοσπληνική ένεση του PC3 κυττάρων καρκίνου του προστάτη γραμμή ανδρογόνα αναίσθητη ανθρώπινο [18]. Τα μεταστατικά υποσειρές, PC3MLN και LNCaPLN, δημιουργήθηκαν από την έγχυση των πατρικών κυττάρων ορθοτοπικά στη ραχιαία λοβού του προστάτη γυμνών ποντικών και καλλιέργεια των κυττάρων που είχαν μετάσταση στον φρουρού (paraaortic) λεμφαδένα. Μετά από καλλιέργεια για 3-5 περάσματα, αυτά τα κύτταρα επανα-εγχέονται εντός του προστάτη της μετέπειτα γυμνών ποντικών. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε για 3 κύκλους για να δημιουργήσει την μεταστατική γραμμή, LNCaPLN3 και για τέσσερις κύκλους για να δημιουργήσει την μεταστατική γραμμή, PC3MLN4 [18]. Όλα τα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen) με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), πενικιλλίνη (100 U /mL) /στρεπτομυκίνη (100 μg /mL), και L-γλουταμίνη και επωάζονται στους 37 ° C, 10% CO

2.

η όξινη φωσφατάση χρωματομετρική δοκιμασία

Με το πέρας κάθε πειράματος, τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS, στη συνέχεια 450 μL του ρυθμιστικού διαλύματος όξινης φωσφατάσης (10 mM φωσφορικού ρ-νιτροφαινόλη, 0,1 Μ οξικό νάτριο, 0,1% Triton Χ-100, ρΗ 5,8) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 45 λεπτά. Πενήντα μΙ από 1 Ν ΝαΟΗ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για να σταματήσει η αντίδραση και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 405 nm [19], [20]. Ο αριθμός των κυττάρων του κάθε κυτταρικό τύπο βαθμονομήθηκε με απορρόφηση χρησιμοποιώντας ένα αιματοκυτταρόμετρο να διασφαλιστεί ότι τα επίπεδα όξινης φωσφατάσης συσχετίζεται γραμμικά με τον αριθμό των κυττάρων. Αναλύσεις και συνωμοτούν για όλες τις αναλύσεις έγιναν χρησιμοποιώντας Προέλευση Pro 8 (Northampton, ΜΑ).

δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης

δοκιμασίες Μετανάστευση πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ενός τροποποιημένου ένθετα καλλιέργειας Boyden θάλαμο Millicell (Millipore, Billerica, ΜΑ) με 8 μm πόρους [20] – [22]. Άνω μεμβράνες προ-επωάζονται όλη τη νύχτα με ινονεκτίνη (10 μg /ml σε PBS), το οποίο αναρροφάται από τα φρεάτια το επόμενο πρωί. Τα κύτταρα (150.000 κύτταρα /φρεάτιο) επιστρώθηκαν σε βασικό μέσο with.010% ζελατίνη με ή χωρίς DBP-MAF ή DBP. Μερικά φρεάτια δείγματος κηλιδώθηκαν κατά την ολοκλήρωση της περιόδου επώασης για να εξασφαλιστεί ότι η προσκόλληση των κυττάρων στους επάνω μεμβράνες ήταν ομοιόμορφη σε όλες τις συνθήκες. Βασικό μέσο προστέθηκε στα φρεάτια πυθμένα με ή χωρίς 10% FBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν για έξι ώρες στους 37 ° C, 10% CO

2. Κύτταρα που δεν μεταναστεύουν απομακρύνθηκαν από την κορυφή της μεμβράνης και τα μεταναστεύσει κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μία χρωματομετρική δοκιμασία φωσφατάσης οξέος.

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού

Καρκινικά κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen) με 10% FBS, πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και L-γλουταμίνη και επωάζονται στους 37 ° C, 10% CO

2. Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και προστέθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων (5000 κύτταρα /φρεάτιο) σε 0,5 mL μέσου καλλιέργειας. Τα κύτταρα στερούνται ορού επί μία νύκτα, στη συνέχεια, το μέσο αντικαταστάθηκε με RPMI 1640, 1% FBS, πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και L-γλουταμίνη και επωάζονται για 72 ώρες με ή χωρίς DBP-MAF ή DBP [23]. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα οξύ φωσφατάσης χρωματομετρική δοκιμασία [4], [23].

Η κυτταρομετρία ροής

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε περίπου 80% συρροή σε 100 mm

2 πιάτα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς DBP-MAF (1 μg /mL) και επωάστηκε στους 37 ° C για 48 ώρες. Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, φυγοκεντρήθηκαν, κατανέμονται σε δοκιμαστικούς σωλήνες και επισημαίνονται με αννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο χρησιμοποιώντας ένα κιτ ανίχνευσης απόπτωσης (APOAF, Sigma, St. Louis, ΜΟ). Annexin V και χρώση ΡΙ διεξήχθησαν σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός διαλογέα κυττάρων Cytomation MoFlo ακολουθώντας τις συστάσεις του κατασκευαστή.

αντίστροφη μεταγραφή και σε πραγματικό χρόνο αλύσου ποσοτικής αντίδρασης πολυμεράσης (RTQPCR)

Ολικό RNA εξήχθη από ανθρώπινα κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ αντιδραστήριο (Invitrogen) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RNase-free DNase (Ambion). ακεραιότητα και ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε μέσω ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 1% και οι συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν φασματοφωτομετρικά (NanoDrop 1000 Φασματοφωτόμετρο V3.7, ThermoFisher Scientific). Ολικό RNA (1 μ§) μεταγράφηκε αντίστροφα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24] χρησιμοποιώντας qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences). Τα προϊόντα RT (cDNA) ενισχύθηκαν με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR (Applied Biosystems 7900 HT Fast σύστημα πραγματικού χρόνου PCR) με το Power SYBR πράσινο Master Mix. Εκκινητές ολιγονουκλεοτιδίων ειδικό για την ανθρώπινη uPAR παραλλαγή 1 (Genebank ένταξη n ° NM-002659, μπροστά 5′-CAACGAGGGCCCAATCCT -3 ‘και αντίστροφη 5′-GTAACACTGGCGGCCATTCT -3’), uPAR παραλλαγή 2 (Genebank ένταξη n ° NM-001005376, προς τα εμπρός 5 «- CAACGAGGGCCCAATCCT -3 ‘και αντίστροφη 5′-CACTGGCGGCCATTCTG -3′), uPAR παραλλαγή 3 (Genebank ένταξη n ° NM-001005377, μπροστά 5’-GCCGTTACCTCGAATGCATT -3 ‘και αντίστροφη 5′-GGCCCCTCTCACAGCTCAT -3′), και 18S rRNA (προς τα εμπρός 5’-CGCAGCTAGGAATAATGGAATAGG-3 ‘και αντίστροφος 5′-GCCTCAGTTCCGAAAACCAA-3’) χρησιμοποιήθηκαν. Οι συνθήκες ποδηλασίας QPCR ήταν 50 ° C για 2 λεπτά, 95 ° C για 10 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους του προγράμματος ενίσχυσης δύο βαθμίδων (95 ° C για 15 s και 58 ° C για 1 λεπτό). Στο τέλος της ενισχύσεως, ανάλυση καμπύλης τήξης εφαρμόστηκε χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο διαχωρισμού από το σύστημα ανίχνευσης αλληλουχίας για τον αποκλεισμό της μόλυνσης με μη ειδική PCR προϊόντα. Τα προϊόντα PCR επιβεβαιώνεται επίσης από πηκτή αγαρόζης και έδειξαν μόνο μία συγκεκριμένη ζώνη του προβλεπόμενου μεγέθους. Για αρνητικούς ελέγχους, κανένα προϊόν RT χρησιμοποιήθηκαν ως μήτρες στην QPCR και καμία ζώνη ανιχνεύθηκε στο πήκτωμα.

Σχετική εκφράσεις γονιδίων στόχων καθορίστηκαν από την 2

-ΔΔCt μέθοδο [25]. Τα μη επεξεργασμένα κύτταρα επελέγησαν ως βαθμονομητές.

ανοσοαποτύπωσης

Ανοσοκηλίδωση διεξήχθη χρησιμοποιώντας μία τροποποίηση της μεθόδου του Besch

κ.ά.

[26]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 100 mm

2 πιάτα και αναπτύχθηκαν σε -80% συρροή, στη συνέχεια, άνευ ορού όλη τη νύκτα. Το μέσο αντικαταστάθηκε με RPMI (1% FBS). DBP ή DBP-MAF προστέθηκε στο αναφερόμενες συγκεντρώσεις. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ή 72 ώρες στους 37 ° C και στη συνέχεια υποβάλλονται σε λύση χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό HTG (20 mM HEPES, ρΗ 7.4,10% γλυκερόλη, 1% Triton Χ-100) και συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ξέστρο κυττάρων. Phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) προστέθηκε (100 μΜ). Τα προϊόντα λύσης διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας SDS-PAGE. Lanes ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ίσα πρωτεΐνη φόρτωσης (40 μg /λωρίδα). Τα επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας έναν BCA προσδιορισμό (Pierce, Rockford, IL). Συγκροτήματα μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF. Η μεμβράνη αποκλείστηκε επί μία νύκτα σε 10% κονιοποιημένο άπαχο γάλα και 0.10% Tween 20 σε PBS. Η μεμβράνη υβριδοποιήθηκε με ένα αντι uPAR αντίσωμα (Santa Cruz, CA), που ακολουθείται από υβριδισμό με ένα υπεροξειδάση αρμορακίας-συνδεδεμένο δευτερεύον αντίσωμα και κατέστησαν ορατά χρησιμοποιώντας χημειοφωταύγεια. Βινκουλίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Στατιστική ανάλυση

Η επίδραση της DBP-MAF ελέγχθηκε χωριστά για δοκιμασίες κυτταρική μετανάστευση και πολλαπλασιασμό. Μια μονόπλευρη t-test χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της στατιστικής σημαντικότητας των μειώσεων της ανάπτυξης του όγκου σε διάφορα επίπεδα. Ένα διπλής όψης Z-test χρησιμοποιήθηκε για να μετρηθεί η επίδραση του DBP-MAF στην απόπτωση ή νέκρωση. Όλες οι αναλύσεις έγιναν χρησιμοποιώντας την έκδοση του στατιστικού λογισμικού SAS 9.1 (SAS Institute, Cary, Βόρεια Καρολίνα) και ένα

P

-τιμή ≤0.01 χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό στατιστική σημαντικότητα.

Αποτελέσματα

DBP-MAF αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων του όγκου

εισβολή και τη μετανάστευση των κυττάρων του όγκου είναι σημαντικά βήματα στην ανάπτυξη και μετάσταση όγκου. DBP-MAF δοκιμάστηκε για την επίδρασή του στην κυτταρική μετανάστευση σε τέσσερις όγκου γραμμών-δύο γραμμές γονική του καρκίνου του προστάτη (LNCaP και PC3M) και δύο μεταστατικές κλώνοι από αυτές τις γραμμές (LNCaPLN3 και PC3MLN4), χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο θάλαμο Boyden. Το βασικό επίπεδο της μετανάστευσης μεταξύ κάθε γονική γραμμή και οι αντίστοιχες μεταστατικό κλώνο του παρέμεινε αμετάβλητη. Σε όλες τις δόσεις που δοκιμάστηκαν, η αναστολή της μετανάστευσης παρατηρήθηκε (Σχήμα 1).

LNCaP (Α), LNCaPLN3 (Β), προστέθηκαν (D) κύτταρα PC3M (C) ή PC3MLN4 (150,000 /φρεάτιο) για το κορυφή θάλαμο ενός τροποποιημένου θαλάμου Boyden (+/- DBP-MAF) με 10% FBS στον κάτω θάλαμο. Μετά από 6 ώρες τα κύτταρα αφαιρέθηκαν που δεν είχαν μεταναστεύσει και τα υπόλοιπα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία όξινης φωσφατάσης. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν για τον έλεγχο. Τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές και λάθους εμφανίζεται ως +/- SD. Σε σύγκριση με την ανάπτυξη των κυττάρων χωρίς DBP-MAF, προσθέτοντας DBP-MAF είχε μια στατιστικά σημαντική συνολική μείωση της κυτταρικής μετανάστευσης κατά 30% (p = 0,0003) για τα συνδυασμένα τέσσερις τύπους καρκινικών κυττάρων. Ατομική σημαντικά ποσοστά μείωσης βρέθηκαν με κάθε έναν από αυτούς τους τύπους καρκινικών κυττάρων. Σε σύγκριση με τον έλεγχο, τη σημαντική μείωση παρατηρήθηκε με DBP-MAF στο (Α) 20% Ρ = 0,0022 (Β) 20% Ρ = 0.0029 (C) 10% Ρ = 0.0045 (D) 30% Ρ = 0,0094. n = 3.

Η

Μια DBP-MAF πεπτίδιο αναστέλλει όγκου κυτταρική μετανάστευση

Η προετοιμασία της ΔΑΠ-MAF περιλαμβάνει ενζυματικές διαδικασίες πολλαπλών βημάτων. Η επιλεκτική απογλυκοζυλίωση είναι ένα απαραίτητο βήμα στη διαδικασία, επειδή η έκφραση της ΔΑΠ-MAF στο E. coli παρήγαγε μια πρωτεΐνη με καμία δραστηριότητα [4]. Μια δραστική αλλά πιο εύκολα τυποποιούνται εκδοχή του μορίου θα καθιστούσε την παραγωγή του DBP-MAF ευκολότερη και λιγότερο δαπανηρή. Για τους λόγους αυτούς ένα πεπτίδιο DBP-MAF συντέθηκε χρησιμοποιώντας μια ακολουθία από το μητρικό μόριο που είχε δείξει δραστηριότητα σε άλλες μελέτες [27]. Το πεπτίδιο ελέγχθηκε για να προσδιοριστεί το δυναμικό της να αναστέλλει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, το πεπτίδιο έδειξε σημαντική ικανότητα να αναστέλλουν τη μετανάστευση του συνόλου των γραμμών όγκου. Η ανασταλτική επίδραση δεν αυξάνεται σε υψηλότερες δόσεις, γεγονός που υποδηλώνει του IC

50 ήταν χαμηλότερη από το εύρος δόση που έχει δοκιμασθεί.

LNCaP (Α), LNCaPLN3 (Β), PC3M (C) ή PC3MLN4 (D) κύτταρα προστέθηκαν (150,000 /φρεάτιο) στον άνω θάλαμο ενός τροποποιημένου θαλάμου Boyden (+/- DBP-MAF) με 10% FBS στον κάτω θάλαμο. Μετά από 6 ώρες τα κύτταρα αφαιρέθηκαν που δεν είχαν μεταναστεύσει και τα υπόλοιπα κύτταρα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία όξινης φωσφατάσης. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν για τον έλεγχο. Τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές και λάθους εμφανίζεται ως +/- SD. Σε σύγκριση με τη μετανάστευση χωρίς DBP-MAF, προσθέτοντας DBP-MAF είχαν μια στατιστικά σημαντική μείωση της μετανάστευσης κατά 40% (Ρ & lt? 0,0001) για τον συνδυασμό όλων των τεσσάρων τύπων κυττάρων όγκου. Ατομική σημαντικά ποσοστά μείωσης βρέθηκαν με κάθε έναν από αυτούς τους τύπους καρκινικών κυττάρων. Σε σύγκριση με τον έλεγχο, σημαντική μείωση παρατηρήθηκε με DBP-MAF στο σημείο (A) 30% P = 0.0038 (Β) 40% P = 0.0016 (C) 20% P = 0.0038 (D) 40% P = 0.0005. n = 3.

Η

ΔΑΠ-MAF αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων

Οι τέσσερις κυτταρικές σειρές στη συνέχεια ελέγχθηκαν για να προσδιοριστεί η ευαισθησία τους σε DBP-MAF σε μελέτες διάδοσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, DBP-MAF στο 1 μg /mL μειωμένη πολλαπλασιασμό στα αρχικά επίπεδα ή κάτω σε όλες τις κυτταρικές γραμμές με την εξαίρεση του PC3M. Ήταν ενδιαφέρον ότι, αν και τα κύτταρα PC3M δεν ήταν ευαίσθητα στην DBP-MAF σε αυτή τη δοκιμασία, η μεταστατική κλώνος PC3MLN4 είχαν αναπτύξει ευαισθησία σε αυτό.

LNCaP (Α), LNCaPLN3 (Β), PC3M (C) ή PC3MLN4 (D) κύτταρα σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων όλη τη νύκτα, στη συνέχεια, μέσο +/- DBP-MAF προστέθηκε με 1% FBS. Μετά από 72 ώρες τα κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία όξινης φωσφατάσης. Τα αποτελέσματα κανονικοποιήθηκαν για τον έλεγχο. Τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον τρεις φορές και λάθους εμφανίζεται ως +/- SD. Σε σύγκριση με τον έλεγχο, σημαντική μείωση παρατηρήθηκε με DBP-MAF στο σημείο (A) 50% P = 0.0001 (Β) 50% P = 0.0001 (C) καμία σημαντική μείωση (D) 40% P = 0.0073. n = 3.

Η

Σε 1 μg /mL, DBP-MAF είχαν μια στατιστικά σημαντική μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης κατά 40% (Ρ = 0.0073) για το συνδυασμό όλων των τύπων κυττάρων όγκου. Ατομική σημαντικά ποσοστά μείωσης (χωρίς DBP-MAF VS.1 Πίνακας μg /ml) βρέθηκαν επίσης μεταξύ αυτών των τύπων καρκινικών κυττάρων εκτός PC3M στην οποία δεν διαπιστώθηκε σημαντική μείωση (Σχήμα 3).

μελέτες διάδοσης χρησιμοποιώντας την DBP- MAF πεπτίδιο δεν έδειξε μείωση σε πολλαπλασιασμό με οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό υποδηλώνει ότι η ικανότητα να αναστέλλουν μετανάστευση και πολλαπλασιασμό μπορούν να διαμένουν σε διαφορετικές περιοχές της πρωτεΐνης και ότι αυτή η πεπτιδική αλληλουχία μπορεί να έχει κανένα ρόλο στην αναστολή του πολλαπλασιασμού. Είναι επίσης δυνατόν ότι η περιοχή υπεύθυνη για την πλήρη DBP-MAF δραστηριότητα είναι πιο πολύπλοκη και απαιτεί τη επιλεκτικά απογλυκοζυλιωμένη αλληλουχία της πρωτεΐνης να είναι παρόντες.

Για να καθοριστεί εάν η αναστολή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων οφείλεται σε κυτταρικό θάνατο ή απόπτωση, κυτταρομετρία ροής ανάλυση έγινε χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο και αννεξίνης V δείκτες. Αυτές οι μελέτες έδειξαν καμία ένδειξη είτε σημαντικής κυτταρικού θανάτου ή τοξικότητας που προκύπτουν από DBP-MAF κατεργασμένων κυττάρων (Πίνακας 1) και, με εξαίρεση την PC3M γονική γραμμή, έδειξαν μια μείωση.

Η

RT-PCR δείχνει μείωση της έκφρασης του uPAR σε κύτταρα κατεργασμένα με DBP-MAF

Η έκφραση του υποδοχέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου ουροκινάσης (uPAR) έχει δειχθεί ότι συσχετίζεται με αυξημένη μετάσταση σε κύτταρα όγκου [28] – [30] και με αντοχή φαρμάκου [31] (για ανασκόπηση βλέπε [32]). RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε όλους τους κυτταρικούς τύπους χρησιμοποιώντας τρεις γνωστές ισομορφές των προδρόμων υΡΑΚ, συμπεριλαμβανομένου του διαλυτού υποδοχέα, ισομορφή 2 (βλέπε Μέθοδοι). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4D, μειωμένη έκφραση RNA παρατηρήθηκε για LNCaPLN3 παρουσία DBP-MAF τόσο σε 0,001 και 1 μg /mL του DBP-MAF τόσο για uPAR1 και ισομορφές uPAR2. Οι ισομορφές uPAR2 και uPAR3 έδειξε παρόμοια μείωση της έκφρασης με τη θεραπεία DBP-MAF των κυττάρων PC3M. Είναι ενδιαφέρον ότι, αν και τα κύτταρα PC3MLN4 δεν έδειξε σημαντική απόκριση σε DBP-MAF (Σχήμα 5D), υπήρξε μια στατιστικά σημαντική μείωση του uPAR2 με DBP στο 1 μg /mL. Σε σχεδόν όλες οι συνθήκες που εξετάστηκαν, μετά από 72 ώρες τα επίπεδα υΡΑΚ επανήλθαν εις τις συγκριτικές τιμές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Το πεπτίδιο ελέγχθηκε επίσης χρησιμοποιώντας την κυτταρική γραμμή (LNCaPLN3), που ήταν ενεργός σε όλες τις δοκιμασίες και (PC3M), που ήταν ενεργός σε μετανάστευση, αλλά όχι σε πολλαπλασιασμό. Δεν έδειξαν σημαντική μεταβολή σε καμία από τις επιπέδων ισομορφής uPAR με το πεπτίδιο (Εικόνα 6Α και 6Β). Οι γραμμές όγκου στη συνέχεια ελέγχθηκαν για να παρατηρηθεί η επίδραση του DBP-MAF για έκφραση uPAR στο πρωτεϊνικό επίπεδο. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά ανοσοστυπώθηκαν 24 ώρες και τα προϊόντα λύσης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, DBP-MAF δεν ανέστειλε την έκφραση του uPAR σε οποιεσδήποτε κυτταρικές σειρές μετά από 24 ώρες (Εικόνα 7Α), ωστόσο μια μείωση παρατηρήθηκε μετά από 72 ώρες μόνο στα κύτταρα LNCaPLN3 (Σχήμα 7Β). κύτταρα κατεργασμένα DBP έδειξαν καμία σημαντική αλλαγή στην έκφραση του υποδοχέα.

LNCaP και LNCaPLN3, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DBP ή DBP-MAF (0,001 και 1 μg /mL) και επωάστηκαν για 24 ώρες και στη συνέχεια συλλέγεται. προϊόντα RT (cDNA), που αναγνωρίζεται ως uPAR1, 2, και 3, ενισχύθηκαν με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR.

Η

PC3M, και τα κύτταρα PC3MLN4 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με DBP ή DBP-MAF (0.001 και 1 μg /mL) και επωάστηκαν για 24 ώρες και στη συνέχεια συλλέγεται. προϊόντα RT (cDNA), που προσδιορίζονται ως uPAR1, 2, και 3, ενισχύθηκαν με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR. ρ & lt?. 0.05

Η

LNCaPLN3 (Α) και τα κύτταρα PC3M (Β) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DBP ή DBP-MAF (0,001 και 1 μg /mL) και επωάστηκαν για 24 ώρες και στη συνέχεια συλλέγεται. προϊόντα RT (cDNA), που προσδιορίζονται ως uPAR1, 2, και 3, ενισχύθηκαν με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR. ρ & lt?. 0.05

Η

LNCaP, LNCaPLN3, PC3M, και PC3MLN4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DBP ή DBP-MAF και επωάστηκαν για 24 ώρες (Α) στη συνέχεια συγκομίζονται και ανοσοαποτύπωση χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι-uPAR. κύτταρα LnCaPLN3 στις 72 ώρες (Β). p & lt?. 0.05

Η

Συζήτηση

Η σύνδεση με τις πρωτεΐνες DBP-MAF βιταμίνης D, έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει τόσο την ανάπτυξη του όγκου και των αιμοφόρων αγγείων. Έχουμε αποδείξει εδώ, για πρώτη φορά, μια άμεση επίδραση επί κυττάρων καρκίνου του προστάτη απουσία μακροφάγων, αυξάνοντας το πεδίο εφαρμογής της DBP-MAF πέραν ήδη αποδείξει αντιαγγειογενετική και ανοσο-ρυθμιστική χαρακτηριστικά της. DBP-MAF κατέδειξε ισχυρή αναστολή τόσο πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων του όγκου.

Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί η απόκριση των γονικών κυττάρων PC3M σε σύγκριση με το μεταστατικό κλώνο. κύτταρα PC3M δεν δείχνουν ευαισθησία σε DBP-MAF σε δοκιμασίες πολλαπλασιασμού, αλλά η μετανάστευση τους ανεστάλη από DBP-MAF. Υπήρξε μια μείωση της έκφρασης uPAR όπως ανιχνεύεται με RT-PCR, αλλά η έκφραση της πρωτεΐνης του uPAR ισοτύπων δοκιμάστηκε εμφανίστηκε αμετάβλητη. Τέλος, DBP-MAF προκάλεσε μικρή αύξηση στην απώλεια λόγω απόπτωσης ή νέκρωσης (Πίνακας 1), ενώ οι άλλες κυτταρικές σειρές καταδείξει μειωμένη απόπτωση ή νέκρωση. Η μεταστατική κλώνος PC3MLN4 εμφάνισε μια ισχυρή απόκριση στη θεραπεία τόσο πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση, ακόμη και σε χαμηλή δόση (1 ng /mL), αλλά δεν έδειξε μείωση στην έκφραση uPAR είτε στο mRNA ή το επίπεδο της πρωτεΐνης. Πρόσθετες μελέτες πολλαπλασιασμού έγιναν για να καθοριστεί αν η διαφορά στην απόκριση μεταξύ των γονικών και μεταστατικών κλώνος οφειλόταν σε γενική αλλαγή στην ευαισθησία των κυττάρων. Calcitriol έδειξε ισχυρή και συνεκτική αναστολή μεταξύ όλων των τύπων κυττάρων εντός ταυτόσημες περιοχές δόσεων. PC3M και PC3MLN4 κύτταρα ελέγχθηκαν επίσης με ετοποσίδη και τις απαντήσεις τους ήταν παρόμοια (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι ο κλώνος μεταστατικό αποκτήθηκε ευαισθησία σε DBP-MAF ότι η γονική γραμμή δεν αποδεικνύει. Η επίδραση της DBP-MAF επί κυττάρων που προκαλείται PC3MLN4 τα υψηλότερα ποσοστά σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης σε σύγκριση με τις άλλες κυτταρικές σειρές. Μελέτες έδειξαν όλα καρκινικές κυτταρικές σειρές να είναι ευαίσθητα σε DBP-MAF σε προσδιορισμούς μετανάστευσης.

Οι παρατηρήσεις μας στην καλλιέργεια αυτών των κυττάρων ήταν ότι τα μεταστατικά κλώνοι τόσο του PC3M και LNCaP ήταν πιο ευαίσθητα σε θρυψινοποίηση από τα γονικά γραμμές. Πολλοί παράγοντες μπορεί να ρυθμίζει τη μετανάστευση των κυττάρων και παρόλο uPAR είναι μια πιθανή μεσολαβητής, μπορεί να μην είναι ο μοναδικός μηχανισμός μέσω του οποίου DBP-MAF αναστέλλει τη μετανάστευση. Το πεπτίδιο ήταν αποτελεσματική σε μελέτες μετανάστευση, αλλά δεν έδειξαν ικανότητα να επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό ή την έκφραση uPAR. Δεδομένου ότι το πεπτίδιο αντιπροσωπεύει μόνο ένα μέρος της πρωτεΐνης δεν διαθέτει όλες τις περιοχές του φυσικού DBP-MAF, όπως η περιοχή πρόσδεσης βιταμίνης D. Είναι πιθανό ότι η ικανότητα να ρυθμίζει τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό κατοικεί σε ξεχωριστές περιοχές της πρωτεΐνης. Παρά το γεγονός ότι όλες οι κυτταρικές γραμμές ανταποκρίθηκαν σε DBP-MAF σε μία ή περισσότερες από τις δοκιμασίες, μόνο LNCaPLN3 κατέδειξε μείωση του επιπέδου της πρωτεΐνης uPAR. Είναι δυνατόν, ωστόσο, ότι το αντίσωμα δεν αναγνωρίζει όλες τις ισομορφές του υΡΑΚ.

Είναι πλέον κοινώς αποδεκτό ότι το μικροπεριβάλλον του όγκου, και όχι μόνο το κύτταρο όγκου μόνο, αντιπροσωπεύει μια αποτελεσματική στόχο για θεραπεία. Εκτός από την έρευνα των επιδράσεων κατά του όγκου, η μέθοδος παράδοσης αυτών των φαρμάκων που διερευνώνται. Η βιοδιαθεσιμότητα είναι ένα κρίσιμο στοιχείο κάθε θεραπευτικής στρατηγικής. Κακή απορρόφηση, εσωτερίκευση, μικρό χρόνο ημιζωής σε κυκλοφορία, καθώς και μια σειρά από άλλες ελλείψεις μπορεί να κάνει μια θεραπεία που έχει δείξει μεγάλη υπόσχεση

in vitro

, αναποτελεσματική στην κλινική. Η αποτελεσματική

in vivo

δόσεις για DBP-MAF (pg-ng) έχουν την τάση να είναι χαμηλότερη από το

in vitro

δόσεις (εύρος ng-μα) [4], [6] – [10]. Ίσως αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι από πολλαπλούς μηχανισμούς της δραστηριότητάς της. Η δυνατότητα να επηρεάσουν την ανάπτυξη των αιμοφόρων αγγείων και την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, καθώς διεγείρει μια ισχυρή ανοσολογική απόκριση μέσω της ενεργοποίησης μακροφάγων είναι δύσκολο να μετρηθεί

στο σύνολό

χρησιμοποιώντας το

in vitro

προσεγγίσεις. Κάνουν, όμως, παρέχει έναν τρόπο για να χαρακτηρίσει αυτά τα αποτελέσματα ξεχωριστά.

Η επίδραση της ΔΑΠ-MAF θεραπεία για την έκφραση του uPAR στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη ήταν προηγουμένως άγνωστη. έκφραση uPAR έχει συσχετιστεί με μετάσταση όγκου σε ένα αριθμό όγκων [26], [28] – [30], [32]. Μελέτες οισοφάγου όγκων έδειξε ΡΑΙ-1 και υΡΑ εκφράστηκαν σε όλη τους όγκους, αλλά όχι σε φυσιολογικό οισοφαγικό ιστό και ότι υΡΑΚ εκφράστηκε στα σύνορα του όγκου [33], [34]. Μια σύνδεση μεταξύ του καρκίνου του παγκρέατος και υΡΑ έχει αποδειχθεί, η οποία θα μπορούσε να εξηγήσει την ισχυρή επίδραση της ΔΑΠ-MAF σε προηγούμενες μελέτες του παγκρέατος καρκινικών μας [33].

Η σχέση μεταξύ των πλασμίνη που σχετίζονται πρωτεΐνες ΡΑΙ-1, υΡΑ και uPAR είναι πολύπλοκη [35]. Αν και ΡΑΙ-1 αναστέλλει την έκφραση του υΡΑ, η οποία θα θεωρείται ότι αναστέλλουν την εξέλιξη του όγκου, ΡΑΙ-1 προάγει επίσης την ανάπτυξη του όγκου και την αγγειογένεση μόνο του [36], [37]. Με αυτή την έννοια, μια θεραπεία η οποία θα εξασθενούν έκφραση uPAR χωρίς να προωθούν την ανάπτυξη του όγκου θα ήταν πολύτιμη. Δεδομένου ότι η μετάσταση είναι η κύρια αιτία θανάτου σε ασθενείς με καρκίνο, uPAR ευαισθησία σε DBP-MAF μπορεί να αντιπροσωπεύει μια ελκυστική λεωφόρος για περαιτέρω μελέτη.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελα να ευχαριστήσω Jayakrishna Ambati και Royce Mohan για τις χρήσιμες συζητήσεις τους.