Αφηρημένο

Το γονίδιο του αντιγόνου του καρκίνου του προστάτη 3 (

PCA3

) είναι ενσωματωμένο σε ένα ιντρόνιο ενός δεύτερου γονιδίου

BMCC1

(Bcl2- /αδενοϊό Ε1Β δεκαεννέα kDa- Οι πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν 2 (B n ‘print-2) και Cdc42GAP ομολογία BCH μόριο που περιέχουν μοτίβο στο καρβοξυλο τερματική περιοχή 1), η οποία επίσης ρυθμίζεται αυξητικά στον καρκίνο του προστάτη. BMCC1 αρχικά περιγράφονται ως δύο γονίδια (

C9orf65 /κλαδέψετε

και

BNIPXL

) και στις δύο πλευρές του PCA3, αλλά τα στοιχεία μας υποδηλώνουν ότι αντιπροσωπεύει ένα μόνο γονίδιο που κωδικοποιεί για μια πρωτεΐνη υψηλού μοριακού βάρους. Εδώ δείχνουμε για πρώτη φορά την έκφραση ενός & gt? 300 kDa BMCC1 πρωτεΐνη (BMCC1-1) στον καρκίνο του προστάτη και κυτταρικές σειρές μελανώματος. Αυτή η πρωτεΐνη βρίσκεται αποκλειστικά στο κλάσμα μικροσωμάτων και εντοπίζεται σε κυτταροπλασματική κυστίδια. Παρατηρήσαμε επίσης έκφραση της πρωτεΐνης BMCC1 στα τμήματα του καρκίνου του προστάτη με τη χρήση ανοσοϊστολογία. GST pull down, μελέτες ανοσοκαταβύθισης και την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης φασματομετρία μάζας εντοπίστηκαν πολλά μέλη του προσαρμογέα Σχετικά Complex 2 (ΑΡ-2) ως BMCC1 αλληλεπιδρούν. Συνεπής με ένα ρόλο για BMCC1 ως ΑΡ-2 πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης ενδοσωμιακό, BMCC1 συν-εντοπισμένη με β-adaptin στην περιπυρηνική περιοχή του κυττάρου. BMCC1 έδειξε επίσης μερική συν-εντόπιση με τις αρχές του ενδοσώματος μικρή GTP-ase Rab-5 καθώς και η ισχυρή συν-εντοπισμός με εσωτερικευμένες παλμού επισημανθεί τρανσφερίνης (Tf), παρέχοντας ενδείξεις ότι BMCC1 εντοπίζεται σε λειτουργική ενδοκυτταρικά κυστίδια. BMCC1 νοκ ντάουν δεν επηρέασε την πρόσληψη Tf και AP-2 νοκ ντάουν δεν διασκορπίζονται BMCC1 φυσαλιδώδη διανομής, με εξαίρεση έναν ουσιαστικό ρόλο για BMCC1 σε κανονική AP-2 με τη μεσολάβηση ενδοκυτταρικής πρόσληψης. Αντ ‘αυτού, εμείς θέτουμε ένα νέο ρόλο για BMCC1 στην μετα-ενδοκυτταρικής διακίνησης. Αυτή η μελέτη παρέχει θεμελιώδεις χαρακτηρισμό του συγκροτήματος BMCC1 στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη και για πρώτη φορά εμπλέκει στη διακίνηση κύστη

Παράθεση:. Harris JL, Richards RS, Chow CWK, Lee S, M Kim, Buck Μ, et al. (2013) BMCC1 Είναι ένα AP-2 Associated ενδοσωματιακής πρωτεΐνης στα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 8 (9): e73880. doi: 10.1371 /journal.pone.0073880

Επιμέλεια: Gnanasekar Munirathinam, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5, Φεβρουαρίου, 2013? Αποδεκτές: 23, Ιουλίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 6η Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Harris et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από το Ίδρυμα Καρκίνου του προστάτη της Αυστραλίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του προστάτη είναι μια ευρέως διαγνωστεί κακοήθεια και η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Αυτή η κατάσταση παρουσιάζει ένα ευρύ φάσμα των ιστολογικών αλλαγών και συμπεριφορές, που κυμαίνονται από προκαρκινικές αλλοιώσεις, σε εντοπισμένη καρκίνους προστάτη που ακολουθούν μια νωχελικός πορεία σε ένα ποσοστό των καρκίνων που μεταστάσεις νωρίς και προόδου ταχέως [1]. Ως εκ τούτου, εκτός από την ανάπτυξη βελτιωμένων διαγνωστικά και προγνωστικά εργαλεία, απαιτείται λεπτομερής κατανόηση της κυτταρικής βιολογίας της ανάπτυξης και εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη. Μια από τις πιο υποσχόμενες βιοδείκτες για τον καρκίνο του προστάτη είναι η μη-κωδικοποίησης ΚΝΑ PCA3 [2,3]. Αυτό το RNA ταυτοποιήθηκε ως βιοδείκτη καρκίνο του προστάτη με διαφορική ανάλυση της οθόνης του RNAs από ιστολογικά φυσιολογικό και κακοήθη ιστό από τους ίδιους ασθενείς, και περιγράφηκε αρχικά ως Differential Display κλώνου 3 (DD3) [2]. Τα υψηλά επίπεδα έκφρασης PCA3 στενά με κακοήθη μετασχηματισμό του επιθηλίου του προστάτη, όμως, η βιολογική βάση για αυτή την συσχέτιση δεν έχει διευκρινιστεί [2-4].

προηγουμένως αποδειχθεί ότι

PCA3

είναι ενσωματωμένη στο ιντρόνιο ενός άλλου γονιδίου,

BMCC1

[5].

BMCC1

αρχικά περιγράφονται ως δύο διακριτά γονίδια

c9orf65 /κλαδέψετε

(κωδικοποίηση για την περιοχή Ν-τερματικό) και

BNIPXL

(κωδικοποίηση για την περιοχή C-τερματικό). Ένα

BNIPXL

(

BMCC1-4

) ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης που προσδιορίζονται από έρευνα σε βάσεις δεδομένων για τα ομόλογα με την Bcl-2 πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης B n ‘print-2 [6]. Οι συγγραφείς προσδιορίζονται

BNIPXL /BMCC1-4

ως ένα γονίδιο με μια περιοχή υψηλής

B n ‘print-2

ομολογία, και πήρε το όνομά της ομόλογη περιοχή η ΟΕΒ (B n’ print-2 /Cdc42GAP ομολογίας) τομέα [ ,,,0],6]. Χρησιμοποιώντας εξωγενώς εκφράζονται πρωτεΐνες με ετικέτα BNIPXL, που απέδειξε ότι αλληλεπιδρά με RhoA και ενεργοποιητή του πρωτο-Lbc [6]. μελέτες συν-έκφραση και αλληλεπίδρασης έδειξαν ότι BNIPXL δεσμεύει RhoA και πρωτο-Lbc μέσω διαφορετικών περιοχών και ότι εμποδίζει την έκφραση BNIPXL RhoA σηματοδότησης, τουλάχιστον εν μέρει, αναστέλλοντας τη διεγερτική RhoA-Lbc αλληλεπίδραση [6]. Machida et al. [7] εντόπισε πλέον ισομορφή του BMCC1 σε ανθρώπινο νευροβλάστωμα (BMCC1-3), η οποία διήρκεσε κωδικοποίησης εξώνια 7-19 του αργότερα ταυτίστηκε BMCC1-1. Υψηλά επίπεδα έκφρασης αυτού του μεταγραφήματος συσχετίστηκαν με ευνοϊκότερη πρόγνωση για αυτόν τον καρκίνο. Αποδεικτικά στοιχεία για την έκφραση του πλήρους μήκους BMCC1-1 μεταγραφή που εκτείνεται το

c9orf65

και

BNIPXL

γονιδίων που παρέχονται από Iwama et al. [8], οι οποίοι κλωνοποίησαν ένα πλήρους μήκους cDNA από κύτταρα HeLa. Σε αυτή τη μελέτη και στη συνέχεια, έχουν BMCC1 μεταγραφές έχουν ανιχνευθεί σε περιορισμένες περιοχές του εγκεφάλου ποντικού [8,9]. Clarke et al. [5] έδειξαν ότι η έκφραση RNA BMCC1 είναι αυξημένη σε καρκίνο του προστάτη και μεταστάσεις σε σύγκριση με καλοήθη ιστό, υποδεικνύοντας ότι BMCC1 μπορούν να λειτουργούν διαφορετικά σε διαφορετικές μορφές καρκίνου και τύπους ιστών. Μια επισκόπηση της έκφρασης ισόμορφου BMCC1 και τις διάφορες λειτουργίες του τομέα BCH που περιέχουν πρωτεΐνες παρέχεται σε πρόσφατες δημοσιεύσεις [10,11].

Αρχικό ταυτοποίηση μιας πρωτεΐνης που αντιστοιχεί σε BMCC1-1 αποδείχθηκε με Iwama et al. [8]. Η ομάδα αυτή έθεσε ένα αντίσωμα ειδικό για την ακραία περιοχή Ν-τερματικό της BMCC1-1, και αν και πολλαπλές ζώνες ανιχνεύθηκαν με Western blot των Hela MR, ΗΕΚ293Τ και KNS81 κύτταρα γλοιώματος, μόνο μπάντες & gt? 250 kDa ήταν ευαίσθητα σε συγκεκριμένα siRNA εξάντληση. φασματομετρία μάζας χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει αυτά τα υψηλού μοριακού βάρους ζώνες, όπως BMCC1-1. Στην ίδια μελέτη, η έκφραση της εξωγενούς πρωτεΐνης από ένα κλώνο cDNA που παράγεται επίσης πολλαπλές ζώνες σε SDS-PAGE, πιθανώς υποδεικνύοντας σημαντική πρωτεόλυση, καθιστώντας ερμηνεία δύσκολη. Πιο πρόσφατα, Li et al. [12] προσδιορίζονται olfaxin πρωτεΐνες που αντιστοιχούν σε εναλλακτικές θέσεις έναρξης μεταγραφής BMCC1 εκφράζονται στο οσφρητικό βολβό, με την κυρίαρχη ζώνη στα 52 kDa. Arama et al. [11] ανιχνεύεται μία ζώνη του ίδιου μεγέθους σε προϊόντα λύσης ολικού εγκεφάλου και καλλιεργημένων νευρώνων και αστροκυττάρων, τα οποία ονόμασαν BMCC1s. Στην παρούσα μελέτη, η έκφραση και αρχικό χαρακτηρισμό μιας ενιαίας 340 kDa BMCC1 πρωτεΐνη στην κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη LNCaP περιγράφεται. Η ταυτότητα αυτής της πρωτεΐνης ήταν εύρωστα συστάθηκε με ανίχνευση με διάφορα αντισώματα να C- και Ν-τερματικές περιοχές της πρωτεΐνης, την εξάντληση από ειδικές siRNA και υποστηρίζεται από τις αναλύσεις MALDI TOF /TOF. Για πρώτη φορά, εντοπίσαμε ενδογενή αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών που περιλαμβάνουν μια περιοχή εκτός του τομέα ΟΕΒ. Βρήκαμε ότι μια περιοχή BMCC1 χωρίς υπολογιστικά αναγνωρίσιμες λειτουργικές περιοχές αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη προσαρμογέας συγκρότημα 2 (ΑΡ-2). Δείξαμε επίσης συν-εντοπισμό των BMCC1 με β-adaptin και διάφορες ενδοσωμιακό δείκτες, συμπεριλαμβανομένων Rab5 και εσωτερικεύονται τρανσφερρίνη (Tf). Προκαταρκτική λειτουργικές αναλύσεις υποδεικνύουν BMCC1 είναι ένα μη-κανονικό AP-2 αλληλεπιδρούν πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην μετα-ενδοκυτταρικής διακίνησης.

Υλικά και Μέθοδοι

ιστούς και κυτταρικές σειρές

Ανθρώπινοι ιστοί του προστάτη δωρίθηκαν από τους ασθενείς στο Royal Brisbane Hospital με τη γραπτή συγκατάθεση δυνάμει ηθική έγκριση του Ινστιτούτου Queensland για την επιτροπή ανθρώπινη ηθική Ιατρικής Έρευνας. έχουν ασθενή μορφές συγκατάθεσης έχουν διατηρηθεί. ιστούς ποντικού ελήφθησαν από α5 μηνών άγριου τύπου αρσενικό BalbC ποντίκι, υπό ηθική έγκριση του Queensland Institute for Medical Research (QIMR) επιτροπή δεοντολογίας των ζώων. LNCaP, 22Rv1, DU145, RWPE1, ALVA, PC3 και MCF-7 ελήφθησαν από την ATCC. Α11, D11, D28, D33 και D38 ήταν δώρα από το εργαστήριο Chris Schmidts (QIMR). Αυτά ελήφθησαν από ασθενείς που συμμετείχαν στις κλινικές δοκιμές σε QIMR, με τη γραπτή συγκατάθεση από την επιτροπή έρευνας για τα ανθρώπινα ηθικής QIMR. Μια μελέτη μικροσυστοιχίας στην κυτταρικές γραμμές Α11 και D11 έχει δημοσιευτεί [13], όπως έχει κλινική μελέτη σχετικά με τους ασθενείς σειράς D [14]. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Gibco) με πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη, συμπληρωμένο με 10% θερμοαπενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (Gibco).

RNA Εκχύλιση και cDNA Synthesis

Ολικό RNA από κυτταρικές γραμμές και ιστών καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Αυτό το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας Superscript III (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

PCR και δημιουργία κλώνων cDNA

κλώνων cDNA του BMCC1 και άλλων γονιδίων δημιουργήθηκαν με ενίσχυση του ο στόχος από LNCaP cDNA. Τα ολιγονουκλεοτίδια αγοράστηκαν από την Sigma Aldrich, πρότυπο ενισχύσεις PCR wth

Pfu Turbo

(Roche). Τυπικές συνθήκες κύκλου ήταν 92 ° C 2 λεπτά ακολουθούμενη από? 92 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 90 sec /kb (2 κύκλοι)? 92 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 57 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 90 sec /kb (2 κύκλοι)? 92 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 53 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 72 ° C για 90 sec /kb (30 κύκλοι). Όλα Q-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Corbett Rotorgene-6000 (Qiagen, Αυστραλία), Rotorgene-6000 Series Software (Qiagen, Australia) και Kit Quantitect® SYBR® Πράσινη PCR (Cat. Νο 204143, Qiagen, Αυστραλία). Οι αντιδράσεις προετοιμάστηκαν εις τριπλούν και κάθε περιείχε 7.5μΙ των qPCR κύριο μείγμα, 0.5 μΐ της κάθε 10μΜ προς τα εμπρός και αντίστροφο εκκινητή και 5 μl αραιωμένου cDNA (αραίωση 1:10). προϋπόθεση ποδηλασία για BMCC1 και β

2Μ εκκινητές ήταν ως εξής: 95 ° C για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από 45 κύκλους των 95 ° C για 20 δευτερόλεπτα, 58 ° C για 20 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 20 sec. Οι συνθήκες κύκλων για AP2M1 εκκινητές ήταν ως εξής: 95 ° C για 15 λεπτά, ακολουθούμενη από 45 κύκλους των 95 ° C για 20 δευτερόλεπτα, 60 ° C για 20 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 20 sec. Τα δεδομένα δημιουργήθηκαν με τη Rotorgene-6000 Series Λογισμικό και τα σχετικά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας μεθοδολογία που περιγράφεται στην Pfaffl [15]. Οι αλληλουχίες των εκκινητών και θέσεις περιορισμού που αναφέρονται στο συμπληρωματικό υλικό (Πίνακας S1). Όλα τα ένζυμα περιορισμού αγοράστηκαν από την ΝΕΒ.

έκφραση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης, ο καθαρισμός και διασυνδέσεως

Η ανασυνδυασμένη έκφραση και καθαρισμό πρωτεΐνης και εγκάρσια σύνδεση διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]

αντισώματα.

η ανασυνδυασμένη BMCC1-GST πρωτεΐνες σύντηξης εκφράστηκαν και καθαρίστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα αντισώματα κουνελιού Ab-1 και Ab-3 παρήχθησαν με ένεση κουνελιών με εκλουσμένο, μη μετουσιωμένες πρωτεΐνες σύντηξης GST (χρησιμοποιώντας το Ινστιτούτο Ιατρικής και Κτηνιατρικής Επιστήμης, πρότυπο ρυθμού δόσης Adelaide, το χρονοδιάγραμμα και πρόσθετα). BMCC1 Ab-2 αντιορό δημιουργήθηκε με εμβολιασμό ενός κουνελιού με μετουσιωμένη πρωτεΐνη σύντηξης GST ενσωματωμένα σε μη σταθερά φέτες πηκτής πολυακρυλαμιδίου (ΙΜΥδ). BMCC1 αντιορός προβάτου παράχθηκε με εμβολιασμό ενός προβάτου με εκλουσμένο μη μετουσιωμένη πρωτεΐνη σύντηξης BMCC1-GST (ΙΜΥδ) (Ab-4). Όλες οι πρωτεΐνες είχαν Ν-τερματικό ετικέτες GST όταν εμβολιάζεται και οι ειδικές αλληλουχίες BMCC1 για κάθε αντίσωμα λεπτομερώς στον πίνακα S1. Ειδικά αντισώματα και μη-ειδικά αντισώματα ελέγχου καθαρίστηκαν από ορό όπως περιγράφεται [16].

Εμπορικά αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε αυτό το έργο ήταν ποντικού αντι-DNA PKcs (Santa Cruz προϊόν 18-2), ποντίκι αντι- RNA πολυμεράση II (Abcam, ab5408), κουνελιού αντι-β-adaptin (η οποία ανιχνεύει το ΑΡ-1Β1 και ΑΡ-2Β1) (Santa Cruz Α-5), ποντικού αντι-EEA1 (BD Transduction Laboratories, 610457), ποντικού αντι-α-τουμπουλίνης (Sigma T9026) και αντι-GAPDH ποντικού (Millipore MAB374). Κατάλληλες Alexafluor συζευγμένα γαϊδάρου δευτερογενή αντισώματα ελήφθησαν από την Invitrogen και HRP συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα ήταν από τη Sigma.

πλασμιδίου και siRNA διαμόλυνση

LNCaP τοποθετήθηκαν σε 6 πιάτα καλά σε αντιβιοτικό μέσο χωρίς αύξηση τουλάχιστον 48 h πριν από την επιμόλυνση. Τα πλασμίδια επιμολύνθηκαν σε LNCaP χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (2 μg του πλασμιδίου και 5 μί Λιποφεκταμίνης 2000 ανά 9,5 cm

2 καλά). siRNA δίπολα αγοράσθηκαν από την Invitrogen (αλληλουχίες στον Πίνακα S1) και επιμολύνθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX ή Lipofectamine 2000 (100 pmol του siRNA διπλής όψης και 5 μί Λιποφεκταμίνης ανά 9,5 cm

2 καλά).

Δημιουργία κυτταρικών και προϊόντα λύσης ιστού

τα κύτταρα αποκολλήθηκαν από το υπόστρωμα της ανάπτυξης τους με θρυψινοποίηση σε DMEM χωρίς ορό με 0.025% θρυψίνη (Gibco), και θρυψίνη αδρανοποιήθηκε με προσθήκη DMEM που περιέχει 10% ορό. Τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση (500 χ g για 5 λεπτά) και πλύθηκαν δύο φορές σε PBS. Τα πλυμένα κυτταρικά ιζήματα μετά υποβλήθηκαν σε λύση σε παγωμένο κυττάρων θηλαστικών ρυθμιστικού λύσης (MCLB, 50 mM Tris ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% ΝΡ-40). Όλα τα λύματα περιέχουν μια συγκέντρωση 2 χ Ολοκληρωμένων αναστολέα πρωτεάσης EDTA χωρίς Roche. Προσεκτικό πλύσιμο για την απομάκρυνση θρυψίνη κυτταρική καλλιέργεια και την προσθήκη μιας υψηλής συγκέντρωσης των αναστολέων πρωτεάσης είναι

κρίσιμη

για τον εντοπισμό μη υποβαθμισμένου BMCC1, η οποία κατά τα άλλα είναι υπόκειται σε ταχεία πρωτεόλυση. Προϊόντα λύσης ιστού παράχθηκαν με ομογενοποίηση σε MCLB, με άλεση σε ένα μέγεθος Kontes 22 εσμυρισμένο Dounce ομογενοποιητή. Κυττάρων και ιστών προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση (17000 χ g για 20 λεπτά στους 4 ° C). λύματα των ιστών του εγκεφάλου υποβλήθηκαν σε πρόσθετη επεξεργασία για να αφαιρέσει ένα στρώμα που επιπλέει λιπιδίων. Προϊόντα λύσης ιστού εγκεφάλου διαχωρίστηκαν στους Biorad Micro Biospin στήλες χρωματογραφίας αφαλάτωση που είχε προ-εξισορροπηθεί με MCLB, το οποίο απομακρύνεται κολλώδες αδιάλυτο υλικό. Οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία πρωτεΐνης Biorad, Lowry με πρότυπα BSA.

κηλίδωση Western

Δείγματα σε Laemelli ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης SDS-PAGE υποβλήθηκαν σε τυπική SDS-PAGE. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη της Amersham σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς (6 g βάσης /L Tris, 3 g /L γλυκίνη, 0.36 g /L SDS, 20% μεθανόλη) για 100 ν.Η. Οι μεμβράνες μπλοκαρίστηκαν σε διάλυμα αποκλεισμού (PBS-0,05% Triton-Χ100 με 5% BSA ή PBS /0.07% Tween 20 με 4% αποβουτυρωμένο γάλα σε σκόνη). Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας μεταξύ 0,2 και 5 ng /μL από τα υποδεικνυόμενα αντισώματα σε διάλυμα αποκλεισμού σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 2 ώρες ή στους 4 ° C επί μία νύκτα και ανιχνεύτηκαν χρησιμοποιώντας συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα και αντιδραστήριο λουμινόλης Western Lightning (Pierce).

Ανοσοκαταβύθιση και GST pulldowns

τα κυτταρολύματα παράχθηκαν όπως περιγράφηκε παραπάνω. Για ανοσοκαταβύθιση, τα κυτταρολύματα επωάζονται με καθαρισμένη μηδενική ή αντισώματα BMCC1 (0.5-2 μg αντισώματος ανά mg του προϊόντος λύσης) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. σύμπλοκα BMCC1-αντισώματος καταβυθίστηκαν με προσθήκη ρητίνης αγαρόζης πρωτεΐνης G για 2 ώρες στους 4 ° C. Για pulldowns GST, προϊόντα λύσης επωάστηκαν με πρωτεΐνη σύντηξης BMCC1-GST διασυνδεδεμένη ρητίνη σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, οι μη δεσμευμένες πρωτεΐνες πλύθηκαν από την ρητίνη σε 3 χ 20 πλύσεις όγκος κλίνης ψυχρού ρυθμιστικού λύσης. Καταβυθισμένες πρωτεΐνες εκλούστηκαν με προσθήκη 2 όγκων κλίνης ρητίνης του ρυθμιστικού φόρτωσης SDS-PAGE. Οι εκλουσμένες πρωτεΐνες στη συνέχεια αναλύθηκαν με SDS-PAGE και κηλίδωση Western.

Φασματομετρίας Μάζας

Silver χρώση τεμάχια πηκτώματος αποχρωματίζονται σε 15 mM σιδηρικυανιούχο κάλιο και 50 mM θειοθειικό νάτριο και πλύθηκε με νερό. Κομμάτια αφυδατώθηκαν σε 25 mM διττανθρακικού αμμωνίου /50% ακετονιτρίλιο και ξηραίνεται υπό κενό. Είχαν διαδοχικά σε αναγωγή και αλκυλίωση με 25mM DTT και 55mm ιωδοακεταμίδιο, τόσο σε 25mM όξινο ανθρακικό αμμώνιο. κομμάτια Gel αφυδατώθηκαν σε 25 mM διττανθρακικού αμμωνίου /50% ακετονιτρίλιο και ξηραίνεται και πάλι. Αυτά στη συνέχεια επανυδατώθηκαν με 20ng /μL βαθμός αλληλούχισης τρυψίνη (Promega) σε 40 mM διττανθρακικού αμμωνίου /10% ακετονιτρίλιο, που ολοκληρώνεται έως αποτρέψει την ξήρανση και χωνεύεται επί μία νύκτα στους 37

° C. Τα πεπτίδια εκχυλίστηκαν με έκπλυση των κομματιών σε 0.1% TFA. Εκλούεται πεπτίδια αφαλατώθηκαν χρησιμοποιώντας C-18 ZipTips (Millipore) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα πεπτίδια στη συνέχεια αναμιγνύεται με MALDI μήτρα (Bruker) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Bruker Ultraflex σε θετικό τρόπο ιόντος ανακλαστήρα με ανοχή MS /MS 100 ppm. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε-σπίτι με τη χρήση μασκότ, ψάχνοντας κατά την θηλαστικών μη πλεονασματική βάση δεδομένων του 2012, επιτρέποντας την προεπιλεγμένη μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις και έως μία αποτυχημένη αποκοπής από θρυψίνη [17].

Καθαρισμός των μικροσωμάτων

LNCaP κύτταρα διαχωρίστηκαν σε πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα με douncing σε υποτονικό διάλυμα, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Μικροσώματα καθαρίστηκαν από κυτταροπλασματικό εκχύλισμα με υπερφυγοκέντρηση (100.000 χ g για 1 ώρα στους 4 ° C χρησιμοποιώντας έναν ρότορα Beckman SW55Ti). Τα μιτοχόνδρια επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης SDS (2% SDS, 1 mM DTT, 125mM Tris ρΗ 6.8) και εκκαθαρίζονται σε 17,000 χ g για 20 λεπτά. Η κυτοσόλη συμπυκνώθηκε στο ένα δέκατο του αρχικού του όγκου χρησιμοποιώντας μια 10Κ αποκοπής μονάδα φυγοκεντρικού φίλτρου (Millipore) πριν από SDS-PAGE.

ανοσοϊστολογική χρώση

Μία πρότυπη διαδικασία χρώσης ανοσοϊστοχημεία ακολουθήθηκε. ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές κόπηκαν σε 4 μm και τοποθετήθηκαν σε 5-αμινοπροπυλοτριαιθοξυσιλάνιο (AAS) επικαλυμμένο διαφάνειες, τα οποία στη συνέχεια αφήνονται να στεγνώσουν όλη τη νύχτα. Οι ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές αποκηρώθηκαν σε ξυλόλιο και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θέρμανση μικροκυμάτων στους 60 ° C για 20 λεπτά σε ένα διάλυμα κιτρικού οξέος (2.1 g /1000 ml? ΡΗ 6.0) για ανάκτηση αντιγόνου. Μετά τον αποκλεισμό της ενδογενούς υπεροξειδάσης, έκπλυση σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και μπλοκάρισμα της μη ειδικής δέσμευσης του δευτερογενούς αντισώματος με φυσιολογικό ορό χοίρου, εφαρμόστηκε ρουτίνα στρεπταβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης ανοσοχρώση με διαμινοβενζιδίνη. Οι τομές επωάστηκαν για μία νύχτα σε BMCC1 Ab-3. Το πρωτογενές αντίσωμα υποκαταστάθηκε με PBS στα τμήματα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες. Οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη Harris. Από BMCC1 είναι γνωστό ότι είναι θετικοί σε καλοήθη προστατική ιστούς, ένας πυρήνας προστατικού ιστού με καλοήθη υπερπλασία του συμπεριλήφθηκε ως θετικός έλεγχος σε κάθε ένα από συστοιχία.

Βαθμολόγηση της έκφρασης πρωτεΐνης BMCC1 μέσα στα κύτταρα των ιστών από τις 74 ασθενείς που μελετήθηκαν, βασίστηκε στην αναλογία των κυττάρων βάφονται με το πολυκλωνικό αντίσωμα BMCC1 και την ένταση της χρώσης εντός των κυττάρων. Ένταση χρώσης βαθμολογήθηκε στην ακόλουθη κλίμακα: αριθ χρώση, ήπια, μέτρια και ισχυρή. Όλα τα δείγματα αναλύθηκαν με μικροσκοπική εξέταση χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο της Olympus. (Μοντέλο: BX40), σε μεγέθυνση x200

ανοσοφθορισμού και μικροσκοπία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε στείρα καλυπτρίδες, τουλάχιστον 24 ώρες πριν στερέωση. Το μέσο αναρροφήθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά σε PBS πριν από τη διασύνδεση (σε PBS με 10% foramlin για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου). Το στερεωτικό αφαιρείται και τα κύτταρα πλένονται σε PBS πριν διαπερατότητας και αποκλεισμού σε PBS με 0,05% Triton-Χ100 και 5% FBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με μεταξύ 0,4 και 2 ng /μL των υποδεικνυόμενων πρωτογενών αντισωμάτων σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 2 ώρες ή στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Αντίστοιχου είδους καθαρισμένη IgG χρησιμοποιήθηκε ως κατάλληλο έλεγχο για αντισώματα διασταυρούμενη /προσρόφησης. Όλα τα αντισώματα ανιχνεύθηκαν με τη χρήση κατάλληλων 594 γαϊδάρου δευτερογενή αντισώματα Alexafluor488 ή Alexafluor. Συνεστιακή μικροσκοπία διεξήχθη επί Zeiss LSM710. Co-εντοπισμό προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας Zen λογισμικού 2011. Overlap συντελεστής /συντελεστής επικάλυψη μετά Manders, μια μέθοδο μη ευαίσθητη σε διαφορές στην ένταση του σήματος, χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση συν-εντοπισμό σε ζεύγη εικόνα.

τρανσφερίνης πρόσληψη

LNCaP σπάρθηκαν επάνω σε αποστειρωμένες καλυπτρίδες 24h πριν η επισήμανση. πρόσληψη Pulse-chase ενός συζευγμένου συμπλόκου τρανσφερίνης-υποδοχέα (Tf-R) εκτελέστηκε ουσιαστικά όπως περιγράφεται από Aschenbrenner et al. [18]. Εν συντομία, τα κύτταρα στερήθηκαν τον ορό σε μέσο ελεύθερο ορού (ελεύθερο ερυθρού φαινόλης DMEM-F12, Life Technologies) για 2 ώρες στους 37 ° C. Για επιφανειακά κύτταρα ετικέτα με συζευγμένα τρανσφερίνης, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πάγο για 30 λεπτά, στη συνέχεια επωάζονται με 20 μg /ml Alexafluor-594 συζευγμένο τρανσφερίνης (Molecular Probes) αραιωμένο σε μέσο ελεύθερο παγωμένου ορού για 30 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με μέσο ελεύθερο παγωμένο ορό για απομάκρυνση αδέσμευτων τρανσφερίνης και t = 0 καλυπτρίδες συλλέχθηκαν για BMCC1 ανοσοφθορισμό, όπως περιγράφηκε. Τα υπόλοιπα καλυπτρίδες εκδιώχθηκαν σε μέσο ελεύθερο προθερμασμένο ορού για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα πριν τη συγκομιδή. Πρόσληψη συζευγμένο σύμπλοκο τρανσφερίνης-υποδοχέα εκτελέστηκε επίσης χρησιμοποιώντας μία μέθοδο παρόμοια με Boucrot et al. [19]. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν μια φορά με DMEM-F12 /5% FCS στη συνέχεια επωάζονται για 10 λεπτά με 10 μΜ Alexafluor-594 συζευγμένο τρανσφερίνης σε DMEM-F12 /5% FCS. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλένονται με παγωμένο PBS πριν από τη συγκομιδή για ανοσοφθορισμό.

Αποτελέσματα

πρωτεΐνη BMCC1-1 εκφράζεται σε επιλεγμένες καρκίνους

hBMCC1

είναι ένα μεγάλο και πολύπλοκο μεταγραφική μονάδα, με την τακτική που χρησιμοποιείται βιοδεικτών του καρκίνου του προστάτη

hPCA3

ενσωματωμένο στο

BMCC1

ιντρόνιο 6.

BMCC1

έχει προηγουμένως σχολιασμένο ως διακριτές

PRUNE2

και

B n ‘print

γονίδια συνοδευτικά

PCA3

, με μελέτες που βασίζονται εξωγενή έκφραση που αντανακλά αυτό. Πρόσφατα αποτελέσματα έχουν δείξει ότι

BMCC1

παράγει μια μεταγραφή (συμβολίζεται BMCC1-1), η οποία εκτείνεται κατά μήκος του ενσωματωμένου αντίθετης φοράς

PCA3

γονίδιο [5,8]. Εδώ δείχνουμε ότι το BMCC1-1 RNA εκφράζεται σε δείγματα καρκίνου του προστάτη θετικά ιστού 10/10 PCA3 (Σχήμα S1).

Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι ο καρκίνος του προστάτη κυτταρική γραμμή LNCaP εκφράζει υψηλά επίπεδα τόσο BMCC1- 1 και PCA3 RNAs [5]. Την επέκταση αυτών των μελετών για την ενδογενή πρωτεΐνη BMCC1, δημιουργήσαμε αρκετές πολύκλωνα αντισώματα χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμό εξέφρασε θραύσματα BMCC1 σαν αντιγόνα (σχηματική στο σχήμα S2, κλωνοποίηση εκκινητών στον πίνακα S1). Αυτά τα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για να αποδείξουν ότι το

BMCC1

παράγει & gt? 300 kDa πρωτεΐνη σε LNCaP (Σχήμα 1). Το μέγεθος αυτής της πρωτεΐνης αντιστοιχεί σε εκείνη που προβλέπεται από τα cds BMCC1-1 και η μεταφρασμένη αλληλουχία του πεπτιδίου (

δηλαδή

3088 αμινοξέα, ~ 340 kDa). Η πρωτεΐνη 340 kDa BMCC1 ανιχνεύθηκε τόσο με C-τερματικό Ab-1 (που εγείρεται έναντι αμινοξέων 2345-2705) και Ν-τερματικό Ab-3 (που εγείρεται έναντι αμινοξέων 1-369) σε κύτταρα LNCaP. Η έκφραση αυτής της πρωτεΐνης δεν ανιχνεύθηκε στο PCA3 αρνητική προστάτη καρκινικές κυτταρικές σειρές PC3, DU145, ALVA, RWPE-Ι (Σχήμα 1Α). έκφραση BMCC1 ήταν επίσης απούσα από το PCA3 αρνητική κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού MCF7. BMCC1 δεν ανιχνεύθηκε σε φυσιολογικά κύτταρα, όπως έχουμε ήδη αναφερθεί [5]. Η ταυτότητα της ζώνης των 340 kDa επιβεβαιώθηκε με ανοσοκαταβύθιση BMCC1 από LNCaP εκχυλίσματα χρησιμοποιώντας Ab-3, που ακολουθείται από ανίχνευση Western blot με Ab-2 (που εγείρεται έναντι αμινοξέων 222-276) (Εικόνα 1Β). Η ειδικότητα της ανίχνευσης BMCC1 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με παροδική μείωση της έκφρασης BMCC1 με siRNA και ανίχνευση με πολλαπλά αντισώματα. BMCC1 siRNA διαμόλυνση προκάλεσε μία δραματική μείωση στην ένταση της 340 kDa πρωτεϊνική ζώνη ανιχνεύθηκε τόσο από C- και Ν- τερματικό αντισώματα Ab-1 και Ab-3 (Εικόνα 1C). Αυτό υποστηρίζει τα δεδομένα ανοσοκαθίζησης να αποδείξει σθεναρά ότι

BMCC1

είναι μια κωδικοποίηση γονίδιο, που παράγουν μια πρωτεΐνη 340 kDa στην PCA3 εκφράζοντας την κυτταρική σειρά LNCaP πρωτεΐνη. Δεν ανιχνεύθηκαν έκφραση του siRNA ευαίσθητων αντιδραστικών ζώνες αντι-BMCC1 σε χαμηλότερα μοριακά βάρη, δεικνύοντας ότι η πρωτεΐνη BMCC1-1 είναι το κυρίαρχο προϊόν γονιδίου σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). έκφραση πρωτεΐνης BMCC1 δεν ανιχνεύθηκε σε διάφορες κυτταρικές σειρές που προέρχονται από νευροβλάστωμα, καρκίνωμα του μαστού και των ωοθηκών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). BMCC1 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε 3/5 πρωτογενείς κυτταρικές σειρές μελανώματος, και σε μερικές περιπτώσεις παρατηρήθηκε μία δυάδα (Σχήμα S3). Η ταυτότητα των ζωνών στις κυτταρικές σειρές μελανώματος αποδείχθηκε σθεναρά με ανίχνευση BMCC1 με αντισώματα σε διαφορετικές περιοχές της πρωτεΐνης, Ab-1 και Ab-3. Αυτό υποδεικνύει ότι BMCC1 θα μπορούσε να έχει ένα ρόλο και σε άλλους τύπους όγκων.

A. BMCC1 ανοσοαποτύπωση του συνόλου των κυτταρικών εκχυλισμάτων. 30 μg του λύματος ανά κυτταρική σειρά υποβλήθηκε σε 5% SDS-PAGE. έκφραση BMCC1 ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα κουνελιού που εγείρεται έναντι ΑΑ 2345 να 2705 (C-τερματικό, αντι BMCC1 κουνέλι, Ab-1) και ένα δεύτερο αντίσωμα, Ab-3, που αναγνωρίζει το Ν-άκρο της BMCC1. DNA PKcs χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Β. Ανοσοκαθίζηση BMCC1 από LNCaP συνολικό προϊόν λύσης. BMCC1 ανοσοκαταβυθίστηκε με επώαση του 1 mg LNCaP λύματος με 1 μα Ab-3 για 8 ώρες στους 4 ° C που ακολουθείται από καταβύθιση με πρωτεΐνη G αγαρόζης. Η μη-ειδική (NS) IgG χρησιμοποιήθηκε στη θέση του Ab-3 σε ένα ΙΡ ελέγχου. Πλένονται ρητίνη εκλούστηκε σε χρωστική φόρτωσης SDS-PAGE και στύπωμα Western. Η βαριά αλυσίδα IgG (φόρτωση) καταδεικνύει εισόδου ίση αντισώματος.

Γ. Η εξάντληση της έκφρασης BMCC1 με siRNA. LNCaP κύτταρα επιμολύνονται με BMCC1 siRNA 1730 (siBMCC1) ή τον έλεγχο siRNA (siControl). Σύνολο λύμα συλλέχθηκε 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση και έκφραση BMCC1 αναλύθηκε με κηλίδωση Western με BMCC1 Ab-1 (C-τερματικό) και Ab-3 (Ν-τερματικό). Το στύπωμα απογυμνώθηκε τελείως μεταξύ διαδοχικών ανιχνευτές. RNA πολυμεράση II είναι ένα στοιχείο ελέγχου φόρτωσης.

Η

Machida et al. [7] και Li et al. [12] χρησιμοποιείται

in situ υβριδοποίηση

εμβρύων ποντικού για να δείξει ότι το RNA BMCC1 εκφράζεται κυρίως σε νευρικό ιστό, και Zhou et al. [20] χρησιμοποιείται PCR του RNA ιστού ποντικού για να δείξει ότι τουλάχιστον η περιοχή ΟΕΒ εκφράζεται σε μια ποικιλία τύπων ιστού. Iwama et al. [8] χρησιμοποιείται PCR εκκινητές που εκτείνονται σε ολόκληρο το γονίδιο για να αποδειχθεί ισχυρή έκφραση στο ραχιαίο ριζικό γάγγλιο με ενδιάμεση έκφραση σε ολόκληρο τον εγκέφαλο, το νωτιαίο μυελό, τον προστάτη και τη μήτρα και χαμηλή έκφραση σε άλλους ιστούς. Για την αντιμετώπιση αυτής της ασυμφωνίας των συστατική έναντι περιορισμένης έκφρασης RNA, και να λάβουν πρόσθετες πληροφορίες σχετικά με την έκφραση της πρωτεΐνης και υποθετικό συγκολλημένα προϊόντα γονιδίων, που ανοσοαποτύπωση λύματα πρωτεϊνών από ένα πάνελ των ενήλικων ιστών ποντικού χρησιμοποιώντας BMCC1 Ab-4. Σε αυτό το μη-ογκογόνο ρύθμιση ανιχνεύσαμε μια ισχυρή ζώνη ~ 80 kDa σε ιστούς του εγκεφάλου, με χαμηλότερη έκφραση ενός μικρότερου 72 μπάντα kDa (Σχήμα S4). Η 52kDa BMCC1s προσδιορίζονται από Arama et al. [11] δεν παρατηρήθηκε εδώ, επειδή το αντιγόνο για Ab-4 εκτείνεται αμινοξέα 2192-2433 του BMCC1-1 και δεν περιέχει οποιοδήποτε τμήμα του BMCC1s (βλέπε σχήμα S2). Για να επιβεβαιωθεί η έκφραση του BMCC1 σε μια ρύθμιση του όγκου του καρκίνου του προστάτη, ανοσοϊστολογική χρώση των καρκινικών ιστών του προστάτη πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Ab-3. Minimal χρώση BMCC1 παρατηρήθηκε σε καλοήθη υπερπλασία του προστάτη αδενικό επιθήλιο και στρώμα, με ισχυρότερη χρώση παρατηρήθηκε στο αδενικό επιθήλιο των όγκων του προστάτη (Σχήμα S5).

BMCC1 αλληλεπιδρά με την ΑΡ-2 σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη

για να αποκτήσουν γνώσεις σχετικά με την κυτταρική λειτουργία των BMCC1, αλληλεπιδρώντας πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν από καθαρισμό με ρητίνες συγγένειας BMCC1-GST. Δημιουργήσαμε μία σειρά επικαλυπτόμενων κλώνων BMCC1-GST σε pGEX που καλύπτουν το πλήρους μήκους cDNA (Πίνακας S1). Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες εκφράστηκαν και διασυνδεδεμένη με αγαρόζη γλουταθειόνης για να δημιουργήσει μια σειρά από matricies συγγένεια για την αλληλεπίδραση πρωτεϊνών. Διασταυρωμένες ρητίνες σύντηξης GST-BMCC1 επωάστηκαν με συνολικό προϊόν λύσεως LNCaP να καθαρίσει BMCC1 αλληλεπιδρούν. πρωτεΐνες που σχετίζονται με ρητίνη εκλούσθηκαν, επιλύονται και οπτικοποιήθηκαν με χρώση αργύρου SDS-PAGE. BMCC1 GST θραύσματα 1-2 και 4-10 τράβηξε προς τα κάτω μια σειρά από πρωτεΐνες συχνά χαρακτηριστεί ως μη-ειδική ή μη λειτουργική αλληλεπιδρούν. Αυτές περιλαμβάνουν eEF1γ, 40S ριβοσωμική πρωτεΐνη, GRP75 και GRP78 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). BMCC1 GST F3 (αμινοξέα 575 έως 904) καταβυθίστηκε συγκεκριμένες ζώνες στα 50 kDa και 110 kDa (Εικόνα 2Α). Η 50 kDa και 110 kDa που αλληλεπιδρούν ζώνες αποκόπηκαν και πιστοποιείται με φασματοσκοπία μάζης (MALDI MS /MS σε ένα φασματόμετρο Bruker Ultraflex III). Μια περίληψη των Mascot δεδομένα αναζήτησης παρουσιάζεται στον Πίνακα S2. Αυτό αποκάλυψε ότι BMCC1-F3 αλληλεπιδρά με αρκετά μέλη του προσαρμογέα Σχετικές πρωτεΐνη Complex 2 (ΑΡ-2). Το συγκρότημα ΑΡ-2 είναι ένα ενδόσωμα που συνδέονται ετεροτετραμερές αποτελείται από τρία διαφορετικά συστατική συστατικών (ΑΡ-2S1, ΑΡ-2Μ1 και ΑΡ-2Β1 /β-adaptin) και μία από τις δύο αμοιβαία αποκλειόμενες συστατικά (ΑΡ-2Α1 ή ΑΡ-2Α2) [ ,,,0],21]. Η πρωτεΐνη αλληλεπίδρασης 50 kDa BMCC1-F3 ταυτοποιήθηκε ως AP-2Μ1, βασίζεται σε δύο ξεχωριστές ταυτοποιήσεις με συνολικά 8 μη περιττών πεπτίδια (Πίνακας S2). Η αλληλεπιδρώντας ζώνη 110 kDa BMCC1 περιείχε ένα μίγμα τριών υψηλού μοριακού βάρους AP-2 σύμπλοκο μέλη: AP-2Α1, ΑΡ-2Α2, και ΑΡ-2Β1 (Πίνακας S2). AP-2Β1 προσδιορίστηκε σε δύο δείγματα με συνολικά 5 μοναδικά πεπτίδια. Η ομολογία μεταξύ AP-2Α1 και AP-2A2 κάνει ατομικές μοναδικό ταυτοποιήσεις συγκρότημα (Σχήμα S6). AP-2Α1 εντοπίστηκε σε 3 δείγματα με συνολικά 6 πεπτίδια που δεν αντιστοιχούν σε AP-2A2. AP-2Α2 εντοπίστηκε σε ένα δείγμα με ένα πεπτίδιο που δεν αποδίδονται στο AP-2Α1. Σε αυτά τα δείγματα, τρία ατομικά πεπτίδια θα μπορούσαν να έχουν αντιστοιχούσε σε είτε ΑΡ-2Α1 ή ΑΡ-2Α2 και δεν μπορεί να αποδοθεί με βεβαιότητα προς τη μία ή την άλλη λόγω ταυτότητα αλληλουχίας (Πίνακας S3). Αριθ υπολογιστικά αναγνωρίσιμες περιοχές θα μπορούσαν να αποδοθούν σε αυτή την περιοχή, έτσι λειτουργική χαρτογράφηση αλληλεπίδραση BMCC1 εντόπισε μία νέα μοτίβο αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Η αλληλεπίδραση μεταξύ BMCC1 και το σύμπλοκο ΑΡ-2 επιβεβαιώθηκε με συν-ανοσοκαταβύθιση. BMCC1 ανοσοκατακρημνίστηκε από κυτταρολύματα LNCaP και τα προκύπτοντα αλληλεπιδρούν πρωτεΐνες εκλούστηκαν και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western (Σχήμα 2Β) αποκαλύπτοντας ότι η ενδογενής BMCC1 αλληλεπιδρά με β-adaptin και ΑΡ-2Α1 /2 (Εικόνα 2Β). Η ενδογενής αλληλεπίδραση μεταξύ BMCC1 και το σύμπλοκο ΑΡ-2 τεκμηριώθηκε περαιτέρω με ανοσοκαθίζηση BMCC1 από προϊόντα λύσης των κυττάρων τα οποία είχαν BMCC1 εξαντληθεί με siRNA. Μία ζώνη 340 kDa ανιχνεύτηκε στο υψηλού μοριακού βάρους επίλυση Coomassie χρώση γέλη (Σχήμα 2C). Αυτή η ζώνη ήταν μειωμένη ένταση στο ανοσοΐζημα από BMCC1 εξαντλημένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα siRNA ελέγχου. Αν και ανοσοκατακρήμνιση δεν είναι μια ποσοτική προσέγγιση, αυτή η μειωμένη ένταση καθοδηγούμενη επιλογή μπάντας για μετέπειτα ανάλυση MS. Η ταυτοποίηση αυτής της ζώνης ως BMCC1 επιβεβαιώθηκε με MALDI-TOF /TOF των τρυπτικών πεπτιδίων από την κομμένο κομμάτι πηκτώματος. Είναι σημαντικό ότι, η ακραία BMCC1 Ν-τερματικό πεπτίδιο TEFNYFTETR, δεν υπάρχει στην κολοβωμένη ισομορφή (BMCC1-3) αναφέρθηκε από Machida et al. [7] εντοπίστηκε μεταξύ αυτών (Πίνακας S4). Αυτό παρείχε

de novo

απόδειξη της έκφρασης πρωτεΐνης BMCC1-1 σε κύτταρα LNCaP. Το προφίλ αλληλεπιδράσεων του BMCC1 εξετάστηκε από κηλίδωση Western αυτά τα ανοσοκαταβυθίσματα για AP-2Α1 /2 και β-adaptin. Σε συμφωνία με την μειωμένο επίπεδο BMCC1 πρωτεΐνης στο ανοσοκαθιζάνει siBMCC1, μειωμένη σήματα για AP-2Α1 /2 και β-adaptin ανιχνεύθηκαν στο ίζημα από siBMCC1 κυτταρόλυμα από κυτταρόλυμα ελέγχου. Αυτό παρείχε περαιτέρω αποδείξεις ότι αυτές οι πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν ειδικά με BMCC1 (Σχήμα 2C).