Αφηρημένο

Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) είναι ικανά για συνεχή πολλαπλασιασμό και την αυτο-ανανέωσης και πρότεινε να παίξει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση , ανάπτυξη όγκου, μετάσταση και υποτροπή του καρκίνου. Τα ΚΕΠ θεωρούνται προέρχονται από φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων που πλήττονται από την μικροπεριβάλλον του όγκου αν και ο μηχανισμός της ανάπτυξης δεν είναι ακόμη σαφές. Το 2007, η ομάδα του Yamanaka κατάφεραν να παράγουν

Nanog

ποντίκι επαγόμενα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (MIPS), στην οποία πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) έχει εισαχθεί στο 5′-αμετάφραστη περιοχή του

Nanog

γονίδιο. Συνήθως, τα κύτταρα iPS, ακριβώς όπως τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, θεωρούνται ότι επάγονται σε προγονικά κύτταρα, τα οποία διαφοροποιούνται σε διάφορους φυσιολογικούς φαινοτύπους, ανάλογα με την κανονική θέση. Υποθέσαμε ότι ΚΕΠ θα μπορούσε να προέρχεται από

Nanog

MIPS κύτταρα στο ρυθμισμένο μέσο καλλιέργειας κυτταρικών σειρών καρκίνου, η οποία είναι ένα μιμητικό του μικροπεριβάλλοντος καρκινώματος. Ως αποτέλεσμα, τα κύτταρα Nanog MIPS κατεργασία με το ρυθμισμένο μέσο από καρκίνωμα πνεύμονος ποντικού Lewis επίκτητα χαρακτηριστικά των ΚΕΠ, με την έννοια ότι σχηματίζεται σφαιροειδή εκφράζουν GFP σε καλλιέργεια εναιωρήματος, και είχε ένα υψηλό ογκογονικότητα σε Balb /c γυμνών ποντικών που εμφανίζουν αγγειογένεση in vivo. Επιπλέον, αυτά τα iPS που προέρχονται ΚΕΠ είχε χωρητικότητα της αυτο-ανανέωσης και εξέφρασε την γονίδια-δείκτες,

Nanog

,

Rex1

,

Εποχές

,

Esg1

και

Cripto

, που σχετίζονται με τις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων και μια αδιαφοροποίητη κατάσταση. Έτσι καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι ένα μοντέλο ΚΕΠ αναπτύχθηκε αρχικά από τα κύτταρα MIPS και πρότεινε το προσαρμοσμένο μέσο καλλιέργειας των καρκινικών κυτταρικών σειρών μπορεί να εκτελέσει ως θέση για την παραγωγή ΚΕΠ. Το μοντέλο των ΚΕΠ και η διαδικασία εγκατάστασης τους θα βοηθήσει να μελετήσει τις γενετικές αλλοιώσεις και τις εκκρίνονται παράγοντες στο μικροπεριβάλλον του όγκου που μετατρέπουν MIPS κύτταρα σε ΚΕΠ. Επιπλέον, ο εντοπισμός δυνητικά καλόπιστων δείκτες των ΚΕΠ, η οποία θα βοηθήσει στην ανάπτυξη νέων θεραπειών κατά του καρκίνου, μπορεί να είναι δυνατή αν το μοντέλο CSC

Παράθεση:. Chen L, Κασάι Τ, Li Υ, οι Sugü Υ, Jin G, Okada M, et al. (2012) Ένα μοντέλο καρκινικά βλαστικά κύτταρα που προέρχονται από το ποντίκι επαγόμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα. PLoS ONE 7 (4): e33544. doi: 10.1371 /journal.pone.0033544

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, City of Hope Εθνικό Ιατρικό Κέντρο και Beckman Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 Σεπτέμβρη, 2011? Αποδεκτές: 10 του Φεβ 2012? Δημοσιεύθηκε: 12 Απριλίου, 2012

Copyright: © 2012 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Grant-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (Β) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (Νο 21300179, https://www.waseda.jp/rps/en/manual/kakenhi_honbun.html), και από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Key Πρόγραμμα, Grant Νο 30930038, https://www.nsfc.gov.cn/e_nsfc/desktop/zn/0101.htm). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μια σειρά από μελέτες έχουν προσπαθήσει να προσδιορίσουν των μηχανισμών που διέπουν την ανάπτυξη κακοήθους όγκου και της προόδου. Παρά τη σημαντική πρόοδο, οι περισσότερες θεραπευτικές προσεγγίσεις αποτυγχάνουν να εξαλειφθούν όλα τα καρκινικά κύτταρα. Τα υπόλοιπα κύτταρα όγκου συχνά να οδηγήσει στην επανεμφάνιση και μετάσταση. Πρόσφατα, η υπόθεση της καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) προτάθηκε για να εξηγήσει την προέλευση των καρκινικών κυττάρων. Εξ ορισμού, ΚΕΠ είναι ένα μικρό κλάσμα των κυττάρων του όγκου με την ικανότητα των δύο αυτο-ανανέωση και απεριόριστη αργή διάδοση. Συχνά είναι ανθεκτικοί σε χημειοθεραπεία και ακτινοβολία και ως εκ τούτου είναι υπεύθυνα για τη συνεχή παροχή νέων καρκινικών κυττάρων [1]. Μια τρέχουσα προβολή του μοντέλου ΚΕΠ θεωρείται ότι τα ενήλικα βλαστικά κύτταρα, αρχέγονα κύτταρα, ή διαφοροποιημένα κύτταρα μπορεί να αποκτήσει τις πολλαπλές γενετικές και επιγενετικές αλλαγές που απαιτούνται για να γίνει ΚΕΠ που εμπλέκονται στην προώθηση και διατήρηση της ογκογένεσης. Αυτό το καρκινικό κύτταρο-κίνηση μπορεί να έχουν ορισμένα κοινά χαρακτηριστικά με ενήλικα βλαστικά κύτταρα που κατοικούν στο όργανο, στο οποίο προκύπτουν, είτε επειδή τα όργανα και τους ιστούς προέρχονται από κάτοικο βλαστικά κύτταρα ή γιατί τα βλαστοκύτταρα συγκεντρώνονται από τις ιδιότητες των θέσεων τους [2]. Στο πλαίσιο αυτό, τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να επανέλθει επιγενετικώς να συγκεκριμένο ιστό βλαστικών κυττάρων όταν μεταμοσχεύονται σε ένα κανονικό κόγχη βλαστοκυττάρων [3] – [6]

Είναι γνωστό ότι το μικροπεριβάλλον μπορεί να ασκήσει βαθιά γενετική ή επιγενετική. συνέπειες για τα βλαστικά κύτταρα μέσω αλληλεπιδράσεων μεταξύ των κυττάρων, ή μέσω παραγόντων που προέρχεται από κύτταρα που προέρχονται από τα γύρω κύτταρα εντός της κόγχης. Αυτές οι επιδράσεις μπορεί να είναι παροδικές, όπως φαίνεται στην ενεργοποίηση σηματοδοτικών οδών που ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση, ή μπορούν να συνδέονται με πιο σταθερό τροποποιήσεις, όπως προσδιορισμός και η διαφοροποίηση των κυττάρων μοίρα [7]. Δεδομένου τον κρίσιμο ρόλο του μικροπεριβάλλοντος στην κυτταρική ρύθμιση, αρκετές μελέτες έχουν δείξει πρόσφατα ότι η εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων μικροπεριβάλλον θα μπορούσε να έχει σημαντική επίδραση στις φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των επιθετικών καρκινικών κυττάρων [8] – [10]. Ωστόσο, ως προς το αν το ογκογόνο μικροπεριβάλλον μπορεί να επηρεάσει την τύχη των βλαστικών κυττάρων δεν έχει ερευνηθεί επαρκώς.

Το 2007, η ομάδα του Yamanaka [11] κατόρθωσαν να παράγουν

Nanog

MIPS κύτταρα από ρετροϊική μεταγωγή των τεσσάρων μεταγραφικών παραγόντων (

οκταμερές 3/4

(

Οκτώβριος 3/4

),

SRY κουτί που περιέχει το γονίδιο 2

(

Sox2

),

Kruppel μοιάζει με συντελεστή 4

(

Klf4

) και

C-myc

) σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού (ΥΠΟΙΟ). GFP εκφράστηκε σταθερά σε αυτά τα κύτταρα, αλλά η έκφραση GFP έσβησε όταν αυτά τα κύτταρα επάγονται προς διαφοροποίηση. Μέχρι σήμερα, τα κύτταρα MIPS έχουν επιτυχώς διαφοροποιούνται σε διάφορους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των αιμοποιητικών και ενδοθηλιακών κυττάρων [12], νευρικά κύτταρα [13], καρδιακά κύτταρα [14] και παγκρεατικά β-κύτταρα [15]. Παρά αυτές τις επιτυχημένες εκθέσεις των in vitro διαφοροποίηση, τα κύτταρα iPS δεν είναι απολύτως κατάλληλα για μεταμόσχευση σε ασθενείς. Το κύριο ζήτημα είναι ανησυχίες για την ασφάλεια στο ότι τα κύτταρα iPS τείνουν να σχηματίζουν τερατώματα και έχουν κίνδυνο κακοήθους μετασχηματισμού [16] – [18]. Με βάση τη θεωρία ΚΕΠ, εμείς εξεταστεί αν ΚΕΠ μπορεί να προέρχεται από κύτταρα MIPS μετά την έκθεση σε ένα μικροπεριβάλλον του όγκου (Σχ. 1).

κύτταρα MIPS πρέπει να προκαλείται σε ορισμένα είδη των προγονικών κυττάρων, όπως τα αιμοποιητικά κύτταρα και νευρικά βλαστοκύτταρα, να διαφοροποιούνται σε διάφορους φαινοτύπους, όπως μακροφάγων, μονοκυττάρων, νευρικά κύτταρα, καρδιακά κύτταρα και τα παγκρεατικά β- κύτταρα, όταν εκτίθενται στην κανονική θέση. Υποθέσαμε ότι τα ΚΕΠ μπορούν επίσης να προέρχονται από κύτταρα MIPS μόνο όταν η έκθεση σε κακοήθη θέση.

Η

Αποτελέσματα

Τα κύτταρα MIPS καλλιεργούνται σε ρυθμισμένα μέσα από κυτταρικές σειρές καρκίνου έδειξαν ογκογενετικότητας και αγγειογένεσης

in vivo

Η

σε αυτή τη μελέτη, σχεδιάσαμε δύο διαδικασίες για τη θεραπεία κύτταρα MIPS. κύτταρα MIPS καλλιεργήθηκαν χωρίς τροφοδοτικά κύτταρα σε ένα μίγμα μέσου MIPS και ρυθμισμένο μέσο που λαμβάνεται από τις ακόλουθες κυτταρικές σειρές καρκίνου ποντικού: Lewis καρκίνωμα του πνεύμονα (LLC), ποντίκι εμβρυϊκό καρκίνωμα (Ρ19), μελάνωμα ποντικού (Β16) και καρκίνωμα μαστού ποντικού (MC .E12) για 4 εβδομάδες. κύτταρα MIPS καλλιεργήθηκαν υπό αυτές τις συνθήκες ονομάζεται MIPS-LLCcm, MIPS-P19 cm, MIPS-Β16 cm και cm κύτταρα MIPS-MC.E12 αντίστοιχα. κύτταρα MIPS επίσης καλλιεργήθηκαν με κάθε καρκινική κυτταρική σειρά που είχαν προηγουμένως υποβληθεί σε θεραπεία με μιτομυκίνη C ως τροφοδοτικά κύτταρα για 4 εβδομάδες. Αυτά τα MIPS κύτταρα ονομάζονται MIPS-LLCc, MIPS-P19c, MIPS-B16c και τα κύτταρα MIPS-MC.E12c αντίστοιχα. Τα κύτταρα MIPS που είχαν καλλιεργηθεί με ή χωρίς τροφοδοτικά κύτταρα υπό τις διαφορετικές συνθήκες στη συνέχεια μεταμοσχεύθηκαν σε γυμνούς ποντικούς. Μετά από 4 εβδομάδες, τα κύτταρα MIPS σχηματίζεται τυπικά τερατώματα που περιείχε διαφοροποιημένους ιστούς χωρίς μετάσταση (Εικ. S1 Α). Σε αντίθεση, τα αλλομοσχεύματα ποντίκι κυττάρων MIPS που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με κύτταρα ρυθμισμένα μέσα, MIPS-LLCcm, MIPS-P19 cm, MIPS-Β16 cm και MIPS-MC.E12 cm, σχηματίζεται αδιαφοροποίητα καρκινώματα που κατείχε κύτταρα με υψηλό λόγο πυρήνα προς κυτόπλασμα , πυρηνική πλειομορφία, παρεκκλίνοντα υψηλά ποσοστά μιτωτικής, και πολλαπλές παθολογικές αριθμητικά μιτωτικής (Σχ. 2Α και S1B). Από την άλλη πλευρά, μόνο MIPS-MC.E12c κυττάρων στην ομάδα που σχηματίζεται συγκαλλιέργειας κακοηθών όγκων (Σχ. S1B). Η ογκογονικότητα των διαφορετικών κυττάρων συνοψίζεται στον Πίνακα 1. Είναι αξιοσημείωτο ότι μόνο οι όγκοι που προέρχονται από κύτταρα MIPS-LLCcm έδειξε χαρακτηριστικά της αγγειογένεσης και μικρομεταστάσεων (Εικ. 2Α).

(Α) Ιστολογία του MIPS -LLCcm κύτταρα που προέρχονται όγκου. Ο όγκος επέδειξε κακοήθη φαινότυπο με αδενικό επιθηλιακή υπερπλασία (αστερίσκος), η υψηλή λόγο πυρήνα προς κυτόπλασμα, σοβαρή πυρηνική ατυπία και πολλαπλές παθολογικές μιτωτικά σχήματα (κεφαλές βέλους, ένθετο) (επάνω αριστερά)? μικρομεταστάσεων (βέλος, πάνω δεξιά)? και υπεραγγείωση ενδεικτικό της αγγειογένεσης (κάτω αριστερά) με χρώση HE. Η θετική του CD31 (μονοκλωνικό αντίσωμα αρουραίου, καφέ) με χρώση IHC έδειξε πολλαπλές αγγειακές αγγείων στον όγκο (κάτω δεξιά). Ράβδοι κλίμακας: 100 μm (επάνω αριστερά και κάτω), 50 μm (πάνω δεξιά). (Β) Δημοτικό πολιτισμό που προέρχεται από MIPS-LLCcm όγκου. Η κύρια καλλιέργεια εμφάνισε βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν (αστερίσκος στο πάνω αριστερά) που εκφράζουν GFP (επάνω δεξιά) και παρόμοια με ινοβλάστη κύτταρα (βέλος στην επάνω αριστερά) χωρίς έκφραση GFP (επάνω δεξιά). Σφαιροειδές κύτταρα που αναπτύχθηκαν από την πρωτεύουσα καλλιέργεια σε εναιώρημα (μέσα αριστερά) με έκφραση GFP (μεσαία δεξιά). Τα κύτταρα σφαιροειδές τοποθετήθηκαν πίσω στο προσκολλημένα καλλιέργεια διατηρείται βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν (αστερίσκος στο κάτω αριστερά) με έκφραση GFP (κάτω δεξιά) και παρόμοια με ινοβλάστη κύτταρα (βέλος στην κάτω αριστερά) χωρίς έκφραση GFP (κάτω δεξιά). (C) χρώση ανοσοφθορισμού για Nanog και Οκτώβριο 3/4 στο σφαιροειδές κύτταρα. Κατεψυγμένες τομές του σφαιροειδούς κύτταρα βάφτηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα (Rabbit anti-Nanog ή ποντικού αντι-οκτ-3/4) που ακολουθείται από αντι-κουνελιού ή αντι-ποντικού δευτερεύοντα αντισώματα σημασμένα με Alexa 555 φθοροφόρα (κόκκινο) ή 488 (Green). Τα κύτταρα βάφτηκαν αντίθετα με DAPI (μπλε). Ράβδοι κλίμακας: 20 μm. (D) Τα επίπεδα έκφρασης του p53, ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 αναλύθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. mips + LIF /-MEF, κύτταρα MIPS καλλιεργούνται με LIF στο μέσο αλλά χωρίς κύτταρα MEFfeeder? MIPS-LLCcm σφαιροειδές, τα κύτταρα σφαιροειδή κύτταρα προερχόμενα μορφή MIPS-LLCcm? MIPS-LLCcm LMT σφαιροειδές, τα κύτταρα που προέρχονται από σφαιροειδές MIPS-LLCcm κύτταρα του πνεύμονα μεταστατικού όγκου? καρκινικών κυττάρων του πνεύμονα LLC, Lewis.

Η

Τα κύτταρα MIPS-LLCcm είχε χωρητικότητα της αυτο-ανανέωσης

Τριάντα έως πενήντα τοις εκατό των κυττάρων ήταν GFP θετικά στους όγκους που προέρχεται από τα κύτταρα MIPS-LLCcm ενώ λιγότερο από πέντε τοις εκατό ήταν θετικά στη διαφοροποιημένη τεράτωμα (Εικ. S2). Από GFP σχεδιάστηκε κάτω από το

Nanog

υποκινητή ώστε να εκφράζουν σταθερά μόνο σε κύτταρα τα οποία ήταν αδιαφοροποίητα και θα σιγήσει σε διαφοροποιημένους ιστούς [11], τα περισσότερα από τα κύτταρα MIPS θεωρήθηκαν να διαφοροποιηθούν στα τερατώματα. Από την άλλη πλευρά, οι κακοήθεις ιστοί σιωπηρή να περιέχουν αδιαφοροποίητα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν. Πρωτογενείς καλλιέργειες του όγκου θα πρέπει να είναι μια αποτελεσματική μέθοδος για την εξάλειψη των δυνητικά διαφοροποιημένα κύτταρα, προκειμένου να λάβει περισσότερες βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν προέρχονται από MIPS-LLCcm. Έτσι ο καρκινικός ιστός που προέρχεται από κύτταρα MIPS-LLCcm υποβλήθηκε σε πρωτογενή καλλιέργεια, από το οποίο παρατηρήθηκαν δύο διαφορετικοί τύποι κυτταρικών πληθυσμών. Ο ένας ήταν βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με τα οποία εξέφραζαν GFP, ενώ ο άλλος πληθυσμός ήταν παρόμοια με ινοβλάστη κύτταρα που απέτυχαν να εκφράσουν GFP (Σχ. 2Β). Εφόσον τα κακοήθη κύτταρα με ιδιότητες στέλεχος-όπως μπορεί να πολλαπλασιάζεται in vitro ως μη προσκολλημένα σφαίρες [19], [20], τα κύτταρα μεταφέρθηκαν σε μη προσκολλημένα τρυβλία καλλιέργειας για να διευκολυνθεί η ανάπτυξη του σφαιροειδή. Στο εναιώρημα, η έκφραση GFP (Σχ. 2Β) παρατηρήθηκε σε αυτούς τους τομείς του όγκου, ενώ οι ινοβλάστες σαν κύτταρα δεν θα μπορούσε να επιβιώσει χωρίς προσκόλληση στο κάτω μέρος του πιάτου και ήταν GFP αρνητική. Τα σφαιρίδια που προέρχονται από MIPS-LLCcm όγκου επανειλημμένα θρυψίνη και επιβεβαίωσε την ικανότητα σχηματισμού σφαιροειδή σύμφωνα με τα μη προσκολλημένα κατάσταση. Indivisual κύτταρα από διαχωρισθεί σφαίρες ήταν σε θέση να σχηματίσουν νέες σφαίρες κατά τη διάρκεια σειριακή διέλευση σε καλλιέργεια ιστού, αποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα θα μπορούσαν να αυτο-ανανέωση [21]. Οι σφαίρες του όγκου στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε δίσκους καλλιέργειας προσκολλημένα (Εικ. 2Β) και υποβλήθηκαν σε χρώση ανοσοφθορισμού για Nanog και OCT 3/4 (Σχ. 2C). Η θετική χρώση Nanog και OCT 3/4, που είναι κρίσιμοι παράγοντες για τη διατήρηση της αδιαφοροποίητη κατάσταση και την αυτο-ανανέωση των βλαστικών κυττάρων [11], [21], επιβεβαίωσε την έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων σε αυτές τις σφαιροειδή. Μια πτυχή των καρκινικών κατάσταση των κυττάρων σφαιροειδή MIPS-LLCcm απευθυνόταν στην έκφραση του γονιδίου p53 με RT-qPCR. Ως αποτέλεσμα, η έκφραση βρέθηκε ρυθμίζεται προς τα κάτω στο επίπεδο στα καρκινικά κύτταρα LLC (Σχ. 2D). Αυτό μπορεί να υποδεικνύει ρύθμιση προς τα κάτω την κακοήθεια των κυττάρων. Για να αξιολογηθεί η ογκογονικότητα των κυττάρων εντός των σφαιρών του όγκου, 1 × 10~4 × 10

6 από αυτά τα κύτταρα μεταφυτεύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς (Πίνακας 2). Μετά από 4 εβδομάδες, οι όγκοι σχηματίζονται και εκτίθενται εκτεταμένη αγγειογένεση (Εικ. 3Α), η οποία ήταν παρόμοια με τα MIPS-LLCcm προέρχεται όγκους. Ωστόσο, αυτοί οι όγκοι εμφανίστηκαν πιο επιθετικοί, λόγω του υψηλού ρυθμού ανάπτυξης. Για να εξεταστεί η μεταστατικό δυναμικό, 1 × 10

5 κύτταρα σφαιροειδείς εγχύθηκαν στη φλέβα της ουράς ποντικού. Ένα μήνα αργότερα, πολλαπλές μεταστατικές οζίδια εκφράζουν GFP βρέθηκαν στους πνεύμονες που να δείχνουν ότι προέρχονται από σφαιροειδές κύτταρα (Σχ. 3Β και 3C). Και το επίπεδο έκφρασης της ΜΜΡ-2 βρέθηκε σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω στα κύτταρα σφαιροειδές που προέρχονται από MIPS-LLCcm κύτταρα του πνεύμονα μεταστατικών όγκων (MIPS-LLCcm LMT σφαιροειδές) (Εικ. 2D), ο οποίος άφησε να εννοηθεί ότι τα κύτταρα MIPS-LLCcm κατέχουν το μεταστατικό δυναμικό που προκαλείται με επαγωγή της έκφρασης ΜΜΡ-2, και του πληθυσμού των άκρως μεταστατικών κυττάρων θα μπορούσε να απομονωθεί από κύτταρα MIPS-LLCcm των in vivo panning.

(Α) Ιστολογία του όγκου που προέρχεται από σφαιροειδές κύτταρα. Ο όγκος έδειξε κάποια αδενικό δομή (αστερίσκοι) με πολλαπλές παθολογικές μιτωτική στοιχεία (αιχμές βελών, ένθετο) (αριστερά), υψηλά ποσοστά μιτωτικής (αιχμές βελών στη μέση), και υπεραγγείωση (δεξιά) με χρώση HE. Ράβδοι κλίμακας: 100 μm. (Β) μετάσταση στους πνεύμονες μετά από ένεση στην φλέβα της ουράς του σφαιροειδούς κυττάρων. Πνεύμονες κατελήφθησαν από μεταστατικά οζίδια όγκων. (Γ) Οι μεταστάσεις έδειξε κάποια αδενική δομή (αστερίσκοι) με πολλαπλές παθολογικές στοιχεία μιτωτικής (κεφαλές βελών στο επάνω αριστερά)? υπεραγγείωση (επάνω δεξιά)? εισβολή σε πνεύμονα παρεγχυματικό ιστό (κάτω αριστερά) με χρώση HE. Η έκφραση του GFP (αντίσωμα κουνελιού πολυκλωνικό, καφέ) βρέθηκε σε αυτά τα μεταστατικών οζιδίων με χρώση IHC (κάτω δεξιά). Τ, όγκου? L, πνευμονικό ιστό. Ράβδοι κλίμακας: 100 μm. (Δ) Η ανοσοϊστοχημεία της CK και GFP εντοπισμού σε όγκους που προέρχονται από MIPS, MIPS-LLCcm και τα κύτταρα σφαιροειδές. Διαδοχικές τομές βάφτηκαν με CK (μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού, καφέ) και GFP (πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού, καφέ), και αντίθετα με αιματοξυλίνη. Αδενικό περιοχή ήταν CK θετικά αλλά GFP αρνητικά στους όγκους. Ράβδοι κλίμακας:. 100 μm

Η

Ο όγκος που προέρχεται από τα κύτταρα MIPS-LLCcm αποτελούνταν από αδενοκαρκινώματα και άφθονα κύτταρα αδιαφοροποίητα όγκου

Στη συνέχεια, διερευνάται το είδος του κακοήθους όγκου από την IHC. Pan-Cytokeratin (CK, ένα επιθηλιακό δείκτης καρκινικά κύτταρα), βιμεντίνη (δείκτης μεσεγχυματικών όγκου), α-ακτίνη (δείκτης μυογονικού όγκου), CD31 (δείκτης για αγγειογένεση), NF-M και GFAP (δείκτες νευρογενή όγκος) χρησιμοποιήθηκαν για τη χρώση των όγκων (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). CK βρέθηκε να βάφονται έντονα στους όγκους. Η έκφραση των CK και GFP στη συνέχεια αξιολογήθηκε σε πολλαπλές σειριακές τομές. Αδενικό περιοχές ήταν CK θετικά, αλλά τα κύτταρα αυτά ήταν GFP αρνητικά στους όγκους (Εικ. 3D). Τριάντα έως πενήντα τοις εκατό των κυττάρων όγκου ήταν GFP θετικά στους όγκους που είχαν προέρχονται και από τις δύο MIPS-LLCcm κύτταρα και πρωτογενή κύτταρα σφαιροειδή ενώ δεν περιοχές ήταν GFP θετικά στην τεράτωμα. Ως εκ τούτου, οι όγκοι αυτοί κρίθηκαν αδενοκαρκινώματα αναμίχθηκαν με άφθονη αδιαφοροποίητα κύτταρα του όγκου.

Τα κύτταρα προερχόμενα εκφράζονται οι δείκτες των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων

εμβρυϊκά σημειωτές βλαστοκυττάρων και οι τέσσερις παράγοντες μεταγραφής που μετήχθησαν στην συνέχεια ελέγχθηκαν με αντίστροφη μεταγραφή PCR (RT-PCR) και ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (RT-qPCR). κύτταρα MIPS-LLCcm και κυττάρων σφαιροειδή έδειξε έκφραση των δεικτών των εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων (Σχ. 4Α), αλλά τα επίπεδα έκφρασης ήταν κάπως διαφορετική μεταξύ αυτών των κυττάρων του όγκου και των αρχικών κυττάρων MIPS (Εικ. 4C). Συγκεκριμένα, με RT-qPCR

Nanog

και

Rex1

ήταν σημαντικά αυξημένα στα καρκινικά κύτταρα MIPS-LLCcm, σε πρωτογενείς καλλιέργειες που προέρχονται από τους όγκους αυτούς ή στις καλλιέργειες σφαιροειδές όπως σε σύγκριση με τα κύτταρα MIPS καλλιεργούνται απουσία ή παρουσία κυττάρων τροφοδότη. Αντίθετα, η έκφραση των τεσσάρων παραγόντων μεταγραφής βρέθηκε να μειωθεί σε διαφορετικό βαθμό σε αμφότερες τις MIPS-LLCcm κύτταρα και κύτταρα σφαιροειδή σε σύγκριση με τα κύτταρα MIPS που πολλαπλασιάστηκαν επί κυττάρων τροφοδοσίας (Σχ. 4Β και 4D).

(Α) RT-PCR ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου δείκτη εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων. (Β) RT-PCR ανάλυση των τεσσάρων παραγόντων MIPS μεταγραφής. Τα προϊόντα της PCR ήταν οι περιοχές κωδικοποίησης (σύνολο), ενδογενείς μεταγραφές μόνο (Endo.), Και οι μεταγραφές διαγονίδιο μόνο (Tg). επίπεδα (C) Έκφραση του γονιδίου δείκτη εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων αναλύθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. (Δ) τα επίπεδα έκφρασης των τεσσάρων MIPS παράγοντες μεταγραφής κυττάρων αναλύθηκαν από ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου.

Η

Συζήτηση

Τα κύτταρα MIPS-LLCcm έδειξε σφαιροειδές σχηματισμός σε καλλιέργεια σε εναιώρημα, ένα υψηλή ογκογόνο δυναμικό σε περιορισμένες αραιώσεις και ένα υψηλού μεταστατικού δυναμικού, τα οποία ήταν όλα συνεπή με τα βασικά χαρακτηριστικά των ΚΕΠ [19], [22], [23]. ταχεία αύξηση του όγκου απαιτεί de novo αγγειογένεση στην οποία η αγγειακή θέση παρέχει σήματα που προάγουν την ανάπτυξη. Οι όγκοι που προέρχονται από κύτταρα MIPS-LLCcm συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων σφαιροειδές έδειξαν επίσης υψηλό βαθμό αγγειογένεσης, η οποία δεν παρατηρήθηκε στα τερατώματα που προέρχεται από κύτταρα MIPS. Η στενή σύνδεση της ΚΕΠ και των αιμοφόρων αγγείων έχει νωρίτερα τεκμηριωθεί στο νευρικό σύστημα και αυτές οι αγγειακές κόγχες βοηθούν στην διατήρηση του ΚΕΠ [24]. ΙΡΝγ, ένα σημαντικό αρνητικό ρυθμιστικό μόριο της αγγειογένεσης, έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν προς τα κάτω την έκφραση των MMPs, αναστέλλουν μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς και επάγουν την αγγειοστατικό παράγοντα ΙΡ-10 μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού σήματος JAK-STAT [25]. αξιολόγηση των μικροσυστοιχιών συγκρίνοντας τα κύτταρα MIPS και τα κύτταρα MIPS-LLCcm έδειξε κάτω ρύθμιση των IFNγR στα κύτταρα MIPS-LLCcm (Υλικά και Μέθοδοι S1, Πίνακας S1), η οποία μπορεί να είναι υπεύθυνα για την αγγειογένεση στα κύτταρα MIPS-LLCcm προέρχεται όγκου. Υψηλότερη έκφραση της MMP-2 σε κύτταρα MIPS-LLCcm LMT δίνοντας το μεταστατικό δυναμικό σε κύτταρα MIPS-LLCcm θα μπορούσε να είναι αποτέλεσμα της μείωσης IFNγR, αν και απαιτούνται περαιτέρω ανάλυση. κύτταρα λαμβάνοντας την αρνητική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης ΜΜΡ-9 και στις δύο MIPS-LLCcm και MIPS-LLCcm LMT υπόψη, MMP-2 φαίνεται να είναι υπεύθυνη για την αγγειογένεση και μετάσταση σε αυτή τη μελέτη.

Αυτο-ανανέωση συχνά αναφέρεται ως ένα χαρακτηριστικό των ΚΕΠ. Ωστόσο, υπάρχουν τεχνικοί περιορισμοί για την αξιολόγηση αυστηρά αυτο-ανανέωση. Για κανονική βλαστικά κύτταρα ιστού, η τυπική δοκιμή της αυτο-ανανέωσης απαιτεί την κλωνική in vivo επίδειξη της αυτο-ανανέωσης και διαφοροποίησης πολλών γράμμωσης σε πρωτογενείς μεταμοσχεύσεις βλαστοκυττάρων, που ακολουθείται από την επίδειξη τις ίδιες ιδιότητες σε σειριακή μεταμοσχεύσεις των ίδιων κυττάρων. Αυτο-ανανέωσης σε ογκογόνα καρκινικά κύτταρα γενικά έχουν αξιολογηθεί από την επίδειξη της σειριακής transplantability πολυκλωνικών όγκων και από την επίδειξη μιας παρόμοιας φαινοτυπική ετερογένεια των γονικών και των απογόνων ξενομοσχευμάτων όγκου [26]. Η αλληλουχία των πειραμάτων χρησιμοποιώντας κύτταρα MIPS-LLCcm που προήλθαν από πρωτογενείς όγκους και επαναλαμβανόμενες υποκαλλιέργεια τους ως σφαιροειδή απέδειξε την ικανότητα της αυτο-ανανέωσης στα κύτταρα MIPS-LLCcm απόκτηση δευτερογενείς όγκους που εμφανίζουν την ίδια ιστολογία και φαινότυπο με τις πρωτογενείς όγκους [21] .

Επιπλέον,

Nanog

, ένας δείκτης ευρέως συνδέεται με «βλαστική ικανότητα» εξακολουθούσε να εκφράζεται σε υψηλότερα επίπεδα στα κύτταρα MIPS-LLCcm και τα κύτταρα σφαιροειδή σε σύγκριση με τα κύτταρα MIPS.

Κομβικές

και

Cripto1 are Κίνα εμβρυϊκά μορφογόνων που είναι υπεύθυνες για την maintaince της πλειοδυναμίας /αυτο-ανανέωσης σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και να εκτελέσει έναν κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της αδιαφοροποίητη κατάσταση των κυττάρων [7]. Στα κύτταρα MIPS-LLCcm,

Κομβικές

και

Cripto1

επίπεδα έκφρασης ήταν σημαντικά υψηλότερα σε σύγκριση με τα κύτταρα MIPS, η οποία επιβεβαίωσε το σχετικά αδιαφοροποίητη κατάσταση των κυττάρων MIPS-LLCcm. Η μείωση των κόμβων έκφρασης κατά 70% το σφαιροειδές κύτταρα απέδειξαν πιθανώς τη διαφοροποίηση των κυττάρων σφαιροειδούς από πολυδύναμα βλαστοκύτταρα να unipotent βλαστοκύτταρα ως ΚΕΠ. Ένα σημαντικό κάτω ρύθμιση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων παρατηρήθηκε σε τερατώματα που προήλθαν από κύτταρα MIPS ως αυτοί οι όγκοι περιέχουν μικτούς πληθυσμούς διαφόρων διαφοροποιημένων κυτταρικών τύπων. Αντιθέτως, σε όγκους που προέρχονται από κύτταρα MIPS-LLCcm και σφαιροειδές κυττάρων, τα επίπεδα έκφρασης αυτών των δεικτών μειώθηκε επίσης αλλά παρέμεινε πολύ υψηλότερες από εκείνες στο τερατώματα. Αυτά τα αποτελέσματα, τα οποία ήταν σύμφωνα με αυτά της IHC, υποδηλώνουν ότι υπήρχε ένα ορισμένο ποσό των ΚΕΠ στις κακοήθεις όγκους ενώ σχεδόν όλα τα κύτταρα διαφοροποιήθηκαν στα τερατώματα.

Τα καρκινικά κύτταρα αναπτύσσονται σε αυτή τη μελέτη από τα κύτταρα MIPS μεγάλωσε ως σφαιροειδή στην καλλιέργεια εναιωρήματος, έδειξαν ένα υψηλό ογκογόνο και μεταστατικό δυναμικό και την αγγειογένεση in vivo. Επιπλέον, η ικανότητα για αυτο-ανανέωση και συντήρηση του μια αδιαφοροποίητη κατάσταση, όπως εκτιμάται από την έκφραση των δεικτών που σχετίζονται με τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα δείχνουν ότι αυτά τα πρωτογενή κύτταρα MIPS-LLCcm και τα κύτταρα σφαιροειδή τα οποία προήλθαν από κύτταρα MIPS-LLCcm περιέχουν ένα υψηλό ποσοστό των ΚΕΠ. Scaffidi και Misteli ανέφεραν πρόσφατα την παραγωγή του CSC-όπως κύτταρα από ινοβλάστες, τα οποία μπορούν να ανιχνευθούν σε σωματικά βλαστικά κύτταρα [27]. Μπορούν μεταγόμενα ογκογόνο γονίδια αντιγόνων hTERT, Η-Ras V12 και SV40 Τ να παράγουν CSC-κύτταρα που μοιάζουν με τον επαναπρογραμματισμό. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι το μοντέλο μας CSC αναπτύχθηκε χωρίς τη χρήση γονιδιακής μεταγωγής. Αυτή είναι η πρώτη έκθεση για να αποδειχθεί η ανάπτυξη ενός πληθυσμού ΚΕΠ από κύτταρα MIPS που μπορεί να επιτευχθεί από παράγοντες που εκκρίνονται από κύτταρα όγκου, αν και η ταυτότητα αυτών των διαλυτού παράγοντα (ες) παραμένει άγνωστη. Εξωγενώς εισαγόμενου

C-myc

στα κύτταρα MIPS μπορεί να συμβάλει στη μετατροπή αφού επανενεργοποίηση του

C-myc

φέρεται από έναν ρετροϊό θεωρήθηκε ότι σχετίζονται με το σχηματισμό όγκων στο 20% των χιμαιρικών ποντικών [11]. Επιπλέον, διαρροές έκφραση αυτών των διαγονιδίων μπορεί επίσης να αναστέλλουν την πλήρη διαφοροποίηση των κυττάρων και MIPS ωρίμανση, οδηγώντας σε μεγαλύτερο κίνδυνο σχηματισμού ανώριμων τεράτωμα [28]. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα διαγονίδια που χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία κυττάρων MIPS ήταν σχεδόν εντελώς αθόρυβη σε κύτταρα MIPS-LLCcm και κυττάρων σφαιροειδές όπως συγκριτικά με κύτταρα MIPS αναπτύσσονται σε κύτταρα τροφοδότες και ότι οι δύο ογκογονίδια,

C-myc

και

Klf4

, μειώθηκαν δραματικά στα κύτταρα MIPS-LLCcm και τα κύτταρα σφαιροειδές. Αυτό υποδηλώνει ότι τα διαγονίδια μπορεί να μην είναι οι κύριοι παράγοντες που ευθύνονται για το μετασχηματισμό των κυττάρων MIPS σε αυτό το σημερινό μοντέλο. Επιπλέον, λόγω της μη σχηματισμού όγκων παρατηρήθηκε στις περιπτώσεις των MIPS-P19c, -B16c, και δεν έχουν καμία επιζών του MIPS-LLCc, τα οποία ήταν όλα στην «ομάδα συν-καλλιέργεια», θα πρέπει να υπάρχει μικρή πιθανότητα της μεταφοράς ή συμβολή των ιών όγκου ποντικού στην ογκογονικότητας των κυττάρων MIPS καλλιεργήθηκαν στο ρυθμισμένο μέσο. Λαμβάνοντας υπόψη την απουσία ογκογένεσης με αυτά τα κύτταρα στην ομάδα συν-καλλιέργεια, η μη βέλτιστη κατάσταση του πολιτισμού iPS θα πρέπει να είναι δύσκολο να εξηγήσει τη μετατροπή του MIPS κυττάρων, ενώ η πιθανότητα ιογενούς επιμόλυνσης παραμένει στις περιπτώσεις του MIPS-MC.E12 cm και -MC.E12c [29]. Επιπλέον, τέσσερα ανεξάρτητα έργα υποβάλει έκθεση σχετικά με γενωμική ανάλυση των iPS και αποκαλύπτουν μια ανησυχητική παρουσία μεταλλάξεων σε αυτά τα κύτταρα [30] – [33], η οποία μπορεί να είναι το σύνθημά MIPS είναι ευκολότερο να επηρεαστεί από το διαλυτό παράγοντα (ες) υπήρχε στο μικροπεριβάλλον του όγκου . Τα εξωσώματα είναι 40-100 nm bilipid κυστίδια μεμβράνης που εκκρίνονται από τους περισσότερους τύπους κυττάρων. Αυτοί πιστεύεται ότι μεσολαβούν την επικοινωνία κυττάρου-κυττάρου και τη διευκόλυνση βιολογικές διεργασίες όπως κυτταρική ανάπτυξη και κακοήθη μετασχηματισμό [34], [35]. Με βάση τις πρόσφατες εκθέσεις εξωσωμάτων όγκου [36], [37], αξίζει να διευκρινιστεί το σημαντικό ρόλο των εξωσωμάτων που εκκρίνονται από τα κύτταρα LLC στη μετατροπή των κυττάρων MIPS σε ΚΕΠ. Επιπλέον, το εύρημα μας από downregluration της έκφρασης του γονιδίου ρ53 σε κύτταρα MIPS-LLCcm υποδεικνύει ότι το διαταραγμένο δίκτυο ρ53 είναι ένας από τους μηχανισμούς της μετατροπής των κυττάρων MIPS για ΚΕΠ. Έχει αναφερθεί ότι τα κύτταρα του όγκου μπορεί να αναστείλει την επαγωγή ρ53 σε παρακείμενες ινοβλαστών [38]. Αξίζει να σημειωθεί ότι ένας μηχανισμός αυτής της καταστολής πρέπει να εξαρτάται από τον παράγοντα που εκκρίνεται από τα κύτταρα του όγκου, αλλά όχι σε άμεση αλληλεπίδραση κυττάρου-προς-κύτταρο. Ορισμός και χαρακτηρισμός των γενετικών αλλαγών και των εκκρίνονται παράγοντες στο μικροπεριβάλλον του όγκου, τα οποία μετατρέπουν MIPS κυττάρων σε ένα CSC θα είναι αποτελεσματική για την ανάπτυξη νέων αντικαρκινικών θεραπειών.

Η έκφραση ειδικών δεικτών κυτταρικής επιφάνειας έχει έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για τον εντοπισμό ΚΕΠ. Μερικοί από αυτούς τους δείκτες επιφάνειας είναι γνωστό ότι είναι κοινά σε διαφορετικό πληθυσμό ΚΕΠ. Ωστόσο, αυτοί οι δείκτες μπορεί να εξακολουθεί να συνδέεται με φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα [1]. Διαφορικά εκφραζόμενο δείκτες επιφάνειας που μπορεί να διακρίνει φυσιολογικών αρχέγονων κυττάρων από ΚΕΠ είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες [19]. Είναι επιτακτική ανάγκη να προσδιοριστούν δείκτες που μπορούν να διακρίνουν μεταξύ ΚΕΠ και φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα. Αυτό το κυτταρικό μοντέλο σε αυτό το έγγραφο θα πρέπει να χρησιμεύσει ως μια βιώσιμη εργαλείο για τον εντοπισμό ενδεχομένως καλόπιστους δείκτες των ΚΕΠ. Τέτοιοι δείκτες θα μπορούσαν να είναι πιθανοί στόχοι για την ανάπτυξη νέων θεραπειών κατά της ΚΕΠ, χωρίς να επηρεάζει αρνητικά τις φυσιολογικές λειτουργίες των βλαστικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Ποντίκι επαγόμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (MIPS? όνομα κυττάρων: iPS-ΥΠΟΙΟ-Ng-20D-17? Lot Νο 012) αγοράστηκαν από την Riken Τράπεζας κυττάρων (Ιαπωνία) και διατηρήθηκαν σε μέσο (ϋΜΕΜ που περιέχει 15% FCS, 0,1 mM ΝΕΑΑ, 2 mM L- Γλουταμίνη, 0.1 mM 2-μερκαπτοαιθανόλη, 1.000 U /ml LIF, 50 U /ml πενικιλλίνη και 50 U /ml στρεπτομυκίνη) επί τροφοδοτικά στρώματα κυττάρων εμβρυϊκών ινοβλαστών (MEF) μιτομυκίνη-C-αγωγή ποντικού (Reprocell, Ιαπωνία). Mouse Lewis καρκινικά κύτταρα πνεύμονα (LLC) αγοράστηκαν από την ATCC (USA) και διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FCS? κύτταρα ποντικού εμβρυϊκό καρκίνωμα (P19) αγοράστηκαν από την Riken Τράπεζας Κυττάρων (Ιαπωνία) και διατηρήθηκαν σε αΜΕΜ που περιέχει 10% FCS? μελανώματος κύτταρα ποντικού (Β16 /BL6) (ATCC, USA) και μαστού ποντικού καρκινικά κύτταρα (BALB-MC.E12) (Riken Τράπεζας Κυττάρων, Ιαπωνία) διατηρήθηκαν σε ΜΕΜ που περιέχει 10% FCS.

Για την παρασκευή συσκευασμένων μέσο (CM) από τις διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου ποντικού, μέσο συλλέχθηκε από συμβάλλουσες πιάτα και διηθείται χρησιμοποιώντας 0,45 μm φίλτρου (Millpore, Ιρλανδία). Στη συνέχεια, 3 ml CM προσετέθησαν σε 3,5 cm τρυβλίου τη διάρκεια της νύχτας για να επιβεβαιώσει δεν υπήρχαν επιβιώνουν καρκινικά κύτταρα σε cm. Για τους ρυθμισμένο πειράματα μέσου, τα κύτταρα MIPS (χωρίς MEF κύτταρα τροφοδότες) διατηρήθηκαν σε μέσο που περιγράφεται παραπάνω χωρίς LIF. Το ήμισυ του μέσου αλλάχθηκε καθημερινά με CM για 4 εβδομάδες. κύτταρα MIPS χωρίς θεραπεία με CM χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος. Για τα πειράματα συγκαλλιέργειας, οι κυτταρικές σειρές όγκου ποντικού υπέστησαν αγωγή με 0,4 μg /ml μιτομυκίνη C (Sigma, USA) και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν ως κύτταρα τροφοδότες και συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα MIPS (χωρίς τροφοδοτικά κύτταρα MEF) για 4 εβδομάδες. κύτταρα MIPS περάστηκαν κάθε 3 ημέρες και η μορφολογία των κυττάρων φωτογραφήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο της Olympus IX81 είναι εξοπλισμένα με συσκευή φωτός φθορισμού (Olympus, Ιαπωνία).

Για την κύρια καλλιέργεια, αλλομοσχεύματα ποντίκι κόπηκαν σε μικρά κομμάτια (περίπου 1 mm

3) σε HBSS. Μετά από πλύση τρεις φορές, οι ιστοί μεταφέρθηκαν σε ένα σωλήνα των 15 ml με 0,25% θρυψίνη 5-6 πλάσιο όγκο στους 37 ° C για 40 λεπτά. Πέντε μικρολίτρα ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FCS προστέθηκε στη συνέχεια να τερματίσει την πέψη. Το κυτταρικό εναιώρημα κατόπιν τοποθετήθηκε σε ένα νέο σωλήνα και φυγοκεντρείται στα 1000 rpm για 10 λεπτά. Το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε 5 ml HBSS, και φυγοκεντρήθηκαν στις 1000 rpm για 5 λεπτά. Το κυτταρικό σφαιρίδιο στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε έναν κατάλληλο όγκο μέσου MIPS χωρίς LIF και τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα πιάτο σε πυκνότητα 5 χ 10

5 /ml. Τα κύτταρα περάστηκαν κάθε 3 ημέρες και τα κύτταρα μορφολογία παρατηρήθηκε και φωτογραφήθηκε χρησιμοποιώντας την Olympus IX81 μικροσκόπιο εξοπλισμένο με διάταξη φως φθορισμού (Olympus, Japan).

καλλιέργειες Αναστολή να παράγει σφαιροειδή διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στο Dontu et al [39 ]. Εν συντομία, μεμονωμένα κύτταρα απλώθηκαν σε μη-επικαλυμμένες πιάτα (βακτηριακή δίσκο καλλιέργειας) σε πυκνότητα 2 × 10

4 /ml σε πρωτογενή καλλιέργεια. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο MIPS ελεύθερο ορού χωρίς LIF. Τα σφαιροειδή κύτταρα συλλέχθηκαν με ήπια φυγοκέντρηση (500 rpm) μετά από 7-10 ημέρες και διαχωρίστηκαν ενζυμικά (0.025% θρυψίνη /EDTA).

Τα πειράματα σε ζώα

Γυμνά ποντίκια (Balb /c Slc

-nu /ηυ

, γυναίκα, 6~8 εβδομάδων) αγοράστηκαν από Charlesriver, Ιαπωνία. Το σχέδιο των πειραμάτων σε ζώα εξετάστηκε και εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας για πειράματα σε ζώα στο Πανεπιστήμιο Okayama υπό την αναγνωριστικά OKU-2008211, OKU-2009144, OKU-2010179 και OKU-2011 με 305.

Για τις μελέτες μεταμόσχευσης, κύτταρα (φαίνονται στον πίνακα 1 και 2) εναιωρήθηκαν σε 100 μΙ ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FCS και εγχέονται υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς. Μετά από 4 εβδομάδες, οι όγκοι αποκόπηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 10% ρυθμιστικό διάλυμα ουδέτερης φορμαλίνης (Wako, Japan).

Για μικρομεταστάσεων μελέτες, 1 × 10

5 κυττάρων σφαιροειδή MIPS-LLCcm εναιωρήθηκαν σε 100 μΙ ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FCS και ενίεται σε φλέβα της ουράς γυμνού ποντικιού (n = 6).

ανάλυση Η ιστολογική και ανοσοϊστοχημεία (IHC)

οι όγκοι μονιμοποιήθηκαν για 24 ώρες και στη συνέχεια σε επεξεργασία χρησιμοποιώντας ένα κερί ρουτίνα διαδικασία -embedding για ιστολογική εξέταση. Τρεις μικρόμετρο πάχους τομές βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ).

IHC για GFP, παν-Cytokeratin, βιμεντίνη, α-ακτίνη, CD31, NF-M, GFAP διεξήχθη χρησιμοποιώντας σταθεροποιημένο με φορμαλίνη ενσωματωμένα σε παραφίνη ιστός τμήματα και τις τυπικές διαδικασίες. Εν συντομία, 3 μm τομές ιστού αποπαραφινοποιήθηκαν και αντιγόνο ανακτάται διεξήχθη χρησιμοποιώντας έκθεση μικροκυμάτων στους 95 ° C για 5 λεπτά σε ένα διάλυμα κιτρικού οξέος (ρΗ 6,0) ή επώαση σε πρωτεϊνάση Κ (40 μg /ml) στους 37 ° C για 30 λεπτά.