Αφηρημένο

Ιστορικό

Διευκρίνιση του ρεπερτορίου της εκκρινόμενης και κυτταρικής επιφάνειας πρωτεΐνες των καρκινικών κυττάρων είναι σχετικό με μοριακή διάγνωση, την απεικόνιση του όγκου και στοχευμένες θεραπείες. Έχουμε χαρακτηρίσει την κυτταρική επιφάνεια πρωτεώματος και οι πρωτεΐνες που απελευθερώνονται στο εξωκυττάριο περιβάλλον τριών κυτταρικών γραμμών καρκίνου ωοθηκών, Caov3, OVCAR3 και ES2 και των κυττάρων των ωοθηκών των όγκων εμπλουτίζονται από υγρό ασκίτη.

Μεθοδολογία και Ευρήματα

για να διαφοροποιηθούν οι πρωτεΐνες που απελευθερώνεται εντός του μέσου από πρωτεϊνικά συστατικά των μέσων που χρησιμοποιούνται για την καλλιέργεια, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν με την παρουσία του [

13C] -επισημασμένο λυσίνη. Μια προσέγγιση βιοτινυλίωση με βάση χρησιμοποιήθηκε για να συλλάβει σχετίζονται πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας. γενική πειραματική στρατηγική μας αποτελείται από κλασμάτωση των πρωτεϊνών από μεμονωμένα διαμερίσματα που ακολουθείται από πρωτεολυτική πέψη και ανάλυση LC-MS /MS. Συνολικά, περίπου 6.400 πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν με υψηλή εμπιστοσύνη σε όλα τα δείγματα και τα κλάσματα.

Συμπεράσματα και Σημασία

Τα πρωτεϊνικά προφίλ των κυτταρικών σειρών είχε σημαντική ομοιότητα με τα προφίλ των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών από ασκιτικό υγρό και περιλαμβάνονται δείκτες πρωτεΐνη που είναι γνωστό ότι σχετίζονται με τον καρκίνο των ωοθηκών. Πρωτεομική ανάλυση έδειξε εκτεταμένη απόπτωση από εξω-κυτταρικών πεδίων των πρωτεϊνών που εκφράζονται στην κυτταρική επιφάνεια, και αξιοσημείωτα υψηλά ποσοστά έκκρισης για μερικές πρωτεΐνες (νανογραμμάρια ανά εκατομμύριο κύτταρα ανά ώρα). επιφάνεια του κυττάρου και εκκρίνονται οι πρωτεΐνες που προσδιορίζονται από το βάθος πρωτεομική των χαρακτηριστικών των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών μπορεί να παρέχει νέους στόχους για τη διάγνωση και τη θεραπεία

Παράθεση:. facA VM, Ventura AP, Fitzgibbon MP, Pereira-facA SR, Pitteri SJ, Πράσινο ΑΕ, et al. (2008) πρωτεομική ανάλυση του καρκίνου των ωοθηκών κυττάρων αποκαλύπτει δυναμικές διαδικασίες της πρωτεΐνης έκκρισης και αποβολής των εξω-κυτταρικών Domains. PLoS ONE 3 (6): e2425. doi: 10.1371 /journal.pone.0002425

Επιμέλεια: Axel Imhof, Πανεπιστήμιο του Μονάχου και το Κέντρο Ολοκληρωμένων Επιστημών Πρωτεΐνη, Γερμανία

Ελήφθη: 24 Μαρτίου 2008? Αποδεκτές: 8η Μαΐου 2008? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιούν, 2008

Copyright: © 2008 facA et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από τις Καναρίους Ιδρύματος. Η οργάνωση χρηματοδότηση δεν είχε κανένα ρόλο στη συλλογή δεδομένων ή ανάλυση, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι μια από τις πιο επιθετική και θανατηφόρα επιθηλιακών καρκίνων στις γυναίκες [1]. Υπάρχουν τέσσερις βασικοί τύποι ιστολογικών επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών: ορώδης, ενδομητριοειδές, σαφείς κυττάρων, και βλεννώδες, τα οποία διαφέρουν σε δύο κλινικές συμπεριφορά τους και μοριακά χαρακτηριστικά. Η υδαρής υπότυπος είναι η πιο συχνά διαγιγνώσκεται και είναι υπεύθυνη για το μεγαλύτερο μέρος των ωοθηκών θανάτων από καρκίνο [1]. Επί του παρόντος, δεν υπάρχει ακριβής μη επεμβατική διαγνωστική εξέταση για τον καρκίνο των ωοθηκών? Οι περισσότεροι ασθενείς διαγιγνώσκονται σε προχωρημένο στάδιο [2], που παρουσιάζει με μεταστάσεις και εισβολή της περιτοναϊκής κοιλότητας και ασκίτη [3]. Ως εκ τούτου, ο προσδιορισμός των πρωτεϊνών που άφθονα και εκφράζονται κυρίως στον καρκίνο των ωοθηκών παρουσιάζει μια πολύτιμη επιχείρηση και μπορεί να παρέχει πρώιμη ενδείξεις για την παρουσία του καρκίνου των ωοθηκών, και /ή ενδείξεις ενός μοριακού υποτύπου που θα μπορούσαν να βοηθήσουν για την καθοδήγηση της θεραπείας.

προσδιορισμός του ρεπερτορίου πρωτεϊνών που διασπώνται από την επιφάνεια του κυττάρου και των πρωτεϊνών που αλλιώς απελευθερώνονται στον εξωκυτταρικό διαμέρισμα μπορεί να συμβάλει στην κατανόηση της συμπεριφοράς του όγκου, με την ταυτοποίηση των πιθανών διαγνωστικών δεικτών ανιχνεύσιμη σε κυκλοφορία και των δυνητικών απεικόνισης και θεραπευτικοί στόχοι που συνεχίζουν να εμφανίζονται στην κυτταρική επιφάνεια. Κατά τη διάρκεια της μετάστασης του καρκίνου των ωοθηκών, η παραγωγή των πρωτεϊνασών μήτρας αποικοδόμησης από τα καρκινικά κύτταρα συνεισφέρει στη διάσπαση των αλληλεπιδράσεων κυττάρου μέσω ενός μηχανισμού της αποβολής των μορίων προσκόλλησης. Οι εν λόγω μηχανισμοί έχουν αποδειχθεί, στο πλαίσιο του καρκίνου των ωοθηκών για ALCAM [4] και για τα επιθηλιακά καντερίνη (Cdh1) [5].

Στο βάθος, ποσοτική πρωτεομική επιτρέπει αυτή την οριοθέτηση των πρωτεϊνών που εκφράζονται σε καρκινικά κύτταρα και σε επιμέρους κυτταρικά διαμερίσματα [6]. Αρκετές μελέτες πρωτεομικής έχουν αναλύσει ιστού ωοθήκης του όγκου [7], [8], οι κυτταρικές σειρές [9] – [11], υγρό ασκίτη [12] και αίματος από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών [13], [14]. Ωστόσο, υπάρχει ακόμη ανάγκη για να χαρακτηρίσει συστηματικά και συγκρίνουν σύνολα των πρωτεϊνών των οποίων οι θέσεις καθιστούν ιδιαίτερα για την διάγνωση και τη θεραπεία, κυρίως πρωτεΐνες στην επιφάνεια του κυττάρου ή αυτά που απελευθερώνονται στο εξωκυττάριο περιβάλλον, και να καθορίζει τον μηχανισμό και τη δυναμική του απελευθέρωση πρωτεΐνη στον εξωκυτταρικό χώρο.

χαρακτηριζόμενη από τρία αδενοκαρκινώματος κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, OVCAR3, Caov3 και ES2, καθώς και των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα εμπλουτίζονται από υγρό ασκίτη με μια σε βάθος πρωτεομική ανάλυση των προϊόντων λύσης ολικού κυττάρου, ο επιφάνεια πρωτεώματος κυττάρων και πρωτεϊνών που απελευθερώνονται στο εξωκυττάριο διαμέρισμα. Λεπτομερής εξερεύνηση των δεδομένων αποκάλυψε διάφορα ενδιαφέροντα βιολογικά φαινόμενα, συμπεριλαμβανομένης της εκτεταμένης αποβολή εξω-κυτταρικών πεδίων για πρωτεΐνες που εκφράζονται στην κυτταρική επιφάνεια και τα υψηλά ποσοστά έκκριση ενός υποσυνόλου των πρωτεϊνών. Τα δεδομένα περιλαμβάνουν επίσης έναν αριθμό πρωτεϊνικών δεικτών είναι γνωστό ότι σχετίζονται με τον καρκίνο των ωοθηκών. Η προκύπτουσα δημόσια σύνολο δεδομένων είναι ένας πόρος για την ανακάλυψη των διαγνωστικών και θεραπευτικών στόχων και μια πλούσια πηγή πληροφοριών σχετικά με την κατανομή των πρωτεϊνών μεταξύ του εσωτερικού των κυττάρων, την κυτταρική επιφάνεια και στον εξωκυττάριο χώρο.

Μέθοδοι

Πολιτισμός και ισοτοπική επισήμανση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

OVCAR3, Caov3 και ES2 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο (Invitrogen) που περιέχει 0.1% του διαπίδυση ορό εμβρύου μόσχου (FBS) (Invitrogen) και

13C-λυσίνη αντί της τακτικής λυσίνη, για 7 περάσματα (1:02) σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο SILAC [15]. Ενσωμάτωση των

13C Lys ισότοπο υπερέβη το 90% της συνολικής περιεκτικότητας σε πρωτεΐνη λυσίνη. Η ίδια παρτίδα κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση των πρωτεϊνών της κυτταρικής επιφάνειας και για την ανάλυση των ρυθμισμένων μέσων και ολόκληρες πρωτεΐνες κυτταρολύματος. Οι εκκρινόμενες πρωτεΐνες ελήφθησαν απευθείας από το εμπλουτισμένο μέσο κυττάρων μετά από 48 ώρες καλλιέργειας. Κύτταρα και συντρίμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση στα 5000 χ g και διήθηση μέσω φίλτρου 0,22 μm. Σύνολο εκχυλίσματα κυττάρων λήφθηκαν με κατεργασία με υπερήχους του ~ 2 × 10

7 κύτταρα σε 1 ml PBS που περιέχει το απορρυπαντικό οκτυλ-γλυκοσίδιο (OG) (1% w /v) και αναστολείς πρωτεάσης (πλήρες κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης, Roche Diagnostics , Γερμανία) που ακολουθήθηκε από φυγοκέντρηση στα 20.000 χ g.

καρκινικά κύτταρα ελήφθησαν από 2,2 λίτρα ασκιτικό υγρό από έναν ασθενή με αδενοκαρκίνωμα ορώδης ωοθηκών. δείγματα ασκίτη συλλέχθηκαν στο πλαίσιο ενός IRB εγκεκριμένο πρωτόκολλο. Μετά από φυγοκέντρηση στις 2000 rpm για 5 λεπτά, το σφαιρίδιο των κυττάρων εκπλύθηκε 3 φορές με PBS που ακολουθείται από φυγοκέντρηση στις 2000 rpm για 10 λεπτά. Μια διαβάθμιση Percoll (30 έως 60%) χρησιμοποιήθηκε για τον εμπλουτισμό του παρασκευάσματος σε κύτταρα που προέρχονται από όγκους και την εξάλειψη των προσμείξεων μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος. Τα καρκινικά κύτταρα που αποτελούνται -80% των βιώσιμων κυττάρων στο προκύπτον δείγμα, όπως αξιολογείται με μικροσκοπική επιθεώρηση. Η ασκίτη κύτταρο ρυθμισμένα μέσα ελήφθη μετά από 24 ώρες καλλιέργειας σε 0.1% αλβουμίνης βόειου ορού (BSA), χωρίς την προσθήκη εμβρυϊκού βόειου ορού (FBS). Κύτταρα και συντρίμματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση στα 5000 χ g και διήθηση μέσω φίλτρου 0,22 μm.

Σύλληψη των πρωτεϊνών επιφανείας κυττάρου

Για να απομονωθούν πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας από τις τρεις προσφυόμενων κυτταρικών γραμμών καρκίνου ωοθηκών, ~ 2 × 10

8 κύτταρα βιοτινυλιώθηκαν στην πλάκα καλλιέργειας μετά από εκτεταμένη έκπλυση PBS, με 10 ml 0,25 mg /ml Σουλφο-ΝΗδ-SS-βιοτίνη σε PBS σε θερμοκρασία δωματίου (23-24 ° C) για 10 min. Το απομένον αντιδραστήριο βιοτινυλίωσης σβήστηκε με 10 mM λυσίνη. Εμπλουτισμένο καρκινικά κύτταρα από ασκίτη πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS και βιοτινυλιωμένο στο εναιώρημα (2.5 × 10

8cells /ml) με 0.48mg /ml Σουλφο-ΝΗδ-SS-βιοτίνη σε PBS για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (23- 24 ° C). Το απομένον αντιδραστήριο βιοτινυλίωσης σβήστηκε με 10 mM λυσίνη τόσο κυτταρική γραμμή και παρασκευή ασκίτη. εκχύλιση πρωτεΐνης διεξήχθη σε ένα διάλυμα που περιέχει ΝΡ 40 απορρυπαντικό 2% (ν /ν) με διάσπαση των κυττάρων με κατεργασία με υπερήχους που ακολουθείται από φυγοκέντρηση στα 20.000 χ g. Βιοτινυλιωμένα πρωτεΐνες χρωματογραφικά απομονώθηκαν με χρωματογραφία συγγένειας με χρήση 1 ml του UltraLink Ακινητοποιημένη Neutravidin (Pierce) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πρωτεΐνες δεσμεύεται στη στήλη ανακτήθηκαν με αναγωγή του αντιδραστηρίου βιοτινυλίωσης με 5 ml ενός διαλύματος που περιέχει 65 μπιοί DTT και 1% οκτυλ-γλυκοσιδίου (OG) απορρυπαντικό για 1 ώρα στους 37 ° C. Οι εκλουσμένες πρωτεΐνες στη συνέχεια αλκυλιώνεται με 200 μmol ιωδοακεταμιδίου σε θερμοκρασία δωματίου.

Η κλασματοποίηση των κυτταρικών εκχυλισμάτων

επιφάνεια Cell, ρυθμισμένα μέσα και ολικό εκχύλισμα κλασματώθηκε με χρωματογραφία αντίστροφης φάσης, χρησιμοποιώντας αντίστοιχα 500 μg , 1 mg και 1 mg ολικής πρωτείνης. Όλα τα κυτταρικά εκχυλίσματα σε αναγωγή και αλκυλίωση με ιωδοακεταμίδιο πριν από τη χρωματογραφία. Ο διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε ένα /10 στήλη POROS R1 (Applied Biosystems-4,6 χ 50 mm) σε 2,7 ml /min χρησιμοποιώντας μία γραμμική κλίση από 10 έως 80% του οργανικού διαλύτη σε 30 λεπτά τρέξιμο. σύστημα διαλύτη που χρησιμοποιήθηκε ήταν: υδατικό διαλύτη-5% acentonitrile /95% νερό /0,1% τριφθοροοξικό οξύ? οργανικός διαλύτης-75% ακετονιτρίλιο /15% ισοπροπανόλη /10% νερό /0,095% τριφθοροξικό οξύ. Κλάσματα συλλέχθηκαν σε ένα ρυθμό 3 κλάσματα /λεπτό.

Αναγνώριση των πρωτεϊνών με LC-MS /MS

πέψη πρωτεϊνών και ταυτοποίηση με LC-MS /MS διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [16] . Εν συντομία, το κάθε ένα από τα κλάσματα αντίστροφης φάση ξεχωριστά πέψη πέψη σε διάλυμα με θρυψίνη (400 ng /κλάσμα) και ομαδοποιούνται σε 15 έως 21 πισίνες για κάθε κυτταρική σειρά και κάθε διαμέρισμα (δηλαδή κυτταρικής επιφάνειας, ρυθμισμένα μέσα και διαλυτές ολόκληρο προϊόν λύσης κυττάρου) με βάση την χρωματογραφική χαρακτηριστικά. Πισίνες ατομικά αναλύθηκαν με LC-MS /MS σε ένα φασματόμετρο μάζας LTQ-Orbitrap (Thermo-Finnigan) σε συνδυασμό με ένα σύστημα χρωματογραφίας λεπτής ροής (Eksigent) χρησιμοποιώντας μια στήλη 25 εκατοστών (Picofrit 75 μm ID, νέους στόχους, συσκευασμένα σε-σπίτι με MagicC18 ρητίνη) πάνω από ένα 90 λεπτών γραμμικό βαθμιαίο διαλύτη. Κεκτημένα δεδομένα αυτόματα σε επεξεργασία από την Υπολογιστική Πρωτεομική Ανάλυση Συστημάτων-CPAS [17]. Τα φάσματα μάζας παράλληλα αναζητήθηκαν κατά την έκδοση 3.13 του ανθρώπινου βάσης δεδομένων IPI. Ένα σταθερό τροποποίηση του 6.020129 μονάδων μάζας προστέθηκε σε υπολείμματα λυσίνης για έρευνα σε βάσεις δεδομένων για να αντιπροσωπεύουν ενσωμάτωση του βαρύ ισότοπο λυσίνης. Για να εκτιμηθεί η σημασία των πεπτιδίων και πρωτεϊνών αγώνες, εφαρμόσαμε την εργαλεία PeptideProphet [18] και ProteinProphet [19]. επελέγησαν και υποβλήθηκαν σε ProteinProphet ταυτοποιήσεις με πιθανότητα PeptideProphet μεγαλύτερη από 0,75. Το τελευταίο συνάγει ένα ελάχιστο σύνολο των πρωτεϊνών που εξηγούν το πεπτίδιο αποδείξεις, αποδίδοντας μια πιθανότητα σε κάθε πρωτεΐνη με βάση τις συνδυασμένες πεπτίδιο πιθανότητες. Τα παράγωγα ταυτοποιήσεις πρωτεΐνη διηθούνται σε ποσοστό λάθους 1% με βάση την πιθανότητα ότι ο καλύτερος αγώνας που λαμβάνονται θα πέσει στην κατανομή των τυχαίων αγώνες βάσης δεδομένων [20]. Η μέθοδος φασματικού καταμέτρησης [21] χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί ο εμπλουτισμός πρωτεΐνης για κάθε διαμέρισμα. Ο συνολικός αριθμός των φασματικών μετρήσεων για κάθε έξοδο ομάδα πρωτεϊνών με ProteinProphet χρησιμοποιήθηκε για την ημι-ποσοτική ανάλυση. Κάθε σύνολο δεδομένων ομαλοποιήθηκε με το συνολικό αριθμό των μετρήσεων σε ολόκληρο το πείραμα. Ο παράγοντας εμπλουτισμού υπολογίστηκε από την ακόλουθη έκφραση: [(C

XP /Nf) 1] /(C

te ρ + 1), όπου C

χ αντιπροσωπεύει μετράει κάθε πρωτεΐνης (ιστ) η υπο-proteome (έκκριση ή κυτταρικής επιφάνειας)? Nf είναι ο συντελεστής κανονικοποίησης (παρουσιάζεται στην κορυφή του πίνακα S1)? C

te είναι οι μετρήσεις για την ίδια πρωτεΐνη (ρ) που παρατηρείται στη συνολική εκχύλισμα του αντίστοιχου κυττάρου. Η προσθήκη 1 στις μετρήσεις επρόκειτο να λάβει υπόψη αυτές τις πρωτεΐνες για τις οποίες δεν παρατήρηση έγινε σε μία από τις υπο-των πρωτεϊνών και αντιπροσωπεύει τον ελάχιστο συντελεστή εμπλουτισμού για τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη.

Αποτελέσματα

πρωτεομική ανάλυση των κυττάρων καρκίνου των ωοθηκών

μια ολοκληρωμένη πρωτεομική προφίλ των κυτταρικών γραμμών OVCAR3, Caov3 και ES2, και ωοθηκικών καρκινικών κυττάρων από τον ασκίτη ενός ασθενούς με καρκίνο των ωοθηκών ορώδες διεξήχθη. Η γενική πειραματική ροή εργασίας αποτελείτο από ανέπαφο κλασμάτωσης πρωτεΐνης που ακολουθείται από την απόκτηση δεδομένων φασματομετρίας μάζας με LC-MS /MS και ανάλυση δεδομένων, όπως περιγράφεται στην Εικόνα 1. Συνολικά, πραγματοποιήσαμε 215 LC-MS /MS τρέχει, οι οποίες αντιστοιχούν σε περισσότερο από δύο εκατομμύρια MS σαρώσεις.

η

Σύνολο κυτταρολύματα.

Ένα χρωματογράφημα ανάστροφης φάσης που αντιπροσωπεύει την κλασμάτωση ακέραιες πρωτεΐνες σε ολόκληρη κυτταρικής λύσης των κυττάρων ES2 παρουσιάζεται στο Σχήμα 2. Συνολικά, το ανάλυση απέδωσε περίπου 3.000 ταυτοποιήσεις πρωτεΐνης υψηλής εμπιστοσύνης για κάθε πληθυσμό κυττάρων που αναλύθηκαν (Σχήμα 3). Ο αριθμός των πρωτεϊνών ταυτοποιήσεων από σύνολο κυτταρικών εκχυλισμάτων από κοινού μεταξύ των τριών κυτταρικών γραμμών ήταν 1,179, και κυμαίνονταν από 2011 να 2267 για δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Α). Κατά μέσο όρο, 655 πρωτεΐνες εξατομικεύονται σε μία κυτταρική σειρά. Εκτός από την βιολογική ετερογένεια, μέρος της μεταβλητότητας σε προσδιορισμένες πρωτεΐνες μεταξύ των κυτταρικών σειρών θα μπορούσε να αποδοθεί σε φασματομετρίας μάζας undersampling χαμηλής πρωτεϊνών αφθονίας.

Το χρωματογράφημα δείχνει το προφίλ της κλασματοποίησης του 1 mg προϊόντος λύσης ολικού κυττάρου. Συλλέξαμε 18 κλάσματα του δείγματος για την περαιτέρω ταυτοποίηση πρωτεΐνης με LC-MS /MS. Η decomplexing των δειγμάτων πριν την ανάλυση LC-MS /MS με ανέπαφη πρωτεΐνη κλασμάτωση βελτιώνει σημαντικά την ταυτοποίηση των χαμηλών πρωτεϊνών αφθονίας [16]. Τα κουτιά κάτω από το προφίλ χρωματογραφίας έδειξε τα κλάσματα αναλύθηκαν. Το στερεό σκοτεινή γραμμή δείχνει την κλίση που χρησιμοποιείται στο χωρισμό.

Η

Βεν διαγράμματα δείχνουν αλληλεπικάλυψη μεταξύ των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται σε διαφορετικούς πληθυσμούς κυττάρων που αναλύθηκαν. A. Ταυτοποιήσεις από προϊόντα λύσης κυττάρων των τριών κυτταρικών σειρών που αναλύθηκαν συνολικά. B. Πρωτεΐνες που προσδιορίζονται στις τρεις υπο-των πρωτεϊνών (προϊόν λύσης ολικού κυττάρου, ρυθμισμένα μέσα και κυτταρικής επιφάνειας). C. Οι πρωτεΐνες που προσδιορίζονται σε καρκινικά κύτταρα εμπλουτίστηκαν από ασκίτη που εμφανίζουν 80% συμφωνία με πρωτεΐνες που προσδιορίζονται στις τρεις κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών. Δ Αριθμός των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται σε κάθε σύνολο δεδομένων. Πίνακας S1 απαριθμεί τις πρωτεΐνες που εντοπίζονται στην παρούσα μελέτη.

Η

πρωτεΐνες κυτταρικής επιφάνειας.

Είμαστε στηρίχθηκε σε μια στρατηγική επισήμανσης με αδιαπέραστο λιπιδίων βιοτίνη για να επισημάνετε και πρωτεΐνες δέσμευσης που εκτίθενται στην κυτταρική επιφάνεια των κυτταρικές γραμμές OVACAR3, Caov3, ES2 και παράγωγα ασκίτη καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 1). Από περίπου 2 × 10

8 κύτταρα, λάβαμε περίπου 500 μg βιοτινυλιωμένου πρωτεϊνών, που αντιπροσωπεύουν περίπου 1-2% της συνολικής μάζας πρωτεΐνης του κυττάρου. Ο κατάλογος των ταυτοποιήσεων πρωτεΐνης παρουσιάζεται στον Πίνακα S1.

πρωτεΐνες που απελευθερώνονται εντός του μέσου.

Οι κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει βαρέα ισότοπα της λυσίνης. Ισοτοπική επισήμανση των πρωτεϊνών που προορίζονται για τη διάκριση μεταξύ των πρωτεϊνών απελευθερώνεται από αναπτυσσόμενα κύτταρα και πρωτεΐνες εγγενή να συμπληρωθούν τα μέσα ενημέρωσης. Μετά από 48 ώρες καλλιέργειας, η συγκέντρωση των πρωτεϊνών αυξήθηκε από 100 μg /ml έως 225 μg /ml σε ρυθμισμένο μέσο των κυττάρων OVCAR3. Λόγω -15% της προβλεπόμενης ανθρώπινης τρυπτικών πεπτιδίων με περισσότερα από 6 αμινοξέα είναι ταυτόσημα μεταξύ ανθρώπινων πρωτεϊνών και των ομολόγων των βοοειδών τους, ισοτοπική επισήμανση των πρωτεϊνών κυτταρικής παρέχεται ένα μέσο για τη διαφοροποίηση ανθρώπινων πρωτεϊνών που εκκρίνονται από καλλιεργημένα κύτταρα από πρωτεΐνες βοοειδούς υπάρχει στο μέσο. Για ασκίτη προερχόμενα κύτταρα, τα μέσα συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες καλλιέργειας με την παρουσία 0,1% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA). Περίπου 1 mg πρωτεϊνών από τα ρυθμισμένα μέσα από κυτταρικές σειρές και τα καρκινικά κύτταρα από ασκίτη κλασματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο χρωματογραφίας αντίστροφης φάσης που χρησιμοποιείται για προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων, και τα μεμονωμένα κλάσματα αναλύονται με LC-MS /MS. Για καλλιεργημένες κυτταρικές γραμμές, οι πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν αποκλειστικά από τα πεπτίδια χωρίς επισημασμένο κατάλοιπα λυσίνης και ότι ήταν ταυτόσημα σε αλληλουχία μεταξύ ανθρώπου και βοοειδών, αποδόθηκαν σε μέσο καλλιέργειας και δεν περιλαμβάνονται στον κατάλογο των πρωτεϊνών που απελευθερώνονται από τα κύτταρα.

Η πρωτεομική προφίλ των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών οδηγήσει στην ταυτοποίηση του 6462 πρωτεϊνών (Σχήμα 3D). Χρησιμοποιήσαμε αυστηρά κριτήρια για ταυτοποιήσεις πρωτεΐνη, θεωρώντας ισχύει μόνο εκείνες τις πρωτεΐνες με ελάχιστο όριο ProteinProphet πιθανότητα 0,9. Για αυτό το όριο, το εκτιμώμενο ποσοστό εσφαλμένης αναγνώρισης είναι μικρότερο από 1%. Αυτό το σύνολο δεδομένων αντιπροσωπεύει την πιο λεπτομερή και πλήρη πρωτεομική μελέτη των κυτταρικών πληθυσμών για τον καρκίνο των ωοθηκών. Το βάθος της ανάλυσης και της κάλυψης επιτυγχάνεται στο επίπεδο της πρωτεΐνης σε αυτή τη μελέτη είναι ισοδύναμο με το βάθος της ανάλυσης για να αποκαλύψει εκφρασμένα γονίδια σε επίπεδο RNA.

διανομής Protein μεταξύ της ενδοκυτταρικής, κυτταρική επιφάνεια και εξωκυτταρικά διαμερίσματα

Μια συγκριτική ανάλυση των πρωτεϊνών σε διάφορα διαμερίσματα επιτρέπει την αξιολόγηση του βαθμού εμπλουτισμού των πρωτεϊνών στην κυτταρική επιφάνεια και στο εξωκυτταρικό διαμέρισμα. Εμείς επικαλέστηκε τη μέθοδο φασματικής μέτρησης [21] για την εκτίμηση εμπλουτισμό πρωτεΐνης για κάθε διαμέρισμα. Μετά την κανονικοποίηση προς το συνολικό αριθμό των φασματικών μετρήσεων, πρωτεΐνες με μεγαλύτερο αριθμό μετρήσεων σε ένα διαμέρισμα (κυτταρική επιφάνεια ή ρυθμισμένο μέσο) σε σύγκριση με τη συνολική κυτταρολύματα εξετάστηκαν εμπλουτισμένο στο εν λόγω διαμέρισμα (Σχήμα 3). Τα αντίστοιχα στοιχεία εμπλουτισμού που παρατηρείται για όλες τις πρωτεΐνες που εντοπίζονται παρουσιάζεται στον Πίνακα S1.

Οι πρωτεΐνες που δόθηκε στα τρία κυτταρικά διαμερίσματα αναλύθηκαν με την εφευρετικότητα Pathways Ανάλυση (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com), καθώς και με αλγόριθμους για την πρόβλεψη των διαμεμβρανικών περιοχών άλφα-έλικα (TMHMM) [22] και για την παρουσία των πεπτιδίων σήματος (SignalP) [23] (Σχήμα 4Α). Αυτή η ανάλυση έδειξε σημαντική συμφωνία μεταξύ αποδειχθεί θέση βασίζεται στην πρωτεομική προφίλ και τις προβλέψεις από την ανάλυση της βάσης δεδομένων μας. Αυτή η συμφωνία ήταν ιδιαίτερα εμφανές για τα κορυφαία εμπλουτισμένο πρωτεΐνες 10%, όταν σε αντίθεση με τις λιγότερο εμπλουτισμένη πρωτεΐνες 10% (Εικόνα 4Β και 4Γ), υποστηρίζοντας τη στρατηγική που χρησιμοποιείται για να αναλύσει συγκεκριμένα διαμερίσματα. Ο σημαντικός αριθμός των πρωτεϊνών περιγράφονται ως πυρηνικό ή κυτταροπλασματικό και παρόντες μεταξύ των ταυτοποιήσεις και στις δύο ρυθμισμένα μέσα και κυτταρική επιφάνεια των πρωτεϊνών υπό-είναι αξιοσημείωτη. Σε κάποιο βαθμό, εμφάνιση αυτών των κυρίως ενδοκυττάριων πρωτεϊνών μπορεί να οφείλεται σε κυτταρική λύση δεδομένου ότι περίπου το 1% των κυττάρων σε καλλιέργεια εκτιμήθηκε να βασίζεται νεκρός μπλε χρώση trypan. Ωστόσο, υπάρχει προηγούμενες ενδείξεις για την εμφάνιση των κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών δεσμεύεται στο εξωκυτταρικό μεμβράνη, ιδιαίτερα στον καρκίνο [24], [25].

A. Η ταξινόμηση κυτταρικού εντοπισμού χρησιμοποιείται ένας συνδυασμός των σχολιασμών από το λογισμικό Ingenuity Pathway Ανάλυση και υπολογιστική πρόβλεψη των διαμεμβρανικών α-έλικα (TMHMM) και πεπτίδια σήμα (SignalP). Β και C. Σύγκριση των top εμπλουτισμένου πρωτεΐνες 10% σε ρυθμισμένα μέσα ή κυτταρικής επιφάνειας (Β και C, αντίστοιχα) με το λιγότερο εμπλουτισμένο κατά 10% καταδεικνύοντας ισχυρή αντιστοιχία μεταξύ της προβλεπόμενης κυτταρική τοποθεσία και το συγκεκριμένο υπο-πρωτεώματος αναλύθηκαν.

οι

οι πρωτεΐνες που εκκρίνονται από τα κύτταρα αναμένεται να διαχέονται μέσα από τους ιστούς και να εισέλθουν στην κυκλοφορία. Ως εκ τούτου, σε αντίθεση με ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες, εκκρινόμενες πρωτεΐνες μπορεί να είναι πιο πιθανό ανιχνεύσιμη στο πλάσμα. Συγκρίναμε τα προφίλ των ωοθηκών κυτταρικής πρωτεΐνης με διαμέρισμα με πρωτεΐνες που αναφέρονται στο Ανθρώπινο Πλάσμα Peptide Atlas [26]. Από το σύνολο των 6462 πρωτεϊνών που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη, 2.341 (36%) εμφανίστηκαν στο πεπτίδιο Atlas ανθρώπινο πλάσμα (Πίνακας S1). Τα κορυφαία 100 πρωτεΐνες που εμπλουτίστηκαν σε ρυθμισμένα μέσα για κάθε ένα από τους κυτταρικούς πληθυσμούς που αναλύθηκαν ήταν περισσότερο υψηλά αντιπροσωπεύονται στο Atlas Πεπτίδιο (65 έως 78%) σε σύγκριση με τη συνολική αναπαράσταση 36%. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι εκκρινόμενες πρωτεΐνες είναι πιο άφθονη στο πλάσμα που μη εκκρινόμενες πρωτεΐνες.

Ομοιότητες μεταξύ κυτταρικών γραμμών και κύτταρα όγκου ασκιτών

Οι τρεις κυτταρικές σειρές σε αυτή τη μελέτη αντιπροσωπεύουν καλά χαρακτηρισμένες

in vitro

μοντέλα για τον καρκίνο των ωοθηκών. OVCAR3 και Caov3 προέρχονται από ορώδες αδενοκαρκίνωμα ωοθηκών ανθρώπου [27], [28] και ES2 προέρχεται από σαφείς καρκίνωμα [29]. Οι διαφορές στην ιστολογία παραλληλίζονται από διαφορές στα προφίλ πρωτεΐνης, όπως αντανακλάται στην ανάλυση συσταδοποίησης χρησιμοποιώντας τις φασματικές μετρήσεις ως μέτρα της πρωτεΐνης αφθονίας (Σχήμα S1). Αυτό είναι εμφανές από τις παρατηρήσεις ότι οι εκκρίνονται και επιφάνεια υπο-των πρωτεϊνών του ES2 είναι σημαντικά διαφορετικές από εκείνες των δύο άλλων κυτταρικών σειρών που αναλύθηκαν.

Τα κύτταρα όγκου εμπλουτίζονται από ασκίτη αναλύσαμε προήλθαν από έναν ασθενή με ορώδες ωοθηκικό αδενοκαρκίνωμα. Ογδόντα τοις εκατό των πρωτεϊνών που εντοπίζονται στα κύτταρα όγκου ασκιτών ταυτοποιήθηκαν επίσης σε μία ή περισσότερες από τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3C). Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα S1, πρότυπα για τα καρκινικά κύτταρα του ασθενούς που απομονώθηκε από ασκίτη έχουν μεγαλύτερη ομοιότητα με Caov3 και OVCAR3 ό, τι με ES2.

Ένας άλλος τρόπος για να αντιπροσωπεύουν ομοιότητες μπορούν να βασίζονται στην παρατήρηση των πρωτεϊνών ήδη γνωστό ότι σχετίζονται με η ασθένεια. Αρκετές καλλικρεϊνών προηγουμένως συνδέονται με αδενοκαρκίνωμα ορώδες ωοθηκικό [30]. KLK6, KLK7 και KLK 9 ήταν άφθονα στο ρυθμισμένο μέσο από τον ασκίτη που προέρχεται κύτταρα όγκου, OVCAR3 και Caov3, αλλά όχι σε ES2 κύτταρο ρυθμισμένα μέσα (Πίνακας S2). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν και πάλι μεγαλύτερη ομοιότητες μεταξύ των κυτταρικών σειρών ορώδης adeonocarcinoma OVCAR3 και Caov3 και τα κύτταρα που προέρχονται όγκου όπως επίσης και τις διαφορές σε σχέση με την εκκαθάριση παράγωγη κυτταρική γραμμή κυττάρων ES2.

παρατηρήθηκαν ορισμένες διαφορές μεταξύ ασκίτη προερχόμενα κύτταρα και κυτταρικές γραμμές. Ορισμένες πρωτεΐνες αποκλειστικά ανιχνεύονται και εμπλουτίζεται στην επιφάνεια ή σε μέσα καλλιέργειας του ασκίτη που προέρχονται καρκινικών κυττάρων. Αυτές περιλαμβάνουν πρωτεΐνες όπως ABP1 (αμιλορίδη ευαίσθητη οξειδάση αμίνη) και ΜΜΡ7 (και mettaloprotease μήτρα 7), οι μεταγραφές για τις οποίες είναι κυρίως άφθονα σε διάφορους υπο-τύπους καρκίνου των ωοθηκών, και άλλοι που κωδικοποιείται από mRNAs με υψηλά επίπεδα έκφρασης σε ειδικές ιστολογικές τύπους καρκίνου των ωοθηκών (Πίνακας S3). Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι πολλές από τις πρωτεΐνες εμπλουτισμένα αποκλειστικά σε καρκινικά κύτταρα από ασκίτη έχουν πολύ χαμηλή έκφραση ιστού σε κανονική ωοθήκη [31] (Πίνακας S3). Αυτές οι πρωτεΐνες είναι πιθανόν προέρχονται από λευκοκύτταρα και mesothelial κύτταρα που θα έχουν συν-καθαρίζεται από υγρό ασκίτη.

Περικοπή των πρωτεϊνών της επιφανειακής μεμβράνης μέσα στο εξωκυττάριο διαμέρισμα

Προς στήριξη της πειραματικής μας και αναλυτική προσέγγιση, βρήκαμε ότι ένα σημαντικό ποσοστό των πρωτεϊνών περιγράφονται ως μεμβράνη πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας, που αντιπροσωπεύουν περισσότερο από το 25% όλων των ταυτοποιημένων πρωτεϊνών όπως για παράδειγμα στην OVCAR3 και παράγωγα ασκίτη καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 4α). Αρκετές από αυτές τις πρωτεΐνες ήταν σημαντικά εμπλουτισμένη τόσο στην κυτταρική επιφάνεια και στο μέσο καλλιέργειας (Πίνακας S4). Η ανάλυση των πεπτιδίων που προσδιορίζονται έδειξε ότι για το μεγαλύτερο μέρος, αυτά τα πεπτίδια που προέρχονται από εξωκυτταρικές περιοχές των πρωτεϊνών κυτταρικής επιφάνειας, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, υποδηλώνοντας εξωτομέα σκόρπισμα.

A. Ταυτοποίηση των πεπτιδίων που εκτείνονται εξωκυτταρικές περιοχές διαμεμβρανικών πρωτεϊνών ανιχνεύθηκαν στα ρυθμισμένα μέσα, σύμφωνα με μια διαδικασία αποβολής. Cdh1 (επιθηλιακό καδερίνης) απεικονίζει καλά αυτή τη διαδικασία, αφού τα πεπτίδια που εκτείνονται μόνο την εξωκυτταρική περιοχή παρατηρούνται σε ρυθμισμένα μέσα ενώ τα πεπτίδια που εκτείνονται τόσο ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών περιοχών ανιχνεύθηκαν στην επιφάνεια των κυττάρων Ovcar3 και ασκίτη. Κόκκινο ίχνη δείχνουν εξωκυτταρικών περιοχών και μπλε ίχνη υποδεικνύουν ενδοκυτταρικές περιοχές. Οι διαμεμβρανικές περιοχές υποδεικνύονται στις κίτρινα κουτιά. Σκούρο πλαίσια δείχνουν πεπτίδια που εντοπίστηκαν. B. κηλίδωση Western του Cdh1 χρησιμοποιώντας ένα ειδικό αντίσωμα εναντίον της ενδοκυτταρικής περιοχής (αντι-Ε-καδερίνης ποντικού κλώνου 36, # 610181, BD Biosciences) αποδεικνύοντας διάσπαση της πλήρους μήκους Cdh1. Δεν υπήρχαν πεπτίδια που προέρχονται από τον ενδοκυτταρικό τομέα σε ρυθμισμένα μέσα.

Η

Επιθηλιακά καδερίνης (Cdh1) απεικονίζει σαφώς τη διαδικασία αποβολής, δεδομένου ότι η κάλυψη αλληλουχία της εξωκυτταρικής περιοχής κυριαρχεί στην εκκρίνεται κλάσμα, ενώ το πεπτίδιο κάλυψη εκτείνονται εντός και εκτός κυτταρικό domains παρατηρήθηκε για την πρωτεΐνη που απομονώνεται από το κλάσμα κυτταρικής επιφάνειας. Συγκρίναμε τα φασματομετρία μάζας συμπεράσματα βασίζονται με ανάλυση κηλίδος Western των ωοθηκική κυτταρική γραμμή και τα καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από ασκίτη. Άθικτα μορφές Cdh1 παρατηρήθηκαν σε προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου, μαζί με χαμηλότερα μοριακά θραύσματα που περιέχουν την ενδοκυτταρική περιοχή. Ωστόσο, σε κύτταρα ασκίτη υπάρχει υπεροχή των θραυσμάτων χαμηλού μοριακού βάρους που περιέχει μόνο την ενδοκυτταρική περιοχή τόσο συνολικά όσο εκχύλισμα κυττάρων και κυτταρική επιφάνεια, υποδεικνύοντας ότι η διαδικασία απόπτωση είναι ευρύτερη σε καρκινικά κύτταρα παρά σε κυτταρικές σειρές. Μορφές Cdh1 περιέχουν την ενδοκυτταρική περιοχή δεν ανιχνεύθηκαν στα ρυθμισμένα μέσα αυτών των κυττάρων (Σχήμα 5Β). Η διαδικασία της εξάπλωσης της Cdh1 έχει πρόσφατα περιγραφεί για ωοθηκών καρκινικά κύτταρα [5], για την υποστήριξη των ερευνών μας φασματομετρία μάζας βάση. Αξιοσημείωτη είναι η παρατήρηση στη μελέτη μας επιπρόσθετων πρωτεϊνών από την οικογένεια cadherin των μορίων προσκόλλησης σε ρυθμισμένα μέσα, όπως νευρικά καντερίνη (CDH2), calsyntenin-1 (CLSTN1), alcadein βήτα (CLSTN3), δεσμογλείνης-1 (DSG1) και δεσμογλεΐνης-2 (DSG2). Με βάση την Ingenuity Pathway Analysis σχολιασμό, οι περισσότερες από αυτές τις πρωτεΐνες μεμβράνης που προσδιορίζονται εμπλουτισμένο στο ρυθμισμένο μέσο σχετίζονται με τις διαδικασίες της κυτταρικής προσκόλλησης και της κίνησης των κυττάρων (Πίνακας S4). Η διαδικασία της διάσπασης και αποβολή δεν είναι ενιαία για όλες τις πρωτεΐνες, όπως έχουμε παρατηρήσει ένα σημαντικό αριθμό πρωτεϊνών εμπλουτισμένο στο κλάσμα κυτταρικής επιφάνειας που δεν ανιχνεύονται στο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας (Πίνακας S4).

ρυθμούς έκκρισης Protein

Αναλύοντας πρωτεΐνες που απελευθερώνονται εντός του μέσου από καλλιεργημένα κύτταρα είναι μια ελκυστική στρατηγική για τον εντοπισμό δυνητικών κυκλοφορούν δείκτες. Το δυναμικό για την ανίχνευση αυξημένων επιπέδων μιας πρωτεΐνης σε κυκλοφορία εξαρτάται εν μέρει από την ταχύτητα με την οποία η πρωτεΐνη απελευθερώνεται στο εξωκυτταρικό χώρο και τελικά το διαμέρισμα αίματος από τον όγκο σε σχέση με άλλους ιστούς. Στη λίστα των πρωτεϊνών πιο εμπλουτισμένο σε μέσα καλλιέργειας σε σχέση με προϊόντα λύσης ολόκληρων κυττάρων ήταν δύο αναστολείς μεταλλοπρωτεασών ιστού (ΤΙΜΡ 1 και Timp2) (Πίνακας S2). Αυτές οι πρωτεΐνες έχουν άμεση διαγνωστική δυναμικό στον καρκίνο των ωοθηκών [32].

αξιολόγησε τον παράγοντα εμπλουτισμού για TIMP1 με ανάλυση Western Blot (Σχήμα 6α). TIMP1 συνέβη κυρίως στην εκκρίνονται διαμέρισμα του όλες τις κυτταρικές σειρές, σύμφωνα με τις προβλέψεις βασίζονται σε φασματική καταμέτρηση. Πραγματοποιήσαμε επίσης μια μέτρηση χρονική πορεία της TIMP1 και συγκέντρωση Timp2 στο ρυθμισμένο μέσο να εκτιμηθεί η ταχύτητα εκκρίσεως αυτών των πρωτεϊνών για όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 6β). TIMP1 δείχθηκε να έχει ένα χαμηλό ρυθμό έκκρισης σε κύτταρα OVCAR3 σε σχέση με άλλες κυτταρικές σειρές, η οποία είναι συνεπής με την ανάλυση μας Western blot. Υπολογίσαμε τα ποσοστά έκκρισης των TIMP1 και Timp2 να είναι της τάξης των νανογραμμαρίων πρωτεΐνης ανά εκατομμύριο κύτταρα, ανά ώρα. Βασισμένο σε ένα ρυθμό έκκρισης των 3 ng της TIMP1 ανά εκατομμύριο κύτταρα ανά ώρα και χωρίς να λαμβάνεται υπόψη το ποσοστό της υποβάθμισης και της κάθαρσης στον ορό, θα λάβει περίπου 10

8-10

9 καρκινικά κύτταρα και αρκετές ημέρες εξόδου για να μεταβάλλουν τα επίπεδα του TIMP1 που συμβαίνουν σε φυσιολογικό ανθρώπινο ορό, η οποία είναι 87 έως 524 ng /ml.

A. Το στύπωμα Western δείχνει την παρουσία του TIMP1 μόνο στα ρυθμισμένα μέσα από όλα τα 4 ωοθηκών καρκινικά κύτταρα. OVCAR3 εκφράζεται σημαντικά λιγότερο TIMP1 σε σύγκριση με τα άλλα κύτταρα. Ίδια μάζα πρωτεΐνης (5μg) φορτώθηκε σε κάθε λωρίδα του πηκτώματος για την ανάλυση αυτή. std αντιστοιχεί στην ανασυνδυασμένη TIMP1 χρησιμοποιηθεί ως πρότυπο ελέγχου? ΤΕ αντιστοιχεί στο λύμα ολόκληρου κυττάρου? SE με ρυθμισμένο μέσο? και SU στην κυτταρική επιφάνεια των πρωτεϊνών. B. η μέτρηση του ρυθμού έκκρισης της TIMP1 και Timp2 χρησιμοποιούνται εμπορικά κιτ ELISA (R &? Συστήματα D). Ρυθμισμένα μέσα αραιώθηκαν 1:15 και 1:60 για την ανάλυση των TIMP1 και Timp2, αντίστοιχα. Ο ρυθμός έκκρισης υπολογίστηκε με βάση την κλίση της καμπύλης σε γραμμική χρονικά σημεία.

Η

Συζήτηση

Σας παρουσιάζουμε εδώ μια σε βάθος πρωτεομική ανάλυση των κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών και του καρκίνου των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων χωριστές αναλύσεις της κυτταρικής επιφάνειας και εκκρινόμενες πρωτεΐνες. Η μελέτη βασίστηκε σε άθικτη κλασματοποίηση πρωτεϊνών ακολουθούμενη από θρυψίνη και LC-MS /MS [16], [33], επιτρέποντας ευαίσθητη ανίχνευση χαμηλών πρωτεϊνών αφθονία. Συνολικά, δημιουργήσαμε ένα εκτεταμένο προφίλ των πρωτεϊνών που αποτελούνται από περισσότερες από 6500 μοναδικές ταυτοποιήσεις με ποσοστό σφάλματος μικρότερο από 1%. Μια πρόσφατη μελέτη του ασκιτικού υγρού που αποτελείται από πρωτεΐνες που προέρχονται από μικτούς πληθυσμούς κυττάρων [12] εντοπίστηκαν 2.737 πρωτεΐνες. 2307 (84%) των πρωτεϊνών που αναφέρθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν περικλείονται μεταξύ των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται στη μελέτη μας.

Η χρήση της φασματικής μετράει ως ένα μέτρο της αφθονίας σε συνδυασμό με τις συγκρίσεις των πρωτεϊνών που βρίσκονται στην κυτταρική επιφάνεια ή εξωκυτταρικό διαμερισμάτων και σε ολόκληρο προφίλ κυτταρικής λύσης, επέτρεψε ταυτοποίηση των πρωτεϊνών εμπλουτίστηκε ιδιαίτερα διαμερίσματα. καταμέτρηση πεπτίδιο παρέχει εκτιμήσεις αφθονίας που συσχετίζονται αρκετά καλά με αυτές που ορίζονται από άλλες μεθόδους [34]. Στη μελέτη μας παρατηρήθηκε επίσης μια καλή συσχέτιση μεταξύ των εκτιμήσεων της αφθονίας του ιστικού αναστολέα της μεταλλοπρωτεϊνάσης 1 (TIMP1) και επιθηλιακά καντερίνη (Cdh1) με βάση την φασματική μέτρηση και αξιολόγηση με βάση την ανάλυση Western blot. Ισοτοπική επισήμανση με SILAC [15] παρέχεται επίσης ένα αποτελεσματικό μέσο για τη διάκριση των πρωτεϊνών σε ρυθμισμένα μέσα που απελευθερώνονται από τα καλλιεργημένα κύτταρα από τις πρωτεΐνες εισφέρει βόειου ορού στο μέσο καλλιέργειας.

Οι αναλύσεις μας έχουν δώσει εικόνα για τη συμβολή του επιφανειακή πρωτεΐνη ρίχνοντας και αφήστε τη σύνθεση της πρωτεΐνης του εξωκυττάριο χώρο. Πρωτεΐνες πολύ εμπλουτισμένο σε μέσα καλλιέργειας αντιπροσωπεύουν μια δυνητική πηγή του κυκλοφορούντος δείκτες για τον καρκίνο των ωοθηκών. Οι μεταγραφές που αντιστοιχούν σε ορισμένες από αυτές τις πρωτεΐνες (π.χ., KLK6, 7 και 9) είναι σχετικά άφθονα σε όγκους των ωοθηκών σε σύγκριση με τους περισσότερους φυσιολογικούς ιστούς [35]. Υπάρχουν ήδη ενδείξεις για την εμφάνιση των περισσότερων από αυτές τις πρωτεΐνες σε φυσιολογικό ανθρώπινο πλάσμα. Από τις 60 πρωτεΐνες που καταγράφονται στον Πίνακα S2, 48 (80%) ήταν παρόντα στο πεπτίδιο Atlas Ανθρώπινο Πλάσμα [26].