Αφηρημένο

Tumor microenvironement είναι ένας σημαντικός παράγοντας της εξέλιξης του καρκίνου των ωοθηκών, αλλά οι σχέσεις μεταξύ των μεσεγχυματικών κυττάρων και καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών παραμένουν ασαφείς. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει βιολογικών τροποποιήσεις των καρκινικών κυττάρων »των ωοθηκών που προκαλούνται από τα μεσεγχυματικά κύτταρα. Για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος, χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών (ΝΙΗ: OVCAR3 και SKOV3) και τους συν-καλλιεργήθηκαν με μεσεγχυματικά κύτταρα. Μετά συν-καλλιέργεια των διαφορετικών πληθυσμών κυττάρων διαλογή για τη μελέτη μεταγραφικό τους και βιολογικές ιδιότητες. Transcriptomic ανάλυση αποκάλυψε τρεις συστάδες γονιδίων βιολογικών λειτουργιών εμπλουτίστηκαν κατά την επαφή με μεσεγχυματικά κύτταρα. Αυτά σχετίζονται με την αύξηση του μεταστατικού ικανότητες (προσκόλληση, μετανάστευση και εισβολή), πολλαπλασιασμό και χημειοαντίσταση

in vitro

. Ως εκ τούτου, η επαφή με την εξειδικευμένη μεσεγχυματικών κυττάρων θα μπορούσε να αυξήσει μεταστατικό έναρξη και επέκταση μέσω της τροποποίησης των καρκινικών κυττάρων. Στο σύνολό τους τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οδών που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση ετερο-κυτταρικό μπορούν να απευθύνονται για να διαταράξει την απέκτησε προ-μεταστατικό προφίλ

Παράθεση:. Lis R, Touboul C, Raynaud CM, Malek JA, Suhre Κ, Mirshahi Μ , et al. (2012) Τα μεσεγχυματικά κυττάρων Αλληλεπιδράσεις με καρκίνο των ωοθηκών κύτταρα Πυροδοτεί Pro-μεταστατικές ιδιότητες. PLoS ONE 7 (5): e38340. doi: 10.1371 /journal.pone.0038340

Συντάκτης: Eric Deutsch, Institut Gustave Roussy, Γαλλία

Ελήφθη: 9η Φεβρουαρίου του 2012? Αποδεκτές: 4 Μάη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 30 Μάη, 2012

Copyright: © 2012 Lis et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η παρούσα δημοσίευση κατέστη δυνατή με επιχορήγηση από το Κατάρ Εθνικό Ταμείο Έρευνας υπό τον αριθμό εθνικές προτεραιότητες Ερευνητικό Πρόγραμμα απονομής της NPRP 09-1174-3-291 και NPRP 4-640-1-096. Το περιεχόμενό του είναι αποκλειστική ευθύνη των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραίτητα τις επίσημες απόψεις του Κατάρ Εθνικό Ταμείο Έρευνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι περισσότεροι ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών γενικά πεθαίνουν από την περιτοναϊκή νόσο [1]. Ανάπτυξη της περιτοναϊκής καρκινωμάτωσης περιλαμβάνει ορίζεται κρίσιμα στάδια, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων απόπτωση, αλληλεπίδραση και προσκόλληση σε μεσοθήλια στρώμα, και τον πολλαπλασιασμό εντός του υπο-mesothelium [2]. Αρκετές αναφορές περιγράφουν ένα προ-μεταστατικό κόγχη εντός του οργάνου-στόχου, διευκολύνοντας την αρχική επιβίωση των καρκινικών κυττάρων [3], [4], [5].

μεσεγχυματικά κύτταρα (MCs) είναι πολυδύναμα κύτταρα που δημιουργούν μια ποικιλία τύπων συνδετικού ιστού κυττάρου [6]. Οι οστών προερχόμενα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (ΒΜ-MSC) προσλαμβάνονται σημαντικό αριθμό σε θέσεις όγκου όπου συμβάλλουν στην εισβολή, μετάσταση, και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία του καρκίνου κυτταρικών γραμμών ωοθήκης [7], [8], [9], [ ,,,0],10], [11]. MSC έχουν δειχθεί ότι συμβάλλουν στην ογκογονικότητα καρκίνο των ωοθηκών μέσω μεταβληθεί παραγωγή του οστικού μορφογενετικού Πρωτεΐνη (ΒΜΡ2) που οδηγεί σε αύξηση του καρκινικού κυττάρου ωοθηκών (OCC) πολλαπλασιασμός

in vitro

και

in vivo

[ ,,,0],12]. Ενώ πολλές μελέτες επικεντρώνονται σε συγκεκριμένους παράγοντες για την απόκτηση του μεταστατικού προφίλ, μόνο λίγες μελέτες αξιολόγησης των παγκόσμιων transcriptomic αλλαγές που συμβαίνουν σε καρκινικά κύτταρα μετά την αλληλεπίδρασή τους με τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSC) [13]. Zhang S et al.

13 ανέφεραν την τροποποίηση του μεταγραφικό κυττάρου καρκίνου του προστάτη που προκαλείται από την αλληλεπίδραση με MCs. Οι τροποποιήσεις που ορίζονται ένα νέο pro-μεταστατική κατάσταση. Η κατανόηση των οδών επηρεάζεται από την αλληλεπίδραση των καρκινικών κυττάρων και μικροπεριβάλλοντος τους και τις προκαλείται από την παγκόσμια τροποποιήσεις είναι υποχρεωτική, προκειμένου να είναι σε θέση να στοχεύσετε μικροπεριβάλλον ειδικών κλάδων [13].

Εδώ, ερευνούμε συν-καλλιέργεια των δύο διαφορετικών τύπους OCC γραμμές με MCs. Έχουμε αποδείξει ότι η αλληλεπίδραση αυτή ενισχύει την μεταστατική ικανότητα των OCC. Χρησιμοποιώντας transcriptomic ανάλυση και λειτουργικές δοκιμασίες? αποδεικνύουμε ότι τα γονίδια που σχετίζονται με την κυτταρική προσκόλληση, εισβολή, τη μετανάστευση, τον πολλαπλασιασμό και χημειοαντίσταση τροποποιείται κατόπιν OCC /MC επαφή σε μια κυτταρική γραμμή ειδικό τρόπο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι συγκεκριμένες οδοί μπορούν να απευθύνονται για να διαταράξει την αποκτήσει φιλο-μεταστατικό προφίλ.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Ο καρκίνος των ωοθηκών κυτταρικές σειρές SKOV3 (ΗΤΒ-77 ) και OVCAR3 (ΗΤΒ-161) αγοράστηκαν από την ATCC και διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια ακόλουθες συστάσεις ATCC (ϋΜΕΜ υψηλής γλυκόζης [Hyclone, Thermo Scientific], 10% FBS [Hyclone, Thermo Scientific], 1% διάλυμα πενικιλλίνης-στρεπτομυκίνης-Amphotericyn B [ ,,,0],Sigma], 1Χ μη ουσιωδών αμινο-οξύ [Hyclone, Thermo Scientific]). Οι κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών σταθερά μεταγωγή από φορείς λεντοϊών που κωδικοποιούν eGFP (Genethon, Evry). μεσεγχυματικά κύτταρα αγοράστηκαν από βλαστικά κύτταρα, Inc (MSC-001F, Βανκούβερ, CA) διατηρήθηκε και επεκτάθηκε σε καλλιέργεια χρησιμοποιώντας MesenCult® MSC Βασικό Μέσο ολοκληρώνεται με μεσεγχυματικά κύτταρα διεγερτική Συμπληρώματα (βλαστοκύτταρα Inc, Βανκούβερ, CA). Η ικανότητά τους να διαφοροποιηθούν σε λιποκύτταρα, οστεοβλάστες και chnodrocytes πιστοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

συν-καλλιέργειες

Εμείς ιδρύθηκε συν-καλλιέργειες eGFP-OCC με BM- MC σε αναλογία 1:02 για 24 ώρες. OCC διαφοροποιήθηκαν από BM-MC με βάση την eGFP τους και Ep-Cam. Οι διαφορετικοί πληθυσμοί κυττάρων διαλογή χρησιμοποιώντας Fluorescence Activated κυττάρου (FACS).

φθορισμού διαλογή κυττάρων ενεργοποιημένων

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μπλοκαρίστηκαν σε PBS-5% FBS-1% BSA-10% FcR Μπλόκο αντιδραστηρίου (Myltenyi Biotec). Single-κυτταρικό εναιώρημα αναλύθηκε και ταξινομημένο σε Sorp FACSAria2 (BD Biosciences). Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με FACSDiva 6.3 (BD ​​Biosciences). Διπλές αποκλείστηκαν από FSC-W × FSC-Η και SSC-W × SSC-H ανάλυση, μόνο βάφονται κανάλια χρησιμοποιήθηκαν για την αποζημίωση, και φθοροφόρο μείον ένα (ΠΑΥ) έλεγχοι χρησιμοποιήθηκαν για την περίφραξη. eGFP φθορισμού αποκτήθηκε με 488 nm μπλε λέιζερ και 510/50 nm εκπομπής, 50 000 εκδηλώσεις αποκτήθηκαν ανά δείγμα. Διαγράμματα εμφανιστεί το διάμεσο ένταση φθορισμού (MFI) σε σχέση με το μάρτυρα. Κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαλογής μάσκα καθαρότητα φάσης εφαρμόστηκε. OCC μονοκαλλιέργειες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και διαλογή ως μάρτυρες.

Ανάλυση

Η γονιδιακή έκφραση

Κατά την διαλογή κυττάρων mRNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ ακολουθούμενη από καθαρισμό χρησιμοποιώντας το κιτ εκχύλισης RNAeasy από Qiagen. 200 ng του συνολικού RNA αναλύθηκαν σε Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array. Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Partek (St Louis, ΜΟ). σύγκριση Class μεταξύ διαφορετικές συνθήκες (τρεις βιολογικούς επαναλήψεις) διεξήχθη για να προσδιοριστούν οι αλλαγές γονιδιακή έκφραση με σημαντικές διαφορές έκφραση και δύο φορές αυξημένη ή μειωμένη έκφραση [14], [15], [16]. Ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Partek με τις τυπικές ρυθμίσεις. Στατιστικές συγκρίσεις για δεδομένα μικροσυστοιχιών υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας δίπλευρη Students t-test. διόρθωση Benjamini-Hochberg εφαρμόστηκε για τον περιορισμό των θετικών ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη στο 5%. Στατιστικές συγκρίσεις για κατηγορικά δεδομένα επιτεύχθηκαν με τη χρήση Chi-squared test. Οι συσχετίσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Pearson συσχέτιση. Όλες οι άλλες στατιστικές συγκρίσεις υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας δύο-tailed t-test.

Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση

Χρησιμοποιήσαμε το λογισμικό Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA) για την ανάλυση του δικτύου των γονιδίων που ρυθμίζονται διαφορικά κατά την συν-καλλιέργεια. Ορίσαμε παγκόσμια λίστες γονίδιο που εκπροσωπούν τις λέξεις-κλειδιά IPA: «μετάσταση», «Διάδοση των κυτταρικών γραμμών» και «κυτταρικός θάνατος των καρκινικών κυττάρων γραμμή». Όλες οι ακμές υποστηρίζεται από τουλάχιστον ένα αναφοράς από τη βιβλιογραφία, βιβλίο, ή κανονικών πληροφορίες που είναι αποθηκευμένες στη βάση δεδομένων γνώσης Ingenuity Pathways.

P-

τιμές για τον εμπλουτισμό των βιολογικών λειτουργιών δημιουργήθηκαν με βάση την εκθετική κατανομή και υπολογίζεται με τη σωστή ουρά του Fisher ακριβή για 2 × 2 πίνακες έκτακτης ανάγκης όπως εφαρμόζεται στην εφευρετικότητα.

δοκιμασία τήρηση

96 καλά πλάκες επικαλυμμένες με Matrigel (BD-Biosciences). 20 000 OCC ΕΟΡΡ σπάρθηκαν ανά φρεάτιο και επωάστηκαν σε 5% CO2 επωαστή στους 37 ° C για 15, 30 και 60 λεπτά. Τα μη προσκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν μακριά. Τα προσκολλημένα κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν με τη χρήση αναγνώστη πλάκας φθορισμού (Wallac, Perkin Elmer) (488 nm διέγερση, 510 εκπομπή). Όλα τα λειτουργικά πειράματα διεξήχθησαν σε βιολογικές τριπλούν. Προσδιορισμοί

Μετανάστευση /Invasion

8 μm πόρους Transwell διαπερατά υποστρώματα επικαλύφθηκαν με Matrigel. 50 000 βιώσιμα OCC (διαλέγεται από συν- και μονοκαλλιέργεια) σπάρθηκαν ανά φρεάτιο και επωάστηκαν σε 5% CO2 στους 37 ° C για 12 και 24 ώρες. OCC μετανάστευση και εισβολή στη συνέχεια αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη πλάκας φθορισμού (Wallac, Perkin Elmer).

Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού

5000 OCC σπάρθηκαν σε μονοκαλλιέργεια ή επί MSC-Morange μονοστιβάδα σε ένα ελεύθερο ορού /κυτοκίνη ελεύθερα μέσα ενημέρωσης. OCC μετρήθηκαν κάθε δύο ημέρες κατά τη διάρκεια των 14 ήταν επικαλυμμένα με Matrigel. 50 000 ημέρες κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιώντας GFP. Κάθε μέρα δέκα πεδία ποσοτικά.

χημειοαντίσταση

100000 Στέγη σπάρθηκαν σε μονοκαλλιέργεια ή με BM-MSC στις 1:02 αναλογία. Μονο- και συν-καλλιέργεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 90 μΜ cisplatinum και 6 μΜ πακλιταξέλη (Sigma) για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με Calcein κόκκινο-πορτοκαλί, Live /DEAD Aqua μπλε (Invitrogen, Molecular Probes), CD73-APC (Biolegend, κλώνος: AD2) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και αναλύθηκαν με FACS. OCC ορίστηκαν ως κύτταρα GFP + CD73-, που ζουν OCC ορίστηκαν ως καλσεΐνης Κόκκινο-Πορτοκαλί + Live /DEAD υδατοκαλλιέργειας. 50 000 εκδηλώσεις αποκτήθηκαν ανά δείγμα.

Η στατιστική ανάλυση

Student-t δοκιμές, Fisher ακριβείς δοκιμές και δοκιμές chi-square εκτελέστηκαν, κατά περίπτωση. Όλες οι p-τιμές είναι δύο όψεων με στατιστική σημαντικότητα αξιολογείται σε επίπεδα 0,05 άλφα. διαστήματα Ενενήντα πέντε τοις εκατό εμπιστοσύνη (95% CI) υπολογίστηκαν για την αξιολόγηση της ακρίβειας των ληφθέντων εκτιμήσεων. Όλα στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση της ανάλυσης των δεδομένων plug-in του Microsoft Excel 2008.

Αποτελέσματα

Τροποποίηση της μεταγραφικό OCC κατά την αλληλεπίδραση με το MC

Για να διερευνήσει τις τροποποιήσεις της OCC μεταγραφικό κατά την επαφή MC, σχεδιάσαμε ένα μοντέλο συγκαλλιέργειας στο οποίο OCC καλλιεργούνται μόνο (συνθήκη ελέγχου) ή παρουσία του MC (συνθήκη ελέγχου) κατά τη διάρκεια 24 h σε μια ελεύθερη, κυτοκίνη μέσο χωρίς ορό. OCC (ελέγχου και δοκιμής συνθήκες) στη συνέχεια ταξινομούνται με FACS με βάση τους συν-έκφραση του μορίου προσκόλλησης επιθηλιακών κυττάρων (EpCAM, CD326) και την ενισχυμένη-Πράσινη Φθορίζουσα Πρωτεΐνη (eGFP) (Σχήμα 1 Α).

οικόπεδο Contour δείχνει μια τυπική διάκριση της OCC και MC με FACS. OCC ορίστηκαν ως eGFP + EpCAM + (πράσινο πληθυσμού), ενώ MCs ορίστηκαν ως eGFP-EpCAM- (σκούρο γκρι πληθυσμού). Ανάλυση Β PCA μόνο στα καρκινικά κύτταρα γραμμές ή μετά την επαφή με τα κύτταρα μεσεγχυματικά

Η

Κατά την επαφή MC, η μεταγραφικό των δύο κυτταρικών σειρών που δοκιμάσαμε (ΝΙΗ ωοθηκών:. OVCAR3-eGFP και SKOV3 -eGFP) ήταν σημαντικά τροποποιημένα (Σχήμα 1 Β). ΝΙΗ: OVCAR3 απορυθμίζεται σημαντικά 26 γονίδια και μειωτικά 10 γονίδια (Πίνακας S1)? SKOV3 απορυθμίζεται σημαντικά 18 γονίδια και μειωτικά 3 γονίδια (Πίνακας S2). Αλλαγές που παρατηρούνται στις δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών δεν μας επιτρέπουν να διαμορφωθεί ένα κοινό γονίδιο υπογραφή κατά την MC επαφής (Σχήμα 1 Β, Πίνακας S1, S2 Πίνακας). Ωστόσο, χρησιμοποιώντας το λογισμικό Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση, ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει τρεις βιολογικούς συστάδες λειτουργία εμπλουτισμένο κατά την επαφή με το MC: «μετάσταση» (ΝΙΗ: OVCAR3, p = 6,48 * 10

-6? SKOV3, p = 5,42 * 10

-5), «Ο πολλαπλασιασμός των κυτταρικών σειρών» (ΝΙΗ: OVCAR3, p = 4.36.48 * 10

-7? SKOV3, p = 6,79 * 10

-6) και «Ο κυτταρικός θάνατος των καρκινικών κυττάρων γραμμής «(ΝΙΗ: OVCAR3, p = 5,68 * 10

-8? SKOV3, p = 7,62 * 10

-5). Αυτές οι συστάδες μοιράστηκαν μεταξύ ΝΙΗ:. OVCAR3-eGFP και SKOV3-eGFP (Πίνακας 1)

Η

Όλα μαζί αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι, παρά την έλλειψη των επικαλυπτόμενων σχετικά με τα γονίδια up-ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται από MC επαφών, οι ίδιες βιολογικές συστάδες λειτουργία εμπλουτίστηκαν στα δύο ωοθηκών καρκίνου κυτταρική γραμμή που δοκιμάσαμε. Σε αυτό το άρθρο, αυτό εκτίθεται η ιδέα ότι η MC ασκούν μια προ-μεταστατική επίδραση στη Στέγη Γραμμάτων & Τεχνών, ως εκ τούτου, αποφασίσαμε να επικυρώσει τα συμπλέγματα βιολογική λειτουργία που περιγράφεται στον Πίνακα 1 με

in vitro

πειραματισμούς.

MCs αυξήσει OCC μετάσταση βιολογική λειτουργία: η εμμονή, τη μετανάστευση και την εισβολή

περιτοναϊκή έναρξη μετάσταση αφορά την τήρηση, τη μετανάστευση και την εισβολή μέσω του mesothelium. Χρησιμοποιώντας το λογισμικό του ΜΠΒ, εντοπίσαμε ένα βιολογικό σύμπλεγμα λειτουργία: «μετάσταση», το οποίο εμπλουτίστηκε κατά των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών επαφή με το MC. Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε η βιολογική επίδραση που αντιστοιχεί σε αυτή την γενωμική προ-μεταστατικό τροποποίηση επιδόσεις

in vitro

δοκιμασίες μετανάστευσης, προσκόλληση και την εισβολή. Μετά από 24 ώρες συγκαλλιέργειας με MC, Στέγη Γραμμάτων & Τεχνών (EpCAM + eGFP +) ταξινομήθηκαν (Εικόνα 1Α). Στη συνέχεια δοκιμάστηκε OCC ικανότητα «να τηρούν ECM. OCC (ΝΙΗ: OVCAR3 και SKOV3) σπάρθηκαν σε Matrigel (BD Biosciences) -επικαλυμμένα καλά για 10 λεπτά, 15 λεπτά, 30 λεπτά και 1 ώρα. Ορίσαμε την τήρηση της ECM ως το υπολειπόμενο φθορισμό GFP ήμασταν σε θέση να αποκτήσουν παρακάτω PBS πλύσιμο. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2.Α, τόσο ωοθηκών κυτταρική σειρά καρκίνου εμφανίζουν αυξημένη προσκόλληση στην ECM: 1.38 φορές αύξηση σε σχέση με τον έλεγχο για ΝΙΗ: OVCAR3 ΕΟΡΡ στα 10 λεπτά, και 1,94 φορές αύξηση στην 1 ώρα, 1,28 και 1,85 φορές για SKOV3-eGFP σε 10 λεπτά και 1 ώρα αντίστοιχα.

Α. OCC-eGFP (NIH: OVCAR3, αριστερά διάγραμμα και SKOV3, δεξιά διάγραμμα) σπάρθηκαν σε Matrigel (BD Biosciences) -επικαλυμμένα καλά για 10 λεπτά, 15 λεπτά, 30 λεπτά και 1 ώρα. Η αυξημένη προσκόλληση στο ECM παρατηρείται όταν OCC είχαν προληπτικά καλλιεργούνται με MC (ανοιχτό γκρι μπάρες) σε σύγκριση με τον έλεγχο (σκούρο γκρι μπάρες). B. Σχέδιο αντιπροσωπεύει την δοκιμασία εισβολής και της μετανάστευσης. Γ Κατάταξη σύμφωνα OCC σπάρθηκαν σε (un) με επικάλυψη transwells και το σήμα GFP κάθε καλά κάτω από την επικαλυμμένη μεμβράνη αποκτήθηκε μετά από 24 ώρες. Αυξημένη μετανάστευση και την εισβολή μέσα από την ECM παρατηρείται όταν OCC είχαν προληπτικά καλλιεργούνται με MC (ανοιχτό γκρι μπάρες) σε σύγκριση με τον έλεγχο (σκούρο γκρι μπάρες). SEM αντιπροσωπεύονται, η = 3, | p & lt?. 0.05 t-Student Test

Η

Για να εκτελέσετε δοκιμασία μετανάστευσης, έχουμε σπάρθηκε 8 μm transwell με την OCC ταξινομημένα κατά 24 ώρες συγκαλλιέργειας με MC. Εξετάσαμε την ικανότητα τους να μεταναστεύουν μέσω του ενθέτου transwell και μετρήθηκε το σήμα GFP κάθε φρεατίου μετά από 24 ώρες. Παρατηρήσαμε μια 2 φορές και 2,5 φορές αύξηση της μετανάστευσης με ΝΙΗ:. OVCAR3 και SKOV3 μετά την επαφή MC, αντίστοιχα

Για να εκτελέσετε δοκιμασία εισβολής, χρησιμοποιήσαμε Matrigel (BD Biosciences) επικαλυμμένη 8 μm transwells. Ταξινόμηση OCC σπάρθηκαν επί επικαλυμμένων transwells και το σήμα GFP κάθε καλά κάτω από την επικαλυμμένη μεμβράνη αποκτήθηκε μετά από 24 ώρες. μετανάστευση των κυττάρων αυξήθηκε κατά 2,5 φορές και 1,5 φορές για ΝΙΗ: OVCAR3 και SKOV3 μετά την επαφή MC, αντίστοιχα

Δείξαμε εδώ, ότι η MC μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με OCC ήταν σε θέση να αλλάξει δραστικά τη συμπεριφορά OCC.. Μετά την επαφή MC OCC εμφανίζεται μια μεγαλύτερη προσήλωση στην ECM, ταχύτερη μετανάστευση και μια πιο αποτελεσματική εισβολή μέσα από την ECM. Λαμβάνονται όλα μαζί αυτές οι παρατηρήσεις τονίζουν το ρόλο του MC, για την ενίσχυση τόσο σε μεταγραφικό και λειτουργικό επίπεδο, το μεταστατικό δυναμικό του ΕΣ.

Τα μεσεγχυματικά κύτταρα να διατηρήσουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

Μετά mesothelial διείσδυση, ανάπτυξη της περιτοναϊκής carcinosis εμπλέκει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών μέσα στο περιβάλλον στρώμα τους. Εμείς συγκεντρωμένα γονίδια με βάση την βιολογική τους λειτουργία, και απέδειξαν ότι τα γονίδια που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυτταρικών γραμμών εμπλουτίστηκαν κατά την επαφή με MC OCC (Πίνακας 1). Συνεπώς ερευνήσαμε την ικανότητα του MC να διατηρήσει τον πολλαπλασιασμό OCC. Δεδομένου ότι η χρήση ορού προκειμένου θα μπορούσε να παρεμποδίσει σημαντικά την μελέτη της επίδρασης του μικροπεριβάλλοντος για το καρκινικό κύτταρο ωοθηκών, πραγματοποιήσαμε την δοκιμασία πολλαπλασιασμού σε ένα σε μια ελεύθερη, κυτοκίνη ελεύθερο πλαίσιο ορού. OCC-eGFP (ΝΙΗ: OVCAR3 και SKOV3) καλλιεργήθηκαν μόνα τους ή σε μια μονοστοιβάδα MC-Morange. Παρατηρήσαμε ότι η MC βιώσιμη ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, τουλάχιστον για 15 ημέρες, ενώ OCC ήταν ηρεμίας σε περίπτωση απουσίας τους (Σχήμα 3Α-C).

Στέγη Γραμμάτων & Τεχνών καλλιεργήθηκαν σε MC εκφράζει Morange ή direclty στο πλαστικό πιάτο. Δοκιμασία πολλαπλασιασμού διεξήχθη σε μια ελεύθερη-κυτοκίνης μέσο ελεύθερο ορού. Ελήφθησαν εικόνες κάθε δύο ημέρες, και τα κύτταρα GFP προσδιορίστηκαν ποσοτικά. B. Λεπτομέρειες του καλά την ημέρα 14, μπορούμε να παρατηρήσουμε OCC εμφανίσει μια φυσιολογική μορφολογία. Γ Διάγραμμα καταμέτρηση εμφάνιση των κυττάρων μεταφέρονται πάνω από 14 ημέρες. OVCAR3 eGFP όταν σπέρνονται σε ένα MC είναι σε θέση να διατηρήσουν τον κυτταρικό κύκλο σε μια κυτοκίνη ελεύθερα μέσα ενημέρωσης ελεύθερο ορού. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με SKOV3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). SEM αντιπροσωπεύονται, η = 3, | p & lt?. 0.05 t-Student Test

Η

MC επάγει χημειοαντίσταση των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα

Η θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών με περιτοναϊκή carcinosis, δηλαδή προχωρημένο στάδιο της νόσου, περιλαμβάνει χημειοθεραπεία πριν ή μετά τη χειρουργική επέμβαση . Εμείς συγκεντρωμένα γονίδια με βάση την βιολογική τους λειτουργία, και απέδειξαν ότι τα γονίδια που εμπλέκονται σε «κυτταρικό θάνατο των κυττάρων του όγκου γραμμή» κυτταρικών γραμμών εμπλουτίστηκαν κατά την επαφή με MC OCC (Πίνακας 1). Ως εκ τούτου, διερευνήθηκε κατά πόσον MC είναι ικανές να προωθήσουν την αντίσταση OCC στη χημειοθεραπεία.

Στέγη καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε απουσία ή παρουσία του MC σε ένα ελεύθερο ορού, κυτοκίνη ελεύθερα μέσα ενημέρωσης. Η μονο- ή συγκαλλιέργειες στη συνέχεια σε επεξεργασία για 24 ώρες με 90 μΜ cisplatinum και 6ηΜ Paclitaxel. Πριν από την ανάλυση FACS, τα κύτταρα βάφονται με χρωστική ουσία βιωσιμότητας (Calcein) και μία χρωστική κυτταρικού θανάτου (Live /DEAD). OCC και MSC οι διακρίσεις στη διαφορική έκφραση των CD73 και eGFP, OCC ορίστηκαν ως eGFP + CD73- (σχήμα 4.Το, άνω φωτογραφία). Βιώσιμη OCC μετά τη χημειοθεραπεία θεραπεία ορίστηκε ως Καλσεϊνη High /Ζωντανή Dead (LD) αρνητικό (σχήμα 4.Το, κάτω πίνακα).

Α. Explanative σχέδιο αναλύσεως FACS. B. OCC ή OCC συν-καλλιεργείται με MSC υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 48 ώρες με 90 μΜ της Cisplatin και 6 nm πακλιταξέλης. τύποι κυττάρων διακρίσεις με FACS, χρησιμοποιώντας GFP ως έναν δείκτη καρκινικών κυττάρων, και CD73 ως δείκτης MC. ανάλυση κυτταρικού θανάτου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη διπλή χρώση νεκρών Calcein /Live. C. Η ποσοτικοποίηση των πειραμάτων ανάλυσης κυτταρικού θανάτου. OCC εμφανίσει μια αντίσταση στη συμβατική χημειοθεραπεία όταν συν-καλλιεργείται με MC σε σύγκριση με τον έλεγχο. SEM αντιπροσωπεύονται, η = 3, | p & lt? 0,05 t-Student Test

Η

Συν-καλλιέργεια της OCC με MC δεν μετέβαλαν τη βιωσιμότητα των κυττάρων ή θνησιμότητα πριν από τη χημειοθεραπεία (Σχήμα 4.Β και 4.Γ).. Χημειοθεραπευτική αγωγή οδήγησε σε 61,4% (ΝΙΗ: OVCAR3) και 63,4% (SKOV3) του OCC θανάτου (Καλσεϊνη χαμηλή, LD υψηλής κύτταρα) (Σχήμα 4.Γ). Ενώ OCC θανάτου μειώθηκε μετά τη χημειοθεραπεία με 42,3%. (ΝΙΗ: OVCAR3) και 42% (SKOV3) καλσεΐνης χαμηλή, LD υψηλής κύτταρα παρουσία του MC (Σχήμα 4.Γ)

Σε επιβεβαίωση με ΙΡΑ μας αποτελέσματα, αποδείξαμε ότι MC δεν ήταν σε θέση να εμπλουτίσουν συστάδες γονιδίων που εμπλέκονται στην ρύθμιση του κυτταρικού θανάτου μόνο, αλλά επίσης την προώθηση αντίσταση OCC (1,45 και 1,50 φορές μείωση σε κυτταρικό θάνατο για ΝΙΗ: OVCAR3 και SKOV3 αντίστοιχα). στη χημειοθεραπεία

Συζήτηση

η μελέτη μας έδειξε ότι MCs τροποποιήσετε OCC μεταγραφικό προς ένα μεταστατικό προφίλ. Κατά την επαφή με το MC, OCC γραμμές (ΝΙΗ: OVCAR3 και SKOV3) εμπλουτισμένο τρεις βιολογικούς συστάδες λειτουργία: «μετάσταση», «Ο πολλαπλασιασμός των κυτταρικών σειρών», «Ο κυτταρικός θάνατος των καρκινικών κυττάρων γραμμή». Εμείς επικυρωθεί ότι αυτές οι λειτουργίες τροποποιήθηκαν

in vitro.

Δεδομένα μας έδειξαν ότι MC επαφή με OCC αυξημένη προσκόλληση, η μετανάστευση και εισβολή από /μέσα στην ECM, τον πολλαπλασιασμό, και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία. Αυτό είναι σύμφωνο με αναφορές MCs τροποποίηση της συμπεριφοράς των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών [7], [8], [11], [12], [17].

Η περιτοναϊκή κοιλότητα είναι επενδεδυμένα με ένα συνεχές μονό στρώμα των μεσοθηλιακών κύτταρα [18]. Τα μεσοθηλιακών κυττάρων περιγράφονται στη βιβλιογραφία ως η πρώτη γραμμή άμυνας ενάντια σε όλες τις κοιλιακά μεταστατικών όγκων. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη της περιτοναϊκής carcinosis στον καρκίνο των ωοθηκών περιλαμβάνει διάφορα βασικά βήματα: προσκόλληση και η κάθαρση προς /από το στρώμα μεσοθηλιακών, τη μετανάστευση και εισβολή μέσω του μεσοθηλιακών και υπο-μεσοθηλιακών στρώματα, και ο πολλαπλασιασμός των ωοθηκών καρκινικών κυττάρων [2], [19 ]. Ενώ οι μεσοθηλιακών κυττάρων έχουν περιγραφεί να αναστέλλουν προσκόλληση των ωοθηκών των καρκινικών κυττάρων και εισβολή [20], ινοβλάστες καρκίνωμα που συνδέεται (CAF) εμφανίζουν οι αντίθετες επιδράσεις [12], [20]. Στη μελέτη μας, δείξαμε ότι τα μεσεγχυματικά κύτταρα (MC) αυξήθηκε ωοθηκών προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων και την εισβολή. Αυτό είναι σύμφωνο με τον Kenny και al δεδομένων, όπου θα περιγράφονται τα μεσεγχυματικά κύτταρα που προέρχονται από ινοβλάστες προωθούν τη μετανάστευση των ωοθηκών των καρκινικών κυττάρων και εισβολή σε ΜΜΡ2 εξαρτώμενο τρόπο [21]. Πρόσφατα, έδειξαν επίσης το ρόλο των λιποκυττάρων στην πρόοδο του καρκίνου των ωοθηκών [22]. Αξιοσημείωτα, MC περιγράφονται να διαφοροποιηθούν σε λιποκύτταρα CAF και όταν αυτά είναι εκτεθειμένα σε υπερκείμενο ωοθηκών καρκινικών κυττάρων [11], [17]. Όλα μαζί αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η καταγωγή μεσεγχυματικά (MC, CAF, λιποκύτταρα) αποτελεί μια ανεκτική θέση στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, και θα μπορούσε να εξηγήσει την περιτοναϊκή τροπισμό των ωοθηκών όγκου μεταστατικού απόφυση.

Στη μελέτη αυτή έδειξε ότι MC διατηρήσουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών σε μια ελεύθερη, κυτοκίνη ελεύθερο πλαίσιο του ορού. Αυτά τα δεδομένα in vitro, είναι επιβεβαίωση με αρκετές στην έκθεσή vivo. Για παράδειγμα, Pasquet και al. απέδειξαν ότι ασκίτη μεσεγχυματικά κύτταρα προερχόμενα από στρωματικά την προώθηση της ανάπτυξης των ωοθηκών όγκου σε γυμνούς ποντικούς [9]. Αυτή η ικανότητα των μεσεγχυματικών κυττάρων που προέρχονται ασκίτη στρωματικά για την προώθηση της ανάπτυξης του όγκου των ωοθηκών εξηγείται από την επαγωγή του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, και από την αύξηση της αγγειογένεσης [9]. Πιο πρόσφατα, το Mac Lean και al. έδειξε ότι η MC θα μπορούσε επίσης να αυξήσει την ετερογένεια των όγκων των ωοθηκών. Altered έκκριση ΒΜΡ2 με MCs είναι σε θέση να αυξήσει τον αριθμό των ωοθηκών καρκίνο βλαστικών κυττάρων και κατά συνέπεια διεγείρουν την ανάπτυξη του όγκου των ωοθηκών σε ένα ανοσοκατασταλμένοι ποντικού [12]. Ένα άλλο συστατικό του μεσεγχυματική γράμμωση, τα λιποκύτταρα, αναφέρθηκε επίσης για την αύξηση της in vitro και in vivo την ανάπτυξη του όγκου με την παροχή ενέργειας στα καρκινικά κύτταρα μέσω της παραγωγής λιπαρών οξέων [22]. Ο ρόλος του λιπαρού οξέος στο καρκινικό κύτταρο βιολογία των ωοθηκών τα πρόσφατα. Μια πρόσφατη εργασία έδειξε ότι χημειοαντίσταση προκλήθηκαν με MC μέσω της απελευθέρωσης του λευκοχρύσου επαγόμενης λιπαρά οξέα [23]. Αυτά τα λιπαρά οξέα αποδείξει την ικανότητά τους, στο πλαίσιο του ξένου μοσχεύματος, για την προστασία OCC από τα πολυάριθμα χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [23]. Δεδομένου ότι το κύριο κλινικό πρόβλημα αναφορικά με την ωοθηκική νόσος είναι η υποτροπή που εξέρχεται από μια πλατίνα ανθεκτικά ελάχιστη ασθένεια, είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι MC και άλλα συστατικά μεσεγχυματικά είναι σε θέση να οδηγεί και τον πολλαπλασιασμό και την αντίσταση στη θεραπεία με την παροχή ενός ανεκτική «μεταβολικό» θέση.

Ως εκ τούτου MC και MC-κύτταρα προερχόμενα από τον προσδιορισμό τόσο της βιολογίας του καρκίνου των ωοθηκών και την αντιμετώπιση του καρκίνου των ωοθηκών στη θεραπεία. Κατανοώντας τις αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης που συμβαίνουν στη Στέγη Γραμμάτων & Τεχνών κατά την αλληλεπίδρασή τους με τη θέση τους MC θα μπορούσαν να βοηθήσουν να καθορίσουν νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις. Ο στόχος μας σε αυτή τη μελέτη ήταν να περιγράψει μια σχέση μεταξύ των αλλαγών που συμβαίνουν στον καρκίνο των ωοθηκών κυτταρική γραμμή στο transcriptomic επίπεδο και οι διαφορές στην συμπεριφορά των κυττάρων που παρατηρήσαμε με την δοκιμασία συγκαλλιέργεια πραγματοποιήσαμε. Ένας περιορισμός της μελέτης αυτής είναι ότι σε σύγκριση transcriptomic ανάλυση των ΝΙΗ: OVCAR3 και SKOV3 σε επαφή με το MC παρέλειψε να καθορίσει μια κοινή παγκόσμια αλλαγή στο επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης. Πρόσφατα, οι άτλαντα του γονιδιώματος του καρκίνου δημοσίευσε το έργο τους σχετικά ωοθηκών ορώδες αδενοκαρκινώματα [24]. Ήταν σε θέση να προσδιορίσει τέσσερα νέα υποσύνολα (διαφοροποιείται, ανοσοδραστικών, μεσεγχυματικά και πολλαπλασιασμού) των ωοθηκών υψηλής ποιότητας ορώδες αδενοκαρκινώματα βασίζεται σε μια μελέτη της γονιδιακής έκφρασης των 489 ασθενών [24]. Μια εξήγηση για την έλλειψη της επικάλυψης σε αλλαγές γονιδιακή έκφραση μεταξύ ΝΙΗ: OVCAR3 και SKOV3 μπορούσε να είναι ότι κάθε κυτταρική σειρά ανήκει σε διαφορετικό υποσύνολο των ωοθηκών υψηλής ποιότητας ορώδης αδενοκαρκινώματα. Πράγματι OVCAR3 και SKOV3 θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν διαφορετικούς τύπους κυττάρων με βάση την ανάλυση κύριων συνιστωσών (Σχήμα 1 Β). Παρά τη φαινομενική αντίφαση, ήμασταν σε θέση να καθορίσει τρία πανομοιότυπα συμπλέγματα γονιδίων βιολογικών λειτουργιών εμπλουτισμένο κατά MC επαφής που επιβεβαιώνεται in vitro δεδομένα μας. Παραδόξως, η μεσεγχυματικά θέση φαίνεται να είναι ανεκτική σε δύο διαφορετικά υποσύνολα των ωοθηκών ορώδες προσκόλληση αδενοκαρκινώματα, μετανάστευση, εισβολή, πολλαπλασιασμό και χημειοαντίσταση. Ως εκ τούτου, απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για την επίδραση του μικροπεριβάλλοντος για κάθε διαφορετικό υποσύνολο των ωοθηκών ορώδες αδενοκαρκινώματα (διαφοροποιείται, ανοσοδραστικών, μεσεγχυματικά και πολλαπλασιαστικές) που απαιτούνται για να βελτιώσετε τα γονίδια που εμπλέκονται και να καθορίσει καινοτόμες θεραπευτικές προσεγγίσεις.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακας S1. ανάλυση της έκφρασης

Gene. Διπλώστε αλλαγές αντιπροσωπεύει τις αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης σε ΝΙΗ:. OVCAR3 μετά την επαφή με το MC σε σύγκριση με τον έλεγχο

doi: 10.1371 /journal.pone.0038340.s001

(DOC)

Πίνακας S2. ανάλυση της έκφρασης

Gene. Διπλώστε αλλαγές αντιπροσωπεύει τις αλλαγές της γονιδιακής έκφρασης σε SKOV3 μετά την επαφή με το MC σε σύγκριση με τον έλεγχο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0038340.s002

(DOC)