Abstract

Πολλαπλές γραμμές απόδειξης προτείνουν ότι ένα μεγάλο μέρος των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος είτε υποφέρουν από υπεργλυκαιμία ή διαβήτη, τα οποία χαρακτηρίζονται από το επίπεδο της γλυκόζης στο αίμα. Ωστόσο, η υποκείμενη βιολογική μηχανισμός του φαινομένου αυτού είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η πολλαπλασιαστική ικανότητα των δύο ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών, BxPC-3 και Panc-1, ρυθμίζεται αυξητικά από υψηλά επίπεδα γλυκόζης σε μια συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο. Περαιτέρω, η δράση προαγωγής των υψηλών επιπέδων γλυκόζης στο μεταγραφής EGF και έκκριση, αλλά όχι υποδοχείς της σε αυτές τις κυτταρικές σειρές PC ανιχνεύθηκε με τη χρήση ενός αντισώματος EGF-εξουδετέρωσης και RT-PCR. Επιπλέον, η μετενεργοποίηση EGFR επάγεται από τα υψηλά επίπεδα γλυκόζης στο συγκέντρωσης- και χρονο-εξαρτώμενη τρόπους σε κύτταρα PC με την παρουσία του αντισώματος EGF-εξουδετέρωσης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η υψηλή γλυκόζη προάγει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος μέσω της επαγωγής της έκφρασης EGF και διενεργοποίησης του EGFR. Τα ευρήματά μας μπορεί να παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τις σχέσεις μεταξύ υψηλού επιπέδου γλυκόζης και PC σε όρους του μοριακού μηχανισμού και να αποκαλύψει μια νέα θεραπευτική στρατηγική για τους ασθενείς PC που πάσχουν ταυτόχρονα είτε από διαβήτη ή υπεργλυκαιμίας

Παράθεση:. Han L, Ma Q, Li J, Liu H, Λι W, Ma G, et al. (2011) Υψηλή Γλυκόζη Προωθεί καρκίνο του παγκρέατος πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω της επαγωγής της έκφρασης και EGF διενεργοποίησης του EGFR. PLoS ONE 6 (11): e27074. doi: 10.1371 /journal.pone.0027074

Επιμέλεια: Xin-γιουάν Guan, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 7 Ιουλ 2011? Αποδεκτές: 9η Οκτωβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 8 Νοεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Han et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Φυσικό Επιστημονικό Ίδρυμα της Κίνας (No.81172360 (σε QM), No.30900705 (σε JL)), ένα 13115 μεγάλο έργο της επαρχίας Shaanxi 2010ZDKG-49 (για QM), ΝΔ EPSCoR (σε EW ), και Πιλοτική Grant έργου (σε EW) από τα Κέντρα Ιατροβιολογικών Ερευνών αριστείας (COBRE) χορηγεί ΝΙΗ P20 RR020151 από το Εθνικό Κέντρο Έρευνας Πόρων (NCRR). NCRR είναι ένα συστατικό του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας (NIH). Το περιεχόμενο της έκθεσης αυτής είναι αποκλειστική ευθύνη των συγγραφέων και δεν εκφράζουν απαραίτητα τις επίσημες απόψεις του ΝΙΗ ή NCRR. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο σακχαρώδης διαβήτης και therioma είναι εξοικειωμένοι ασθένειες που επηρεάζουν δραματικά την ανθρώπινη υγεία σε όλο τον κόσμο. Επιδημιολογικές ενδείξεις υποδεικνύουν ότι οι ασθενείς με διαβήτη διατρέχουν σημαντικά υψηλότερο κίνδυνο ανάπτυξης πολλών τύπων καρκίνων, ιδιαίτερα των καρκίνων του παγκρέατος, του μαστού, του ήπατος, του οισοφάγου, και παχύ έντερο [1]. Το πάγκρεας εμπλέκεται τόσο σακχαρώδη διαβήτη και τον καρκίνο του παγκρέατος. Ο διαβήτης συνήθως διαιρείται σε δύο μεγάλες υποκατηγορίες, τύπου 1 και τύπου 2? από αυτά, τύπου 2 διαβήτη μετοχές πολλούς παράγοντες κινδύνου με τον καρκίνο. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι περίπου το 80% των ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος (PC) υποφέρουν από είτε υπεργλυκαιμία ή διαβήτη, και τα δύο από τα οποία μπορούν να ανιχνευθούν στο προσυμπτωματική φάση του PC [2]. Οι ασθενείς με καρκίνο με διαβήτη είναι κυρίως τύπου 2 στη φύση [3]. Για τις γνώσεις μας, λίγες μελέτες μέχρι σήμερα έχουν διερευνηθεί το σύνδεσμο μεταξύ του καρκίνου και του διαβήτη τύπου 1. Επιπλέον, δεν υπάρχει συναίνεση μέχρι σήμερα όσον αφορά την αιτιώδη σχέση μεταξύ σακχαρώδη διαβήτη και PC επειδή η φύση του σωματείου πιστεύεται ότι είναι πολύπλοκη. Λόγω του διαβήτη που σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο PC, είναι γεγονός ότι μεγάλος αριθμός ασθενών PC πάσχουν από αυξημένα επίπεδα γλυκόζης. Όταν η γλυκόζη του αίματος σε ασθενείς με PC είναι καλά ελεγχόμενη, ο χρόνος επιβίωσης των ασθενών μπορεί να παραταθεί, υποδηλώνοντας ότι η υψηλή γλυκόζη θα μπορούσε να προωθήσει άμεσα την εξέλιξη της PC [4]. Πρόσφατη μελέτη μας έδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα γλυκόζης που προωθούνται κυτταρικό πολλαπλασιασμό μέσω της ρύθμισης της έκφρασης του νευροτροφικού παράγοντα από νευρογλοιακή κυτταρική σειρά που προέρχεται (GDNF) και RET σε PC κύτταρα [5]. Σε μια άλλη μελέτη, δείξαμε ότι η υπεργλυκαιμία, ένας κοινός παράγοντας σύγχυσης που συνδέεται με τον υπολογιστή, μπορεί να συμβάλει στην περινευρικό εισβολή [6]. Ωστόσο, ο μηχανισμός πίσω από αυτή τη διαδικασία δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητός.

επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) είναι μια χαμηλού μοριακού βάρους (Mr = 6,045), πολυπεπτίδιο που παράγει υπερπολλαπλασιασμό των επιδερμικών ιστών όταν χορηγούνται σε ζώα [7]. Στο PC, μια ποικιλία παραγόντων ανάπτυξης εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα. Η υπερέκφραση του EGF και /ή ΤΟΡ-α και EGFR σε περισσότερα κύτταρα PC παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη των κυττάρων PC [8]. Η ταυτόχρονη παρουσία του EGFR και συνδέτη, EGF, συνδέεται με αυξημένη επιθετικότητα του όγκου και μικρότερο χρόνο επιβίωσης [9]. Οι βιολογικές λειτουργίες των καρκινικών κυττάρων είναι αξιοσημείωτα καταστέλλονται όταν ειδικούς αναστολείς αναστέλλουν τη φωσφορυλίωση του EGFR. Η οδός EGF-EGFR έχει πρόσφατα ανακαλυφθεί ως βασικό θεραπευτικό στόχο στον καρκίνο του πνεύμονα. Ωστόσο, δεν υπάρχει καμία μελέτη σχετικά με το αν οι συγκεντρώσεις γλυκόζης επηρεάζουν την έκφραση του EGF και EGFR σε PC.

Εκτός από το ρόλο του στη σύνδεση EGF, EGFR εξυπηρετεί έναν κεντρικό ρόλο ως κεντρικό μετατροπέα ετερόλογων συστήματα σηματοδότησης ως αποτέλεσμα της τρανσενεργοποίησης του [10]. Η διενεργοποίηση του EGFR από διαφορετικές διεγέρσεις, όπως συζευγμένου με πρωτεΐνη υποδοχείς, κυτοκίνες, ή κυτταρικού στρες, παρέχει ένα μηχανισμό για την EGFR να ενσωματώσει αυτές τις εξωκυτταρικά σήματα και ενεργεί ως σταθμός αναμετάδοσης στον μεταγραφικό μηχανισμό. Υψηλή γλυκόζη έχει πρόσφατα δειχθεί ότι διενεργοποιεί EGFR σε νεφρική νόσο [11]. Ωστόσο, αν η τρανσενεργοποίηση του EGFR συμβαίνει σε PC δεν είναι σαφής.

Για να διερευνήσουν το πόσο υψηλή γλυκόζη προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC, ερευνήσαμε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την έκφραση των δύο EGF και EGFR σε απόκριση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις γλυκόζης στο τα κύτταρα PC. Μέσω διαλογής, δύο διαφορετικά κύτταρα διαφοροποίηση PC BxPC-3 (υψηλή διαφοροποίησης) και Panc-1 (χαμηλή διαφοροποίηση) ήσαν επέλεξε στη μελέτη. Επιπλέον, εξετάσαμε τη σκοπιμότητα του EGFR διενεργοποίησης στο PC, το οποίο συμμετέχει στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινα κύτταρα PC-3 BxPC και Panc-1 αγοράστηκαν από την American Type Tissue Collection ([ATCC], USA). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (ϋΜΕΜ) (Life Technologies, USA) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (FBS) και επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στον αέρα. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε μέσο με συγκεντρώσεις γλυκόζης που κυμαίνονται από 5,5 έως 50 mM για 12 ώρες, 24 ώρες, ή 48 ώρες για να μελετηθεί η επίδραση της συγκέντρωσης της γλυκόζης.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

BxPC-3 και τα κύτταρα Panc-1 σπάρθηκαν σε πλάκες ιστοκαλλιέργειας 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5.000-10.000 κυττάρων ανά φρεάτιο 24 ώρες πριν από τη ορού λιμοκτονία. Μετά ασιτία ορού για 24 ώρες, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM με συγκεντρώσεις γλυκόζης που κυμαίνονται από 5,5 έως 50 mM στους 37 ° C. Μετά από 12 ώρες, 24 ώρες, ή 48 ώρες, το μέσο απομακρύνθηκε, και το αντιδραστήριο ΜΤΤ (3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Μετά από επώαση στους 37 ° C επί 4 ώρες, 150 μΙ DMSO προστέθηκε στα κύτταρα. Οι οπτικές πυκνότητες (OD) στα 490 nm μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακός (ΒΙΟ-TEC Inc, VA). Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού ορίστηκε ως OD (κύτταρα πλάκα) /OD (κενό πλάκα).

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και στη συνέχεια εκτίθενται σε 3% Η

2O

2 για 10 λεπτά για να εμποδίσει ενδογενούς υπεροξειδάσης. Τα κύτταρα επωάστηκαν σε μη άνοσο ορό αποκλεισμού για 15 λεπτά για να εμποδίσει μη ειδικών θέσεων σύνδεσης ανοσοσφαιρίνης και στη συνέχεια επωάζονται με κουνελιού αντι-ΕΟΡ πολυκλωνικό αντίσωμα (Sigma-Aldrich Inc.) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Μετά την πλύση με PBS 3 φορές, τα κύτταρα επωάστηκαν με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) κατσίκας αντι-χάμστερ IgG Αρμενικά (Jackson Immuno Research) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε ένα σκοτεινό θάλαμο. Μετά από πλύση με PBS για 5 λεπτά και DMEM ελεύθερο ορού για άλλα 5 λεπτά, τα κύτταρα τοποθετούνται σε Fluoromount-G (Southern Biotech). Ως αρνητικός έλεγχος, το πρωτογενές αντίσωμα αντικαταστάθηκε από αραιωτικό αντισώματος.

μεταγραφή-αλυσωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR)

Ολικό RNA από κύτταρα PC εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απομόνωσης RNA Fastgen200 Kit (Fastgen, Σαγκάη, Κίνα) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ολικό RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας την Fermentas RevertAid ™ Kit (ΜΒΙ Fermentas, Καναδάς). EGF PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός κύκλου 94 ° C για 3 λεπτά, ακολουθούμενη από 35 κύκλους των 94 ° C για 30 s, 60 ° C για 30 s, και 72 ° C για 35 s. EGFR και β-ακτίνης ενισχύθηκαν ως εξής: μετά τη μετουσίωση στους 94 ° C για 3 λεπτά, 35 κύκλοι των 94 ° C για 30 s, 58 ° C για 30 s, και 72 ° C για 35 s χρησιμοποιήθηκαν. Τα δείγματα έτρεξαν εις τριπλούν, και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Η γονιδιακή έκφραση προσδιορίστηκε ποσοτικά με κανονικοποίηση σε β-ακτίνη. Οι αλληλουχίες εκκινητών ήταν ως εξής:

β-ακτίνης-F: 5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3 ‘

β-ακτίνης-R:. 5′-AGGAAGAAGGCTGGAAGAGTG-3′.

EGFR-F: 5′-GGTGGCTGGTTATGTCCTCATTG-3 ‘.

EGFR-R: 5′-AGTTTCTGGCAGTTCTCCTCTCC-3′

EGF-F:. 5′-TGTCTGCGTGGTGGTGCTTG-3 ‘ .

EGF-R:. 5′-CTGCGACTCCTCACATCTCTGC-3 ‘

Η

κηλίδωση Western

οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε πολυβινυλιδενίου διφθοριούχο μεμβράνες. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 10% αποβουτυρωμένο γάλα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-ανθρώπινα αντισώματα έναντι EGF ή EGFR (Sigma-Aldrich Inc.) ή ρ-EGFR (Cell Signaling) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά από πλύση 3 φορές, τα στυπώματα επωάστηκαν με αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα κατσίκας συζευγμένο με υπεροξειδάση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η ειδική σύνδεση ανιχνεύθηκε με το ενισχυμένο σύστημα χημειοφωταύγειας (Sigma-Aldrich Inc.).

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS (version16.0, SPSS Inc. Chicago, USA) . Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Πολλαπλές συγκρίσεις ομάδα επιτεύχθηκαν με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από την post hoc δοκιμασία Bonferroni.

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν ανεξάρτητα τουλάχιστον τρεις φορές.

Αποτελέσματα

Υψηλή γλυκόζη προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC

Για να διερευνηθεί η επιρροή των επιπέδων της γλυκόζης στην κυτταρική ανάπτυξη, τα κύτταρα επωάστηκαν σε μία σειρά βαθμιαία αυξανομένων συγκεντρώσεων γλυκόζης για 12 ώρες, 24 ώρες, και 48 ώρες. Σε BxPC-3 κύτταρα και Panc-1 κύτταρα, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων αυξήθηκε κατά εξαρτώμενο από τη δόση τρόπο σε συγκεντρώσεις γλυκόζης 5,5 mM (ως μάρτυρας), 25 mM, και 50 mM, σε 12 ώρες, 24 ώρες, 48 ώρες , αντίστοιχα (

ρ

& lt? 0,05). (. Εικ. 1Α και Σχήμα 1Β)

τα κύτταρα εκτέθηκαν σε μέσο με συγκεντρώσεις γλυκόζης που κυμαίνονται από 5,5 έως 50 mM για 12, 24, ή 48 h. ΜΤΤ δοκιμασία αναλύθηκε για ρυθμούς πολλαπλασιασμού (5,5 mM ως μάρτυρας). (Α, Β) δείχνει τα ποσοστά πολλαπλασιασμού που αντιστοιχούν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις γλυκόζης σε BxPC-3 και Panc-1 κύτταρα. (C, D) δείχνει τα ποσοστά πολλαπλασιασμού που αντιστοιχούν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις γλυκόζης σε BxPC-3 και Panc-1 κύτταρα κατεργασμένα με αντίσωμα EGF-εξουδετέρωσης (

* ρ

& lt? 0,05 σύγκριση με την ομάδα σε 5,5 mM γλυκόζης?

# p

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα σε 25 mM γλυκόζης? n = 8 ανά ομάδα). (Ε, F) δείχνει τη σύγκριση των ποσοστών πολλαπλασιασμού πριν και μετά τη θεραπεία με αντίσωμα EGF εξουδετέρωσης με τις διαφορετικές συγκεντρώσεις γλυκόζης σε BxPC-3 και τα κύτταρα Panc-1 κατά το χρόνο σημείο 24 h (

* ρ

& lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα του χωρίς EGF αντισώματος εξουδετέρωσης)

η

Εμείς προσδιορίζεται το ποσοστό του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετά από θεραπεία με αντισώματα EGF-εξουδετέρωσης [12].. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 1C και 1D, αυξημένη κυτταρική ανάπτυξη του BxPC-3 και τα κύτταρα Panc-1 υποβάλλεται σε επεξεργασία με αντίσωμα EGF-εξουδετέρωσης παρατηρήθηκε σε απάντηση στις συγκεντρώσεις γλυκόζης που κυμαίνονται από 5,5 mM έως 50 mM (

ρ

& lt ? 0,05) (Σχ 1C και Εικ 1D)… Συγκρίνοντας με τα κύτταρα χωρίς αντίσωμα EGF-εξουδετέρωσης, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μειώθηκε κατά ένα μικρό περιθώριο σε συγκεντρώσεις γλυκόζης 5,5 mM και 25 mM, αλλά έδειξε μια αξιοσημείωτη πτώση στα 50 mM γλυκόζη στα κύτταρα EGF-εξουδετερωτικού αντισώματος προεπεξεργασία (Εικ. 1 Ε και 1 F ).

έκφραση του EGF σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα

έχει αποδειχθεί ότι ο EGFR έχει εκτεταμένη έκφραση στην κυτταρική επιφάνεια των κυττάρων PC [8]. Για να εξεταστεί η έκφραση του EGF σε BxPC-3 και τα κύτταρα Panc-1, χρησιμοποιήσαμε φθορισμό σημασμένο ειδικό αντίσωμα για την επισήμανση EGF κυττάρων, και τα σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φθορίζον μικροσκόπιο. Μεγάλοι αριθμοί επισημασμένου ανοσοφθορισμού κόκκοι ανιχνεύθηκαν στο κυτόπλασμα αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 2). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν την έκφραση του EGF σε κύτταρα PC.

Τα κύτταρα σημάνθηκαν με ειδικό αντίσωμα φθορισμού συζευγμένο με EGF (πράσινο) και στα δύο κύτταρα BxPC-3 (Εικ. 2Α, 2Β) και Panc-1 (Σχ. 2C, 2D) (200 Χ). Κόκκοι με πράσινο φθορισμό είναι εμφανή στο κελί του πλάσματος, αλλά όχι στον πυρήνα και στα δύο BxPC-3 και Panc-1 κύτταρα (Σχ. 2Α και το σχ. 2C). Σύκο. 2Β και Σχ. 2D ήταν η χρώση πυρήνα με DAPI.

Η

Πρόκληση EGF mRNA και της πρωτεΐνης, αλλά χωρίς προφανή αλλαγή στην έκφραση του EGFR, υπό υψηλή γλυκόζη διέγερση

RT-PCR ανάλυση αποκάλυψε ότι τόσο EGF και EGFR εκφράστηκαν στις δύο BxPC-3 και Panc-1 κύτταρα (Εικ. 3). Το επίπεδο έκφρασης του EGF mRNA σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές επάνω ρυθμίζονται σε απόκριση της γλυκόζης διέγερση με τρόπο που εξαρτάται της δόσης από 5,5 έως 50 mM σε όλα τα χρονικά σημεία (

ρ

& lt? 0,05). Οι αλλαγές μεταξύ 5,5 και 25 mM ήταν ιδιαίτερα σημαντική (Σχ. 3Α και 3Β). Ωστόσο, η έκφραση του EGFR mRNA διατήρησε ένα σταθερό επίπεδο ανεξαρτήτως της συγκέντρωσης γλυκόζης ή χρονικό σημείο (

σ

& gt? 0,05). (Δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα)

Το επίπεδο έκφρασης του EGF mRNA αυξήθηκε σταδιακά σε απόκριση σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις γλυκόζης (5,5 έως 50 mm) σε μέσο καλλιέργειας (5,5 mM ως μάρτυρας) (

* ρ

& lt? 0,05 σύγκριση με την ομάδα σε 5,5 mM γλυκόζης?

# p

& lt? 0,05 σύγκριση με την ομάδα σε 25 mM γλυκόζη? η = 8 ανά ομάδα). Η αλλαγή αυτή ήταν ιδιαίτερα σημαντική μεταξύ 5,5 και 25 mM γλυκόζης. Ωστόσο, η έκφραση του EGFR mRNA διατηρείται μια σταθερή παρέμεινε αμετάβλητη (

σ

& gt? 0,05). (Α, Β) δείχνει έκφραση EGF mRNA σε BxPC-3 και Panc-1 κύτταρα? (C, D) δείχνει έκφραση πρωτεΐνης EGF σε BxPC-3 και Panc-1 κύτταρα.

Η

Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης του EGF και EGFR σε BxPC-3 και τα κύτταρα Panc-1 προσδιορίστηκαν με κηλίδωση Western (Εικ. 3), και τα αποτελέσματα ήταν συνεπή με εκείνα των πειραμάτων RT-PCR (

ρ

& lt? 0,05) (Σχ 3C και 3D.). Είναι γνωστό ότι ο EGF, ένα ουσιαστικό παράγοντα ανάπτυξης, ασκεί μια κρίσιμη μιτογονικό αποτέλεσμα σε αμφότερες τις μη-κακοήθη και κακοήθη κύτταρα [13]. Ως εκ τούτου, με βάση την παρατήρηση μας, είναι αυτονόητο ότι ο μηχανισμός δράσης μέσω του οποίου υψηλή γλυκόζη επιδρά στα κύτταρα PC θα μπορούσε, μέσω της προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης EGF.

Η διενεργοποίηση του EGFR που προκαλείται από υψηλά επίπεδα γλυκόζης

Η ενεργή κατάσταση του EGFR αξιολογήθηκε με το επίπεδο της φωσφορυλίωσης του EGFR. Εκτός από EGF ενεργοποίηση EGFR, άλλοι παράγοντες, όπως ΗΒ-ΕΟΡ, Ang II και αλδοστερόνης, είναι γνωστό ότι διενεργοποιεί EGFR [14], [15], [16]. Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε ότι η υψηλή γλυκόζη είναι επίσης μεταξύ των παραγόντων που μπορούν να προκαλέσουν τη μετενεργοποίηση των EGFR. Για να καταργήσει πλήρως την επίδραση του EGF, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1 μg /ml του αντισώματος EGF-εξουδετέρωσης πριν από τη θεραπεία της γλυκόζης. Όταν BxPC-3 και τα κύτταρα Panc-1 καλλιεργήθηκαν στο μέσο που περιέχει 25 mM γλυκόζη, το επίπεδο φωσφορυλίωσης του EGFR αυξήθηκε σταδιακά, με τρόπο που εξαρτάται φορά (10 λεπτά, 30 λεπτά, 60 λεπτά, 6 ώρες, 12 ώρες, 24 ώρες ) (

σ

& lt?. 0,05) (Σχήμα 4). Ως έλεγχος, τα επίπεδα φωσφορυλίωσης στα κύτταρα ανιχνεύθηκαν με την παρουσία 5.5 mM γλυκόζης. Το επίπεδο της φωσφορυλίωσης του EGFR σε 5,5 mM γλυκόζης ήταν χαμηλότερη σε σύγκριση με το 25 mM γλυκόζη κατάσταση σε ένα χρόνο εξαρτώμενο τρόπο (10 λεπτά, 30 λεπτά, και 60 λεπτά) (Σχ. 4Α και 4Β).

ΕΟΡ- εξουδετερωτικό αντίσωμα (1 μg /ml) προστέθηκε σε κύτταρα πριν από τη θεραπεία υψηλής γλυκόζης. Τα στοιχεία για ρ-EGFR% προέρχεται από την αναλογία του ρ-EGFR και EGFR. Οι διαφορές στα επίπεδα φωσφορυλίωσης ήταν διαφορετικές μεταξύ 5,5 και 25 mm γλυκόζη. Το επίπεδο φωσφορυλίωσης σε απόκριση 25 mM γλυκόζη αυξήθηκε ταχέως σε BxPC-3 και τα κύτταρα Panc-1 (Σχ. 4). Το επίπεδο φωσφορυλίωσης σε απόκριση συγκέντρωση γλυκόζης 5,5 mM ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη (10 λεπτά, 30 λεπτά, και 60 λεπτά)? το έκανε αύξηση αργά, αλλά ήταν αμυδρή, στα κύτταρα BxPC-3 και Panc-1 (Σχ. 4Α και 4Β).

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι ο πολλαπλασιασμός των BxPC-3 και Panc-1 κύτταρα επηρεάστηκε από διαφορετικές συγκεντρώσεις της γλυκόζης σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Δείξαμε επίσης την επίδραση των επιπέδων γλυκόζης στο EGF και των υποδοχέων του σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές PC. Επιπλέον, βρήκαμε ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης προκάλεσε μια σημαντική αύξηση στη μεταγραφή και έκκριση EGF αλλά δεν μετέβαλε την έκφραση του EGFR. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η υψηλή γλυκόζη επαγόμενη μετενεργοποίηση EGFR σε μια συγκέντρωση και το εξαρτώμενο από το χρόνο τρόπο BxPC-3 και Panc-1 κύτταρα παρουσία του αντισώματος EGF-εξουδετέρωσης.

PC είναι από τις πιο θανατηφόρες των καρκίνων? περίπου 75% των ασθενών πεθαίνουν μέσα σε 1 χρόνο από τη διάγνωση, και μόνο το 5% ή λιγότερο επιβιώσουν για 5 έτη [17]. Λόγω αυτής της κακής πρόγνωσης, ο εντοπισμός των τροποποιήσιμων παραγόντων κινδύνου για PC είναι ζωτικής σημασίας. Επί του παρόντος, υπάρχουν ενδείξεις ότι ο διαβήτης και η υπεργλυκαιμία μπορεί να εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου του παγκρέατος. Αν και μακροχρόνιο διαβήτη είναι αποδεκτή παράγοντας κινδύνου για PC, μια πρόσφατη έκθεση αποκάλυψε ότι ο διαβήτης μπορεί να προκληθεί από το PC, και ότι ο υπολογιστής είναι μια διαβητογενείς κατάσταση [2]. Επί του παρόντος, η βασική αιτιότητα μεταξύ σακχαρώδη διαβήτη και το PC δεν έχει επιτευχθεί συναίνεση. Στη μελέτη μας, η συγκέντρωση γλυκόζης μπορεί να είναι ένας σημαντικός αιτιώδης σύνδεσμος μεταξύ σακχαρώδη διαβήτη και PC, όπως υπάρχει υπεργλυκαιμία στο μικροπεριβάλλον του όγκου [1], [18], μελετήσαμε την επίδραση της υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και να διερευνηθεί το ενδεχόμενο μηχανισμό.

Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η υψηλή γλυκόζη (25, 50 mM) θα μπορούσε να αυξήσει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC σε σύγκριση με χαμηλή γλυκόζη (5,5 mM). Η διεγερτική δράση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε PC μπορεί να είναι μέσω επιταχύνοντας την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, όπως συμβαίνει σε αγγειακά αρουραίου κύτταρα λείου μυός και των ανθρωπίνων κυττάρων καρκίνου του μαστού [19], [20]. Αυτή η υψηλή γλυκόζη επαγόμενη έκφραση EGF υποδηλώνει υπάρχει ένα μονοπάτι για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε απόκριση της γλυκόζης διέγερση. Ωστόσο, όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με αντίσωμα EGF-εξουδετέρωσης, η αύξηση στον πολλαπλασιασμό σε απόκριση της γλυκόζης ακόμη συνέβη (Σχ. 1C και 1D). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η υψηλή γλυκόζη μπορεί να προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω μονοπατιών εκτός από EGF. Κατά τη σύγκριση των ποσοστών πολλαπλασιασμού των κυττάρων με ή χωρίς αγωγή με αντίσωμα EGF-εξουδετέρωσης, μια μικρή μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων βρέθηκε στην παρουσία ενός αντισώματος EGF-εξουδετέρωσης στο 5,5 και 25 mM γλυκόζη. Σημαντικές διαφορές ήταν εμφανείς στα 50 mM γλυκόζη (Εικ. 1 Ε και 1 F). Ως εκ τούτου, ο EGF μπορεί να παίζει ένα ρόλο μερική, αντί για ένα μοναδικό ρόλο, στην επίδραση της χαμηλής (5.5 mM) ή υψηλή γλυκόζη (25 mM) επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Επιπλέον, όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε υψηλή γλυκόζη (50 mM), EGF μπορεί να παίζει πιο σημαντικό ρόλο στην διέγερση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων παρά σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις γλυκόζης.

EGF επάγει υπερπολλαπλασιασμό των επιδερμικών ιστών και ενισχύει όγκου προώθηση δράσεις, όπως ο πολλαπλασιασμός και η μετάσταση κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου. Ως εκ τούτου, EGF και EGFR ήταν στην πρώτη γραμμή της έρευνας σηματοδότησης και έχουν στόχους στην ανάπτυξη θεραπευτικών [9]. EGF και EGFR εκφράζονται ευρέως σε κακοήθεις καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων PC. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι οι επιδράσεις της υψηλής γλυκόζης στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό εμφανίστηκε μέσω της ρύθμισης των επιπέδων EGF και EGFR mRNA και πρωτεΐνης σε PC. Παρατηρήσαμε ότι μία συνέπεια της υψηλής γλυκόζης ήταν η αυξημένη έκφραση του EGF (Σχ. 3), το οποίο είναι εξαιρετικά ευαίσθητο σε συγκέντρωση γλυκόζης. Σε αντίθεση με τον συνδετήρα αυτού, EGFR επηρεάστηκε ελάχιστα από υψηλά επίπεδα γλυκόζης. Τα αποτελέσματά μας ενοχοποιηθεί EGF ως δυνητικού παράγοντα για την επίδραση της υψηλής γλυκόζης στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αλλά είναι απίθανο να έχει διαδραματίσει έναν μοναδικό ρόλο σε αυτή την περίπτωση επειδή άλλοι παράγοντες κύτταρο, όπως GDNF και RET [5], και ακόμη άγνωστες συνθήκες /παράγοντες, θα μπορούσε να φέρει θετικά αποτελέσματα για την αντιμετώπιση της υψηλής γλυκόζης. Η σαφής σχέση μεταξύ σακχαρώδη διαβήτη και τον υπολογιστή και, στη συνέχεια, εξακολουθεί να χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση.

Warburg αποτέλεσμα, το οποίο περιγράφει ότι τα καρκινικά κύτταρα προτιμούν γλυκόλυση πάνω από οξειδωτική φωσφορυλίωση για να παράγουν ΑΤΡ, είναι ότι τα καρκινικά κύτταρα έχουν υψηλότερο μεταβολισμό από την πρόσληψη περισσότερα γλυκόζη σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα [21]. Οι αλλαγές στην κατανάλωση γλυκόζης και βιοσυνθετικών δραστικότητα των αμινοξέων, τα λιπίδια και τα νουκλεοτίδια είναι μεταβολικές αλλαγές για τη διατήρηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα [22]. Το οξειδωτικό στρες παίζει ζωτικό ρόλο στη σχέση μεταξύ φαινόμενο Warburg και καρκινικά κύτταρα [23]. Επιπλέον, ορισμένοι ερευνητές βρήκαν ότι αποσύμπλεξη του αποτελέσματος Warburg από καρκίνο θα μπορούσε να μειώσει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [21]. Έτσι, το αποτέλεσμα Warburg σε καρκινικά κύτταρα ίσως να παρέχει εν μέρει κατανοητό δίκτυο μεταξύ γλυκόζης και PC.

μετενεργοποίηση EGFR μέσω G-πρωτεΐνη υποδοχέα (GPCR) αγωνιστές, όπως Ang II, αλδοστερόνη [14], [15], β-αδρενεργικών υποδοχέων [16], και η θρομβίνη [24], έχει επίσης μελετηθεί ιδιαίτερα καλά. Τα υψηλά επίπεδα γλυκόζης έχουν πρόσφατα δειχθεί να διενεργοποιεί EGFR σε καλοήθεις νόσους [11]. Διενεργοποίησης του EGFR με υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης παρατηρήθηκε σε κύτταρα PC στη μελέτη μας. Η συγκέντρωση γλυκόζης μπορεί να είναι ένας σημαντικός αιτιώδης σύνδεσμος μεταξύ σακχαρώδη διαβήτη και PC. Χρησιμοποιήσαμε ένα αντίσωμα EGF-εξουδετέρωσης να αναστέλλουν την επίδραση του EGF στην ενεργοποίηση EGFR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το επίπεδο φωσφορυλίωσης του EGFR αυξήθηκε αξιοσημείωτα, ακόμα και εμφανίστηκαν νωρίτερα, όταν τα κύτταρα είχαν εκτεθεί σε υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης (Εικ. 4). Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε τη μετενεργοποίηση των EGFR από υψηλά επίπεδα γλυκόζης σε κύτταρα PC, αλλά δεν είχαμε ερευνήσει το εσωτερικό μηχανισμό μετενεργοποίησης. Μια πρώιμη μελέτη έδειξε ότι θα μπορούσε να τονώσει GPCRs μεταλλοπρωτεϊνάσες, οι οποίες επαγόμενη διάσπαση του συνδέτη προδρόμων τύπου EGF, με αποτέλεσμα την φωσφορυλίωση του EGFR [25]. Έχει επίσης προταθεί ότι η σηματοδότηση EGFR παίζει κεντρικό ρόλο στην παθογένεση του καρκίνου και την εξέλιξη [26]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη και επιβίωση των καρκινικών κυττάρων φαίνεται να υφίσταται κάποιο δίκτυο υποδοχέων /συνδετών της οικογένειας EGF. Έχουμε λόγο ότι διενεργοποίησης του EGFR μπορεί να είναι το κύριο μονοπάτι για να επάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε απόκριση υψηλής γλυκόζης. Διενεργοποίησης του EGFR είναι ένα σημαντικό μέρος της εξέλιξης του καρκίνου, αν και η διαδικασία είναι πολύπλοκη και ακόμη δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Είναι πιθανό ότι EGFR είναι ένα κεντρικό στοιχείο στη μεταγωγή σήματος των κυττάρων και προκαλεί την ενεργοποίηση του ras /raf μονοπάτι /ΜΕΚ /ΜΑΡΚ [27], [28], [29] και PI3K [30]. Πόσο υψηλή γλυκόζη επηρεάζει η σχετική σηματοδοτικό μονοπάτι του EGFR δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητή, και απαιτείται περαιτέρω μελέτη.

Πρόσφατα, Ke-Ping Xu et al. ανέφεραν ότι η υψηλή γλυκόζη έβλαψε την EGFR-φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης /Akt μονοπάτι, με αποτέλεσμα καθυστερημένη επούλωση του κερατοειδούς επιθηλιακών πληγών [31]. Στις μελέτες τους, υψηλή γλυκόζη μειωμένη φωσφορυλίωση του EGFR πιθανόν μέσω αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS). Το αποτέλεσμα αυτό φαίνεται να έρχεται σε αντίθεση με τη δική μας. Η σχέση μεταξύ της υψηλής γλυκόζης και ασθενειών είναι μάλλον πολύπλοκη. Υψηλή γλυκόζη έχει διάφορες δράσεις σε ανόμοια όργανα-στόχους. Για παράδειγμα, η υψηλή γλυκόζη διεγείρει την ανάπτυξη των κυττάρων ή υπερπλασία σε καρκίνο του παγκρέατος [5], του καρκίνου του μαστού [19] και μεσαγγειακά κύτταρα [11], [32], αλλά μειώνει την ανάπτυξη των κυττάρων σε κερατοειδή [31] και του καρκίνου του προστάτη [33]. Επιπλέον, ο μηχανισμός της υψηλής γλυκόζης επί της φωσφορυλίωσης του EGFR είναι ασαφής και περίπλοκη. Για διαβητικούς κερατοπάθεια, ROS είναι ένα σημαντικό και αξιόλογο παράγοντα κατά τη διάρκεια της υψηλής γλυκόζης αλλοιώνοντας τη φωσφορυλίωση του EGFR, εξάλλου, αντιοξειδωτικά και EGFR συνδετήρες έλλειψη δεν είναι αμελής παράγοντες [31]. Εν τω μεταξύ, δέσμευσης ηπαρίνης τύπου EGF αυξητικό παράγοντα (ΗΒ-EGF), η οποία στερείται σε κερατοειδή, μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην φωσφορυλίωση του EGFR από υψηλά επίπεδα γλυκόζης [31], [32].

Συμπέρασμα

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν μια νέα λεωφόρο για να εξερευνήσετε το πόσο υψηλά επίπεδα της γλυκόζης μπορεί να συμβάλει στην εξέλιξη PC. Η μελέτη αυτή μπορεί να αντιπροσωπεύει μια παραδειγματική στροφή στη σχέση μεταξύ διαβήτη και PC. Η μελέτη μας διαπίστωσε ότι EGF μπορεί να παίζει ένα ρόλο μερική αντί για ένα μοναδικό ρόλο, στην επίδραση της υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Περαιτέρω, δείξαμε ότι η υψηλή γλυκόζη διαενεργοποιεί EGFR σε κύτταρα PC. Το αποτέλεσμα αυτό ενημερώνει τους ασθενείς υπολογιστή του τη σημασία της διατήρησης σταθερών γλυκόζης στο αίμα και ζητά διερεύνηση των υποκείμενων μηχανισμών των επιδεινούμενων επιπτώσεις της υψηλής γλυκόζης στα δύο ενοχλητικές ασθένειες.

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να επεκταθεί μας χάρη στην Δρ Fengfei Wang (Βόρεια Ντακότα State University) για στοχαστική ανάγνωση του χειρογράφου.