Αφηρημένο

Ιστορικό και στόχος

μεταγραφικού παράγοντα E2A είναι ζωτικής σημασίας για την φυσιολογική ανάπτυξη και διαφοροποίηση των Β και Τ λεμφοκυττάρων. Δυσλειτουργία του Ε2Α οδηγεί σε λευχαιμία και ογκογένεση μερικών στερεών όγκων. Η έκφραση και η κλινική σημασία των E2A, καθώς και το ρόλο της στην καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) είναι ακόμη άγνωστες. Η μελέτη αυτή έχει ως στόχο να αξιολογήσει την έκφραση E2A στους ιστούς CRC, αξιολογεί την αξία πρόγνωση της, και να διερευνήσουν το ρόλο της στην ανάπτυξη του παχέος εντέρου καρκινικών κυττάρων.

Μέθοδοι

έκφρασης Ε2Α σε ιστούς CRC και φυσιολογικό βλεννογόνο ανιχνεύθηκε από ανοσοϊστοχημική χρώση? καμπύλη επιβίωσης Kaplan-Meier και μοντέλου παλινδρόμησης Cox χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η προγνωστική αξία του Ε2Α. Lentivirus χρησιμοποιήθηκε για να κατασκευαστεί E2A κύτταρα σταθερά νοκ-κάτω. ΜΤΤ δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει την αλλαγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού? κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής? και χρωματίνης ανοσοκατακρήμνιση (chip) θα δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να επικυρώσετε την προβλεπόμενη δεσμευτικό στόχο της E2A

Αποτελέσματα

Η έκφραση της Ε2Α ήταν χαμηλότερη στους ιστούς CRC από το φυσιολογικό βλεννογόνο.? χαμηλή έκφραση E2A συσχετίζονται με προχωρημένο στάδιο TNM και μεγαλύτερο μέγεθος του όγκου, και προέβλεψε κακή πρόγνωση των ασθενών με CRC. Ε2Α knockdown είχε ως αποτέλεσμα αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων και την επιτάχυνση του κυτταρικού κύκλου. δοκιμασία ChIP έδειξε miR-320a ήταν ένα άμεσο στόχο E2A και ρύθμιση προς τα άνω του miR-320a σε E2A μειωτικά κύτταρα θα μπορούσε να αντιστρέψει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου αλλαγές που προκαλούνται από την ανεπάρκεια E2A.

Συμπεράσματα

Ε2α ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για τους ασθενείς CRC και στοχεύει miR-320a να ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων

Παράθεση:. Huang Α, Zhao Η Quan Υ, Jin R, Feng Β, Zheng Μ (2014) Ε2Α προβλέπει πρόγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου ασθενών και ρυθμίζει τον καρκίνο κυτταρική ανάπτυξη κατά Στόχευση miR-320a. PLoS ONE 9 (1): e85201. doi: 10.1371 /journal.pone.0085201

Επιμέλεια: Ρατζίβ Samant, Πανεπιστήμιο της Αλαμπάμα στο Μπέρμιγχαμ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 του Σεπτέμβρη 2013? Αποδεκτές: 25 Νοεμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιανουαρίου του 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε οικονομικά από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (NSFC, 30873000). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το γονίδιο Ε2Α θηλαστικού βρίσκεται στο χρωμόσωμα 19 και είναι μη-ιστο-ειδικά και εκφράζονται παντού σε ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών τύπων. Μέσω εναλλακτική συρραφή, το γονίδιο Ε2Α κωδικοποιεί δύο ισομορφές, Ε12 και Ε47 (συλλογικά αναφέρονται ως πρωτεΐνες Ε2Α), που και οι δύο έχουν τον τομέα βασική έλικα-βρόχος-έλικα (bHLH) και θα μπορούσε να ρυθμίσει τη μεταγραφή γονιδίων δια συνδέσεως με το DNA E-box ακολουθίες, CAGGTG. Αν και εκφράζεται ευρέως, Ε2Α δεν είναι απαραίτητη σε ορισμένες organogeneses όπως σκελετικό ή καρδιακό μυογένεση, ερυθροποίηση, χονδρογένεση και νευρογένεσης [1], αλλά παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση των Β [2], [3] και Τ λεμφοκύτταρα [4 ]. E2A ανεπαρκή ποντίκια έδειξαν σύλληψης κατά το στάδιο προ-Β-κυττάρων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των κυττάρων Β [3] και διαγονιδιακών έκφραση είτε Ε12 ή Ε47 θα μπορούσε εν μέρει να σώσει την έναρξη Β λεμφοποίησης? Ομοίως, η ανεπάρκεια E2A οδήγησε σε ένα μπλοκ, στα αρχικά στάδια της ανάπτυξης των κυττάρων Τ [4] και διαταραχθεί θυμοκυτταρικό θετική επιλογή [5]. Επιπλέον, Ε2Α έχει βρεθεί ότι εμπλέκεται σε ορισμένες κυτταρικές δραστηριότητες όπως η διαφοροποίηση των κυττάρων [6], του πολλαπλασιασμού [7], η απόπτωση [8], τον κυτταρικό κύκλο [9] και επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) [10].

Εκτός από κρίσιμο ρόλο της στην κανονική Β και την ανάπτυξη των κυττάρων Τ, Ε2Α συμμετέχει επίσης στην ογκογένεση. Μελέτες είχαν αναφέρει την καθιερωμένη ρόλο των Ε2Α σε λευχαιμογένεση: δύο πρωτεΐνες σύντηξης, Ε2Α-HLF [11] και Ε2Α-ΡΒΧ1 [12], και τα δύο περιέχουν την περιοχή διενεργοποίησης του Ε2Α και το πεδίο σύνδεσης ϋΝΑ του HLF ή ΡΒΧ1, θα μπορούσε να οδηγήσει σε προ-Β κυττάρων οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ALL) σε εφήβους και προ-Β κυττάρων ALL σε παιδιά αντίστοιχα [13]. Επιπλέον, Ε2Α έχει βρεθεί ότι εμπλέκεται στην ογκογένεση στερεών όγκων, είτε ως ογκογονιδίου ή ως ογκοκατασταλτικού γονιδίου. Παρουσία πρωτεΐνης σύντηξης Ε2Α-ΡΒΧ1 στον καρκίνο του πνεύμονα αναφέρθηκε πρόσφατα και συσχετίζεται με τη συνολική επιβίωση των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα in situ [14]. Αυξημένη έκφραση του Ε2Α ανιχνεύθηκε στον καρκίνο του μαστού [15], [16] και του καρκίνου του προστάτη [17], από τα οποία βρέθηκε για την προώθηση της ογκογένεσης. Ωστόσο, τα ποντίκια με μηδενική μετάλλαξη του Ε2Α ήταν ευαίσθητα σε αυθόρμητα αναπτυχθεί θυμικό λέμφωμα [18] και την απώλεια των Ε2Α σε πρωτοπαθές λέμφωμα συλλογή οδήγησε στην αντίσταση απόπτωση [19], υποδηλώνοντας την εναλλακτική ρόλος του Ε2Α ως γονίδιο καταστολής όγκων. Επιπλέον, η έκφραση Ε2Α έχει προταθεί να είναι από διαγνωστική αξία σε ορισμένες υπότυπο του γαστρικού MALT (βλεννογόνου που σχετίζεται λεμφικού ιστού) λέμφωμα [20]. Στο σύνολό τους, Ε2Α μπορεί να δρα ως γονίδιο καταστολής όγκων ή ως ογκογονίδιο σε διαφορετικές μορφές καρκίνου.

Η έκφραση του Ε2Α σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC) και προγνωστική αξία της δεν έχουν συζητηθεί πριν και είναι ακόμα άγνωστο αν E2A προωθεί ή να καταστέλλει την ανάπτυξη του CRC. Σε αυτή τη μελέτη, στη γνώση μας, για πρώτη φορά, ερευνήσαμε την κλινική σημασία των Ε2Α εις το CRC και βρήκε χρησιμότητά της ως προγνωστικός δείκτης? Επιπλέον, βρήκαμε Ε2Α κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου με στόχευση miR-320a σε καρκινικά κύτταρα κόλου, αποδεικνύοντας όγκο κατασταλτικής ρόλο της στην CRC.

Μέθοδοι

Ασθενείς και κλινικά δείγματα

συμπεριλήφθηκαν συνολικά 98 ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου? οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με χειρουργική επέμβαση από τον Ιούνιο του 2007 και τον Ιανουάριο 2008 στο Shanghai Ελάχιστα Επεμβατικής Χειρουργικής Center. Οι ασθενείς αποκλείστηκαν εάν: είχε λάβει εισαγωγική χημειοραδιοθεραπεία? είχε ανεγχείρητο του παχέος εντέρου? είχαν όγκους άλλων οργάνων? ήταν απίθανο να κληθούν σε συνέντευξη κατά τη διάρκεια της παρακολούθησης. Δημογραφικά και κλινικοπαθολογοανατομικές δεδομένα εξήχθησαν από την ανασκόπηση διαγραμμάτων. Οι ασθενείς ερωτήθηκαν μέσω τηλεφώνου σε τρεις μήνες, έξι μήνες και στη συνέχεια κάθε χρόνο μετά την επέμβαση. δείγματα όγκου κόπηκαν αμέσως μετά την απομάκρυνση χειρουργικά δείγματα κατά τη διάρκεια των εργασιών και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με φορμαλίνη και διατηρήθηκαν στους 4 ° C για δύο εβδομάδες πριν από την επόμενη θεραπεία? φυσιολογικούς ιστούς ορίστηκαν ως βλεννογόνου που βρίσκεται τουλάχιστον 5 εκατοστά μακριά από το περιθώριο του όγκου και κομμένα, σταθερό, διατηρημένα και αντιμετωπίζεται ως ανωτέρω. Αυτή η μελέτη διεξήχθη με τις γραπτές ενημέρωσε συγκατάθεση όλων των ασθενών που εντάχθηκαν πριν από τη χειρουργική επέμβαση και σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Ruijin Νοσοκομείο της Σαγκάης Jiao Tong University School of Medicine.

Η ανοσοϊστοχημεία και βαθμολόγησης

χρώση Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως πρωτόκολλο [21]. Εν συντομία, μετά από στερέωση με φορμαλίνη, οι ιστοί εγκλείστηκαν με παραφίνη, κομμένα και τοποθετημένα σε διαφάνειες. Στη συνέχεια, τα πλακίδια πλύθηκαν με ξυλόλιο για να deparaffinize, με διαβαθμισμένη αιθανόλη να ενυδατωθεί, επωάστηκαν με διάλυμα κιτρικού οξέος για να ανακτήσετε αντιγόνο, και αποκλείστηκαν με 3% Η

2O

2 για την αδρανοποίηση ενδογενούς υπεροξειδάσης. Τα πλακίδια επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα Ε2Α (Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA? 1:200 αραίωση) στους 4 ° C όλη τη νύκτα, που ακολουθείται από επώαση με υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα κατσίκας (Santa Cruz) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Complex οπτικοποίηση έγινε με ένα 2-Διάλυμα DAB Kit (Invitrogen). Οι αρνητικοί έλεγχοι ελήφθησαν με αντικατάσταση του πρωτογενούς αντισώματος Ε2Α με προάνοσο ορό κουνελιού.

Τα πλακίδια εξετάστηκαν από δύο ερευνητές (Huang και Quan) ανεξάρτητα. Κριτήρια βαθμολόγησης που χρησιμοποιήθηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως με ελάσσονες τροποποιήσεις. Χρώση ένταση βαθμολογήθηκε ως 0 (καθόλου χρώση), 1 (ασθενής χρώση), 2 (μέτρια χρώση), και 3 (ισχυρή χρώση)? θετικών κυττάρων σε κάθε τμήμα βαθμολογήθηκαν ως 0 (λιγότερο από 10%), 1 (10% -25%), 2 (26% -50%), και 3 (& gt? 50%). Το τελικό σκορ ήταν ένα προϊόν της βαθμολογίας της έντασης και των θετικών κυττάρων της κάθε διαφάνεια. Διαφάνειες με 0-3 ορίστηκαν ως χαμηλή έκφραση και 4-9, όπως υψηλή έκφραση.

Κυτταρική καλλιέργεια

Καρκίνος του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές LOVO, HCT116, Caco-2, ΗΤ29, SW480, και SW1116 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και υποκαλλιεργήθηκαν και διατηρημένα με Σαγκάη Ινστιτούτο Πεπτικό Χειρουργική? φυσιολογικό ανθρώπινο βλεννογόνου του παχέος εντέρου επιθήλιο των κυττάρων NCM460 ευγενική δωρεά του Jingqing Ζενγκ (Ruijin Νοσοκομείο, Σαγκάη Jiao Tong University School of Medicine? ο δωρητής αγόρασε κυτταρική σειρά NCM460 από INCELL Corporation, LLC, Σαν Αντόνιο, Τέξας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). LOVO καλλιεργήθηκε σε F-12K θρεπτικό μίγμα Medium (Corning Cellgro®, MA, USA), HCT116 και ΗΤ29 σε McCoy 5Α (Corning Cellgro®), SW480 και SW1116 σε Leibovitz «L-15 (Corning Cellgro®), και NCM460 σε DMEM (Corning Cellgro®). Όλα μέσο καλλιέργειας παραπάνω συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Caco-2 καλλιεργήθηκαν σε Ελάχιστο Απαραίτητο Μέσο (Corning Cellgro®) με 20% FBS. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε επωαστή (Heracelles, Γερμανία) στους 37 ° C, σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% κηλίδος

Cells Western συλλέχθηκαν σε CO

2.

εκχύλιση πρωτεϊνών και μια συρροή 80% με RIPA (Solarbio, Beijing, Κίνα) και η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, USA) με μέτρηση Οϋ

562 χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (Epoch, BioTek, Winooski, USA) . κηλίδα Western διεξήχθη σύμφωνα με προηγουμένως αναφερθείσες πρωτόκολλο [22] και πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν Ε2Α (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA). GAPDH (Kangchen, Σαγκάη, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

RNA και την απομόνωση microRNA, qRT-PCR

Σύνολο κυττάρων RNAs εξήχθησαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) και το σύνολο των microRNAs κυττάρων ( miRNAs) εκχυλίζονται με κιτ απομόνωσης mirVana ™ miRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). RNA αντίστροφης μεταγραφής διεξήχθη χρησιμοποιώντας PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time (Takara, Shiga, Japan). Το επίπεδο του mRNA της Ε2Α (εμπρός: 5′-CCACT TCACT GAGTC GCACAG-3 ‘? Αντίστροφη: 5′-GTCTC TCCCG AAGGA GGCATA-3′) αξιολογήθηκε από qRT-PCR, χρησιμοποιώντας SYBR Green ΡΟΚ Master Mix (Applied Biosystems)? το επίπεδο του RNA του GAPDH (εμπρός: 5’-GGAGC GAGAT CCCTC CAAAAT-3 ‘? αντίστροφη: 5′-GGCTG TTGTC ATACT TCTCA ΤΟΟ-3’) χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση. Η έκφραση του miR-320a αξιολογήθηκε με qRT-PCR χρησιμοποιώντας Taqman microRNA RT Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), TaqMan microRNA δοκιμασίες (Applied Biosystems), και Taqman καθολική PCR κύριο μείγμα (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών? το επίπεδο U6 miRNA χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση.

λεντοϊών επιμόλυνσης για σταθερούς κλώνους έκφρασης

Ε2Α /shRNA-eGFP-φακοϊού σωματίδια και Ε2Α /sh-αρνητικό μάρτυρα (SHNC) -eGFP-lentivirus σωματίδια , δηλαδή Ε2Α /shRNA-LV και Ε2Α /SHNC-LV, αγοράστηκαν από Novobio (Σανγκάη, Κίνα). SHNC συντέθηκε με τις ίδιες βάσεις shRNA αλλά με περιπλεγμένο αλληλουχία. Λεντοϊών επιμόλυνση και διαλογή κυττάρων διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για να καθοριστεί η Ε2Α σταθερά μειωτικά και η σταθερά NC transefected SW480 κλώνους, δηλ SW480 /shE2A και SW480 /SHNC. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης αξιολογήθηκε με οπτική εξέταση του ποσοστού του eGFP-κυττάρων που εκφράζουν υπό μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus, Tokyo, Japan), western blot, και qRT-PCR.

παροδική επιμόλυνση

Τα πλασμίδια, Pez-M29-E12 (πλασμίδιο που κωδικοποιεί ισόμορφη Ε12), Pez-M29-E47 (πλασμίδιο που κωδικοποιεί ισόμορφη E47), Pez-M29-NC (πλασμίδιο με αρνητικό ακολουθία ελέγχου) και του φορέα ελέγχου αγοράστηκαν από Genecopoeia (Rockville, MD, USA) και επικυρώνεται από αλληλούχιση? μιμείται miRNA-320a (διπλή έλικα RNA μόρια που μιμούνται miR-320a) και μιμείται NCS (ακολουθίες αρνητικός έλεγχος βασίζεται σε C. elegans microRNAs έχουν ελάχιστη ταυτότητα αλληλουχίας σε ανθρώπινο) αγοράστηκαν από GenePharma (Σανγκάη, Κίνα). Κύτταρα λογαριθμικής φάσης συλλέχθηκαν και σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε πυκνότητα 4 * 10

5 κύτταρα /φρεάτιο, 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση, σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Αποτελεσματικότητα της παροδικής επιμόλυνσης εξετάστηκε με Western Blot ή qRT-PCR. Κύτταρα επιμολυσμένα με φορείς χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού κυττάρων εκτελέστηκε με το κύτταρο Μετρώντας Kit-8 (CCK8) (Dojindo, Kumamoto, Japan). Εν συντομία, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε πέψη με θρυψίνη (Beyotime, Σαγκάη, Κίνα), πλύθηκε με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) δύο φορές, διηθείται με ένα σουρωτήρι (BD Falcon), επαναιωρήθηκαν σε RIPA 1640, μετρήθηκαν και αραιώθηκαν σε μια τελική συγκέντρωση του 5 κύτταρα /μl. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων, 200 μΐ (1000 κύτταρα) ανά φρεάτιο, σε sixplicate, και τοποθετούνται στον επωαστήρα για 6 ημέρες. Τα βιώσιμα κύτταρα προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε κάθε χρονικό 24 ώρες με CCK8, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή, και η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε με χρήση αναγνώστη μικροπλάκας (Epoch, BioTek).

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Πριν από την ανάλυση, κύτταρα (2 χ 10

6) συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την παροδική διαμόλυνση, καθώς και τα αντίστοιχα στοιχεία ελέγχου. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS, μονιμοποιήθηκαν με 75% αιθανόλη και αποθηκεύονται στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Κατά την ανάλυση, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS δύο φορές και υποβάλλεται σε επεξεργασία με RNase στους 37 ° C για μία ώρα, που ακολουθείται από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο για 30 λεπτά σε σκοτάδι. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε με κυτταρομετρία ροής (FACSCalibur, Becton Dickinson, MD, USA).

χρωματίνης δοκιμασία ανοσοκατακρήμνισης

EZ-chip ™ χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση Kit (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA ) αγοράστηκε για την εκτέλεση της δοκιμασίας ChIP, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, ένα 15 εκατοστά πλάκα καλλιέργειας κυττάρων των SW480 κυττάρων (περίπου 80% συρροή) καθορίστηκε με 1% PFA (Sigma). Στη συνέχεια, τα κύτταρα λύθηκαν, σε υπερήχους σε διάτμηση του DNA και ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-Ε2Α (Santa Cruz) και αντίσωμα ελέγχου (IgG). Μετά από αυτό, πρωτεΐνης /DNA διασταυρώσεων αντιστράφηκε και το DNA καθαρίζεται για την ακόλουθη PCR, χρησιμοποιώντας Takara Εχ Taq Hot Start Έκδοση (Takara).

Στατιστική ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση το λογισμικό SPSS 15.0. Η συσχέτιση των κλινικών παραγόντων με έκφραση Ε2Α εξετάστηκε με ανάλυση συσχέτισης Pearson. Η επίδραση των Ε2Α στην επιβίωση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την καμπύλη Kaplan-Meier και δοκιμασία log-rank. Μονοπαραγοντική και μοντέλο αναλογικών κινδύνων του Cox πολυμεταβλητή είχαν χρησιμοποιηθεί για να αξιολογήσει τις επιδράσεις της έκφρασης Ε2Α και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων στις 5 ετών OS και DFS, αντίστοιχα. t δοκιμή Student χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν οι διαφορές μεταξύ των δύο ομάδων και μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιήθηκε σε περίπτωση δεδομένων αποτελείτο από περισσότερες από δύο ομάδες. Ένα δίπλευρη τιμή

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

Η έκφραση της E2A συσχετίζονται με CRC παθολογικά στάδια

Πρώτον, αξιολογήσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης Ε2Α σε ιστούς CRC και φυσιολογικό βλεννογόνο με ανοσοϊστοχημεία (Εικόνα 1). Εξετάστηκαν παχέος δείγματα όγκων που προέρχονται από 98 ασθενείς με CRC και φυσιολογικό βλεννογόνο διαθέσιμη από 43/98 ασθενείς. Τα δημογραφικά και κλινικοπαθολογικών παράμετροι όλα περιλαμβάνονται ασθενείς παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Από τους 98 ασθενείς, υψηλή έκφραση του Ε2Α ανιχνεύθηκε σε 35/43 φυσιολογικό βλεννογόνο και 39/98 καρκινικών ιστών (

P

& lt? 0,01) . Χρώση Ε2Α στην κανονική βλεννογόνο παρουσιάζονται στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα και τα δύο, αλλά σε καρκινικούς ιστούς, χρώση Ε2Α ήταν κυρίως πυρηνική (Σχήμα 1). Το πιο σημαντικό, η έκφραση του Ε2Α μειώθηκε ως CRCs προηγμένη (Σχήμα 1Ε-Η). Στη συνέχεια έκανε μια ανάλυση συσχέτισης για να μελετήσουμε τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης E2A και των κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, χαμηλή έκφραση του Ε2Α συσχετίστηκε σημαντικά με το στάδιο υψηλότερη ΤΝΜ (

P

& lt? 0,01) και μεγαλύτερο μέγεθος όγκου (

P

= 0.035), αλλά δεν ήταν συνδεδεμένη με ασθενείς ηλικίας (

P

= 0,761), το φύλο (

P

= 0,655), ιστολογία του όγκου (

P

= 0.985), ή την τοποθεσία του όγκου (

P

= 0.120). Έτσι Ε2Α ήταν πιθανό να εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την πρόοδο της CRC

Αντιπροσωπευτικά εικόνες των IHC παρουσιάζονται ως:. (Α) HE χρώση του φυσιολογικού βλεννογόνου? (Β) η χρώση του CRC ιστού? (C) έκφραση υψηλής E2A (καφέ χρώμα) παρουσιάζονται ως πυρηνική και κυτταροπλασματική χρώση σε φυσιολογικό βλεννογόνο? (D) χαμηλή έκφραση Ε2Α σε φυσιολογικό βλεννογόνο? (Ε-Η) στάδιο Ι (Ε) προς το στάδιο ΙΙ ιστούς με διαφορετικές εντάσεις χρώσης Ε2Α (F), III (G), και IV (H) CRC? E2A εμφανίστηκε κυρίως στον πυρήνα. Εικόνες ελήφθησαν κάτω από 200 × μεγέθυνση.

Η

Η

Χαμηλή έκφραση E2A προβλέψει κακή πρόγνωση των ασθενών με CRC

Για να διερευνήσουν την προγνωστική αξία της Ε2Α, χρησιμοποιήσαμε Kaplan καμπύλη επιβίωσης 5 ετών -Meier για να δείξει τις διαφορές στα αποτελέσματα μεταξύ CRC ασθενείς χαμηλού και υψηλού έκφραση E2A. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, οι ασθενείς με υψηλή έκφραση Ε2Α είχε πλέον 5 χρόνια συνολική επιβίωση (OS) και της νόσου επιβίωση χωρίς (DFS) από τους ασθενείς με χαμηλή έκφραση. Το 5-ετή OS και DFS για ασθενείς έκφραση υψηλού E2A ήταν 84,6% και 82,1%, και για τους ασθενείς με χαμηλή έκφραση E2A ήταν 47,5% και 42,4% (

P

= 0.000, για το OS και DFS και τα δύο). Στη συνέχεια, θα χρησιμοποιηθεί το μοντέλο παλινδρόμησης Cox να εξεταστεί η προγνωστική αξία του Ε2Α. Στην μονοπαραγοντική ανάλυση, το στάδιο και E2A έκφραση ΤΝΜ βρέθηκαν να είναι προγνωστικά για το OS και DFS? ενώ στην πολυπαραγοντική ανάλυση, οι δύο παράγοντες προέβλεψε επίσης χειρότερα κλινικά αποτελέσματα (Πίνακας 3). Ως εκ τούτου, η έκφραση Ε2Α φαινόταν να είναι ένα χρήσιμο προγνωστικό παράγοντα για την πρόγνωση των ασθενών CRC

(Α) OS για τους ασθενείς υψηλού και χαμηλού έκφραση Ε2Α.? (Β) DFS για ασθενείς υψηλού και χαμηλού έκφραση E2A. Ασθενείς με υψηλή έκφραση E2A έχουν ευνοϊκότερους OS και DFS (

P

= 0.000, για το OS και DFS και τα δύο).

Η

Η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων από E2A στα κύτταρα CRC

Λαμβάνοντας υπόψη την κλινική σημασία των Ε2Α, θα ήθελα να ρωτήσω αν E2A έπαιξε ρόλο στην ανάπτυξη της CRC. κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου Έξι, LOVO, HCT116, Caco-2, ΗΤ29, SW480, SW1116 και και με φυσιολογικά ανθρώπινα βλεννογόνου του παχέος εντέρου επιθηλίου κυτταρικές NCM460 εξετάστηκαν για έκφραση Ε2Α χρησιμοποιώντας κηλίδα western (Σχήμα 3Α). Από τις επτά κυτταρικές σειρές, NCM460 έδειξε πολύ υψηλότερο επίπεδο έκφρασης Ε2Α από όλες τις άλλες καρκινικά κύτταρα. Σε συνδυασμό με την έκφρασή της σε ασθενείς με CRC, Ε2Α σημαντικά προς τα κάτω σε ιστούς και τα κύτταρα CRC.

(Α) Έκφραση Ε2Α στο φυσιολογικό ανθρώπινο βλεννογόνου του παχέος εντέρου επιθήλιο των κυττάρων NCM460 και CRC κυτταρικές σειρές δείχθηκε με western blot. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης? (Β) και (Δ) Κύτταρα με έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω Ε2Α (SW480 /shE2A, Caco-2 /shE2A) έδειξε υψηλότερο ποσοστό πολλαπλασιασμού των κυττάρων από εκείνη του αρνητικού μάρτυρα (SW480 /SHNC, Caco-2 /SHNC) και άγριου τύπου (SW480 /WT, Caco-2 /) WT κύτταρα? (C) και (Ε) γονικά κύτταρα (SW480 /shE2A, Caco-2 /shE2A) συν-επιμολύνθηκαν με E12 ή E47 πλασμίδιο (SW480 /shE2A_E12 και SW480 /shE2A_E47? Caco-2 /shE2A_E12 και Caco-2 /shE2A_E47) για την αποκατάσταση της έκφρασης Ε2Α. Co-επιμολυσμένα κύτταρα έδειξαν μειωμένο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων από εκείνη του γονικού ή φορέα ελέγχου (SW480 /shE2A_VC, Caco-2 /shE2A_VC) επιμολυσμένα κύτταρα. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα. (*,

P

& lt? 0,05).

Η

Για να διερευνήσουν άμεσα τη λειτουργία της Ε2Α, κατασκευάσαμε E2A σταθερά νοκ-κάτω κλώνος, κύτταρα SW480 /shE2A, και ο αρνητικός μάρτυρας κλώνου, τα κύτταρα SW480 /SHNC, με Ε2Α /shRNA-LV και Ε2Α /SHNC-LV, αντίστοιχα. Νοκ ντάουν αποτελεσματικότητα επικυρώθηκε από western blot και qRT-PCR (Σχήμα S1 Α). Στη συνέχεια, έχουμε εντοπίσει τις αλλαγές του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του SW480 /shE2A και κυττάρων SW480 /SHNC με τη δοκιμασία ΜΤΤ, χρησιμοποιώντας κύτταρα SW480 άγριου τύπου (SW480 /WT) ως έλεγχος. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, SW480 /shE2A έδειξε υψηλότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού από SW480 /SHNC και κυττάρων SW480 /WT, υποδεικνύοντας ένα κατασταλτικό ρόλο των Ε2Α στον πολλαπλασιασμό. Για να καταδειχθεί περαιτέρω το ρόλο αντι-πολλαπλασιασμό των Ε2Α, πραγματοποιήσαμε συν-επιμόλυνση σε σταθερά κύτταρα SW480 /shE2A με δύο πλασμίδια, Pez-M29-E12 (το οποίο κωδικοποιεί ισομορφή Ε12) και Pez-M29-E47 (το οποίο κωδικοποιεί ισομορφή Ε47) για να αντισταθμίσει το ρύθμιση προς τα κάτω επίδραση από shE2A. Η συν-επιμόλυνση διασώθηκε την έκφραση Ε2Α των κυττάρων SW480 /shE2A στο φυσιολογικό επίπεδο (Σχήμα S1 Α) και επίσης αποκατέστησε το ρυθμό πολλαπλασιασμού (Σχήμα 3C). Επιπλέον, η επιμόλυνση του Ε12 ή Ε47 σε κύτταρα SW480 άγριου τύπου θα μπορούσε να αναστείλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και τα αποτελέσματα που προκαλούνται από την αναστολή Ε12 και Ε47 δεν έδειξαν καμία διαφορά (Σχήμα S1 Β). Για να αποκλειστεί η κυτταρική γραμμή εξαρτώμενη πιθανότητα, κατασκευάσαμε Caco-2 /shE2A και Caco-2 κλώνοι /SHNC να επαναλάβουν τα παραπάνω πειράματα και τα αποτελέσματα έδειξαν Ε2Α είχε τον ίδιο ρόλο αντι-πολλαπλασιασμού σε κύτταρα Caco-2 (Σχήμα 3D & amp? Ε) . Επιπλέον, έχουμε χειριστεί την έκφραση E2A στα κύτταρα NCM460. E2A σίγηση και αποκατάσταση επηρεάζεται επίσης την ανάπτυξη των κυττάρων NCM460 σε ένα κατασταλτικό τρόπο (Εικόνα S1 C). Συμπερασματικά, Ε2Α μπορεί να είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής του πολλαπλασιασμού σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

E2A ρυθμίζονται κυτταρικό κύκλο εξέλιξης των SW480 κυττάρων

Στη συνέχεια θελήσαμε να γνωρίζουμε τους μηχανισμούς μέσω των οποίων E2A ρυθμίζονται πολλαπλασιασμό των κυττάρων SW480. Σε προηγούμενες δημοσιεύσεις, Ε2Α αναφέρθηκε ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου [9], [23], [24]. Έτσι, κάναμε την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής για την ανίχνευση πιθανών αλλαγών μετά E2A ρύθμιση προς τα κάτω και την αποκατάσταση. Σταθερά, η αλλαγή του κυτταρικού κύκλου εξηγείται μεταβολή στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων: όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων SW480 /shE2A διέφερε από SW480 /SHNC και κυττάρων SW480 /WT, με περισσότερα κύτταρα προχώρησαν σε φάση S, υποδηλώνοντας αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Όταν τα κύτταρα SW480 /shE2A συν-επιμολύνθηκαν με είτε Ε12 ή Ε47 πλασμίδιο, ο κυτταρικός κύκλος ομαλοποιήθηκε, το οποίο ήταν σε συμφωνία με την αποκατάσταση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα 4Β). Επιπλέον, η επιμόλυνση του Ε12 ή Ε47 σε άγριου τύπου SW480 οδήγησε σε μείωση των κυττάρων φάσης S (Σχήμα S1 D). Παρόμοια αποτελέσματα ρύθμιση παρατηρήθηκαν επίσης σε NCM460 κύτταρα (Σχήμα S1 Ε). Έτσι, θα μπορούσε να Ε2Α ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο για τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων

(Α) ρύθμιση προς τα κάτω του Ε2Α σε κύτταρα SW480 οδήγησε σε αύξηση των κυττάρων σε φάση S και ταυτόχρονα μείωση των κυττάρων σε G1 /φάση Ο0.? (Β) Η έκτοπη έκφραση του Ε12 ή Ε47 αυξημένη κυττάρων σε φάση G1 /Ο0 κυττάρων SW480 /shE2A και μείωσε κύτταρα φάσης S. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέσο ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα. (*,

P

& lt? 0,05).

Η

E2A ελέγχονται κυτταρικού κύκλου με τη στόχευση miR-320a

Οι ανωτέρω διαπιστώσεις περαιτέρω μας οδήγησε να διερευνήσει πώς ρυθμίζονται E2A αλλαγή του κυτταρικού κύκλου. Τις τελευταίες δεκαετίες, microRNAs (miRNAs) έχουν βρεθεί να εμπλέκονται στην παθογένεση ανθρώπινων ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου [25]. Απροσδόκητα, βρήκαμε ένα miRNA, miR-320a, το οποίο ήταν ένα καταστολέα μετάστασης [26], ρυθμιζόταν από E2A. Σε κύτταρα SW480 /shE2A, η έκφραση του miR-320a ήταν μειωτικά (Σχήμα 5Α) και επιμόλυνση είτε Ε12 ή Ε47 σε αυτήν την ομάδα κυττάρων (Σχήμα 5Β) ή σε άγριου τύπου SW480 κύτταρα (Σχήμα S1 Ρ) θα μπορούσαν να ρυθμίζουν προς τα πάνω miR-320a . Για να διερευνηθεί κατά πόσο miR-320a ήταν ένας στόχος ρυθμίζεται άμεσα από E2A, εκτελέσαμε τον προσδιορισμό της χρωματίνης ανοσοκατακρήμνισης (μάρκας). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Ε2Α θα μπορούσε να συνδεθεί με το E-box (GCAGGTG, στο -138bp, ανάντη του stemloop miR-320a) του miR-320a, υποδηλώνοντας Ε2Α μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση του miR-320a με τη στόχευση απευθείας αλληλουχία προαγωγέα του (Σχήμα 5C) .

(Α) έκφραση του miR-320a μειώθηκε στα κύτταρα SW480 /shE2A όπως φαίνεται από qRT-PCR? (Β) συν-επιμόλυνση του Ε12 ή Ε47 σε SW480 κύτταρα /shE2A θα μπορούσε να εξομαλύνει την έκφραση του miR-320a? (C) Άνω πίνακα: αλληλουχία του γονιδίου miR-320a δείχνει το E-box, την προβλεπόμενη θέση δέσμευσης της Ε2Α? κάτω πίνακα: δοκιμασία ChIP έδειξε E2A δεσμεύεται να miR-320a στο E-κουτί του, GCAGGTG? Η συν-επιμόλυνση του μιμείται miR-320a αντιστραφεί τις αλλαγές του κυτταρικού κύκλου (D) και την κυτταρική ανάπτυξη (Ε) των κυττάρων SW480 /shE2A? (F) Η συν-επιμόλυνση μιμείται miR-320a μειωμένο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων του Caco-2 κύτταρα /shE2A. Τα δεδομένα εκφράζονται με τα μέσα ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα. (*,

P

& lt? 0,05).

Η

Στη συνέχεια, ρωτήσαμε αν miR-320a ήταν ο στόχος, μέσω των οποίων ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ρυθμιζόμενη E2A. Με επιμόλυνση μιμείται miR-320a σε κύτταρα SW480 /shE2A, βρήκαμε την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου που προκαλείται από E2A νοκ ντάουν συνελήφθη και ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων μειώθηκε (Σχήμα 5D & amp? Ε). Επίσης, συν-διαμόλυνση του μιμείται miR-320a σε κύτταρα Caco-2 /shE2A ανέστειλε ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Σχήμα 5F). Ως εκ τούτου, E2A ρυθμίζονται πολλαπλασιασμό των κυττάρων με απευθείας στόχευση miR-320a

Συζήτηση

Παρά τις μεγάλες προσπάθειες που έχουν γίνει για τη βελτίωση της πρόληψης και της θεραπείας του CRC, τη νοσηρότητα και τη θνησιμότητα της εξακολουθούν να παραμένουν σε υψηλά επίπεδα:. Τόσο εκτιμάται ότι είναι η τρίτη θέση μεταξύ όλων των καρκίνων στις ΗΠΑ, το 2013 [27]. Η ογκογένεση του CRC είναι πολλαπλάσιο διαδικασία που διαμεσολαβείται από συσσώρευση μεταβολές στην ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων και ένα ευρύ φάσμα γενετικών διαταραχών [28]. Βάσει αυτών, πρόσφατες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην εξεύρεση νέων βιοδεικτών και παρεκκλίνουσα γενετικών χαρακτηριστικών στο CRC [29]. Εδώ δείξαμε E2A ήταν ένα μυθιστόρημα προγνωστικός δείκτης για CRC και miR-320a ήταν ένα άμεσο στόχο μέσω του οποίου E2A ρυθμίζονται καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικού κύκλου για τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

Ο ρόλος των Ε2Α σε φυσιολογικά Β και την ανάπτυξη των κυττάρων Τ και λευχαιμογένεση έχει μελετηθεί καλά [13], [30], [31] και ήταν επίσης αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στον καρκίνο του μαστού, τον καρκίνο του προστάτη, του γαστρικού MALT και θυμικού λεμφώματος [15], [17], [18], [20 ]. Ειδικά, η έκφραση Ε2Α συνδέεται με τη διαφοροποίηση των κυττάρων του όγκου και έκβαση των ασθενών σε καρκίνο μαστού [15] και τα στάδια του όγκου στον καρκίνο του προστάτη [17]. Ως εκ τούτου, Ε2Α είναι πιθανό να είναι ένας παράγοντας που συνδέεται με την ανάπτυξη του όγκου και έχουν προγνωστική αξία. Σε υποστήριξη αυτού, βρήκαμε ότι η έκφραση Ε2Α μειώθηκε σημαντικά σε ιστούς CRC σε σύγκριση με την κανονική βλεννογόνο και ανοσοϊστοχημεία έδειξε ένα φθίνοντα βαθμολόγησης θετική χρώση Ε2Α ως κλινικά στάδια προηγμένες, υποδεικνύοντας μία αρνητική συσχέτιση του Ε2Α με την ανάπτυξη CRC και ένα πιθανώς από όγκο κατασταλτική δράση του E2A. Στην ανάλυση παλινδρόμησης Cox, βρήκαμε χαμηλή έκφραση του E2A προβλέψει φτωχή πρόγνωση του OS και DFS σε CRC ασθενείς ανεξάρτητα από την ηλικία, το φύλο, την περιοχή του όγκου, ιστολογία του όγκου, και το μέγεθος του όγκου. Αυτά τα αποτελέσματα, τα οποία πρότεινε μια κατασταλτική ρόλος του Ε2Α σε CRC, ήταν συνεπής με τα ευρήματα σε λέμφωμα [18], [32] και της λευχαιμίας [4], αλλά αντικρούεται με εκείνα που βρέθηκαν σε καρκίνο του μαστού και του προστάτη [15], [17 ]. Λαμβάνοντας υπόψη την πολυσταδιακή διαδικασία της καρκινογένεσης και CRC διαφορετικές βιολογικές συμπεριφορές των όγκων, η διαφορά θα μπορούσε να γίνει κατανοητό, τουλάχιστον εν μέρει

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει τα αυτο-αντιφατικά ρόλους των Ε2Α στον πολλαπλασιασμό:. Αποσιώπηση του Ε2Α στο μητρικό [15 ] και του καρκίνου του προστάτη κύτταρα [17] ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων, αλλά σε λέμφωμα, λευχαιμία, αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα, και καρκινικά κύτταρα CRC, απώλεια της Ε2Α οδήγησε σε ενισχυμένο πολλαπλασιασμό [7], [30], [32], [33]. Εκτός αυτού, επιβάλλεται Ε47 υπερέκφραση ανάπτυξη ανέστειλε κυττάρων από κύτταρα-Τ ALL [34]. Να αποκαλύψει με σαφήνεια ο ρόλος των Ε2Α στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, κατασκευάσαμε ένα E2A μειωτικά σταθερά SW480 κλώνος να ερευνήσει την επίδρασή της. Συνεπής με τα σε αιμοποιητικά κακοήθεια και CRC πριν αποτελέσματα, παρατηρήσαμε ότι μειορρύθμιση του Ε2Α αυξήθηκε σημαντικά ρυθμό κυτταρικού πολλαπλασιασμού και συν-επιμόλυνση με είτε το Ε12 ή Ε47 πλασμίδιο θα μπορούσε να αντισταθμίσει αυτό το αποτέλεσμα, γεγονός που υποδηλώνει την άμεσο ρόλο του Ε2Α στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Κατά συνέπεια, η ανάλυση κυτταρικού κύκλου έδειξε μια πρόοδο από φάση G1 /Ο0 να φάση S σε Ε2Α μειωτικά κύτταρα. Αν και μερικές μελέτες έδειξαν κυτταρικού κύκλου συνελήφθησαν κατά τη φάση G1 στην E2A ανεπάρκεια καρκινικά κύτταρα [17], [23], τα αποτελέσματά μας ήταν υποστηρικτική προς το αποτέλεσμα προ-πολλαπλασιασμό και σε συμφωνία με τα ευρήματα οι περισσότερες μελέτες που έδειξαν επιτάχυνση της προόδου του κυτταρικού κύκλου μετά την Ε2Α ανεπάρκεια [24], [35] – [39]. Στο σύνολό τους, knockdown του Ε2Α προωθείται πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και αυτό είχε ως αποτέλεσμα αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Τα ευρήματα αυτά παρέχουν μερική, αν όχι πλήρη, γνώσεις σχετικά με την κατασταλτική του όγκου ρόλο του Ε2Α στο CRC.

Ως μεταγραφικός παράγοντας, E2A ασκεί τα καθήκοντά της με τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και μελέτες έχουν αναφερθεί προς τα κάτω τους στόχους του, συμπεριλαμβανομένης της p21, ID1 , c-myc, κλπ [17], [24], [36]. Στη μελέτη μας, βρήκαμε miR-320a ήταν ένας στόχος που ρυθμίζονται από E2A στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού του κυτταρικού κύκλου και. Ανθρώπινη miR-320a εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 8p21.3, έναν τόπο ήπατος μεταστατικού επιδεκτικότητα [40], και έχει αναφερθεί ότι είναι ρυθμιστής της γλυκόλυσης [41] και απορρυθμισμένη στον καρκίνο [42]. Μελέτες έχουν δείξει ότι miR-320a καταστέλλει ογκογένεση και τη μετάσταση σε CRC [26], [43], [44]. Απροσδόκητα, έχουμε εντοπίσει το E-box του miR-320a ως θέση πρόσδεσης του Ε2Α με TESS (Μεταγραφή Element Αναζήτηση System) και μάλιστα αποδεικνύεται ότι E2A δεσμεύεται να miR-320a με χρήση του προσδιορισμού chip. Έκφραση του miR-320a ρυθμιζόταν από E2A άμεσα και το πιο σημαντικό, ρύθμιση προς τα άνω του miR-320a θα μπορούσε να αντιστρέψει τις αλλαγές που προκαλούνται από E2A νοκ ντάουν, το οποίο πρότεινε περαιτέρω ως καθοδικός τελεστής της Ε2Α. Ωστόσο, παραμένει ασαφές εάν η επίδραση της Ε2Α για miR-320a είναι ένα παγκόσμιο φαινόμενο. Στο σύνολό τους, προτείνουμε ότι το miR-320a είναι ένας από τους στόχους μέσω των οποίων E2A ρυθμίζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

Με λίγα λόγια, σας παρουσιάζουμε πειστικά στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι η Ε2Α είναι ένας προγνωστικός παράγοντας για τους ασθενείς CRC και θεατρικά έργα ένας όγκος-κατασταλτικό ρόλο σε κύτταρα CRC. Μέσω δέσμευσης απευθείας σε miR-320a, Ε2Α ρυθμίζει την κυτταρική ανάπτυξη πρόοδο του κύκλου των καρκινικών κυττάρων και των ελέγχων. Ωστόσο, ο ρόλος των Ε2Α σε στερεούς όγκους δεν έχει πλήρως κατανοηθεί και τα ευρήματά μας μόνο αποκαλύψει μερικώς τις μοριακούς στόχους και τους μηχανισμούς δράσης των Ε2Α. Ως εκ τούτου, οι μελλοντικές μελέτες που απαιτούνται για την επικύρωση ευρήματά μας και σε βάθος διαλεύκανση του ρόλου των Ε2Α στο CRC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

(Α) Αριστερά: πρωτεΐνη έκφραση E2A του άγριου τύπου SW480, SW480 ελέγχου, και τα κύτταρα SW480 νοκ-κάτω. Δεξιά: Αλλαγή της έκφρασης Ε2Α σε κύτταρα SW480 μετά την επιμόλυνση του shE2A, Ε12 ή Ε47: shE2A μείωσε την έκφραση του Ε2Α σε SW480, ενώ Ε12 και Ε47 αυξημένη έκφραση Ε2Α σε κύτταρα SW480 /shE2A, σε σχέση με τους ελέγχους? (Β) Επιμόλυνση του Ε12 ή Ε47 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων SW480 /WT? (Γ) Ε2Α ρυθμίζει την ανάπτυξη των κυττάρων σε κύτταρα NCM460? (Δ) Η επιμόλυνση των Ε12 ή Ε47 αυξημένη G

0 /G

1 φάση των κυττάρων SW480 /WT και μείωσε τη φάση S? (Ε) Ε2Α ρυθμίζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα NCM460?