Αφηρημένο

Ο ρόλος των νευροενδοκρινών πεπτίδιο καλσιτονίνη (CT) και του υποδοχέα του (CTR) σε επιθηλιακά εξέλιξης του καρκίνου είναι μια αναδυόμενη έννοια με μεγάλη κλινική δυναμικό. Έκφραση των CT και το CTR είναι συχνά αυξημένα σε καρκίνους του προστάτη (PC) και την ενεργοποίηση του άξονα CT-CTR σε μη επεμβατικές κύτταρα PC προκαλεί μια επεμβατική φαινότυπο. Εδώ μπορούμε να δείξουμε με ζυμομύκητα δύο υβριδίων ότι το CTR συνδέεται με το σφιχτό πρωτεΐνη διασταύρωση zonula Οοοίιιάεηδ-1 (ΖΟ-1) μέσω της αλληλεπίδρασης μεταξύ του τύπου 1 PDZ μοτίβο στο καρβοξυ-τελικό άκρο του CTR και του τομέα PDZ3 του ΖΟ-1 . Μετάλλαξη είτε του C-PDZ μοτίβο σύνδεσης CTR ή το πεδίο ΖΟ-1-PDZ3 δεν επηρέασε τη δέσμευση της CTR με το πρόσδεμά του ή G-πρωτεΐνη μεσολάβηση σηματοδότηση αλλά καταργείται αποσταθεροποιητικές δράσεις του CT επί στενοσυνδέσεων και το σχηματισμό των απομακρυσμένων μεταστάσεων από ορθοτοπικά εμφυτευμένα κύτταρα PC σε γυμνούς ποντικούς, δεικνύοντας ότι αυτές οι αλληλεπιδράσεις περιοχή PDZ ήταν παθολογικά σχετικό. Περαιτέρω, παρατηρήσαμε CTR-ΖΩ-1 αλληλεπιδράσεις σε δείγματα PC από την εγγύτητα απολίνωση ανοσοϊστοχημεία, και διαπίστωσε ότι ο αριθμός των αλληλεπιδράσεων στο μεταστατικό δείγματα PC ήταν αρκετές φορές μεγαλύτερη από ό, τι σε μη μεταστατικό PC. Τα αποτελέσματα μας για πρώτη φορά να αποδείξει ένα μηχανισμό με τον οποίο απαιτείται η αλληλεπίδραση PDZ μεσολάβηση μεταξύ CTR και ZO1 για CT-διεγερμένα μετάσταση του καρκίνου του προστάτη. Δεδομένου ότι πολλοί υποδοχείς περιέχουν μοτίβα ΡΟΖ-δέσμευσης, αυτό θα σήμαινε ότι ΡΟΖ-αλληλεπιδράσεις δέσμευσης πρωτεϊνών μοτίβο-προσαρμογέα αποτελούν ένα κοινό μηχανισμό για τη μετάσταση του καρκίνου

Παράθεση:. Aljameeli Α, Thakkar Α, Thomas S, Lakshmikanthan V, Iczkowski KA, Shah GV (2016) καλσιτονίνης Receptor-zonula Οοοίιιάεηδ-1 αλληλεπίδραση είναι κρίσιμη για την καλσιτονίνη-εξαναγκασμένη Καρκίνος του προστάτη μετάσταση. PLoS ONE 11 (3): e0150090. doi: 10.1371 /journal.pone.0150090

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 29η Οκτωβρίου του 2015? Αποδεκτές: 9 του Φλεβάρη, 2016? Δημοσιεύθηκε: 2 Μαρτίου του 2016

Copyright: © 2016 Aljameeli et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:.. ΝΙΗ CA096534

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η καλσιτονίνη υποδοχέα (CTR) είναι ένα μέλος της οικογένειας της κατηγορίας Β του συζευγμένου με πρωτεΐνη υποδοχείς (GPCRs), τα οποία περιέχουν πολλές φαρμακευτικών στόχων. CTR δεσμεύει νευροενδοκρινείς πεπτίδιο CT για τη διατήρηση της ομοιόστασης ασβεστίου στα οστά και τα νεφρά [1]. Ωστόσο, η έκφραση του σε πολλαπλά όργανα και τις δράσεις του στην ανάπτυξη, την ανάπτυξη και την διαφοροποίηση των κυττάρων δείχνουν ότι το CTR μπορεί να έχει ποικίλες ρόλο Tolcos et al. [2], [3,4]. Η αφθονία των CT και CTR μεταγραφές αυξάνεται σε κακοήθεις προστάτες, και συσχετίζεται θετικά με Gleason βαθμού του καρκίνου του προστάτη (PC). Επιπλέον, η ενεργοποίηση του CT-CTR αυτοκρινής άξονα διεγείρει διάφορες διαδικασίες που συνδέονται με την ανάπτυξη του όγκου, εισβολή, αγγειογένεση, χημειοαντίσταση και μετάσταση, γεγονός που υποδηλώνει ότι το CTR χρησιμεύει ως ένας σημαντικός παράγοντας στην εξέλιξη μιας εντοπισμένης PC σε μεταστατική μορφή του [5-7] .

αλληλουχία CTR mRNA που απομονώθηκε από ανθρώπινο προστάτη στερείται ένθετο 16-αμινοξέων στην πρώτη ενδοκυτταρική θηλιά, ένα χαρακτηριστικό των ισομορφής 2 του CTR [8,9]. CTR2 ζευγάρια τόσο διεγερτική δέσμευσης GTP πρωτεΐνης G

αs και G

αq να συν-διεγείρουν αδενυλυλοκυκλάσης και φωσφολιπάση C [10]. Επιπλέον, CTR αποσταθεροποιεί σφιχτά και ενώσεις προσφύσεως και ενεργοποιεί μη-G οδών συζευγμένου με πρωτεΐνη σηματοδότησης όπως ΡΙ-3-κινάσης (ΡΙ3Κ) -Akt-survivin και WNT /SS-κατενίνης [5,11]. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο το CTR διεγείρει την μετάσταση του καρκίνου του προστάτη δεν έχει ταυτοποιηθεί.

Δεδομένου ότι η διακοπή των μεσοκυττάρια κόμβους και την απόκτηση των χωροκατακτητικών φαινοτύπου είναι υποχρεωτικά βήματα στην εξέλιξη του όγκου, εξετάσαμε τη δράση του CTR στο σφιχτό κόμβους (TJS) και η σημασία της στην CTR-διεγερμένα μετάσταση των κυττάρων PC. Στην έκθεση αυτή θα δείξουμε ότι η κυτταροπλασματική (C) ουρά του CTR συνεργάτες με σφιχτή διασταύρωση (TJ) πρωτεΐνη zonula Οοοίιιάεηδ-1 (ΖΟ-1) μέσω της αλληλεπίδρασης μεταξύ του τύπου 1 PDZ μοτίβο σύνδεσης στο καρβοξυ-τελικό άκρο του CTR και PDZ3 πεδίο της ΖΟ-1. Αυτή η αλληλεπίδραση είναι ζωτικής σημασίας για τις ενέργειες του CTR στο TJ αποσταθεροποίηση καθώς και μακρινή μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα

Άντρας balb /c nu /nu ποντίκια (ηλικίας 6-8 εβδομάδων) αγοράστηκαν από τη Harlan (Madison, WI), και στεγάστηκαν δύο ανά κλουβί σε μονάδες μικροαπομονωτικά σε μια εγκατάσταση φράγματος σε ένα σωματιδιακό υψηλής απόδοσης arrestance (ΗΕΡΑ) διηθημένο ράφι κάτω από πρότυπες συνθήκες 12 ωρών κύκλοι φωτός /σκότους, τρέφονται

ad lib

σε ένα τυπικό κυψελωτό εργαστήριο διατροφής, και σε καραντίνα για μία εβδομάδα πριν από τη χρήση τους στη μελέτη.

Cell Culture

LNCaP, κυτταρικές σειρές DU-145 PC-3 και λήφθηκαν από την American Tissue Culture Collection (Manassas, VA), και συντηρείται όπως συνιστάται από τον προμηθευτή στο εργαστήριό μας για λιγότερο από έξι μήνες μετά την παραλαβή. PC-31 υποσειρά ήταν ένα μεμονωμένο PC-3 ορθόλογο που έλειπε CT και το CTR mRNA (S1 Παράρτημα, S1 Α-S1D σχήμα). κυτταρική σειρά PC-3M παρασχέθηκε από τον Δρ Isiah Fidler (MD Anderson Cancer Κέντρο, Houston, TX). PC-3, κυτταρικές σειρές PC-3M PC-31 και ήταν επικυρώνονται από STR προφίλ (S1 Παράρτημα)

DNA Μορφώματα:. FLAGCTRwt και FLAGCTRΔESS

δεσμευτική

CTR C-ΡΟΖ μοτίβο ( ESSA) αντικαταστάθηκε με αλανίνες εισάγοντας αναντιστοιχίες στα αντίστοιχα κωδικόνια όπως υπογραμμίζεται. Οι αλληλουχίες εκκινητών ήταν ως εξής:

Προώθηση Primer: 5′-ΑΑΟ /CTT /ATG /GAC /tac /ΑΑΟ /GAC /GAC /GAT /GAC /ΑΑΟ /AGC /TTC /ACA /ttt /ACA /AGC /CGG /TGC /tTG-3 ‘

Αντίστροφη Αστάρια:

CTRwt: 5′-CTC /gag /TCA /AGC /AGA /TGA /CTC /tTG /CTC /tat /GAT /ATT /ΥΠΑ /ΑΓΓ /GAT /GAT /CTC-3 ‘

CTRΔESS: 5′-CTC /gag /TCA /AGC /AGC /AGC /AGC /tTG /CTC /tat /gat /ΑΤΤ /ΥΠΑ /ΑΓΓ /GAT /GAT /CTC-3 ‘

Η πλήρους μήκους FLAG-CTRwt και FLAG-CTRΔESS εισήχθησαν στο φορέα έκφρασης pcDNA3.1 από κατευθυντική κλωνοποίηση (Invitrogen) [12].

ΖΟ-1ΔPDZ

ΖΟ-1 cDNA αλληλουχία μεταλλάχθηκε με τη διαγραφή κάθε /ή όλες τις τρεις περιοχές ΡΟΖ για να ληφθούν τα ακόλουθα τέσσερα μεταλλάγματα: ΔPDZ1 (αα 2-156) , ΔPDZ2 (αα 159 έως 252), ΔPDZ3 (αα 294-633) και ΔPDZX (αα 67 με 1033) [13]. Όλα τα κατασκευάσματα ΖΟ-1 με επισύναψη myc στο Ο-τερματικό και κλωνοποιήθηκε σε ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης pCB6 [13].

Τα κατασκευάσματα cDNA διαμολύνθηκαν σε κύτταρα PC-3 με τη χρήση Fugene 6 ™, που επιλέγονται σε G418, πολλαπλές κλώνοι εξετάστηκαν, και εκείνοι που εκφράζουν σταθερή έκφραση διαγονιδίου επιλέχθηκαν για μεταγενέστερες μελέτες, όπως περιγράφεται παραπάνω [11,14].

ζυμομύκητα δύο-υβριδίων

Η αλληλουχία cDNA που αντιστοιχεί στο Ο-τερματικό πεδίο του hCTR2 (υπολείμματα 411-476) εισήχθη εντός πλαισίου στον φορέα έκφρασης ζυμομύκητα pNLex-NLS [15]. Αυτό το πλασμίδιο δόλωμα χρησιμοποιήθηκε για να μετασχηματίσει το στέλεχος ζύμης RFY231:

ΜΑΤ ± ura3-1 his3 trp1î Ιστοσελίδα ::

hisG

3LexAop-

LEU2 Ιστοσελίδα ::

leu2

. Το μεταμορφωμένο ζυμομύκητα στη συνέχεια συνδυάζεται με ζύμη (RFY309:

MAT

α

his3î200 leu2-3 lys2î201 ura3-52 trp1îhisG

: pSH18-34) προ-μετασχηματισμένα με μια βιβλιοθήκη cDNA ανθρώπινου προστάτη σε pJG4 -5 φορέα (ΟηΟεηε). Όλα τα διασωθέντα αποικίες επιλέχθηκαν και εξάρτηση γαλακτόζη, Leu και lacZ φαινότυποι τους ελέγχθηκαν [15,16]. ORFs όλων των κλώνων γαλακτόζη εξαρτώμενη απομονώθηκαν με PCR και κλωνοποιήθηκε στον τομέα ενεργοποιήσεως μεταγραφής (AD) φορέα με επισκευή κενό. Οι κλώνοι μ.Χ. στη συνέχεια ζευγάρωσαν κατά το δόλωμα για να επιβεβαιώσει ότι η Leu και lacZ φαινότυποι ήταν εξαρτάται από το ORF. Θετικοί κλώνοι μ.Χ. εξετάστηκαν περαιτέρω για την εξειδίκευση από το ζευγάρωμα με 7 στελέχη δόλωμα που εκφράζουν άσχετα δολώματα (

Campylobacter

πρωτεΐνες) [16].

Για να ελέγξετε την ισχύ της αλληλεπίδρασης, πρωτότυπο στέλεχος δόλωμα ήταν ζευγάρωσαν με στελέχη που εκφράζουν κάθε απομονωμένο κλώνο μ.Χ., και η ενεργοποίηση δημοσιογράφος είχε σκόραρε στο 0-3 κλίμακας για την ανάπτυξη στις πλάκες leu (0 = καμία ανάπτυξη? 3 = μέγιστη μεγέθυνση)? και 0-5 κλίμακας για τη δραστηριότητα lacZ σε πλάκες X-Gal (0 = άσπρο? 5 = σκούρο μπλε). Όλα αλληλεπιδρούν σε αυτή την οθόνη σκόραρε μέγιστη ανάπτυξη σε λέι? και η απουσία δραστηριότητας lacZ έδειξε ένα ασθενές, αλλά αναπαραγώγιμη αλληλεπίδραση.

κυκλική (γ) ΑΜΡ πρωτεϊνική κινάση Α (ΡΚΑ), και πρωτεϊνικής κινάσης C (PKC) Δοκιμασίες

PC-3CTR και τα κύτταρα PC-3CTRΔESS αναπτύχθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων, πλύθηκαν και διεγέρθηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις CT (0-100 ηΜ) για 3 λεπτά. Τα κύτταρα λύθηκαν με διάλυμα TCA παγωμένο 10%, και τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν για τα επίπεδα cAMP με ραδιοανοσοδοκιμασία.

Για δοκιμασίες ΡΚΑ και PKC, τα προϊόντα λύσης των μη επεξεργασμένων /κυττάρων CT-αγωγή επωάστηκαν με αντίστοιχες ΡΚΑ ή πεπτίδιο υπόστρωμα PKC και

32Ρ-ΑΤΡ όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή (Promega, Madison, WI). Εν συντομία, τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με CT ή το όχημα για 10 λεπτά (2 χ 10

6 κύτταρα ανά 100 mm δίσκο) συλλέχθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris, ρΗ 7,5, που περιέχει 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM πυροφωσφορικό νάτριο, 0,5 mM EGTA, 10 mM β-μερκαπτοαιθανόλη, 1 μg /ml λευπεπτίνη, και 1 μg /ml απροτινίνης), κατεργασία με υπερήχους, και θραύσματα απομακρύνθηκαν με φυγοκέντρηση. Τα εκχυλίσματα στη συνέχεια επωάστηκαν για 5 λεπτά στους 30 ° C στο ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης [τελική συγκέντρωση ήταν 50 mM Tris, ρΗ 7.5? 10 mM MgCl

2? 100 μΜ ΑΤΡ? 4 ηΜ [

32Ρ] ΑΤΡ? 0,25 mg /ml BSA? και 50 μΜ ΡΚΑ ή πεπτίδια υπόστρωμα PKC (Promega Corp., Madison, WI)]. 10 μΜ cAMP (συνολική δραστηριότητα ΡΚΑ), χρησίμευσε ως θετικός έλεγχος και 1 μΜ ΡΚΙ συν cAMP χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος για δοκιμασίες ΡΚΑ (συνολική δραστηριότητα υποβάθρου). Εις τριπλούν από κάθε δείγμα αναλύθηκαν, και στυπώθηκαν επί μεμβρανών SAM2 σύλληψη βιοτίνης στο τέλος της επώασης (Promega Corp., Milwaukee, WI). Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν εκτενώς με 2 Μ NaCl, καθώς και 2 Μ NaCl 1% Η

3PO

4, και το δεσμευμένο φωσφορυλιωμένο υπόστρωμα σε ένα δίσκο φίλτρου ποσοτικοποιείται σε απαριθμητή σπινθηρισμού. PKI-ανασταλεί δραστηριότητα κινάσης υπολογίστηκε, και τα δεδομένα αναφέρθηκαν ως picomoles ΑΤΡ ανά λεπτό ανά g πρωτεΐνης.

ανοσοφθορισμού

Τα κύτταρα (περίπου 5×10

4 κύτταρα) καλλιεργήθηκαν είτε σε θάλαμοι Transwell (0.4μm μέγεθος πόρων) και αναπτύχθηκαν σε συρροή (περίπου 5 ημέρες). Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν, και ανοσοσημασμένων με το κατάλληλο πρωτογενές αντίσωμα (ποντικού αντι-CTR, Acris Laboratories? Κουνελιού αντι-ΖΩ-1 ορού, Invitrogen? Κουνελιού αντι-κλαουδίνης 3 αντιορό, Invitrogen) για όλη τη νύχτα σε 4

0 C . εφαρμόστηκαν Τα αντίστοιχα δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με φθοροφόρα. Μετά τις πλύσεις, οι πλάκες παρατηρήθηκαν κάτω από Nikon Optiphot-2 μικροσκόπιο εξοπλισμένο για επιφθορισμό. Οι εικόνες που έχουν ληφθεί με Retiga 1300 φωτογραφική μηχανή συνδεδεμένη με έναν υπολογιστή iMac φορτωμένο με το πρόγραμμα ανάλυσης εικόνας ΤΩΝ ΖΩΩΝ (Biovision Technologies, Exton, ΡΑ). Όλα τα αντισώματα χαρακτηρίστηκαν ως προς την ειδικότητα και διασταυρούμενη αντιδραστικότητα, όπως περιγράφεται στο Παράρτημα S1, S2A-S2C Σχ.

Μέτρηση του επιθηλίου ηλεκτρικής αντίστασης (TER) και παρακυτταρικής διαπερατότητας (PCP)

Περίπου 5×10

4 κύτταρα απλώθηκαν σε φίλτρα Transwell (0.4μm μέγεθος πόρων) και αναπτύχθηκαν σε συρροή (συνήθως 5-6 ημέρες). TER (εις διπλούν φρεάτια) μετρήθηκε σε διάφορες χρονικές στιγμές με μετρητή EVOM volt-ohm όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Οι μετρήσεις διορθώθηκαν για τα κενά (τιμές TER του φίλτρου σε μέσο κολύμβησης). Η πυκνότητα ακεραιότητα και κυτταρική μονοστοιβάδες παρακολουθείται προσεκτικά.

Για μετρήσεις PCP, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε συρροή σε φίλτρα Transwell. Tetra μεθυλ ροδαμίνη-δεξτράνη (1 mg /ml, ~ 4 kDa, Sigma) προστέθηκε στον άνω θάλαμο. Ο φθορισμός της κατώτερης μέσου θαλάμου μετρήθηκε σε Modulus Microplate Reader (Turner Biosystems) μετά από μία ώρα.

In vitro

Invasion Δοκιμασία

πειράματα Εισβολή διεξήχθησαν σε 24 φρεατίων , δύο με διαμερίσματα, θάλαμοι εισβολής Matrigel ™ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]

Διόρθωση ανάπτυξης:. από CT επάγει επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PC γραμμών, προσδιορίσαμε τον παράγοντα για τη διόρθωση για την πιθανή πολλαπλασιασμό των κυττάρων που μπορεί να έχουν μεταναστεύσει σε πρώιμη φάση της περιόδου επώασης 24 h. 25 χ 10

4 κύτταρα απλώθηκαν σε ωριαία διαστήματα σε πιάτα έξι φρεατίων και καλλιεργήθηκαν επί 1-24 ώρες. Μέση ποσοστιαία αύξηση στον αριθμό των κυττάρων σε κάθε φρεάτιο προσδιορίστηκε. Η διόρθωση αυτή εφαρμόστηκε στα αποτελέσματα των δοκιμασιών εισβολής.

CTR-C pull-down Δοκιμασία

cDNA που κωδικοποιεί την ενδοκυτταρική περιοχή της CTRwt και CTRΔESS (αα 441 με 476) κλωνοποιήθηκε στο pGEX φορέα (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Ελέγχου (C) -cDNA κατασκεύασμα (τυχαία αλληλουχία cDNA του ισοδύναμου μήκους) παρασκευάστηκε για αρνητικό έλεγχο. Τα cDNA που εκφράζονται σε BL-21

Escherichia coli

στέλεχος, και ισοδύναμη ποσότητα κάθε πρωτεΐνης σύντηξης (περίπου 2 mg) απορροφήθηκε σε γλουταθειόνη-Sepharose 4Β (GE Healthcare). Τα σφαιρίδια που περιέχουν πρωτεΐνες σύντηξης GST του πεπτιδίου C, CTR-CWT και CTR-CΔESS στη συνέχεια επωάστηκαν με PC-31 προϊόν λύσης κυττάρου. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν με μειωμένη γλουταθειόνη. Η παρουσία του ΖΟ-1 στο έκλουσμα ανιχνεύτηκε με στύπωμα Western.

δοκιμασίες Επικάλυψη

δοκιμασίες Επικάλυψη διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Κυτταρολύματα από σταθερά επιμολυσμένα PC-3M εκφράζουν είτε ΖΟ-1 βάρος-MYC ή μεταλλάκτες ZO-1ΔPDZ-MYC παρασκευάστηκαν, κλασματοποιημένο σε ένα πήκτωμα SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Η κηλίδα κόπηκε σε λωρίδες που αντιπροσωπεύουν κάθε λωρίδα του πηκτώματος. Οι λωρίδες στη συνέχεια αποκλείστηκε σε πολύ Western ρυθμιστικό διάλυμα και επωάστηκαν με καθαρισμένη GST πρωτεΐνη σύντηξης με ετικέτα CTRwt όλη τη νύκτα στους 4 ° C, και υποβάλλονται σε επεξεργασία για GST ανοσοκηλίδωση. Για τους ελέγχους φόρτωση πρωτεϊνών, οι κηλίδες απογυμνώθηκαν και ξαναϊχνηθετούνται για MYC.

Co-immunoprecpitation

Ο ορός-πεινασμένο PC-31-V, PC-31-CTRwt ή PC-31-CTRΔ κύτταρα ESS (2 χ 10

6 ανά 100 mm δίσκο) διεγέρθηκαν με /χωρίς 50 ηΜ CT για 3 λεπτά, πλύθηκαν και λύθηκαν εντός του ρυθμιστικού διαλύματος ΠΕ, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19]. CTR σε κανονικοποιημένη πρωτεΐνες λύμα ανοσοκαταβυθίστηκε με αντι-FLAG EZ-view σφαιρίδια (Sigma), και εκλούστηκε με το πεπτίδιο FLAG (600 μg /ml σε PBS). CTR immunopreciptates υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ΖΩ-1 ανοσοαποτύπωση. Για τον έλεγχο για την πρωτεΐνη φόρτωσης και μεταφοράς, οι κηλίδες απογυμνώθηκαν και ξαναϊχνηθετούνται με ανοσοκαταβύθιση αντίσωμα.

Αποδέκτης Φωτογραφία-λεύκανση Μεταφορά Ενέργειας Συντονισμού Φθορισμού (FRET) Μικροσκοπία

PC-31 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε γυάλινο κάτω θαλάμους και αναπτύχθηκαν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με πλασμίδια χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη ™ CTRwt-ECFP-Ν1 (ή CTRΔESS-ECFP-Ν1) και ΖΟ-1 βάρος-EYFP-Ν1 (ή ZO1-ΔPDZ3-EYFP-N1), καλλιεργήθηκαν για επιπλέον 36 ώρες, και απεικονίζεται ζωντανά μετά από θεραπεία με 50 nM CT (ή ελέγχου) σε θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας Nikon Eclipse 2000 ΤΕ συνδέεται με Sensicam-qe (Cooke Corporation, Romulus, MI). ΚΑΠ και YFP εικόνες αποκτήθηκαν με διέγερση στα 436 nm και εκπομπή στα 480/535 nm, αντίστοιχα. Ένα φίλτρο διχροϊκό 505 nm που σε διπλή προβολή χρησιμοποιήθηκε για να χωρίσει τις εικόνες (Optical Insights, Santa Fe, NM). FRET καταγράφηκε από τον έλεγχο της σβέσης της Κοινής Αλιευτικής Πολιτικής κατά τη διάρκεια YFP φωτολεύκανση. Οι εικόνες αναλύθηκαν με IPLab 4.0 λογισμικό απεικόνισης (Scanalytics, Inc, Rockville, MD), να ανησυχεί αποδόσεις υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τον τύπο: FRET

Αποδοτικότητα = (δότης ΚΑΠ

μετά την λεύκανση-δότη ΚΑΠ

πριν από λεύκανση) /δότη ΚΑΠ

μετά την λεύκανση. Κατώτατα όρια για δότη (ΚΑΠ), δέκτη (YFP), και FRET εικόνες τέθηκαν κατά την έναρξη της συλλογής δεδομένων και παρέμειναν αμετάβλητα για ολόκληρο το σύνολο δεδομένων.

In situ

δοκιμασία εγγύτητας απολίνωση (PLA)

Σταθερό κύτταρα PC ή ιστοί ανοσοσημασμένων με πρωτεύοντα αντισώματα (αντι-κουνέλι ΖΩ-1 στον ορό και αντι-ορό κατσίκας CTR) για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Τα δευτερεύοντα αντισώματα που συνδέονται με ανιχνευτές PLA παρέχονται με το κιτ Duolink ™ (Olink Bioscience, Uppsala, Σουηδία). CTR-ΖΩ-1 παρατηρήθηκε αλληλεπίδραση με ομοεστιακό μικροσκόπιο στα 400Χ. Μια κόκκινη φθορίζουσα κουκίδα υποδεικνύει τα δύο πρωτεΐνες βρίσκονται σε κοντινή απόσταση με τα 35nm. Ο αριθμός των κουκκίδων ανά κύτταρο καθορίστηκε με λογισμικό ανάλυσης εικόνας Blobfinder ™ [20].

Κατεψυγμένα προστάτη όγκοι

Snap-κατεψυγμένα δείγματα όγκου ανθρώπινου προστάτη ελήφθησαν από τη Λουιζιάνα Cancer Research Center, και ήταν επεξεργασία για συν-ανοσοκαταβύθιση όπως περιγράφεται προηγουμένως [21]. Οι ιστοί του όγκου του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη ελήφθησαν από τη Λουιζιάνα Cancer Research Consortium (LCRC? New Orleans, LA) με τη γραπτή συγκατάθεση του ασθενούς και την έγκριση Institutional Review Board των δύο θεσμικών οργάνων, IRB του Πανεπιστημίου της Λουιζιάνα στο Monroe και την Επιτροπή Ερευνών του Πανεπιστημίου Tulane ( turc) του Tulane University Medical Center και Λουιζιάνα Cancer Research Center. Για μια παρόμοια μελέτη βλέπε Liu et al [22].

ορθοτοπική ανάπτυξη και μετάσταση όγκου

Για την ανίχνευση μικρομεταστάσεων εμφυτευμένων κυττάρων όγκου στα ποντίκια, θα σταθερώς επιμολυσμένα τις κυτταρικές γραμμές με DsRed-MCherry- Hyg-Ν1 (Clontech, Palo Alto, CA). επιλέχθηκαν υγρομυκίνη ανθεκτικές αποικίες που εξέφρασαν έντονο κόκκινο φθορισμό σε ένα σταθερό επίπεδο κατά τη διάρκεια της περιόδου παρατήρησης, και χρησιμοποιούνται για ορθοτοπική εμφύτευση

.

Όλες οι διαδικασίες σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις αρχές και τις διαδικασίες που περιγράφονται από το ΝΙΗ και Θεσμικών ζώων φροντίδα και Χρήση επιτροπή στο Πανεπιστήμιο της Λουιζιάνα στο Monroe. Οι διαδικασίες των ζώων που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη είχαν εγκριθεί από το IACUC του Πανεπιστημίου της Λουιζιάνα στο Monroe. Η ορθοτοπική χειρουργική εμφύτευση διεξήχθη κάτω από Κεταμίνη /Ξυλαζίνη αναισθησία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6]. Καρκινικών κυττάρων εναιωρήματα (1×10

6 κύτταρα /20 μΙ) εγχύθηκαν στην ραχιαία προστάτη, τα ζώα παρακολουθήθηκαν για ανάπτυξη όγκου και μετάσταση με φθοριογραφία χρησιμοποιώντας Kodak 4000 σταθμός απεικόνισης ΜΜ, και θανατώθηκαν εντός εξήντα ημερών [23]. Τα ζώα παρατηρήθηκαν σε ημερήσια βάση και ανώδυνα θυσιάζονται με CO

2 εισπνοή όταν συναντήθηκαν τα ακόλουθα ανθρώπινη κριτήρια καταληκτικό σημείο: κατάπτωση, δερματικές βλάβες, σημαντική απώλεια βάρους του σώματος, δυσκολία στην αναπνοή, επίσταξη, περιστροφική κίνηση και πτώση της θερμοκρασίας του σώματος. Διάφορα όργανα συλλέχθηκαν, σταθεροποιήθηκαν και εξετάστηκαν για μετάσταση όγκου. Ευθανασία πραγματοποιήθηκε από εκπαιδευμένους ερευνητές Δρ. Arvind Thakkar και Vijaybasker Lakshmikanthan. Ο Δρ Shibu Τόμας συμμετείχε σε πρώτο μέρος της μελέτης, όπου συνέβαλε στην ανάπτυξη των κατασκευασμάτων, η παραγωγή των κυτταρικών σειρών και την καθιέρωση της ορθοτοπικό μοντέλο εμφύτευσης.

Κατά τη νεκροψία, πρωτοπαθή όγκο και σε άλλα όργανα συλλέχθηκαν και ζυγίστηκαν . Wet τμήματα όργανα εξετάσθηκαν για την παρουσία του RFP. Τα υπόλοιπα ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε ουδέτερη ρυθμισμένη φορμαλίνη και υποβάλλονται σε επεξεργασία για την H & amp? Χρώση Ε. Η χρήση ζώων ήταν αναγκαίο να εκτιμηθεί ογκογονικότητα και metastastasizing ικανότητα των κυτταρικών γραμμών που εκφράζουν άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο CTR.

Αρσενικά BALB /c ηυ /ηυ ποντίκια (ηλικίας 6-8 εβδομάδων) αγοράστηκαν από τη Harlan (Madison, WI), και στεγάζονται δύο ανά κλουβί σε μονάδες μικροαπομονωτικά σε εγκατάσταση εμπόδιο σε μια σωματιδίων υψηλής απόδοσης arrestance (HEPA) διηθημένο ράφι υπό κανονικές συνθήκες 12 ωρών φωτός /σκότους, τρέφονται

ad lib

σε ένα πρότυπο αυτόκλειστο εργαστηριακή δίαιτα, και σε καραντίνα για μία εβδομάδα πριν από τη χρήση τους στην μελέτη.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

CTR κυτταροπλασματική (C) ουρά περιέχει έναν τύπο Ι PDZ μοτίβο σύνδεσης

Πολλά κατηγορίας GPCRs Β ενεργοποιήσετε μη G-σηματοδότησης της πρωτεΐνης-διαμεσολαβείται από την αλληλεπίδραση με πρωτεΐνες σκαλωσιές μέσω κυτταροπλασματικές ουρές τους [24-26]. Από CTR ενεργοποιείται επίσης μη G-σηματοδότησης της πρωτεΐνης-συζευγμένο, εξετάσαμε την πρωτοταγή αλληλουχία του και διαπίστωσε ότι τα τέσσερα τερματικά υπολείμματα του CTR C-ουρά (αα 471-74, ESSA) σχημάτισε μου ΡΟΖ μοτίβο περιοχή δέσμευσης κανονικού τύπου [27, 28]. Εμείς αδρανοποιηθεί αυτό το μοτίβο με την αντικατάσταση αυτών των καταλοίπων με αλανίνη (που αναφέρεται ως ΔESS).

PC-3 κύτταρα επιλέχθηκαν επειδή στερούνται ενδογενή CTR και να καταστεί δυνατή η μελέτη του εξέφρασε CTR χωρίς παρεμβολή από ενδογενή CTR. Συγκρίναμε τα επίπεδα CTRwt ή CTRΔESS σε μεμβράνες PC-3 σταθερές γραμμές με ενδογενή επίπεδα CTR σε μεμβράνες από άλλες κυτταρικές γραμμές PC πλάσματος πλάσματος. PC-3 κύτταρα έλειπε CTR, και τα κύτταρα LNCaP εμφανίζεται χαμηλά επίπεδα CTR. Ωστόσο, τα επίπεδα των CTR στο PC-3CTRwt και PC3-CTRΔESS κύτταρα ήταν συγκρίσιμα με τα ενδογενή επίπεδα CTR της ελάχιστα διαφοροποιημένο κυτταρική σειρά DU-145 όπως ανιχνεύεται με ανοσοαποτύπωση (Εικ 1A1 και 1A2).

Α1 . CTR ανοσοαντιδραστικότητα στις μεμβράνες των κυτταρικών σειρών PC (30 μg πρωτεΐνη /λωρίδα) στο πλάσμα προσδιορίστηκε με ανάλυση κηλίδας Western. Η κηλίδα ξαναϊχνηθετούνται για SS-ακτίνη για εξομάλυνση. Εκπρόσωπος των τριών ξεχωριστών πειραμάτων. Α2. Οπτική πυκνότητα του CTR και ακτίνη ζώνες σε κάθε κηλίδα που λαμβάνεται με ανάλυση εικόνας για Kodak 4000 σταθμό Εικόνα ΜΜ. Το σχήμα παρουσιάζει τα δεδομένα της ομάδας (αναλογία CTR OD /ακτίνη OD ± SEM από 3 κηλίδες). Β κύτταρα PC-3CTR-ΔESS PC-3-CTRwt και καλλιεργήθηκαν σε επικοινωνούντα δοχεία μέχρι συρροής, πλύθηκαν, σταθεροποιήθηκαν και επεξεργασία για CTR ανοσοφθορισμό όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Οι μικροφωτογραφίες είναι 400Χ. C. PC-3CTR και PC-3CTRΔESS κύτταρα διεγέρθηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις CT (0-100 ηΜ) για 3 λεπτά. Τα κύτταρα λύθηκαν και τα υλικά λύσεως αναλύθηκαν για τα επίπεδα cAMP με ραδιοανοσοδοκιμασία. D-E. Κυτταρολύματα μη επεξεργασμένης /CT-αγωγή PC-3CTRwt και PC-3CTRΔESS κύτταρα επωάστηκαν με τα αντίστοιχα ΡΚΑ ή PKC υπόστρωμα πεπτιδίου και

32Ρ-ΑΤΡ όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή (Promega, Madison, WI). Ποσό

32Ρ-σημασμένο υπόστρωμα πεπτιδίου προσδιορίσθηκε, και η δραστικότητα υπολογίσθηκε.

Η

Μετάλλαξη του CTR-C PDZ μοτίβο σύνδεσης δεν μεταβάλλει υποκυτταρική εντόπιση του CTR ή G του συζευγμένου με πρωτεΐνη σηματοδότησης

Τόσο CTRwt και CTRΔESS εντοπίστηκαν στη μεμβράνη πλάσματος (Σχήμα 1Β). Για να εξετασθεί η ικανότητα του CTRwt και CTRΔESS να ενεργοποιεί G τελεστές που συζευγνύονται με πρωτεΐνη του, εξετάσαμε το σύνολο της καμπύλης δόσης-απόκρισης του CT επί συσσώρευσης cAMP σε κυτταρικές σειρές CTRwt και CTRΔESS, και ανέλυσε την επίδραση των 50 ηΜ CT επί δραστηριότητα ΡΚΑ και PKC. Αμφότεροι οι υποδοχείς προκάλεσε μια παρόμοια αύξηση στη συσσώρευση cAMP σε μία περιοχή συγκέντρωσης από 0-100 ηΜ και προκάλεσε παρόμοιες αυξήσεις στην ΡΚΑ και PKC δραστικότητας (Σχήμα 1C-1Ε). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ΔESS μετάλλαξη δεν μεταβάλλει ούτε τον εντοπισμό των CTR στο PC-3 κυτταρικές μεμβράνες ή την ικανότητά του να ενεργοποιεί G

αs και G

αq σηματοδότησης.

CTR- C ΡΟΖ-μοτίβο σύνδεσης απαιτείται για τη δράση του CTR για τη σταθερότητα TJ και την εισβολή

Α. TER.

Για να εξεταστεί η επίδραση της CT για σφιχτό κόμβους (TJS), TER του πολωμένου PC-3 κύτταρα που εκφράζουν είτε τον φορέα (PC-3V), CTRwt ή CTRΔESS παρακολουθήθηκε για 8 ώρες μετά την CT διέγερση. Πολωμένα κύτταρα PC-3V εμφανίζεται σχετικά υψηλό ΔΣΕ, και CT δεν είναι (Σχήμα 2Α1) αλλάξει. Σε αντίθεση, η έκφραση του CTRwt οδήγησε σε μείωση κατά 40% της TER σε κύτταρα PC-3CTRwt (Σχήμα 2Α2). Η πτώση αυτή είναι πολύ πιθανό να προκαλείται από την αλληλεπίδραση του μορφομετατραπέντος CTR με χαμηλά επίπεδα CT κανονικά εκκρίνονται από κύτταρα PC-3. Πράγματι, η προσθήκη εξωγενούς CT (50 ηΜ) μειώθηκε TER ακόμη περισσότερο. Ωστόσο, η έκφραση του CTRΔESS σε PC-3 κύτταρα δεν επηρέασε TER είτε πριν είτε μετά την προσθήκη εξωγενούς CT (Σχήμα 2Α3). Επιλέξαμε 50 ηΜ δόση CT που βασίζονται σε προηγούμενες μελέτες μας δείχνουν 10- έως 20-φορές αύξηση σε ενδογενή επίπεδα CT, καθώς και CT-εκκρίνουν κυτταρικούς πληθυσμούς κακοήθων προστάτη [29,30]. Επιπλέον, CT ​​ήταν μέγιστη αποτελεσματική δόση στο 50 ηΜ στην τόνωση της εισβολής των κυττάρων PC [17]. Δοκιμάσαμε επίσης CT σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις. Παρατηρήσαμε ότι η CT μειώθηκε σημαντικά TER των κυττάρων PC-3CTRwt στις συγκεντρώσεις 1 ηΜ ή μεγαλύτερη όταν επωάζονται για 2 ώρες (Σχ 2Β). Και πάλι, τα κύτταρα PC-3CTRΔESS δεν έδειξε καμία αλλαγή στο ΔΣΕ σε όλες τις συγκεντρώσεις CT υπό τις συνθήκες αυτές (Σχήμα 2Β). Για να ελεγχθεί ο ρόλος των ενδογενών CTR σε σταθερότητα TJ, χρησιμοποιήσαμε κυτταρική σειρά PC-3M, το οποίο προέρχεται από κύτταρα PC-3, είναι εξαιρετικά επιθετική, και συν-εκφράζει CT, καθώς και CTR [30,31]. Η knock-down του ενδογενούς CTR μόνη προκάλεσε μια σημαντική αύξηση στην TER των κυττάρων PC-3M (Σχήμα 2C).

A. Διεπιθηλιακού ηλεκτρικού αντίστασης (TER): Πολωμένη PC-3V, κύτταρα PC-3-CTRwt και PC-3CTR-ΔESS στερήθηκαν ορό για 4 ώρες, στη συνέχεια κατεργάζεται με /χωρίς 50 ηΜ CT. TER μετρήθηκε με μετρητή EVOM volt-ohm. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ohm-cm2 ± s.e.m. για η = 6). Β πολωμένο PC-3-CTRwt και PC-3CTR-ΔESS κύτταρα ήταν άνευ ορού επί 4 ώρες, έπειτα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με /χωρίς διάφορες συγκεντρώσεις CT 0-100 ηΜ). TER μετρήθηκε δύο ώρες μετά την προσθήκη του CT με μετρητή EVOM volt-ohm. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως TER (ohm-cm2) ± s.e.m. για n = 6. κύτταρα C. PC-3M διαμολύνθηκαν σταθερά είτε με φορέα πλασμίδιο pSuper.neo εκφράζει κωδικοποιημένα RNA (PC-3MV) ή φορέα pSuper.neo εκφράζει CTR shRNA (PC-3MCTR

KD) [14,42 ]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται στο σχήμα 2Α και TER μετρήθηκε σε διάφορα χρονικά διαστήματα μέχρι 2 ώρες παρουσία ή απουσία 50 ηΜ CT. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± s.e.m. για η = 4. knock-down του CTR μόνη προκάλεσε μια σημαντική αύξηση της TER των κυττάρων PC-3M, καταδεικνύοντας τη σημασία της ενδογενούς CTR στη ρύθμιση TJ σταθερότητα των κυττάρων PC-3M. Δ παρακυτταρική διαπερατότητα (PCP): Πολωμένη PC-3V, κύτταρα PC-3-CTRwt και PC-3CTRΔESS υποβλήθηκαν σε θεραπεία με /χωρίς 50 ηΜ CT. PCP προσδιορίστηκε με διάχυση του ~ 4kDa TRITC-συζευγμένο δεξτράνης από την άνω στον κάτω θάλαμο σε μία ώρα. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μg /ml /ώρα του TRITC-Δεξτράνης διαχέεται ± s.e.m. για n = 6. * ρ & lt? 0,05 (-CT vs + CT, μια κατευθύνσεων ANOVA και τεστ Newman-Keuls). Ε Σε ένα πείραμα παρόμοιο με 2Β, PCP προσδιορίστηκε με διάχυση του ~ 4kDa TRITC-δεξτράνης συζευγμένα από την άνω στον κάτω θάλαμο σε δύο ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μg /ml /ώρα του TRITC-Δεξτράνης διαχέεται ± s.e.m για n = 6. * ρ & lt? 0,05 (-CT vs + CT, μονόδρομη ANOVA και τεστ Newman-Keuls). κύτταρα

KD F. PC-3MV και PC-3MCTR ελέγχθηκαν για PCP, όπως περιγράφεται στο Σχ 2C. Και πάλι, το knock-down του CTR παρήγαγε μία σημαντική μείωση στην PCP των κυττάρων PC-3M, καταδεικνύοντας τη σημασία της ενδογενούς CTR στη ρύθμιση TJ σταθερότητα των κυττάρων PC-3M. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μg /ml /ώρα του TRITC-Δεξτράνης διαχέεται ± s.e.m για n = 6. * ρ & lt? 0,05 (-CT vs + CT, μονόδρομη ANOVA και τεστ Newman-Keuls). G. εισβολή: PC-3V, PC-3CTRwt και PC-3CTRΔESS κυττάρων προστέθηκαν σε άνω ένθετο θαλάμων εισβολή μαζί με /χωρίς 50 ηΜ CT, και τα κύτταρα που πέρασαν μέσα από το φράγμα Matrigel ™ ™ μετρήθηκαν μετά από 48 ώρες. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσος αριθμός κυττάρων ανά εισέβαλαν 400Χ πεδίο ± s.e.m. για n = 6. * ρ & lt? 0,05 (PC-3V έναντι PC-3CTR-κβ)? $ P & lt? 0,05 (PC-3CTR-κβ έναντι PC-3CTRΔESS)? $ $ -p & Lt? 0,05 (PC-3CTRwt + CT έναντι PC-3CTRΔESS + CT) (One-way ANOVA και τεστ Newman-Keuls). Η CTR ανοσολογική αντίδραση σε PC-3V, PC-3-CTRwt και PC-3CTRΔESS κύτταρα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με /χωρίς 50ηΜ CT. CTR σε κανονικοποιημένη πρωτεΐνες λύμα ποσοτικοποιήθηκε με ανοσοστύπωμα. Εκπρόσωπος κηλίδα από τρία ξεχωριστά πειράματα.

Η

Β. PCP.

TJs σχηματίζουν ένα φράγμα που ρυθμίζει την κίνηση των ιόντων, διαλυμένες ουσίες και παράγοντες ανάπτυξης μεταξύ των κυττάρων. Για να εξακριβώσουμε αν CT επηρεάζει την «διαρροή μονοπάτι», δηλαδή το φράγμα σε μεγάλα μη φορτισμένα μόρια, μετρήσαμε διάχυση του φθοροφόρου-δεξτράνης συζευγμένα σε όλη πολωμένο PC μονοστοιβάδων κυτταρική γραμμή. κύτταρα PC-3V εμφανίζεται σχετικά χαμηλή PCP και εξωγενείς CT δεν είναι (Σχήμα 2D) αλλάξει. Έκφραση CTRwt σε κύτταρα PC-3 προκάλεσε μία μικρή αύξηση στην PCP τους, και η προσθήκη του CT αυξήθηκε σημαντικά PCP. Αντίθετα, η έκφραση CTRΔESS είχε μικρή επίδραση στην PCP με την παρουσία ή απουσία CT. Όταν δοκιμάστηκε σε πολλαπλές συγκεντρώσεις CT, CT προκάλεσε αύξηση PCP των κυττάρων PC-3CTRwt στις δόσεις του 1 ηΜ ή υψηλότερες μετά από 2 ώρες επώασης (Σχήμα 2Ε). Και πάλι, CT δεν μετέβαλε PCP των κυττάρων PC-3CTRΔESS σε όλες τις συγκεντρώσεις που ελέγχθηκαν (Σχήμα 2Ε). Για να εξεταστεί η σημασία της ενδογενούς CTR σε σταθερότητα TJ, χρησιμοποιήσαμε πάλι τα κύτταρα PC-3M [30]. Όπως ήταν αναμενόμενο, το CTR

KD μειώθηκε σημαντικά PCP των κυττάρων PC-3M (Σχήμα 2F). Όταν εξεταστούν από κοινού, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι άξονα CT-CTR μπορεί να εμπλέκονται σε δυναμική ρύθμιση της TJs στα κύτταρα του προστάτη.

C. Εισβολή.

CT αυξάνει τη διεισδυτικότητα, και ακόμη και επάγει μια επεμβατική φαινότυπο σε μη επεμβατικές PC κύτταρα [14]. Εξετάσαμε το ρόλο της μοτίβου ΡΟΖ δέσμευσης σε CT-διεγερμένα εισβολή. Έκφραση CTRwt σε κύτταρα PC-3 αυξήθηκαν εισβολή κατά 2,5-φορές (Σχήμα 2G). Ωστόσο, η έκφραση του CTRΔESS δεν προκάλεσε μια παρόμοια αύξηση. Όταν διεγείρονται με 50 ηΜ CT, τα κύτταρα PC-3-CTRwt ανταποκρίθηκαν με ένα πρόσθετο 2,5-πλάσια αύξηση στην εισβολή, αλλά PC-3CTRΔESS δεν το έκανε. Από CTRwt και CTRΔESS είχε δραματικά διαφορετικά αποτελέσματα στην ΔΣΕ, PCP και την εισβολή, θέλαμε να βεβαιωθείτε ότι οι αποκλίσεις δεν ήταν λόγω των διαφορών στα επίπεδα τους CTR. επίπεδα Ανοσοαντιδραστικά CTR ήταν παρόμοια σε όλες τις κυτταρικές σειρές με την παρουσία ή απουσία του CT (Σχήμα 2Η), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αλληλεπίδραση του CTR με συντροφικής πρωτεΐνης του μέσω μοτίβο δέσμευσης ΡΟΖ της είναι κρίσιμη για την αποσταθεροποιητική δράσεις της στην TJs και την προώθηση της εισβολής

CTR αποσταθεροποιεί επίσης TJs και αυξάνει την εισβολή των άλλων κυττάρων PC γραμμές

Δοκιμάσαμε επίσης αν CT παράγει παρόμοια αποτελέσματα σε LNCaP, PC-3M και DU-145 κυτταρικές σειρές, οι οποίες εκφράζουν ενδογενή CTR (Εικ 1Α ). CT μειωμένη TER και αυξημένη PCP αυτών των κυτταρικών γραμμών, υποδηλώνοντας CT αποσταθεροποιεί TJs σε κυτταρικές σειρές PC-ανδρογόνο πυρίμαχα αποκρίνονται στο ανδρογόνο καθώς και (Σχήμα 3Α και 3Β). Ομοίως, CT αύξησε σημαντικά την εισβολή των λιγότερο επεμβατικές LNCaP, καθώς και πιο επεμβατική DU-145 και τα κύτταρα PC-3M (Σχήμα 3C).

LNCaP, PC-3M και DU-145 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 ηΜ CT και TER τους (Α), PCP (Β) και την εισβολή (C) μετρήθηκαν όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM (n = 6). * P & lt? 0.05 από αντίστοιχες ελέγχου (-CT vs + CT, One-way ANOVA και τεστ Newman Keuls). ^ P & lt? 0,01 (-CT vs + CT, One-way ANOVA και Newman-Keuls δοκιμή)

Η

Αναγνώριση CTR-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης

Από τη δράση του CTR στο TJ. της σταθερότητας και της εισβολής απαιτούνται ΡΟΖ μοτίβο σύνδεσης, επιδιώξαμε να εντοπίσει CTR-πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης με κοσκίνισμα Y2H συμπληρώσεως. Μετά τη διαλογή 1×10

6 προϊόντα μεταμόρφωσης, ταυτοποιήθηκαν 11 αλληλεπιδρούν κλώνους, καθαρίστηκαν και αλληλουχήθηκαν (Πίνακας 1). Οι περισσότεροι θετικοί κλώνοι κωδικοποιημένων πρωτεϊνών μεμβράνης πλάσματος ή /και πρωτεΐνες που σχετίζονται με το σύστημα αδενυλικής κυκλάσης. Ως νέο εύρημα, ένας κλώνος που κωδικοποιείται σφιχτό πρωτεΐνη διασταύρωση ΖΟ-1, και αυτός ο κλώνος παρείχε επίσης το ισχυρότερο σήμα σε δευτερογενή συστηματική εξέταση. Από CTR αποσταθεροποίησε TJs μόνο με την παρουσία του μοτίβου ΡΟΖ-δεσμευτική, θα χαρακτηρίζεται CTR-ΖΩ-1 αλληλεπίδραση περαιτέρω

Η

CTR-C-ουρά αλληλεπιδρά με ΖΩ-1:. Δοκιμασία pull-down Α

CTR-C ουρά-ΖΩ-1 αλληλεπίδραση εξετάστηκε χρησιμοποιώντας GST προσδιορισμοί pull-down.