Αφηρημένο

Ιστορικό

Η πρόσθια κλίση ομόλογο 2 (AGR2) είναι μια λειτουργική πρωτεΐνη με κρίσιμο ρόλο σε ένα ευρύ φάσμα των βιολογικών συστημάτων, συμπεριλαμβανομένης της ανάπτυξης των σπονδυλωτών ιστού, φλεγμονώδεις αντιδράσεις τραυματισμό των ιστών, και εξέλιξης του καρκίνου. Κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι η πρωτεΐνη AGR2 υπερεκφράζεται σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των καρκινωμάτων του οισοφάγου, του παγκρέατος, του μαστού, του προστάτη, των πνευμόνων και, καθιστώντας την πρωτεΐνη ως δυνητικό βιοδείκτη καρκίνου. Ωστόσο, οι γενικές βιοχημικές λειτουργίες του AGR2 σε ανθρώπινα κύτταρα παραμένουν απροσδιόριστες, και οι μηχανισμοί σηματοδότησης που οδηγούν AGR2 να αναστέλλουν ρ53 δεν έχουν ακόμα σαφώς απεικονίζεται. Ως εκ τούτου, έχει μεγάλο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη μοριακών ανιχνευτές που αναγνωρίζουν ειδικά AGR2 για την ανίχνευση του και για την αποσαφήνιση των AGR2 σχετίζεται με μοριακό μηχανισμό.

Μεθοδολογία /Principal Εκτίμηση

Μέσω ένα σφαιρίδιο με βάση και κυτταρομετρία ροής παρακολουθείται τεχνολογία SELEX, έχουμε εντοπίσει μια ομάδα απταμερών DNA που μπορούν να δεσμεύονται ειδικά με AGR2 με

K

δ

τιμές στο εύρος nanomolar μετά από 14 κύκλους επιλογών. Το απταμερές C14B επιλέχθηκε να μελετήσει περαιτέρω, λόγω της υψηλής συγγένειας δέσμευση και εξειδίκευση του. Η βελτιστοποιημένη και να συντομευθούν C14B1 έχει ιδιαίτερη G-πλούσια χαρακτηριστικά, και το G-πλούσια περιοχή αυτή μοτίβο δέσμευσης χαρακτηρίζεται περαιτέρω για να αποκαλύψει μια ενδομοριακή παράλληλα G-τετραπλών με φασματοσκοπία CD και φασματοσκοπία UV. Τα πειράματά μας επιβεβαίωσε ότι η σταθερότητα της δομής G-τετραπλών εξαρτάτο σε μεγάλο βαθμό από τη φύση των μονοσθενών ιόντων και του σχηματισμού της δομής G-τετραπλών ήταν επίσης σημαντική για την ικανότητα δέσμευσης του C14B1 με τον στόχο. Επιπλέον, έχουμε σχεδιάσει ένα είδος αλλοστερική μορίου φάρος (AMB) καθετήρα για επιλεκτική και ευαίσθητη ανίχνευση AGR2.

Συμπέρασμα /Σημασία

Σε αυτό το έργο, έχουμε αναπτύξει νέες ανιχνευτές απταμερούς για συγκεκριμένες αναγνώριση του AGR2. Διαρθρωτικά μελέτη έχουν προσδιορίσει ότι η σύνδεση μοτίβο του απταμερούς είναι μία ενδομοριακή παράλληλη δομή G-τετραπλών και η δομή του και συγγένεια σύνδεσης εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από τη φύση του μονοσθενούς ιόντος. Επιπλέον, με το σχεδιασμό μας AGR2-AMB, AGR2 θα μπορούσε να είναι με ευαισθησία και επιλεκτικά ανιχνεύονται. Αυτός ο ανιχνευτής απταμερές έχει μεγάλες δυνατότητες για να χρησιμεύσει ως ένα χρήσιμο εργαλείο για την έγκαιρη διάγνωση και την πρόγνωση του καρκίνου και για τη βασική έρευνα για τη διαλεύκανση των βιοχημικές λειτουργίες του AGR2

Παράθεση:. Wu J, Wang C, Λι Χ, Υ Τραγούδι , Wang W, Li C, et al. (2012) Προσδιορισμός, χαρακτηρισμός και εφαρμογή ενός G-Τετράκλινο Δομημένη DNA απταμερές κατά του καρκίνου βιοδεικτών Πρωτεΐνη Πρόσθιο Κλίση ομόλογο 2. PLoS ONE 7 (9): e46393. doi: 10.1371 /journal.pone.0046393

Επιμέλεια: Pierre Busson, Ινστιτούτο θέματα καρκίνου Gustave Roussy, Γαλλία

Ελήφθη: 2 Ιούνη, 2012? Αποδεκτές: 29 Αυγούστου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 28, Σεπτεμβρίου 2012

Copyright: © Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (2010CB732402), Εθνικό Πρόγραμμα Instrumentation (2011YQ03012412), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Fujian Διακεκριμένου νέους επιστήμονες (2010 J06004), και το Εθνικό βρέθηκαν για Προώθηση ταλέντων Βασικών Επιστημών (J1030415). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

πρόσθια ομόλογο βαθμίδωση από 2 (AGR2) ταυτοποιήθηκε αρχικά ως εκκριτική παράγοντας που εκφράζεται στην πρόσθια περιοχή του ραχιαίου εκτόδερμα σε έμβρυα Xenopuslaevis, όπου υποτίθεται ότι προκαλεί την προδιαγραφή του dorsoanterior μοίρα εκτοδερμικής, ιδιαίτερα στο σχηματισμό του αδένα τσιμέντου [1]. Κλινικές μελέτες έχουν δείξει επίσης ότι η πρωτεΐνη AGR2 υπερεκφράζεται σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των καρκινωμάτων του οισοφάγου, του παγκρέατος, του μαστού, του προστάτη, των πνευμόνων και [2] – [6]. Πιο βιολογικές μελέτες σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές καρκίνου έδειξαν ένα σημαντικό ρόλο για AGR2 σε οδούς που σχετίζονται με όγκους, συμπεριλαμβανομένων της ανάπτυξης του όγκου, τον κυτταρικό μετασχηματισμό, τη μετανάστευση των κυττάρων, την αναγέννηση των άκρων, και μετάσταση [5], [7] – [9]. Ωστόσο, οι γενικές βιοχημικές λειτουργίες του AGR2 σε ανθρώπινα κύτταρα παραμένουν απροσδιόριστες, και οι μηχανισμοί σηματοδότησης που οδηγούν AGR2 να αναστέλλουν ρ53 δεν είναι ακόμη σαφώς απεικονίζεται [10]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη της μοριακής συνδέτες αναγνωρίζοντας συγκεκριμένα AGR2 έχει μεγάλη σημασία για την έγκαιρη διάγνωση και την πρόγνωση του καρκίνου και με τη βασική έρευνα για τη διαλεύκανση των βιοχημικών λειτουργιών του AGR2.

Διάφορα συνδέτες έχουν αναπτυχθεί για συγκεκριμένες μοριακή αναγνώριση , όπως μικρά μόρια, αντισώματα, πεπτίδια και [11] – [13]. Πιο πρόσφατα, ένα άλλο είδος των μοριακών συνδετήρα, που ονομάζεται απταμερές, επέστησε ιδιαίτερη προσοχή. Τα απταμερή, μονόκλωνα τροποποιημένα ή μη τροποποιημένα ολιγονουκλεοτίδια (RNA ή DNA), παράγονται μέσω

in vitro

διαδικασία επιλογής ή SELEX (Συστηματική εξέλιξη προσδεμάτων δι ‘εκθετικού εμπλουτισμού) με υψηλή συγγένεια σύνδεσης και ειδικότητα προς καθορισμένους στόχους [14 ], [15]. Τα επιλεγμένα απταμερή μπορούν να αναγνωρίσουν μια ευρεία ποικιλία των στόχων, συμπεριλαμβανομένων μικρών μορίων, πρωτεϊνών, κυττάρων και ιστών βασίζονται σε διαφορετικές τριτοταγείς δομές τους. Σε σύγκριση με τα αντισώματα, απταμερή έχουν χαμηλό μοριακό βάρος, γρήγορο ρυθμό διείσδυσης ιστού, υψηλή σταθερότητα και χαμηλή immunogenesis [16]. Μπορούν να συντεθούν χημικά με χαμηλό κόστος και να τροποποιηθούν εύκολα με διάφορες ρεπόρτερ [17]. Επιπλέον, μπορούν να συνδεθούν και /ή ενισχύεται από ένζυμα

in vitro

[18]. Αυτά τα πλεονεκτήματα κάνουν απταμερών υπόσχεται συνδετήρες για την ιατρική και φαρμακευτική έρευνα, όπως η ανάπτυξη φαρμάκων, τη διάγνωση της νόσου, καθώς και στοχευμένη θεραπεία [19].

Οι δυνατότητες που παρέχονται από απταμερή είναι τεράστιες, και μερικά απταμερή έχουν ήδη δείξει πολλές σημαντικές εφαρμογές σε bioanalysisand βιοϊατρική [20] – [23]. Συγκεκριμένα, αρκετές απταμερή παραχθεί κατά του καρκίνου που σχετίζονται με πρωτεΐνες, όπως PDGF, VEGF, HER3, NFkB, τενασκίνη-C ή PMSA [24] – [26]. Πολλές aptameric αισθητήρες, ανιχνευτές και οι προσδιορισμοί έχουν αναπτυχθεί για να επιτρέψει ευαίσθητη και επιλεκτική ανίχνευση των πρωτεϊνών αυτών καρκίνο βιοδείκτη [27]. Για παράδειγμα, Yang

et al

έχει αναφερθεί ένα ελαφρύ-μεταγωγής excimer ανιχνευτές απταμερούς για ευαίσθητες ποσοτική ανίχνευση του PDGF σε μέσα κυττάρων [28]. Kwon

et al

έχουν αναπτύξει μια λειτουργοποιημένη πολυπυρρόλης νανοσωλήνων με απταμερές να οικοδομήσουμε μια VEGF βιοαισθητήρα [29]. Απταμερή έχουν επίσης εφαρμοστεί για τη μοριακή απεικόνιση για

in vivo

χαρακτηρίζει το συγκρότημα παθογόνων δραστηριότητες που συνοδεύουν την ανάπτυξη του όγκου για τη νόσο έγκαιρη διάγνωση και τη μέτρηση παθογένεια [30] – [33]. Δεδομένου ότι οι στόχοι για απταμερή μπορεί να είναι ενδοκυτταρικό, εξωκυτταρικό ή κυτταρικής επιφάνειας βιομόρια, διάφορες θεραπευτικές μέθοδοι έχουν αναπτυχθεί με τη χρήση των απταμερών ως αντιδραστήρια στόχευσης [34] – [37], το οποίο διευρύνει σημαντικά το φάσμα των στοχευμένη θεραπεία. Επιπλέον, ορισμένοι θεραπευτικά χρήσιμη απταμερή έχουν βρεθεί να αναστέλλουν τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, όπως οι αλληλεπιδράσεις υποδοχέα-συνδέτη, και με αυτόν τον τρόπο λειτουργούν ως ανταγωνιστές [38].

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιώντας την βάση σφαιρίδια και η ροή κυτταρομετρία παρακολουθείται η τεχνολογία SELEX, έχουμε ως στόχο να αποκτήσει συγκεκριμένες απταμερή να AGR2 και να μελετήσει τη δομή δική τους και τις δυνατότητες λειτουργίας. Χάντρες με βάση SELEX επέτρεψε τη χρήση του απλή, αλλά αποτελεσματική, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την παρακολούθηση της προόδου της επιλογής, αποφεύγοντας την επίπονη, χρονοβόρα και ραδιενεργών διαδικασία EMSA [39] – [43]. Μετά από 14 γύρους επιλογής, έχουμε εντοπίσει μια ομάδα απταμερών DNA που δεσμεύονται ειδικά με AGR2 με υψηλές συγγένειες. Δομικές μελέτες σχετικά με μία από τις αλληλουχίες απταμερούς, C14B, αποκάλυψε μία ενδομοριακή παράλληλο G-τετραπλών, και η δομή του και συγγένεια σύνδεσης προς AGR2 εξαρτώνται από K

+ ιόν εντατικά. Επιπλέον, σχεδιάσαμε ένα αλλοστερική μόριο φάρος AGR2-AMB με βάση τις προσδιοριζόμενες απταμερές, το οποίο επιτρέπει απλή, ευαίσθητη και επιλεκτική ανίχνευση AGR2. Οι ακολουθίες απταμερούς και AGR2-AMB αναφέρθηκε σε αυτή τη μελέτη είναι δυνητικά χρήσιμα εργαλεία για την έγκαιρη διάγνωση και την πρόγνωση του καρκίνου και για τη βασική έρευνα για τη διαλεύκανση των βιοχημικές λειτουργίες του AGR2.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Επιλογή απταμερών DNA για να αναγνωρίσει AGR2

για να ταυτοποιηθούν απταμερή εναντίον AGR2, ανασυνδυασμένη AGR2 συντήχθηκε με γλουταθειόνη-δ-τρανσφεράσης (GST) για τη διευκόλυνση της προσάρτησης της πρωτεΐνης σε στερεά υποστρώματα (Sepharose GSH-σφαιρίδια). Τα προκύπτοντα AGR2-GST-σφαιρίδια χρησιμοποιήθηκε ως θετικός στόχος σε SELEX ενώ οι GST-σφαιρίδια ως αρνητικός έλεγχος για την απομάκρυνση μη ειδικών αλληλουχιών πρόσδεσης επιφάνεια. Η διαδικασία της

in vitro

sepharose-με βάση σφαιρίδια SELEX απεικονίζεται σχηματικά στο Σχήμα 1.

σεφαρόζης-σφαιρίδια που βασίζονται σε διαδικασία SELEX για πρωτεΐνη AGR2, οι GST-σφαιρίδια επωάστηκαν με το βιβλιοθήκη ssDNA για αντι-επιλογή για την αφαίρεση της μη ειδικής ακολουθίες. Οι μη δεσμευμένου ϋΝΑ στη συνέχεια επωάστηκαν με AGR2-GST-σφαιρίδια για στόχο επιλογής. Μετά από πλύση σκληρά, οι αλληλουχίες DNA AGR2 ειδικές στη συνέχεια ενισχύθηκαν με PCR για τον επόμενο γύρο επιλογής, ή για κλωνοποίηση και αλληλούχιση για την αναγνώριση μεμονωμένων απταμερή μετά ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.

Η

Ένα 87-νουκλεοτιδίων ( 87-nt) μονόκλωνου DNA (ssDNA) βιβλιοθήκη με 45 βάσεις τυχαία πλαισιώνεται από δύο αλληλουχίες εκκινητών (22-nt και 20 nt) υποβλήθηκε στη διαδικασία SELEX. Η βιβλιοθήκη πρώτα αφέθηκε να αλληλεπιδράσουν με περίσσεια σφαιρίδια αρνητικού ελέγχου, και μόνο οι DNA αλληλουχίες που δεν δεσμεύονται στα σφαιρίδια GST-συλλέχθηκαν. Τα συλλεχθέντα αλληλουχίες στη συνέχεια επωάστηκαν με AGR2-GST-σφαιρίδια. Μετά αυστηρή πλύση, εκείνες οι αλληλουχίες που είτε δεν δεσμεύτηκαν, ή μόνο ασθενώς δεσμευμένο στο στόχο απορρίφθηκαν. Μόνο οι αλληλουχίες που δεσμεύονται αρκετά έντονα διατηρήθηκαν σε σφαιρίδια, και τα σύμπλοκα σφαιριδίου-ssDNA συλλέχθηκαν και ενισχύθηκαν με PCR για τον επόμενο γύρο επιλογής. Μετά από πολλαπλές γύρους επιλογής, η διαδικασία αφαίρεσης μειώνεται αποτελεσματικά τις αλληλουχίες DNA που δεσμεύονται στα σφαιρίδια GST, ενώ οι εν λόγω AGR2 ειδικά υποψήφιοι απταμερές σταδιακά εμπλουτίζεται. Η πρόοδος της διαδικασίας επιλογής παρακολουθήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Όσο ισχυρότερη σύνδεση του DNA βιβλιοθήκη για AGR2, τόσο πιο FAM σημασμένο αλληλουχίες δεσμεύονται στα σφαιρίδια, έτσι το υψηλότερο ένταση φθορισμού τα σφαιρίδια θα εκπέμπουν. Με την αύξηση του αριθμού των κύκλων επιλογής, σταθερή αύξηση στην ένταση φθορισμού στα σφαιρίδια στόχου παρατηρήθηκαν (Σχήμα 2α). Η συγγένεια δέσμευσης του εμπλουτισμένου βιβλιοθήκη μετά από 14 γύρους επιλογής προσδιορίστηκε ότι είναι στο εύρος nanomolar (K

d = 64.1 ± 5.4 ηΜ), ενώ δεν υπήρχε παρατηρήσιμη πρόσδεσης της βιβλιοθήκης για τον έλεγχο σφαιρίδια (Σχήμα 2β). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι οι απταμερή DNA που αναγνωρίζουν εξειδικευμένα AGR2 εμπλουτίστηκαν κατά τη διάρκεια της διαδικασίας επιλογής.

α) Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας για την παρακολούθηση της πρόσδεσης ενός επιλεγμένου πισίνα με AGR2 (πρωτεΐνη στόχος) και GST (πρωτεΐνη ελέγχου). Το κόκκινο καμπύλη αντιπροσωπεύει τη δέσμευση της μη επιλεγμένη βιβλιοθήκη φόντο. Για την πρωτεΐνη-στόχο AGR2, υπήρξε μια αύξηση της παραγωγικής ικανότητας της πισίνας δεσμευτική, όπως προχωρούσε η επιλογή, ενώ δεν υπήρξε καμία παρατηρήσιμη αλλαγή για την πρωτεΐνη GST έλεγχο. Η τελική συγκέντρωση του επιλεγμένου πισίνα σε ρυθμιστικό σύνδεσης ήταν 100 ηΜ. β) Προσδιορισμός της σταθεράς διαστάσεως του εμπλουτισμένου βιβλιοθήκης και μη επιλεγμένη βιβλιοθήκη για AGR2. γ) Οι μετρήσεις φθορισμού για τον προσδιορισμό της σταθεράς διαστάσεως των επιλεγμένων C14B απταμερούς. Δύο αρνητικά δείγματα αναφοράς, GST-χάντρες και GSH-σφαιρίδια, διεξήχθησαν. Τα δεδομένα ήταν ο μέσος όρος των τριπλών αποτελεσμάτων πειράματος.

Η

Χαρακτηρισμός των επιλεγμένων αλληλουχιών απταμερούς

Μετά από 14 γύρους επιλογής, της δεξαμενής εμπλουτισμένου ϋΝΑ κλωνοποιήθηκε και αλληλουχήθηκε. Τα δεδομένα αλληλούχισης για κλώνους αναλύθηκαν με χρήση λογισμικού ανάλυσης προσδιορισμού αλληλουχίας Clustal W 6.0 [44]. Οι αλληλουχίες ομαδοποιήθηκαν με βάση την ομοιότητα ομολογίας των αλληλουχιών DNA από επιμέρους κλώνο. Μεταξύ των αλληλουχιών από 62 κλώνους, υπήρχαν δύο υποοικογένειες καθένα περιέχει πολλαπλές αλληλουχίες με κοινά χαρακτηριστικά. Μία υποοικογένεια είναι γουανοσίνη πλούσιες αλληλουχίες (22 κλώνοι), και το άλλο είναι θυμίνη πλούσιες αλληλουχίες (40 κλώνοι) (Σχήμα S1). Τέσσερις σειρές επιλέχθηκαν και συντέθηκαν για περαιτέρω χαρακτηρισμό (Πίνακας S1): τρία αλληλουχίες από G-πλούσιος υποοικογένεια, Ο14Α (εμφανίστηκε 2 φορές), C14B (εμφανίστηκε 3 φορές) και C14C (εμφανίστηκε 5 φορές), και μία αλληλουχία C14D (εμφανίστηκε 2 φορές) από πλούσιο σε Τ υποοικογένεια. Μόνο μία πλούσια σε Τ αλληλουχία επιλέχθηκε λόγω της Τ-πλούσιες αλληλουχίες τείνουν να από μη άκαμπτο τριτοταγείς δομές και η πιθανότητα να είναι απταμερούς πιστεύεται ότι είναι πολύ χαμηλή. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 2c, C14B μπορεί να δεσμεύσει AGR2 με την υψηλότερη συγγένεια (

K

d

= 13.1 ± 7.2 ηΜ). Τιτλοποίηση των C14B σε GST-χάντρες προέκυψε κανένα παρατηρήσιμο δέσμευσης, διαπιστώνεται ότι η επίτευξη του δεσμευτικού στόχου της C14B ήταν πράγματι AGR2. Άλλες τρεις αλληλουχίες έχουν παρόμοια σταθερές σύνδεσης για AGR2 αλλά λίγο ασθενέστερη από C14B, στην οποία το

K

d

του Ο14Α είναι 20,9 ± 5,2 ηΜ, C14C είναι 44,6 ± 7,0 ηΜ και C14D είναι 48,4 ± 15,6 ηΜ. (Εικόνα S2).

βελτιστοποίηση Ακολουθία του απταμερούς C14B

Από C14B είναι η καλύτερη απταμερές που λαμβάνονται από τις τέσσερις σειρές που ελέγχθηκαν, ήταν choses για μελλοντική βελτιστοποίηση και χαρακτηρισμό. Το μήκος του είναι C14B 87mer, η οποία είναι μειονεκτική για μελλοντικές εφαρμογές διότι είναι άβολο και δαπανηρό να συντεθεί μια τέτοια μακρά ακολουθία. Για τον προσδιορισμό της δέσμευσης περιοχή του απταμερούς, το οριακό ακολουθίες C14Bwas σταδιακά περικοπεί. Δύο κολοβωμένη sequencesC14B0 και C14B1 από C14B φαίνονται στον Πίνακα 1. Πειράματα συγγένεια πρόσδεσης Μεταγενέστερες αποκάλυψε ότι και οι δύο C14B0 (8.5 ± 3.6 ηΜ) και C14B1 (19.1 ± 5.1 ηΜ) έχουν παρόμοια

K

d

να AGR2 όπως εκείνη του αρχικού C14B (13.1 ± 7.2 ηΜ). Η πλειονότητα των εξαλειφθούν αλληλουχίες ήταν αλληλουχίες εκκινητών, υπονοώντας ότι η περιοχή πρόσδεσης του απταμερούς ήταν η μέση τυχαίων αλληλουχιών και οι αλληλουχίες εκκινητών δεν υπερβαίνουν ή συμβάλλουν ελάχιστα στην συγγένεια δέσμευσης του απταμερούς. C14B1 έχει πέντε τμήματα πολυ-G και σχεδιάσαμε πέντε αποκομμένες αλληλουχίες με την αφαίρεση ενός από μέρους πολυ-G το καθένα (Πίνακας S2). Η απομάκρυνση του οποιουδήποτε τμήματος πολυ-G θα κατέστρεφαν συγγένεια πρόσδεσης του σε κάποιο βαθμό (Εικόνα S3), γεγονός που υποδηλώνει το σύνολο G-μοτίβο απαιτείται για σύνδεση απταμερές. Λαμβάνοντας μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι C14B1, η οποία ήταν μόνο 33 mer, ήταν η απαραίτητη περιοχή πρόσδεσης για AGR2. Έτσι, C14B1 εφαρμόστηκε για περαιτέρω χαρακτηρισμό και καθετήρα σχεδιασμού.

Η

Η επιλεκτικότητα του απταμερούς C14B1

Για να καταδειχθεί η ειδική αλληλεπίδραση μεταξύ AGR2 και C14B1, τρεις πρωτεΐνες έλεγχο BSA, θρομβίνης και θρυψίνη συζεύχθηκαν με τα NHS-sepharose-σφαιρίδια και στη συνέχεια επωάστηκαν με C14B1. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, C14B1 μπορούσε να συνδεθεί με στόχευση AGR2 έντονα, ενώ υπήρχαν καθόλου ή λίγο συγγένεια σύνδεσης προς τη θρομβίνη, BSA και θρυψίνη, καταδεικνύοντας την υψηλή επιλεκτικότητα του απταμερούς.

Ο λόγος σήματος προς υπόβαθρο (SBR) ορίζεται ως ο λόγος του σήματος φθορισμού του ΡΑΜ-επισημασμένου απταμερούς να FAM σημασμένο τυχαία ακολουθία κατά τη θεραπεία με σφαιρίδια πρωτεΐνης τροποποιηθεί. Τα στοιχεία που ήταν ο μέσος όρος των τριπλών αποτελεσμάτων του πειράματος.

Η

Απταμερές C14B1 είναι μια ενδομοριακή Παράλληλη G-τετραπλών

Περαιτέρω εξέταση έδειξε ότι C14B1 έχει πολλαπλά τμήματα του guanines (CGGGTGGGAGTTGTGGGGGGGGGTGGGAGGGT). Είναι γνωστό ότι οι αλληλουχίες γουανίνης-πλούσιοι μπορούν να διπλώνουν σε τέσσερις έλικας δευτεροβάθμια δομές που ονομάζονται τετραπλά. Σύμφωνα με G-Τετράκλινο τύπο πρόβλεψης d (G

3 + N

1-7G

3 + N

1-7G

3 + N

1-7G

3 +) [45], C14B1 είχε μεγάλη πιθανότητα να σχηματίσουν μια δομή G-Τετράκλινο. Στην G-τετραπλών, η επίπεδη πλατεία διάταξη των τεσσάρων guanines (τετράδα) σταθεροποιείται με δεσμούς υδρογόνου Hoogsteen. Ανάλογα με την κατεύθυνση των κλώνων ή μέρη ενός κλώνου που αποτελούν τα τετράδες, οι δομές μπορεί να περιγραφεί ως παράλληλη ή αντιπαράλληλη. Επιπλέον, αυτά τα τετραπλά μπορούν να σχηματίσουν μέσω της ενδομοριακής σύνδεσης των τεσσάρων ή δύο μορίων DNA, ή από την ενδομοριακή αναδίπλωση ενός μονού κλώνου που περιέχει τέσσερα συγκροτήματα γουανίνες [46] πειράματα CD διεξήχθησαν για να διερευνηθεί η δευτερεύουσα δομή του aptamerC14B1. Το φάσμα CD των C14B1 έδειξε μία αρνητική κορυφή κοντά 240 nm και μία θετική κορυφή κοντά 260 nm, ένα τυπικό φάσμα ενός παράλληλου G-τετραπλών [47]. Προκειμένου να διερευνηθεί κατά πόσον C14B1 σχηματίζει ένα λανθάνον ή ενδομοριακό λανθάνον δομή διαμοριακές 4 μονά G-τετραπλών, η εξάρτηση της θερμοκρασίας τήξης με τη συγκέντρωση των C14B1 μελετήθηκε [48]. Η θερμοκρασία τήξης του C14B1 βρέθηκε να είναι 59 ° C, η οποία ήταν ανεξάρτητη από τη συγκέντρωση ολιγονουκλεοτιδίου (Σχήμα S4), υποδεικνύοντας ότι η απταμερές σχηματίζει ένα ενδομοριακό G-τετραπλών.

συγγένεια και δομή Σταθερότητα των C14B1 είναι Κ οι

+ Εξαρτάται

Πολλοί απταμερή DNA έχουν βρεθεί και να σχηματίζουν δομές G-τετραπλών [49] – [51]. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η ύπαρξη ενός μονοσθενούς κατιόντος (ειδικά κάλιο) στο κέντρο αυτών των τετράδων μπορεί να σταθεροποιήσει σημαντικά την G-τετραπλά [52] – [54]. Έτσι, ερευνήσαμε το πώς ένα κατιόν θα επηρεάσει τη δομική σταθερότητα των C14B1 και δραστικότητα σύνδεσης του με κατεύθυνση προς AGR2. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4α, η σταθερότητα της δομής G-τετραπλών C14B1 εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την παρουσία του μονοσθενούς ιόντος. Με 60 mM ΚΟΙ, ισχυρές κορυφές CD παρατηρήθηκαν, υποδηλώνοντας τον σχηματισμό σταθερής δομής G-τετραπλών. Αντικατάσταση ΚΟΙ με την ίδια συγκέντρωση LiCl, NaCl, και MgCl

2 οδήγησε σε δραματική μείωση της έντασης σε CD.

α) Τα φάσματα CD του C14B1 απταμερούς με την παρουσία διαφόρων κατιόντων. Αυτό απταμερές έχει μια θετική ζώνη κοντά στο 260 nm που μπορεί να ανατεθεί σε παράλληλες δομές τετραπλών. β) Η δομική σταθερότητα του απταμερούς στηρίζεται σε μεγάλο βαθμό [K

+]. γ) μετανάστευση φθορισμού σήμα της δέσμευσης C14B1 να AGR2-χάντρες σε διαφορετικά συγκέντρωση του Κ

+ διερευνήθηκε. δ) Οι σταθερές συνδέσεως των C14B1 στο ρυθμιστικό w /και w /o K

+. Τα στοιχεία που ήταν ο μέσος όρος των τριπλών αποτελεσμάτων του πειράματος.

Η

Μελετήσαμε περαιτέρω την επίδραση της Κ

+ συγκέντρωσης στη σταθερότητα του G-τετραπλών. Στο σχήμα 4β, η προσθήκη 0,1 mM Κ

+ σε ρυθμιστικό φωσφορικού αυξηθεί δραματικά την ένταση CD στα 240 και 260 nm. Ένταση απορρόφησης CD ενισχύεται με την αύξηση του Κ

+ συγκέντρωση και φτάσει σε ένα οροπέδιο, όταν Κ

+ συγκέντρωση ήταν μεγαλύτερη από 20 mm. Η συγγένεια δέσμευσης του C14B1 σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του Κ

+ ερευνήθηκε επίσης. Καθώς η κυτταρομετρία ροής αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 4c, πολύ ασθενής σύνδεση του C14B1 προς AGR2 σφαιρίδια παρατηρήθηκε όταν δεν υπήρχε K

+ στο ρυθμιστικό, και η συγγένεια δέσμευσης συνέχισαν να αυξάνονται με την προσθήκη του Κ

+. Οι σταθερές δέσμευσης των C14B1 μετρήθηκαν και συγκρίθηκαν με την παρουσία ή απουσία K

+ (Σχήμα 4d). Η

K

δ

αξία στην παρουσία της K

+ προσδιορίστηκε να είναι 6,2 ± 1,9 nM. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο σχηματισμός του G-τετραπλών είναι σημαντική για την ικανότητα συνδέσεως του απταμερούς C14B1 στο στόχο της, το οποίο είναι εξαιρετικά K

+ εξαρτώμενη.

Αλλοστερική μοριακών φάρων για ανίχνευση AGR2

Κλινικές μελέτες έχουν ήδη δείξει ότι η πρωτεΐνη AGR2 υπερεκφράζεται σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκίνων. Η ευαίσθητη και επιλεκτική ανίχνευση AGR2 είναι έτσι έχουν μεγάλη σημασία για την πρώιμη διάγνωση του καρκίνου. Εδώ, με την εφαρμογή της επιλεγούν και να βελτιστοποιηθούν C14B1 απταμερές, έχουμε σχεδιάσει και αναπτύξει μια αλλοστερική μοριακού φανού έναντι AGR2, που ονομάστηκε AGR2-AmB, η οποία μετατρέπει το μόριο ιδιότητα αναγνώριση του απταμερούς να ροής φθορισμού κυτταρομετρίας σήματος για AGR2 ανιχνεύσεως [55]. Σχήμα 5 απεικονίζει την αρχή λειτουργίας της AGR2-AMB. Ένα AGR2-Amb είναι ssDNA που αποτελείται από μία αλληλουχία στρεπταβιδίνης (SA) απταμερές [56], μία αλληλουχία C14B1, σε μικρή αλληλουχία συμπληρωματική προς ένα μικρό τμήμα της αλληλουχίας απταμερούς SA, και ένα φθοροφόρο. Μια σταθερή δομή φουρκέτας σχηματίζεται από ενδομοριακή υβριδοποίηση μεταξύ της ακολουθίας απταμερούς ΑΕ και την συμπληρωματική αλληλουχία, απενεργοποιώντας προσωρινά την ικανότητα του ανιχνευτή να συνδεθεί με χάντρες ΑΕ. Κατά συνέπεια, όταν επωάζονται με σφαιρίδια SA, δεν ανιχνευτής μπορεί να συνδεθεί με σφαιρίδια SA, και τα σφαιρίδια εμφανίζουν πολύ χαμηλό φθορισμό. Με την παρουσία του AGR2, ωστόσο, η ακολουθία C14B1 στο βρόχο του ΑΜΒ δεσμεύεται με την αλληλουχία στόχο, η οποία με τη σειρά της διασπά την δομή φουρκέτας να ελευθερώσει την αλληλουχία πρόσδεσης SA, ενεργοποιώντας έτσι συγγένεια πρόσδεσης του ανιχνευτή σε σφαιρίδια SA. Έτσι, ο ανιχνευτής AGR2 δεσμευμένου θα συνδέεται προς σφαιρίδια SA, το οποίο θα φθορίζει έντονα επειδή ο ανιχνευτής σημαίνεται FAM. μόρια στόχοι μπορούν να ανιχνευθούν και να ποσοτικοποιηθούν με την ανάγνωση της έντασης φθορισμού των σφαιριδίων Α.Ε., μέσω της ροής κυτταρομετρίας

Η

Σχεδιάσαμε AGR2-AMB, με την ακόλουθη σειρά:. CGACGCACCGATCGCAGGTTCGGGATTTTCGGGTGGGAGTTGTGGGGGGGGGTGGGAGGGTT-FAM, όπου η περιοχή δέσμευσης AGR2 υπογραμμίζεται και η ακολουθία απταμερές SA είναι με έντονα γράμματα. Σταθερή δομή φουρκέτας σχηματίζεται με ενδομοριακή υβριδισμού (Σχήμα S5). Στο πείραμά μας, όταν μόνο AGR2-AmB επωάζονται με σφαιρίδια SA, δεν ανιχνευτής μπορεί να συνδεθεί με σφαιρίδια SA, και τα σφαιρίδια φθορισμό πολύ ασθενώς. Με την παρουσία του AGR2, ωστόσο, η ένταση του φθορισμού των σφαιριδίων SA αυξηθεί σημαντικά, γεγονός που υποδηλώνει την πρόσδεση του ανιχνευτή AGR2 δεσμευμένου σε σφαιρίδια SA. Με την αύξηση της συγκέντρωσης AGR2, παρατηρήθηκαν σταθερή αύξηση στην ένταση φθορισμού στα σφαιρίδια στόχου. AGR2 σε 100 ηΜ συγκέντρωση μπορεί να ανιχνευθεί εύκολα (Σχήμα 6α). Μια σειρά από πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων BSA, θρυψίνη, θρομβίνη, και IgG χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι (500 ηΜ), και δεν υπάρχουν διακριτά σήματα φθορισμού παρατηρήθηκαν (Σχήμα 6b), υποδεικνύοντας μια εξαιρετική ειδικότητα της AGR2-ΑΜΒ προς μόριο-στόχο. Τα αποτελέσματα έδειξαν την ευαισθησία και ειδικότητα της αλλοστερικής ανιχνευτή μοριακού φάρου, υπονοώντας το δυναμικό της για εφαρμογή στην ανάλυση πραγματικό δείγμα, όπως μελέτη της λειτουργίας των πρωτεϊνών και τη διάγνωση της νόσου.

α) Απόκριση AGR2-AmB σε διαφορετικές συγκεντρώσεις AGR2 σε ρυθμιστικό Tris-HCI. β) Απάντηση του AGR2-AMB σε διαφορετικούς στόχους, συμπεριλαμβανομένων AGR2 (100 ναυτικών μιλίων), BSA, IgG, θρυψίνη και θρομβίνη (500 nM κάθε πρωτεΐνες ελέγχου). Τα στοιχεία που ήταν ο μέσος όρος των τριπλών αποτελεσμάτων του πειράματος.

Η

Εν κατακλείδι, έχουμε αναπτύξει νέες ανιχνευτές απταμερούς για ειδική αναγνώριση της AGR2. Κατά τη διαδικασία SELEX, AGR2-GST συντηγμένη πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε ως πρωτεΐνη-στόχο, και να συνδεθεί με σφαιρίδια sepharose μέσω της ήπιας, ακόμη ειδικές, μη ομοιοπολική αλληλεπίδραση GST-γλουταθειόνης. Χάντρες με βάση SELEX επέτρεψε τη χρήση του απλή, αλλά αποτελεσματική, ανάλυση κυτταρομετρίας ροής για την παρακολούθηση της προόδου της επιλογής, αποφεύγοντας την επίπονη, χρονοβόρα και ραδιενεργών διαδικασία EMSA. Μέσω πολλαπλούς γύρους επιλογής με GST ως μάρτυρας, έχουμε εντοπίσει απταμερή, τα οποία αναγνωρίζουν επιλεκτικά AGR2 με νανομοριακή

K

d

αξίες. Μετρήσεις CD και προσδιορισμούς θερμοκρασίας τήξεως έδειξε ότι η βέλτιστη απταμερές C14B1 σχηματίζει ένα ενδομοριακό παράλληλη δομή G-τετραπλών και τη δομή και δεσμευτική συγγένεια του εξαρτώνται σε μεγάλο βαθμό από τη φύση του μονοσθενούς ιόντος. Επιπλέον, με το σχεδιασμό μας AGR2-AMB, AGR2 θα μπορούσε να είναι με ευαισθησία και επιλεκτικά ανιχνεύονται Οι ακολουθίες απταμερούς και οι αισθητήρες που αναφέρονται εδώ έχει μεγάλες δυνατότητες για να χρησιμεύσει ως ένα χρήσιμο εργαλείο για την έγκαιρη διάγνωση και την πρόγνωση του καρκίνου και για τη βασική έρευνα για τη διαλεύκανση των βιοχημικές λειτουργίες του AGR2.

Υλικά και Μέθοδοι

Αρχικός σχεδιασμός βιβλιοθήκη

Το ΗΡΙΧ-καθαρισμένο βιβλιοθήκη που περιέχει μία κεντρική τυχαιοποιημένη αλληλουχία 45 νουκλεοτιδίων που πλαισιώνεται από δύο 20-nt και 22-nt εκκινητή sites υβριδισμού. Αρχική βιβλιοθήκη ήταν: 5′-TCT CGG ACG CGT ΟΤΟ GTC GG-N45-C ΤΕΕ CTG ΚΔ GGC ΚΔ AGA ΟΤΟ-3 ‘, προς τα εμπρός εκκινητή: 5′-FAM-TCT CGG ACG CGT ΟΤΟ GTC GG-3′, αντίστροφο εκκινητή : 5’-Βιοτίνη-CAC TCT ΑΓΓ GCC AGG CAG CGA G-3 ‘

Προετοιμασία των συγχωνευμένων πρωτεϊνών AGR2-GST

το πλασμίδιο pGEX-GST-AGR2 μεταμορφώθηκε σε στέλεχος της μηχανικής. BL-21 και το GST-tagged πρωτείνης AGR2 εκφράστηκε. Μετά από καθαρισμό με χάντρες γλουταθειόνης σεφαρόζης (GE Healthcare) με χρωματογραφία συγγένειας, η GST-AGR2 συντηγμένη πρωτεΐνη συνδέθηκε με σφαιρίδια sepharose για θετική επιλογή. Αφού πλύθηκε αρκετές φορές με ρυθμιστικό W1 (25 mM Tris-HCl ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 0,07% β-μερκαπτοαιθανόλη, 1% Triton Χ-100), τα τελικά καθαρισμένα AGR2-GST-σφαιρίδια φυλάχθηκαν σε αποστειρωμένο ρυθμιστικό διάλυμα PBS. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής με TAMRA-επισημασμένο μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-AGR2 (Santa Cruz) και SDS-PAGE έδειξε ότι η GST-AGR2 συντηγμένη πρωτεΐνη επιτυχώς συνδεδεμένη με τα σφαιρίδια sepharose.

Επιλογή των απταμερών δέσμευσης AGR2

Οι διαδικασίες επιλογής έχουν ως εξής. Η πισίνα ssDNA (200 pmol) διαλύθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (200 μί, 1 × PBS ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 137 mM NaCl, 2.7 mM ΚΟΙ, 10 mM Na

2HPO

4 και 2,0 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4, ρΗ 7.4) μετουσιώθηκε με θέρμανση στους 95 ° C για 5 λεπτά, στη συνέχεια ψύχεται ταχέως σε πάγο για 10 λεπτά, και στη συνέχεια επωάστηκαν για άλλα 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν δεσμευτική. Η πισίνα ssDNA στη συνέχεια επωάστηκε με αρνητικό σφαιρίδια GST (1,0 × 10

5 σφαιρίδια) για επιλογή σε αντίθεση προς απομάκρυνση αλληλουχιών μη-ειδική πρόσδεση σε σφαιρίδια GST. Μετά από διήθηση με ένα σπιτικό στήλη φίλτρο, το διήθημα επωάζεται με θετικό AGR2-GST-σφαιρίδια (1.0 × 10

5 σφαιρίδια) στους 37 ° C για 45 λεπτά. Οι μη δεσμευμένου ή μη ειδικά δεσμευμένο oligoes απομακρύνθηκαν με διήθηση. Οι αλληλουχίες που δεσμεύονται στα σφαιρίδια στόχου επικαλυμμένα μετά ενισχύθηκαν με PCR με FAM και επισημασμένο με βιοτίνη εκκινητές (5-15 κύκλοι 0,5 λεπτά στους 94 ° C, 0,5 λεπτά στους 53 ° C, και 0,5 λεπτά στους 72 ° C, που ακολουθείται από 5 λεπτά στους 72 ° C? το Easytaq συν πολυμεράση και dNTPs αποκτήθηκαν από διαγονιδιακής Πεκίνο). Μετά την μετουσίωση σε NaOH (0,1 Μ), η επιλεγμένη αίσθηση ssDNA διαχωρίστηκε από το βιοτινυλιωμένο αντινόημα ssDNA σκέλος για sepharose επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη σφαιρίδια (GE Healthcare) και χρησιμοποιήθηκε για τον επόμενο γύρο επιλογής. Για την επιλογή του πρώτου γύρου, η ποσότητα της αρχικής πισίνα ssDNA ήταν 5 nmol, διαλύεται σε 500 μL ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης, και το στάδιο αντι-επιλογής είχε εξαλειφθεί. Για την απόκτηση απταμερή με υψηλή συγγένεια και εξειδίκευση, η αντοχή επιλογή ενισχύθηκε σταδιακά με την αύξηση του αριθμού πλύσεων (από τρία έως δέκα φορές με 200 μL 1 χ PBS ρυθμιστικού διαλύματος κάθε φορά) και τη μείωση του ποσού της βιβλιοθήκης ssDNA ανά γύρο (από 200 σε 150 pmol).

Η κλωνοποίηση και αλληλούχιση του DNA

Η προκύπτουσα πισίνα από το 14

ου γύρου ενισχύθηκε με PCR, κλωνοποιήθηκε και η αλληλουχία (εγκατάσταση αλληλουχίας Σαγκάη Sangon). Οι προκύπτουσες αλληλουχίες 62 υποβλήθηκαν σε ανάλυση πολλαπλής στοίχισης αλληλουχιών χρησιμοποιώντας Clustal W 6.0 λογισμικό για να ανακαλύψει υψηλά συντηρημένα μοτίβα σε ομάδες των επιλεγμένων αλληλουχιών DNA. Οι ανακάλυψαν συναινετικές αλληλουχίες με υψηλή επαναλήψεις μεταξύ των επιλεγμένων πισίνες στη συνέχεια συντίθεται χημικά για περαιτέρω δοκιμές.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Για την παρακολούθηση του εμπλουτισμού των απταμερών μετά την επιλογή, η FAM σημασμένο πισίνα ssDNA επωάστηκε με 5 × 10

4 AGR2-GST-σφαιρίδια ή GST-σφαιρίδια σε ρυθμιστικό διάλυμα (200 μL) δέσμευσης στους 37 ° C για 45 λεπτά. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές με 200 μι ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης με διήθηση, και αιωρήθηκε σε ρυθμιστικό σύνδεσης (250 μL). Η ένταση φθορισμού των προκυπτόντων σφαιριδίων παρακολουθήθηκε με ένα κυτταρόμετρο FACSAria (Becton Dickinson Immuno κυτταρομετρία συστήματα) μετρώντας 10.000 γεγονότα. Οι συγγένειες δέσμευσης απταμερών προσδιορίστηκαν με επώαση AGR2-GST-σφαιρίδια (5 × 10

4) με διάφορες συγκεντρώσεις FAM-σημασμένου απταμερή (προ-θερμική κατεργασία) σε ρυθμιστικό (200 μL) δέσμευσης στους 37 ° C για 45 λεπτά στο σκοτάδι. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με το ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης, μετά επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό (250 μL) δέσμευσης και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρομετρίας ροής. Το FAM σημασμένο μη επιλεγμένη βιβλιοθήκη ssDNA χρησιμοποιήθηκε σαν αρνητικός έλεγχος για την μη ειδική αξιολόγηση δέσμευσης. Όλα τα πειράματα δέσμευσης επαναλήφθηκαν δύο έως τέσσερις φορές. Η μέση ένταση φθορισμού της πρωτεΐνης-στόχου επισημασμένου με απταμερή χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της συγγένειας σύνδεσης με αφαίρεση της μέσης εντάσεως φθορισμού των μη ειδική σύνδεση που παράγεται από μη επιλεγμένη βιβλιοθήκη ssDNA. Οι σταθερές διάστασης (

K

δ

) των φθοριζόντων προσδεμάτων ελήφθησαν με την τοποθέτηση του εξάρτηση της έντασης φθορισμού της πρόσδεσης με τη συγκέντρωση των συνδετών με την εξίσωση (1) ειδικό: Y = Β

MAXX /(

K

δ

+ Χ) χρησιμοποιώντας το λογισμικό SigmaPlot.

Εγκύκλιος φασματοσκοπία διχρωισμού

μετρήσεις CD εκτελέστηκαν σε ένα Jasco J-810 φασματοπολαριμέτρου εξοπλισμένη με μία προγραμματιζόμενη μονάδα ελέγχου της θερμοκρασίας (Julabo ΗΡ-4). Η συγκέντρωση των δειγμάτων DNA ήταν 2 mm. Πριν από τη μέτρηση του φάσματος CD, τα δείγματα του DNA ανοπτήθηκαν με θέρμανση στους 95 ° C για 5 λεπτά, στη συνέχεια ψύχθηκε ταχέως επί πάγου για 10 λεπτά, και επωάστηκαν για άλλα 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα φάσματα από 400 έως 200 nm ελήφθησαν με τη χρήση πλάτους σχισμής 1 nm και ανάλυση σάρωσης 0,1 nm. Κάθε φάσμα CD ήταν κατά μέσο όρο 8 σαρώσεις με το φόντο ρυθμιστικό αφαιρείται.

πείραμα UV θερμική μετουσίωση

μελέτες υν απορρόφηση και τήξεως διεξήχθησαν σε Agilent 8453 φασματοφωτόμετρο εξοπλισμένο με ένα προγραμματιζόμενο θερμοκρασία -Έλεγχος μονάδα (Agilent 89090A). θερμοκρασίες τήξης (Τ

m) ελήφθησαν καθώς η θερμοκρασία του μισού διάστασης του τετραπλών και ελήφθησαν από το μέγιστο των πρώτων παραγώγων οικόπεδα dA /dT στα 295 nm. Τα διαλύματα DNA έχει υποστεί θερμική επεξεργασία σε διάφορες συγκεντρώσεις εισήχθησαν σε μια κυψελίδα χαλαζία και επικαλύπτονται με ένα λεπτό στρώμα ελαίου σιλικόνης για την πρόληψη της εξάτμισης. Το μήκος της οπτικής διαδρομής ήταν 1 εκ. Η απορρόφηση και η θερμοκρασία καταγράφονταν κάθε 2 ° C.

Αξιολόγηση των AGR2-AmB

AGR2-AMB (40 ηΜ) ανόπτηση με θέρμανση στους 95 ° C για 5 λεπτά σε 200 μί Τρις- HCl ρυθμιστικό (25 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 0,5 mM KCl, 2 mM MgCl

2 σε ρΗ 7.4), και στη συνέχεια ψύχεται ταχέως επί πάγου για 10 λεπτά, και στη συνέχεια περιμένει για άλλα 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν χρήση. Στο διάλυμα AGR2-AmB, προστέθηκαν διάφορες συγκεντρώσεις AGR2 και τα προκύπτοντα διαλύματα αφέθηκαν να επωαστούν στους 37 ° C για 30 λεπτά. Στο μείγμα, 1 μL σφαιριδίων στρεπταβιδίνης (περίπου 5 × 10

4 σφαιρίδια) προστέθηκαν και το μίγμα αφήνεται να πήξει για 45 λεπτά σε σκοτάδι. Μετά από πλύση δύο φορές με ρυθμιστικό Tris-HCl, SA σφαιρίδια διηθούνται για την εξάλειψη των μη δεσμευμένων AGR2-AmB και επαναιωρήθηκαν σε Tris-HCl ρυθμιστικό διάλυμα 250 μΙ προτού ανάλυση κυτταρομετρίας ροής.