Αφηρημένο

Η απόπτωση μπορεί να προκληθεί με δύο διαφορετικούς τρόπους, μέσα από την εγγενή ή εξωγενή οδό. Η ενδογενής οδός διαμεσολαβείται από τα μιτοχόνδρια μέσω της απελευθέρωσης του κυτοχρώματος C, ενώ η εξωγενής οδός αυτή υπαγορεύεται από τα σήματα των υποδοχέων θανάτου και παρακάμπτει τα μιτοχόνδρια. Αυτές οι δύο οδοί είναι στενά συνδεδεμένα με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και καταρράκτες σηματοδότησης επιβίωσης, οι οποίες αποτελούν έτσι πιθανούς στόχους για τη θεραπεία του καρκίνου. Σε προηγούμενες μελέτες έχουμε εισαγάγει δύο φυτού που προέρχονται ισομερείς φλαβονοειδή, φλαβόνης Α και Β φλαβόνης που επάγουν απόπτωση σε υψηλά ογκογόνα κύτταρα καρκίνου του μαστού, του παχέος εντέρου, του παγκρέατος, και του προστάτη. Flavone Ένα εμφανίζεται ισχυρή κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι περισσότερο διαφοροποιημένα καρκινώματα του παχέος εντέρου (Caco-2) και του παγκρέατος (Panc28), ενώ φλαβόνης Β κυτταροτοξική δράση παρατηρείται σε φτωχά διαφοροποιημένο καρκίνωμα του παχέος εντέρου (HCT 116) και το πάγκρεας (ΜΙΑ PaCa). Η απόπτωση επάγεται από φλαβόνης Α σε καλύτερη διαφοροποιημένο καρκίνο του παχέος εντέρου Caco-2 και του καρκίνου του παγκρέατος Panc 28 κύτταρα μέσω της εσωτερικής οδού από την αναστολή των ενεργοποιημένων μορφών του εξωκυτταρικού κινάσης σήματος ρυθμιζόμενη (ERK) και PS6, και την επακόλουθη απώλεια της φωσφορυλίωσης του Bcl -2 συνδέονται υποστηρικτής του θανάτου (BAD) πρωτεΐνη, ενώ η απόπτωση ενεργοποιείται από flavone Β σε φτωχά διαφοροποιημένα HCT καρκίνο του παχέος εντέρου 116 και ΜΙΑ PaCa καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος μέσω της εξωγενούς οδού με την ταυτόχρονη ρύθμιση προς τα άνω των φωσφορυλιωμένες μορφές της ERK και c-Jun σε σερίνη 73. Αυτές οι αλλαγές στα επίπεδα της πρωτεΐνης τελικά να οδηγήσει στην ενεργοποίηση της απόπτωσης, χωρίς τη συμμετοχή της ΑΚΤ

Παράθεση:. Lejeune TM, Tsui ΗΥ, Parsons LB, Miller GE, Whitted C, Lynch ΚΕ, et al. (2015) Μηχανισμός δράσης των δύο Flavone ισομερή Στόχευση Τα καρκινικά κύτταρα με Διαφορετικές τηλέφωνα Διαφοροποίηση Κατάσταση. PLoS ONE 10 (11): e0142928. doi: 10.1371 /journal.pone.0142928

Επιμέλεια: Yu-Jia Chang, Ταϊπέι Ιατρικής του Πανεπιστημίου, Ταϊβάν

Ελήφθη: 29 Απριλίου του 2015? Αποδεκτές: 28 του Οκτώβρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 25 Νοεμβρίου, 2015

Copyright: © 2015 Lejeune et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. το έργο αυτό χρηματοδοτήθηκε από το Τμήμα Φαρμακευτικής Επιστημών στο East Tennessee State University Gatton College of Pharmacy (https://www.etsu.edu/pharmacy/), επιχορήγηση 82.171 από την Ανατολή Tennessee State Επιτροπή Ερευνητικό Πανεπιστημιακό Πρόγραμμα Ανάπτυξης Major Επιχορηγήσεις (https://www.etsu.edu/research/rdc/) και το Τμήμα Χημείας στο Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales (http: //www. udca.edu.co/)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η συχνότητα του καρκίνου αυξάνεται σταθερά σε όλο το παρελθόν. δεκαετίες [1]. Ενώ τρέχουσες θεραπείες είναι αποτελεσματικές σε διάφορα επίπεδα, πολλές από αυτές τις θεραπείες είναι επίσης μη ειδικά σε σχέση με το μηχανισμό δράσης τους. Αυτό με τη σειρά του αυξάνει τα ανεπιθύμητα αποτελέσματα που βιώνουν οι ασθενείς που έλαβαν θεραπεία? σκληρές παρενέργειες και τα χαμηλά ποσοστά αποτελεσματικότητας είναι μερικοί από τους πολλούς λόγους για τους οποίους έχουν αναζητηθεί περισσότερο συγκεκριμένες θεραπείες στην ογκολογία. Μεταξύ αυτών των προσπαθειών, έχουν φυσικά προϊόντα [2] έχουν μελετηθεί εκτενώς με τις ελπίδες των ταυτοποίηση νέων μοριακών οντοτήτων με αντινεοπλασματικά ιδιότητες. Από αυτά τα φυσικά προϊόντα, τα φλαβονοειδή, μία κατηγορία πολυφαινολικών ενώσεων που βρίσκονται στα φυτά, έχουν δειχθεί ότι εξασκούν αντινεοπλασματικών [3-9] ιδιότητες, καθώς και αντιοξειδωτικό [10, 11], αντι-φλεγμονώδη [12], αντιμικροβιακή [13] και αντι-ιική [14, 15] δραστηριότητες.

για τα τελευταία πέντε χρόνια η έρευνά μας έχει επικεντρωθεί στα φυτά από τα βουνά των Άνδεων σε μεγάλο βαθμό γνωστή ως

vira viras

. Αυτά τα φυτά έχουν χρησιμοποιηθεί από τους γηγενείς ανθρώπους αυτής της περιοχής για ιατρικούς σκοπούς, όπως για τη θεραπεία του καρκίνου, όπως αναφέρεται σε διάφορες μελέτες εθνοβοτανικής [16, 17]. Ανήκουν στην οικογένεια

Asteraceae

, γένη

Gnaphalium

,

Achyrocline

, και

Gamochaeta

. Η εστίασή μας σε σχέση με τα φυτά vira vira έχει τοποθετηθεί στο

Gnaphalium elegans

και

Achyrocline bogotensis

από τα οποία δύο δραστικές ενώσεις απομονώθηκαν, 5,7-διυδροξυ 3,6,8-τριμεθοξυ 2-φαινυλ-4Η-χρωμεν-4-όνη (5,7-διυδροξυ-3,6,8-trimethoxyflavone ή flavone Α) [18], και 3,5-διυδροξυ-6,7,8-τριμεθοξυ-2- φαινυλ-4Η-χρωμεν-4-όνη (3,5-διϋδροξυ-6,7,8-trimethoxyflavone ή flavone Β) αντίστοιχα [19]. Έχει προταθεί σε προηγούμενες εργασίες μας ότι αυτά τα δύο ισομερή φλαβόνης μπορεί να σχετίζονται με τις αντινεοπλασματικών δραστηριοτήτων αυτών των φυτών [20]. Πράγματι, φλαβόνες Α και Β επέδειξε κυτταροτοξική δραστικότητα έναντι κυτταρικών γραμμών που προέρχονται από καρκίνους του παχέος εντέρου, του παγκρέατος, του μαστού και του προστάτη που έχουν χαρακτηρισθεί ως ιδιαίτερα ογκογόνα, με τα πιο πολλά υποσχόμενα αποτελέσματα σε καρκίνους του παχέος εντέρου και του παγκρέατος. Υψηλά επίπεδα έκφρασης της αφυδρογονάσης αλδεΰδης (ΑΙ_ϋΗ) θεωρείται ως ένα πολύ συγκεκριμένο δείκτη που χρησιμοποιείται στην ανίχνευση των κυττάρων του καρκίνου-κίνηση ως υποπληθυσμοί σε όγκους, και έχει αποδειχθεί ειδικά στις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν [21-23]. Μεταξύ αυτών των εξαιρετικά ογκογόνων κυτταρικών σειρών, τα δύο ισομερή φλαβόνης δείχνουν προτιμησιακή αντινεοπλασματική δράση σε κύτταρα με ανόμοια κατάστασης διαφοροποίησης. Flavone Μια επαγόμενη απόπτωση στα καλύτερα διαφοροποιημένες κυτταρικές γραμμές, αλλά όχι για τα φτωχά διαφοροποιημένο κύτταρο γραμμές, ενώ φλαβόνης Β δείχθηκε να είναι δραστικές έναντι πτωχά διαφοροποιημένα, αλλά όχι εναντίον των καλύτερα διαφοροποιημένα κύτταρα. Επιπλέον, αυτά τα δύο ισομερή φλαβόνης δεν επάγουν απόπτωση σε φυσιολογικά κύτταρα και εμφανίζουν σημαντικά μικρότερη αποπτωτική δραστικότητα σε λιγότερο ογκογόνο κυτταρικές γραμμές [20].

Είναι γνωστό ότι το μιτοχονδριακό διαχείριση της απόπτωσης μπορεί να ελεγχθεί μέσω της δραστηριότητας της επιβίωσης παράγοντες, όπως αυξητικούς παράγοντες ή κυτοκίνες, μέσω εξωκυτταρικών υποδοχέων ενεργοποιώντας καταρράκτες της πρωτεΐνης γεγονότων που τελικά οδηγούν σε κασπάση-3 διάσπαση. Αυτά τα μονοπάτια ανιχνεύθηκαν με τη διερεύνηση των επιδράσεων των δύο ισομερών φλαβόνης στην εξωκυττάρια κινάσες σήματος ρυθμιζόμενη (ΕΚΚ), κινάσης πρωτεΐνης Β (ΑΚΤ), S6 ριβοσωμική πρωτεΐνη (S6), και Bcl-2 σχετίζεται υποκινητή θανάτου (BAD). Η προτιμησιακή επαγωγή της απόπτωσης σε ιδιαίτερα ογκογόνων κυττάρων με ανόμοια κατάσταση διαφοροποίησης από φλαβόνης Α και Β φλαβόνη, δύο δομικά παρόμοιες ενώσεις, προτείνουν την ενεργοποίηση διαφορετικών κυτταρικών οδών από κάθε ένωση. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι flavone Μια ασκεί κυτταροτοξική δράση της για τη βελτίωση διαφοροποιημένα καρκινικά κύτταρα μέσω μιας εγγενούς αποπτωτικό μονοπάτι, ενώ flavone Β παρακάμπτει το μιτοχονδριακό μονοπάτι για να επάγει απόπτωση μέσω μιας εξωγενούς οδού σε φτωχά διαφοροποιημένα καρκινικά κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Εξαγωγή, καθαρισμός και ταυτοποίηση της φλαβόνες

οι φλαβόνες ελήφθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Εν συντομία, flavone Α καθαρίστηκε από 1,5 kg του

G

.

elegans

αποξηραμένα λουλούδια εκχυλίζεται με χλωροφόρμιο

3. Το εκχύλισμα συμπυκνώθηκε με ξηρή κενό, διαλύθηκε σε μεθανόλη, και διηθείται για να εξαλειφθούν τα λίπη και υδρογονάνθρακες. Αυτό στη συνέχεια συμπυκνώθηκε και διαλύθηκε σε C

6Η

6 ακολουθούμενη από χρωματογραφία πυριτικής πηκτής χρησιμοποιώντας C

6Η

6: Me

2CO (19: 1) ως έκλουσμα. Από αυτό, 50 mg της φλαβονοειδές καθαρίστηκε από τα κλάσματα 12 έως 18 από κρυσταλλώσεις σε εξάνιο. Η ένωση ταυτοποιήθηκε με φυσικές και φασματοσκοπικές του ιδιότητες όπως 5,7-διυδροξυ 3,6,8 trimethoxyflavone, mp 170 171 C, 1Η NMR (300ΜΗζ) 3.86 (3Η, s), 3.97 (3Η, s), 4,20 (3Η, s), 7.50 7.6 (3Η, m), 8.08 8.16 (2Η, m). Flavone Β καθαρίστηκε από 200 γραμμάρια φρέσκα φύλλα του

A

.

bogotensis

. Τα φύλλα βυθίστηκαν σε ΟΗΟ

3 για 20 λεπτά και στη συνέχεια διηθήθηκε, συμπυκνώθηκε, και διαλύθηκε σε θερμή μεθανόλη. Προκειμένου να εξαλειφθούν τα λίπη και υδρογονάνθρακες, το κρύο εκχύλισμα διηθήθηκε και συμπυκνώθηκε και πάλι. Το προκύπτον στερεό στη συνέχεια διαλύθηκε σε θερμό εξάνιο και οι διαδοχικές ανακρυσταλλώσεις σε εξάνιο παρήγαγε 100 mg καθαρισμένου φλαβονοειδών. Η ένωση ταυτοποιήθηκε με φυσικές και φασματοσκοπικές του ιδιότητες όπως 3,5-διϋδροξυ-6,7,8-trimethoxyflavone, mp 149 150C, 1Η NMR (300ΜΗζ) 3.86 (3Η, s), 3.97 (3Η, s), 3.99 ( 3Η, s), 4,12 (3Η, s), 7.30 7.45 (3Η, m), 8.70 8.82 (3Η, m), 11.46 (1Η, s).

Γραμμές κυττάρων και συνθήκες καλλιέργειας.

Colon (Caco-2, HCT116) και του παγκρέατος (ΜΙΑ PaCa-2) κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και αναπτύχθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες ATCC. Η κυτταρική σειρά Panc28 ήταν ένα δώρο από τον Dr. Paul Chiao (University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, Houston, ΤΧ), και αναπτύχθηκε με τον ίδιο τρόπο όπως παγκρεατική κυτταρική γραμμή ΜΙΑ PaCa-2. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσα συμπληρωμένα με 10% ορό (Gibco, Grand Island, ΝΥ) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (Hyclone, Logan, UT). Όλα τα κύτταρα σπάρθηκαν και αφέθηκε να φθάσει το 75% συρροή πριν από τη θεραπεία με φλαβόνη Α, Β, ή φορέα (διμεθυλοσουλφοξείδιο) σε τελική μέγιστη συγκέντρωση 0,27% στα επεξεργασμένα φρεάτια (Sigma Aldrich, St Louis, ΜΟ).

η απόπτωση Ανίχνευση με μικροσκόπιο φθορισμού

η απόπτωση ανιχνεύθηκε με τη χρήση της Annexin V-FITC κιτ από Abcam (Cambridge, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 4-5×10

4 /φρεάτιο σε στρογγυλά καλυπτρίδες 12-mm (Fisher Scientific, Pittsburgh, ΡΑ), αφέθηκε να φθάσει σε 75% συρροή, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία είτε με φορέα, Flavone Α, ή flavone Β σε μια συγκέντρωση 40 μΜ. Έξι ώρες μετά τη χορήγηση, τα κύτταρα επωάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα και ΡΙΤΟ-συζευγμένο δέσμευσης αννεξίνης V για πέντε λεπτά στο σκοτάδι. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με 2% παρα-φορμαλδεΰδης και εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού EVOs (AMG, Bothell, WA).

κυτταρικού κύκλου και απόπτωση Ανάλυση με κυτταρομετρία ροής

κύτταρα αναπτύσσονται επί έξι φρεατίων, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα είτε διάλυση, φλαβόνης Α ή Β φλαβόνης Μετά από εννέα ώρες επώασης, τα κύτταρα ανυψώνονται από την πλάκα με θρυψίνη, και προσδιορίστηκε για ποσοτικοποίηση της απόπτωσης και κυτταρικού κύκλου διανομές χρησιμοποιώντας ένα Αννεξίνη V- FITC κιτ από Abcam (Cambridge, ΜΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα πρόσδεσης αννεξίνης V και-FITC και ιωδιούχο προπίδιο προστέθηκαν, ακολουθούμενα από επώαση 5 λεπτών στο σκοτάδι. καταμέτρηση των κυττάρων λήφθηκε με χρήση της ροής BD Accuri C6 κυτταρομετρητή (BD Biosciences, San Jose, CA) και αναλύθηκαν με CFLOW Plus (BD Biosciences).

Αντισώματα και Αντιδραστήρια

εκτιμήθηκε Ο μηχανισμός δράσης χρησιμοποιώντας αντισώματα εναντίον της ERK2 από Σάντα Κρουζ (Ντάλας Τέξας), ΑΚΤ από Millipore (Billerica, ΜΑ), c-Jun και BAD από την Cell Signaling (Beverly, ΜΑ), φωσφορυλιωμένη c-Jun (T91 /93) από Abcam (Cambridge, MA ), φωσφορυλιωμένη c-Jun (S63 /73), οι φωσφορυλιωμένες μορφές της ERK, S6 ριβοσωμική πρωτεΐνη (91B2), και BAD, από κυτταρική σηματοδότηση, φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ S473 από την Millipore, ΒΗ3-αλληλεπιδρώντας αγωνιστή πεδίου θανάτου (Bid) από την R & amp? D Systems (Minneapolis, ΜΝ), ανενεργή και ενεργές μορφές της κασπάσης 3 από την Santa Cruz και την Ε & amp? D Systems, κασπάσης 8 και κασπάσης 10 από την MBL (Woburn, ΜΑ), και κασπάσης 9 από την Cell Signaling, και α-τουμπουλίνης και β ακτίνης από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ). Όλα τα δευτερογενή αντισώματα καθαρισμένα με συγγένεια χωρίς διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με άλλα είδη. δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση ελήφθησαν από την Pierce (Rockford, IL), Promega (Madison, WI), και Jackson ImmunoResarch (West Grove, ΡΑ). Alexa Fluor 488 και 594-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα (Molecular Probes, Eugene, OR) χρησιμοποιήθηκαν ως ορίζεται από τον κατασκευαστή. Tamoxifen χρησιμοποιείται για να ληφθεί ένα θετικό σήμα ελέγχου για την ανάλυση φωσφορυλίωση του c-Jun ήταν από τη Sigma.

PAGE και ανοσοκηλίδος

Τα επεξεργασμένα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που αποτελούνταν από 20 mM ιμιδαζολίου, 100 mM ΚΟΙ, 1 mM MgCl

2, 10 mM EGTA, 0,2% Triton Χ-100, αναστολείς φωσφατάσης, και πρωτεάσης (Sigma Aldrich). Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των κυτταρολυμάτων μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά (Cary 50? Varian, ΡβΙο Alto, CA) χρησιμοποιώντας έναν προσδιορισμό πρωτεΐνης από Cytoskeleton (Denver, CO, USA). Τα δείγματα έτρεξαν σε SDS-PAGE και στη συνέχεια στυπώθηκαν πάνω σε φύλλα νιτροκυτταρίνης ή PVDF. Το σήμα του πρωτεύοντος μονοκλωνικών ή πολυκλωνικών αντισωμάτων ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας δευτερογενή καθαρισμένο με συγγένεια κατσίκας αντι-ποντικού ή ανοσοσφαιρίνες αντι-κουνελιού συζευγμένο με υπεροξειδάση και ένα σύστημα χημειοφωταύγειας (Pierce? Grand Island, ΝΥ) και εκτέθηκαν σε φιλμ ακτίνων Χ (Kodak? Rochester, ΝΥ). Η ένταση των ζωνών υπολογίσθηκε με την ψηφιοποίηση της εικόνας (Image J-) από φιλμ ακτίνων Χ. Μετά την αφαίρεση του φόντου, όλες οι εντάσεις ζώνη συγκρίθηκαν έναντι μάρτυρα.

ανοσοφθορισμού

ανοσοφθορισμός πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 3% ρ-φορμαλδεΰδη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την έκπλυση, τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά με 0,2% Triton Χ-100 για 5 λεπτά ή 0,1% σαπωνίνη διάρκεια της διαδικασίας. Η διαπερατότητα ακολουθήθηκε από σβήσιμο των ομάδων αλδεΰδης σε 50 mM ΝΗ

4Cl. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο σε 1% BSA, για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πλύσεις και η επώαση με δευτερογενές αντίσωμα, τα κύτταρα τοποθετούνται σε 10% πολυβινυλική αλκοόλη, 30% γλυκερόλη, 1% η-γαλλικό προπυλεστέρα, και αργή εναλλαγή (Molecular Probes, Invitrogen) σε αραίωση 5: 1. εικόνες φθορισμού ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού EVOs (AMG, Bothell, WA).

Αποτελέσματα

Flavone Α και Β Flavone επάγουν την απόπτωση και τον κυτταρικό κύκλο

μετατόπιση

προηγούμενο μας τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι φλαβόνες Α και το DNA του κατακερματισμού Β αιτία για την καλύτερη και ανεπαρκώς διαφοροποιημένα κύτταρα αντίστοιχα [20]. δοκιμασίες αννεξίνης V διεξήχθησαν για να επιβεβαιωθεί η επαγωγή της απόπτωσης σε κύτταρα ογκογόνων κατάσταση μετά τη χορήγηση δόσης με τις φλαβόνες. Η απόπτωση ανιχνεύθηκε 6 ώρες μετά τον καρκίνο του παγκρέατος Panc-28 (Σχήμα 1Α) και τα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου Caco-2 (Σχήμα 1Β) δοσολογήθηκαν με 40 μΜ φλαβόνης Α Με τον ίδιο τρόπο, η απόπτωση ανιχνεύθηκε 6 ώρες μετά τον καρκίνο του παγκρέατος MIA Paca -2 (Σχήμα 1 C) και του καρκίνου του παχέος εντέρου HCT116 κύτταρα (Σχήμα 1 D) δοσολογήθηκαν με 40 μΜ φλαβόνης Β Για την ποσοτικοποίηση των αποπτωτικών μεταβολές που προκαλούνται από τις φλαβόνες, τα κύτταρα δοσολογήθηκαν με το όχημα ή φλαβόνη, αναλύθηκαν 6, 9 και 12 ωρών μετά την επεξεργασία μέσω κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιώντας ιωδιούχο αννεξίνης V /προπίδιο. Σε 9 ώρες, Panc 28 κύτταρα κατεργασμένα με φλαβόνης Α είχε 2,9 φορές αύξηση στην απόπτωση (Σχήμα 2Α και 2C). Ομοίως, στις 9 ώρες, HCT 116 κύτταρα κατεργασμένα με φλαβόνης Β είχε 2,3 φορές αύξηση στην απόπτωση (Σχ 2Β και 2C).

αποπτωτικό αποτέλεσμα φλαβόνης Α σε συγκέντρωση 40 μΜ, στην πιο διαφοροποιημένη παγκρεατική Panc28 και κόλον CaCo 2 καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 1Α και 1Β), όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία αννεξίνης V (πράσινο κανάλι) έξι ώρες μετά τη θεραπεία. DAPI (μπλε κανάλι) χρησιμοποιείται για να εντοπίσει τους πυρήνες των κυττάρων. Κύτταρα κατεργασμένα με φορέα μόνο (DMSO σε τελική συγκέντρωση 0,27%) χρησίμευσαν ως έλεγχος. Η ενεργοποίηση της απόπτωσης για την πτωχά διαφοροποιημένο παγκρεατικών ΜΙΑ PaCa και του παχέος εντέρου HCT116 κύτταρα (Σχήματα 1 C και 1 D) από φλαβόνης Β σε μία συγκέντρωση 40 μΜ, όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία αννεξίνης V (πράσινο κανάλι) έξι ώρες μετά τη θεραπεία. συνθήκες ελέγχου είναι η ίδια όπως περιγράφεται παραπάνω και DAPI χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό των πυρήνων.

Η

Α. Η απόπτωση ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-FITC και το ιωδιούχο προπίδιο σε Panc 28 κύτταρα επεξεργασμένα με 40 μΜ φλαβόνη Α, 9 ώρες μετά τη θεραπεία. B. Ανίχνευση απόπτωσης σε HCT 116 κύτταρα επεξεργασμένα με 40 μΜ φλαβόνη Β, 9 ώρες μετά τη θεραπεία. Γ Μπαρ γράφημα αναπαράσταση της απόπτωσης σε Panc 28 και HCT 116 κύτταρα επεξεργασμένα με φλαβόνης Α και Β αντίστοιχα. D-E. προσδιορισμός κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο σε Panc 28 κύτταρα επεξεργασμένα 40 μΜ φλαβόνης Α F-G. Κυττάρων αποφασιστικότητα κύκλου HCT 116 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 40 μΜ flavone Β

Η

Για να ελέγξετε εάν η θεραπεία με flavone Α ή Β flavone είχε επίπτωση στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου, κυτταρομετρία ροής δοκιμασίες χρησιμοποιώντας ιωδιούχο προπίδιο πραγματοποιήθηκαν. Καλύτερη διαφοροποιημένα κύτταρα Panc παγκρεατικών 28 κύτταρα επεξεργάστηκαν με φλαβόνης Α (Εικ 2Δ και 2Ε). Μετά από 9 ώρες, μια μετατόπιση από την G0 /G1 στην S και G2 φάσεις φαίνεται καθαρά. Τα κακώς διαφοροποιημένα κόλον καρκινικά κύτταρα HCT 116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με φλαβόνης Β Ένα παρόμοιο μετατόπιση από τη φάση G0 /G1 στην S και G2 φάσεων είναι εμφανής 9 ώρες μετά την κατεργασία (Σχ 2F και 2G).

Flavone Α έχει μία ανασταλτική επίδραση στην φωσφορυλιωμένη ERK και S6, αλλά δεν έχει καμία επίδραση στην ΑΚΤ ή c-Jun σε καλύτερη διαφοροποιημένα Panc28 και Caco-2 κύτταρα καρκίνου

για να προσδιοριστεί ο μηχανισμός που ευθύνεται για την κυτταροτοξική δράση για τη βελτίωση της διαφοροποιημένα κύτταρα καρκίνου παρατηρήθηκε μετά την αγωγή με φλαβόνη Α, πολλαπλασιαστικές, την επιβίωση, και τις οδούς αποπτωτικής σηματοδότησης εξετάστηκαν. παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα Panc28 Καρκίνο του παχέος εντέρου Caco-2 και δοσολογήθηκαν με 40 μΜ φλαβόνης Α και τα επίπεδα των ενεργοποιημένων ΑΚΤ, ERK, S6, και c-jun αναλύθηκαν. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3Α και 3C, η δοσολογία Panc 28 κυττάρων με φλαβόνης Α προκάλεσε μία μέση μείωση του φωσφορυλιωμένη μορφή της ERK σε 64,27% (51,84% -74,83%? P = 0,0029) και του PS6 να 52,58% (37,90% -62,50 %? p = 0,012) σε σύγκριση με τον έλεγχο. Σε κύτταρα Caco-2, η μέση μείωση του φωσφορυλιωμένου ERK από φλαβόνης Α ήταν να 42,58% (25,38% -55,64%? P = 0,0031) και 57,99% (43,84% -77,36%? P = 0,0138) για PS6, σε σύγκριση με τον έλεγχο. Καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στα επίπεδα έκφρασης των unphosphosphorylated πρωτεΐνες αναλύθηκαν (Σχήμα 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα ανοσοαποτυπώματος επιβεβαιώθηκαν με ανοσοφθορισμό. είναι φωσφορυλιωμένα ERK αποτελέσματα σε κύτταρα Caco-2 παρουσιάζεται στο Σχ 3Ε. Επιπλέον, οι ενεργοποιημένες μορφές του ΑΚΤ στην σερίνη 473 και c-jun σε σερίνη 73, μελετήθηκαν επίσης ως αυτές οι πρωτεΐνες ρυθμίζουν τόσο κυτταρική επιβίωση και το άγχος που προκαλείται από απόπτωση, αντίστοιχα. Κανένα από αυτά τα κατέδειξε σημαντικές αλλαγές στις Caco-2 κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Α και 3C) Panc-28 και

Α και Β:. Η ανίχνευση των ενεργοποιημένων και μη φωσφορυλιωμένη μορφές ERK, c-Jun, S6, ΑΚΤ με ανοσοαποτύπωση των συνολικών εκχυλίσματα SDS. Καλύτερη διαφοροποιημένα κύτταρα Panc28 και CaCo 2 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 40 μΜ του φλαβόνης Α (+ Α), και κακώς διαφοροποιημένο ΜΙΑ PaCa και HCT116 κυττάρων με φλαβόνης Β (+ Β), ή DMSO (-) του οχήματος διάλυση. Μετά τη λύση και SDS-PAGE, μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με την υποδεικνυόμενη αντίσωμα. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν και πάλι για ακτίνη ως έλεγχο φόρτισης, και ένα αντιπροσωπευτικό εικόνας παρέχεται. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Γ και Δ: Για τον ποσοτικό προσδιορισμό (γραφικές παραστάσεις) οι πυκνότητες μπάντα από τα επεξεργασμένα /μη επεξεργασμένα όροι προσδιορίζονται με (+) ή (-), ομαλοποιήθηκαν και υπολογίζονται ως ποσοστά της τιμής για τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (100%), και φαίνονται οι μέσοι όροι ± τυπικές αποκλίσεις από τρία ανεξάρτητα πειράματα (* ρ & lt? 0,05). Ε και F:. Ανίχνευση φωσφορυλιωμένου ERK μετά την επεξεργασία του CaCo 2 κυττάρων με κύτταρα φλαβόνης Α και HCT116 με φλαβόνης Β με ανοσοφθορισμό

Η

αυξημένη έκφραση του φωσφόρου-c-Jun (S73) και ERK ήταν παρατηρήθηκε μετά από επεξεργασία των ελάχιστα διαφοροποιημένων κυττάρων ΜΙΑ PaCa και τον καρκίνο HCT116 με Flavone Β

Μια μέση αύξηση σε 190,19% του ενεργού ERK στον καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα ΜΙΑ PaCa (175,32% -204,08%? p = 0,0036? n = 3 ), και 160,23% σε κύτταρα κόλου HCT116 καρκίνο (144,99% -174,22%? ρ = 0.012? n = 3) παρατηρήθηκαν μετά από θεραπεία με φλαβόνης Β (σχήμα 3Β και 3D) σε σύγκριση με τους ελέγχους. Καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στα επίπεδα έκφρασης των unphosphosphorylated πρωτεΐνες αναλύθηκαν (Σχήμα 3Β). Αυτά τα αποτελέσματα ανοσοαποτυπώματος επιβεβαιώθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού και οι φωσφορυλιωμένες αποτελέσματα ERK παρουσιάζονται για HCT-116 κύτταρα (Σχ 3F). Επίσης παρατηρήθηκε αυξήθηκαν τα επίπεδα της φωσφορυλιωμένης μορφής του c-Jun (S73) σε ΜΙΑ PaCa στο 170,83% από τα επίπεδα ελέγχου (162,27% -181,90%? P = 0,0008? N = 3), και HCT116 σε 271,34% (222,95 % -312,93%? p = 0,0028? n = 3), όπως φαίνεται στο Σχ 3Β και 3D

Flavone Β έχει ανόμοια αποτελέσματα επί PS6 σε ΜΙΑ PaCa και κυττάρων HCT116, αλλά δεν έχει καμία επίδραση στην φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ

Μετά την κατεργασία των κυττάρων ΜΙΑ PaCa με φλαβόνη Β, τα μέσα επίπεδα του PS6 μειώνονται σε 51,68% (19,95% -77,77%? p = 0,0237? η = 3) έναντι του ελέγχου, όπως φαίνεται στο Σχ 3D. Αντιστρόφως, μετά την επεξεργασία των κυττάρων HCT116, μία αύξηση 149,88% (136,54 – 170,22? Ρ = 0,0116? N = 3) παρατηρείται, σε σύγκριση με τους ελέγχους. Τα επίπεδα έκφρασης του φωσφοσερίνης 473 ΑΚΤ, ήταν αμετάβλητη μετά την επεξεργασία της ΜΙΑ PaCa και HCT116 κυττάρων με φλαβόνης Β όπως φαίνεται στο Σχ 3Β και 3D.

Flavone Α ρυθμίζει φωσφορυλίωση της Bad στην σερίνη 112 αλλά όχι φλαβόνης Β

Για να διερευνηθούν περαιτέρω οι διαφορές των κυτταρικών επίδραση της φλαβόνης Α και Β φλαβόνη, η κατάσταση φωσφορυλίωσης του Bad στη σερίνη 112 μελετήθηκε. Κυτταρικές σειρές Panc-28 και Caco-2 δόσεις με flavone έκθεμα μια μείωση στη φωσφορυλιωμένη BAD στη σερίνη 112 (Σχήμα 4Α). Αυτή η μείωση είχε μέσο όρο του 35,91% (34,21% -37,61%? P = 0,006? Η = 3) σε Panc-28, και 57,03% (42,12% -71,62%? P = 0,0068? Η = 3) σε Caco-2 κύτταρα (σχήμα 4Γ). Αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώθηκαν μέσω ανοσοφθορισμού για Panc-28 όπως φαίνεται στο Σχ 4Ε. Αντιστρόφως, η δοσολογία ΜΙΑ PaCa-2 και HCT116 ογκογόνα κύτταρα με 40 μΜ της φλαβόνης Β παρήγαγε καμία σημαντική αλλαγή στο συνολικό ποσό των φωσφορυλιωμένων BAD στη σερίνη 112, όπως φαίνεται με κηλίδα western (Σχήμα 4Β και 4D) και ανοσοφθορισμού για ΜΙΑ Paca-2 ( Σχήμα 4F). Ενώ δεν υπάρχει καμία σημαντική αλλαγή που παρατηρείται στα επίπεδα έκφρασης του μη φωσφορυλιωμένου BAD καλύτερη διαφοροποιημένα κύτταρα (Σχήμα 4Α), μια μικρή αύξηση παρατηρείται στα ελάχιστα διαφοροποιημένα κύτταρα (Σχήμα 4Β)

Α και Β:. Ανίχνευση η απώλεια της φωσφορυλίωσης της BAD με ανοσοαποτύπωση των συνολικών εκχυλίσματα SDS. Καλύτερα διαφοροποιημένη Panc 28 και CaCo 2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 40 μΜ του φλαβόνης Α (+ Α), και κακώς διαφοροποιημένο ΜΙΑ PaCa και HCT116 κυττάρων με φλαβόνης Β (+ Β), ή DMSO (-) του οχήματος διάλυση. Μετά τη λύση και SDS-PAGE, μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με ένα αντίσωμα ειδικό για φωσφορυλιωμένη BAD στην σερίνη 112 ή την μη φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν και πάλι για ακτίνη ως έλεγχο φόρτισης. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Γ και Δ: Για τον ποσοτικό προσδιορισμό (γραφικές παραστάσεις) οι πυκνότητες μπάντα από τα επεξεργασμένα /μη επεξεργασμένα όροι προσδιορίζονται με (+) ή (-), ομαλοποιήθηκαν και υπολογίζονται ως ποσοστά της τιμής για τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (100%), και φαίνονται οι μέσοι όροι ± τυπικές αποκλίσεις από τρία ανεξάρτητα πειράματα (* ρ & lt? 0,05). Ε και F: Ανίχνευση φωσφορυλιωμένου BAD στην σερίνη 112 (κόκκινο κανάλι), μετά την επεξεργασία των Panc 28 κυττάρων με κύτταρα ΜΙΑ PaCa με φλαβόνης Β με ανοσοφθορισμό φλαβόνης Α και. DAPI (μπλε κανάλι) χρησιμοποιήθηκε για να εντοπίσετε το πυρήνες.

Η

Flavone Α μπορεί να προκαλέσει απόπτωση μέσω της κασπάσης 9

Για να προσδιορίσετε αν κασπάσης 9 συμμετέχει στην αποπτωτική καταρράκτη ξεκίνησε από flavone Α, Caco-2 και Panc28 κύτταρα δοσολογήθηκαν και αναλύθηκαν με SDS PAGE ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδα για την παρουσία διασπασμένου θραύσματα 37 και 17 kDa με ένα αντίσωμα ικανό να ανιχνεύει την ενεργοποιημένη κασπάση. Το σχήμα 5Α δείχνει μια αντιπροσωπευτική ανοσοκηλίδα Caco-2, και το Σχήμα 5Β για κύτταρα Panc28 των κυτταρολυμάτων που λαμβάνονται σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά τη δοσολόγηση με φλαβόνης Α Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές εμφανίζουν τα μεγάλα θραύσματα, 37 και 35 kDa, που ανιχνεύεται από το αντίσωμα (Σχήμα 5Α και 5Β). Το θραύσμα 37 kDa είναι προφανές στον έλεγχο (κύτταρα δοσολογήθηκαν με όχημα) υποδηλώνοντας την απορρύθμιση της πρωτεΐνης σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές. Ωστόσο, μια προοδευτική μείωση του επιπέδου της έκφρασης του προκασπάσης 9 (47kDa) είναι εμφανής αρχίζοντας 3 ώρες μετά τη χορήγηση της δόσης.

Ανίχνευση της ενεργοποιημένης κασπάσης 9 με ανοσοστύπωμα του SDS εκχυλισμάτων Α CaCo 2 και Β Panc 28 κύτταρα 1,5, 3, 6, 9 και 12 ώρες (διαδρομές 2-6) μετά από θεραπεία με φλαβόνης Α ή όχημα (DMSO) για τον έλεγχο (C, διαδρομή 1) και SDS-PAGE. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με ένα αντίσωμα ικανό να ανιχνεύει τόσο την προκασπάσης (47 kDa) και τα μεγάλα θραύσματα που προέκυψε μετά την ενεργοποίηση (37 και 35 kDa). Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν και πάλι για ακτίνη ή τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν και πάλι για ακτίνη ή τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Flavone Β ούτε φωσφορυλιώνουν c-Jun σε θρεονίνες 91 και 93 ούτε ενεργοποιούν κασπάσες 8 και 10 σε HCT 116 ή κύτταρα ΜΙΑ PaCa

για να επιβεβαιωθεί η ενεργοποίηση φλαβόνη Β του αποπτωτικού προγράμματος μέσω της εξωγενούς οδού, χωρίς τη συμμετοχή της ενδογενούς οδού, μελετήσαμε μορφές φωσφορυλίωση του c-Jun σχετικά με την εμπλοκή των μιτοχονδρίων μέσω της διάσπασης κασπάσης 8 [25, 26]. HCT 116 και κύτταρα ΜΙΑ PaCa δοσολογήθηκαν με φλαβόνης Β δεν δείχνουν ενεργοποίηση της c-Jun επί θρεονινών 91 και 93 όπως φαίνεται στο Σχ 6Α μέσω ανοσοφθορισμού σε HCT 116 κύτταρα. Μαστού καρκινικά κύτταρα SKBR3 δοσολογήθηκαν με ταμοξιφένη, ένας θετικός έλεγχος για αυτήν την ενεργοποίηση [27], υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον ίδιο τρόπο όπως περιγράφηκε παραπάνω (Σχήμα 6Β). Αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωση όπως φαίνεται στο Σχ 6C. Εξέταση της κατάστασης ενεργοποίησης των κασπασών 8 και 10 σε αυτά τα κύτταρα μετά από θεραπεία με φλαβόνης Β δεν έδειξαν διάσπαση αυτής της πρωτεΐνης είτε στην HCT 116 ή τα κύτταρα ΜΙΑ PaCa. Αυτό είναι εμφανές από την παρουσία των μη διασπασμένης κασπασών σε διαφορετικά χρονικά σημεία που εκτείνεται από 1.5-12 ώρες. Αντιπροσωπευτικά ανοσοστυπώματα των πειραμάτων χρονικής πορείας για κασπάσες 8 και 10 σε HCT τα 116 κύτταρα που φαίνεται στο Σχ 6D και 6Ε αντίστοιχα.

Α και Β ανοσοφθορισμού των κατεργασμένων κυττάρων δείχνουν έκφραση φωσφο-c-Jun (T91 /Τ93 ) σε κύτταρα SKBR3 (πράσινο κανάλι), αλλά όχι σε κύτταρα HCT116. DAPI (μπλε κανάλι) χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό των πυρήνων. Γ Ανοσοστύπωμα φωσφο-c-Jun (T91 /T93) χρησιμοποιώντας SDS εκχυλισμάτων ελάχιστα διαφοροποιημένων κυττάρων HCT116 σε επεξεργασία με 40 μΜ του φλαβόνης Β (+ Β), ή η διάλυση όχημα DMSO (-). SDS προϊόντα λύσης από κύτταρα SKBR3 σε επεξεργασία με 10 μΜ ταμοξιφένη (+) χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. Μετά SDS-PAGE, μεμβράνες νιτροκυτταρίνης ανιχνεύτηκαν με ένα αντίσωμα ειδικό για αυτή τη φωσφορυλιωμένη μορφή. D. Ανίχνευση της κασπάσης 8 με ανοσοστύπωμα του SDS προϊόντων λύσης των κυττάρων HCT116 1,5, 3, 6, 9 και 12 ώρες (διαδρομές 2-6) μετά από θεραπεία με φλαβόνης Β ή όχημα (DMSO) για τον έλεγχο (C, διαδρομή 1) και SDS-PAGE. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με ένα αντίσωμα ικανό να ανιχνεύει τόσο την προκασπάσης (54/55 kDa) και τα θραύσματα που προέκυψε μετά την ενεργοποίηση (43 και 18 kDa). Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν και πάλι για ακτίνη ή τουμπουλίνης ως έλεγχος φόρτωσης. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Συζήτηση

Είχαμε προηγουμένως δείξει τη διαφορά αντινεοπλασματικά αποτελέσματα της φλαβόνες Α και Β για καρκίνους κύτταρα του μαστού (MCF7, SKBR3) , του παχέος εντέρου (Caco-2, HCT116), του παγκρέατος (Panc 28, ΜΙΑ PaCa), και του προστάτη (LnCaP, PC3) με ανόμοια κατάστασης διαφοροποίησης. Οι φλαβόνες εξήχθησαν από το

G

.

elegans

και

Μια

.

bogotensis

, φυτά με φαρμακευτικές ιδιότητες, όπως ότι έτσι χρησιμοποιούνται indistinctively σύμφωνα με εθνοβοτανικής μελέτες. Ωστόσο, οι φλαβόνες δεν είναι αποκλειστικά για αυτά τα είδη. Flavone Α έχει βρεθεί σε

Ainsliaea henryi

[28] και

decumbens Helichrysum [29]

ενώ flavone Β έχει απομονωθεί από το

Helichrysum graveolens

[30], όπως καθώς και

Helichrysum odoratissimum

[31], και

Helichrysum compactum

[32]. Φλαβόνες Α και Β έδειξαν μια σημαντική κυτταροτοξική δράση κατά της υψηλής ογκογόνες κυτταρικές σειρές, ενώ διαφυλάσσει φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα. Συγκεκριμένα, flavone Α επέδειξε υψηλή κυτταροτοξικότητα ενάντια στην πιο διαφοροποιημένα Panc28 και κυττάρων Caco-2, ενώ φλαβόνης Β έδειξαν μια προτίμηση για πτωχά διαφοροποιημένο ΜΙΑ PaCa, HCT 116 και κύτταρα SKBR3 [20]. Κυττάρων διπλασιασμού του χρόνου, και η παρουσία ειδικών δεικτών διαφοροποίησης και την πολικότητα χρησιμοποιούνται για να καθορίσουν την κατάσταση κυτταρικής διαφοροποίησης. Μεταξύ των κυττάρων που εξετάσαμε, Panc28 έχει περιγραφεί προηγουμένως ως ελάχιστα διαφοροποιούνται κυρίως λόγω της απουσίας των δεικτών πολικότητας παρούσα σε άλλες κυτταρικές γραμμές παγκρεατικού όπως Capan-1, παρά το γεγονός ότι έχει μια αρκετά μακρά κύτταρο διπλασιασμού του χρόνου. Ωστόσο, είναι η γενική συναίνεση που Panc 28 κύτταρα έχουν μια υψηλότερη κατάσταση διαφοροποίησης από κύτταρα ΜΙΑ PaCa [33], και τα αποτελέσματά μας προτείνουν ότι οι φλαβόνες μπορεί να είναι ευαίσθητα σε αυτή τη διαφορά. Για την καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού με τον οποίο κινείται η αποπτωτική πρόγραμμα από φλαβόνες Α και Β στα κύτταρα-στόχους τους, εκτιμήσαμε την επίδραση της κάθε flavone σε βασικά εξωγενή και ενδογενή αποπτωτικών πρωτεϊνών της οδού, όπως ΕΚΚ, PS6, ΑΚΤ, BAD, και γ -Jun σε ενεργοποιημένες μορφές τους.

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Flavone Α μπορεί να διεγείρει απόπτωση σε καλύτερη διαφοροποιημένα παγκρέατος και του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα, μέσω της μιτοχονδριακής εσωτερικής οδού. Αυτό είναι εμφανές από τη μείωση στη φωσφορυλιωμένη ERK και S6 και την επακόλουθη απώλεια των ενεργοποιημένων BAD. Η φωσφορυλίωση κρατά BAD στο κυτταρόπλασμα, και τα αποτελέσματα απώλειας του στη σύνδεση και την αδρανοποίηση των πρωτεϊνών επιβίωσης Bcl-xL ή Bcl-2 μετά τη διέλευση της μιτοχονδριακής μεμβράνης [34] ενεργοποιώντας έτσι την απόπτωση. Μια σημαντική μείωση της φωσφορυλιωμένης BAD στην σερίνη 112 παρατηρείται σε καρκίνο του παγκρέατος Panc 28 και καρκίνο του παχέος εντέρου Caco-2 κυττάρων μετά από θεραπεία με φλαβόνης Α Η ενεργοποίηση του Bad στην σερίνη 112 διαμεσολαβείται από την οδό ΜΑΡΚ, ειδικά μέσω της ενεργοποίησης του RAS- Raf-ΕΚΚ [35]. Έτσι, η αναστολή της φωσφορυλιωμένης ERK και S6 που παρατηρείται μετά από αγωγή με φλαβόνη Α, θα μπορούσε να είναι ανάντη της απώλειας των ενεργοποιημένων BAD στη σερίνη 112 και η επακόλουθη έναρξη της απόπτωσης μέσω της διατάραξης της ακεραιότητας της μιτοχονδριακής μεμβράνης και απελευθέρωση του κυτοχρώματος C και άλλων αποπτωτικών παράγοντες. Τα γεγονότα αυτά μπορεί να οδηγήσει στην ενεργοποίηση της κασπάσης 9 και τελεστή κασπασών. Ωστόσο, κασπάσες είναι ιδιαίτερα απορύθμιση στον καρκίνο μέσα από διάφορες μεταλλάξεις ή απώλεια της έκφρασης [36]. Στην περίπτωση της κασπάσης 9, αυτά είναι ασυνήθιστο, και είναι η κατάργηση των μετα μιτοχονδριακής λειτουργικές δραστηριότητες που ευνοούν την εξέλιξη του όγκου [37]. Αυτό μπορεί να συμβαίνει σε μας κασπάσης 9 αποτελέσματα, όπου ενεργοποιημένη κασπάση είναι παρούσα σε έλεγχο και τα επεξεργασμένα κύτταρα, το οποίο μπορεί να υποδηλώνουν απώλεια της αποπτωτικής λειτουργίας. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η εξασθενημένη μιτοχονδριακή ακεραιότητα μπορεί να προκαλέσει μια προεπιλεγμένη κασπάσης 9-ανεξάρτητο πρόγραμμα του κυτταρικού θανάτου [38]. Είτε η απόπτωση συμβαίνει ανεξάρτητα από δραστηριότητα κασπάσης 9 ή με τη δημιουργία ενός ευνοϊκού αναλογία δραστικών έναντι ανενεργών κασπάσης, όπως φαίνεται στα αποτελέσματα μας, παρουσιάζουμε αποδείξεις που υποστηρίζουν την ενεργοποίηση ενός ενδογενούς οδού. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας δείχνουν επίσης ότι ούτε η ΑΚΤ ούτε c-Jun εμπλέκονται στον προτεινόμενο μηχανισμό δράσης για Flavone Α

Αντιστρόφως, φλαβόνης Β προκαλεί απόπτωση σε πτωχά διαφοροποιημένα κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος και του παχέος εντέρου μέσω ενός εξωγενή οδό.